FI119203B

FI119203B - Menetelmä protrombiiniajan määrittämiseksi

Info

Publication number: FI119203B
Application number: FI20050298A
Authority: FI
Inventors: Juha Horsti
Original assignee: Juha Horsti
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2005-03-21
Publication date: 2008-08-29
Also published as: FI20050298A0; US7767459B2; FI20050298A; WO2006100346A1; JP2008533496A; EP1861720A1; US20090263903A1

Description

119203

Menetelmä protrombiiniajan määrittämiseksi KEKSINNÖN ALA

Esillä oleva keksintö koskee INR-yksiköihin perustuvia testejä oraalisen antikoagulaatioterapian ja hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) seuraamiseksi (INRpivka). Tarkasti sanoen keksintö antaa käyttöön menetelmän plasma- tai kokoverinäytteen protrombiiniajan määrittämiseksi ottamalla huomioon vaikutus, joka K-vitamiinin poissaololla tai antagonistien indusoimalla proteiinilla (Pivka) on INR-arvoon. Keksinnön mukainen kohde on harmonisoida protrombiiniaikamenetelmiä kansainvälisen normalisoidun suhdeluvun (INR) tulosten suhteen ja mitata myös Pivka-vaikutus INR-yksikköinä.

KEKSINNÖN TAUSTA

Protrombiiniaika (PT) -testi otettiin käyttöön oraalisen antikoagulanttiterapian (OAT) kontrolloimiseksi, jota terapiaa käytetään tromboottisia häiriöitä, kuten trombofiliaa, omaavien potilaiden hoitamiseksi. Tämä terapia perustuu K-vitamiiniantagonisteihin, kuten varfariiniin (tai kumariiniin), jotka estävät koagulaatiotekijöiden (F II, F VH, FIX

* * * .ja F X) synteesiä maksassa. Tällä hetkellä OAT:n tarve on kasvamassa • · · . maailmanlaajuisesti. Esimerkiksi vuonna 2003 Suomessa varfariinilääkitys määrättiin 1,7 • ♦♦ %:lle väestöstä ja potilaiden lukumäärä on kasvamassa ikääntyvästä väestöstä johtuen.

• ♦

Koska OAT-lääkitys tarvitsee jatkuvaa kontrollia tromboosin tai verenvuodon vakavien • · · seurausten ehkäisemiseksi, ei ole yllättävää, että koko maailmassa suoritetaan 800 • ♦ miljoonaa PT-testiä joka vuosi. Tavallisimmin käytetyt PT-testit perustuvat Quickin . ... yksivaiheiseen PT-ja Owrenin menetelmään. Jälkimmäistä käytetään laajimmin • * · ,»··. Pohjoismaissa ja Benelux-maissa sekä Japanissa, kun taas Quickin PT on muualla • · • · · .· . käytetty lähestymistapa vastaten noin 95 %:sta kaikista suoritetuista PT-testeistä.

• ♦ * • ·· • · *·· * · *; * Kun Maailman terveysjäqestö (WHO) otti käyttöön kansainvälisen normalisoidun suhdeluvun (INR) ja kansainvälisen herkkyysindeksin (ISI), tavoite oli harmonisoida PT- • · • · ··· 119203 2 oraaliseen antikoagulanttihoitoon (5): PT-tulosten pitäisi olla INR-yksiköissä samat tietyllä plasma- tai kokosolunäytteellä käytetystä reagenssista, laitteesta tai menetelmästä huolimatta. Tänään PT-testin kukin kaupallinen koagulaatioreagenssi (eli tromboplastiini) kalibroidaan primääristä WHO:n vertailuvalmistetta vastaan. Tuloksia käytetään laskettaessa tromboplastiinireagenssien suhteellinen herkkyys, joka ilmoitetaan ISI-arvona (kansainvälinen herkkyysindeksi). INR-tulokset lasketaan sitten kaavan INR ~ [PT-suhde]ISI mukaisesti. INR-formaatin lisääntyvä käyttö on kuitenkin johtanut sen rajoitusten ymmärtämiseen, ja äskettäin havaittiin, että osan (tai ehkä useimpien) kaupallisten INR-menetelmien keskinäinen yhtäpitävyys on heikko, ja kliinisesti havaittiin liian paljon INR-vaihtelua, mikä siten vaarantaa potilaiden hyvän hoidon (9, 10).

Hemker ja kollegat (1,2) karakterisoivat ensimmäisinä K-vitamiinin poissaolon tai antagonistien indusoiman proteiinin (Pivka) roolin. He havaitsivat, että kumariiniterapia on yhteydessä endogeenisen, kompetitiivisen koagulaatioinhibiittorin kanssa, jonka he myöhemmin nimesivät Pivkaksi. Kyseiset proteiinit olivat K-vitamiinista riippuvien tekijöiden esiasteita. Ne inhiboivat protrombiinia konvertoivaa kompleksia oletettavasti koagulaatiotekijää X (FX) vastaan (3). Havaittiin, että Pivka-tekijöiltä puuttuu : Y· gammakarboksiglutamiinihappo, joka on välttämätön kalsiumin sitomiselle ja siten • · :*·*; näiden tekijöiden "adsorptiolle" fosfolipidipinnoille. Siten ne ovat aktiivisten .·*·. · koagulaatiotekijöiden inaktiivisia analogeja (4, 5).

* · • · * • * • · * * · : : Talstad pohtii kysymystä, miksi PT-testin standardisointi on ongelma, ja ehdottaa PT- ; * * *: testin standardisointia Pivka-inhibiittorin koriauksen avulla (15,16). Mitään käytännön * · · menetelmää PT-testien Pivka-koijaukselle ei kuitenkaan esitetty. Esillä olevan keksinnön Y*; tavoite oli siis tutkia Pivka-vaikutusta edelleen ja verrata Quickin ja Owrenin PT- * * * « * menetelmiä Pivka huomioon ottaen käyttämällä erilaisia reagensseja. Tuloksena esillä .: oleva keksintö antaa käyttöön PT-testaamiseen yksinkertaisen menetelmän, joka ratkaisee * · * • i . * * \ Pivka-vaikutuksen ongelman.

• · · * * • · ·

KEKSINNÖN YHTEENVETO

• · • P • · · 3 119203

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää Pivkalla kokatun protrombiiniajan (PT) määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää seuraavat vaiheet: a) mitataan oraalisessa antikoagulanttiterapiassa (OAT) olevalta potilaalta tai hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) omaavalta potilaalta otetun plasma- tai kokoverinäytteen tai kalibraattori- tai kontrolliplasmanäytteen vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika tmjn- tai INRmin-arvon määrittämiseksi näytteelle; b) mitataan terveeltä kohteelta otetun plasma- tai kokoverinäytteen (eli normaalin plasman näytteen) vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika tmjn- tai INRmin-arvon määrittämiseksi normaalille plasmalle; c) lasketaan tpjVka- tai INRpiVka-arvo vaiheiden a) ja b) tuloksista; d) määritetään Pivkalla koijattu PT vaiheen a) näytteelle vähentämällä vaiheessa c) saatu tpivka- tai INRpivka-arvo vaiheessa a) mitatusta protrombiiniajasta.

PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS

• · · • » ··· • 1 · • ♦ · ;\i Kuvio 1. Pivka-laskennan malli. Normaalin plasman t„,in-arvo on vakio yhdellä ♦ · • 1 1'. reagenssierällä. Potilaan plasman t„,jn-arvo on vain yhdelle potilaalle. Yhdelle »·· • potilasnäytteelle tarvitaan vähintään kaksi mittausta suoran yhtälön laskemiseksi.

»«« · ··1 • · • · ♦ •t

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN SELITYS

• · · o · · ·1· ;’2 3· Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmän Pivka-vaikutuksen määrittämiseksi t·· , · [ . INR-yksiköissä ja Pivkalla koijatun protrombiiniajan (PT) määrittämiseksi, joka • · · * , · · ·. menetelmä käsittää vaiheet: * · • · · * • · · • · t • · · ·1 • · 2 • · 3 4 119203 a) mitataan oraalisessa antikoagulanttiterapiassa (OAT) olevalta potilaalta tai hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) omaavalta potilaalta otetun plasma- tai kokoverinäytteen tai kalibraattori- tai kontrolliplasmanäytteen vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika tmin- tai INRmm-arvon määrittämiseksi näytteelle; b) mitataan terveeltä kohteelta otetun plasma- tai kokoverinäytteen (eli normaalin plasman näytteen) vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika tmin- tai INRmm-arvon määrittämiseksi normaalille plasmalle; c) lasketaan tpjvka- tai INRnvka-arvo vaiheiden a) ja b) tuloksista; d) määritetään Pivkalla korjattu PT vaiheen a) näytteelle vähentämällä vaiheessa c) saatu tpivka- tai INRpivka-arvo vaiheessa a) mitatusta protrombiiniaj asta.

INRmin- tai tmin-arvo saadaan näytteille käyrän avulla, joka antaa yhteyden näytteen laimennoksen tai näytteen tilavuuden (X-akseli) ja INR-arvona tai sekunteina olevan hyytymisajan (Y-akseli) välillä. Regressiosuora piirretään pisteiden kautta, jotka . , vastaavat näytteen eri laimennosten tai näytteen tilavuuksien INR-arvoja tai • · · hyytymisaikoja. Regressiosuoraleikkaa Y-akselin INR^ssätai tm^rssä (katsokuviota 1).

• · · • * * « • · • 4 # • *· # # l.. * Edullisesti mitattavaan protrombumaikaan vaikuttavan Pivka-vaikutuksen arvo lasketaan • · . * * * käyttämällä yhtälöä: * * · • · * ··· · • · · • · • * _ *** INRpivka = INRmin (potilasnäyte, kalibraattori tai kontrolli) - INRmm (normaali plasma) • « · • * * ·*· , .

·** täi • · • · *·* * 4 I • · · *· '·' tpjvka " tmin (potilasnäyte, kalibraattori tai kontrolli) - tmin (normaali plasma).

• *· ♦ « ···

On myös mahdollista konvertoida tpivka-arvo INR-yksiköiksi.

··· .* : **♦ 5 119203

Menetelmän vaiheessa d) Pivka-vaikutus potilasnäytteen PT-arvoihin kokataan edullisesti käyttämällä yhtä seuraavista yhtälöistä: INRkoijattu = INRpotilas, kalibraattori, kontrolli " INRpivka tai tkorjattu = tpotilas, kalibraattori, kontrolli ~ tpivka joissa INRpotilas, kalibraattori, kontrolli tai tpotiias, kalibraattori, kontrolli on menetelmän vaiheessa a) mitattu näytteen protrombiiniaika ja joissa INRpivka tai tpivka on menetelmän vaiheessa c) laskettu arvo.

INR-alkuarvot PT-näytteille lasketaan kaavalla:

INR = (näytesek/normaalisek)ISI

jossa näytesek on potilasnäytteen (tai kalibraattorin tai kontrollinäytteen) protrombiiniaika . ·. ·. mitattuna sekunneissa, normaalisek on normaalin plasman näytteen protrombiiniaika • * · • · . ·: ·, mitattuna sekunneissa ja ISI on PT-testissä käytetyn koagulanttireagenssin suhteellinen • · · « : herkkyys. ISI-arvon antaa tavallisesti reagenssin valmistaja, tai se mitataan käyttämällä • «· • · . * * ·. ISI-kalibraattorireagenssipakkauksia.

* · * · · • * * · · • · · • · · · . * * *. Plasmanäytteet laimennetaan PT-testeihin edullisesti fysiologisella suolaliuoksella tai • · · muulla sopivalla puskurilla. Kun mittaukseen käytetään erilaisia näytetilavuuksia, . näytteen laimentaminen ei ole kuitenkaan välttämätöntä. Yksinkertaisuuden vuoksi näitä * · · ; * * *; erilaisten näytetilavuuksien j a testireagenssien sekoituksia kutsutaan tässä myös • · · / . "laimennoksiksi". Lisäksi ilmaus "vähintään kaksi laimennosta" viittaa tässä myös • ·· i./ tilanteeseen, jossa yksi "laimennoksista" on laimentamaton näyte.

• * ··· * • * · • · « ·«· ··· ♦ · • » ·** , 119203 Ο

Edullisesti menetelmän vaihe b) suoritetaan vain kerran tietyllä koagulaatioreagenssilla (eli tromboplastiinilla) ja saatua tulosta käytetään vaiheessa c) suurelle määrälle samalla reagenssilla testattuja potilas-, kalibraattori- tai kontrollinäytteitä. Tämä on mahdollista, koska normaali plasma ei sisällä Pivkaa, ja siten normaalin plasman tmjn- tai INRmin-arvo on aina vakio tietylle koagulaatioreagenssille.

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa myös täysin automaattisella koagulaatioanalysaattorilla, koska nykyiset analysaattorit voidaan ohjelmoida helposti ajamaan näyteryhmitys ja laskutoimitukset, joita tarvitaan esillä olevan menetelmän täytäntöönpanoon.

KOKEELLINEN OSA

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja verinäytteenotto

Kaikki menettelyt olivat laitoksemme vastuullisen komitean hyväksymiä vuoden 1975 Helsingin julistuksen mukaisesti. Analysoimme normaalien ja OAT-potilaiden näytteitä, • · · • · . *: *. jotka oli valittu ilman tietoista mieltymystä sairaala- ja terveyskeskuspotilaiden joukosta.

• * · .·. · Verta (1,8 ml) otettiin 10 normaalilta ja 10 OAT-potilaalta sitraattikoagulaatioputkiin • ·* a · ,··, (Greiner Labortechnik GmbH, Vacuette luett. nro 454322,9NC), jotka sisälsivät 0,2 ml * · • · · ; .·. 0,109 moolin/l sitraattiliuosta (3,2 %). Näyteneula (Terumo, Venoject-neula, Quick Fit, ♦ · · .*··, luett. nro MN-2138MQ) oli 0,8 x 40 mm. Näyteputket sentrifugoitiin 1 850 g:ssä 10 min • · • · · 20 °C:ssa plasman erottamiseksi. Kaikki mittaukset alkoivat samaan aikaan 8 tunnin . .*. sisällä veren keräämisestä.

♦ * · • · · • · · • * * · *·* .* , PT-ajan määrittäminen • · · * • ·· • * • · · • · • * '* PT-koagulaatioajat mitattiin käyttämällä täysin automatisoitua BCS- • · · *·ϊ·* koagulaatioanalysaattoria (The Dadebehring Coagulation System, Dadebehring, Marburg, ··« • · • · # · · 7 119203

Saksa). Yksivaiheiseen protrombiiniaikaan Quickillä lisättiin 100 μΐ koagulaatioreagenssia 50 pl:aan sitraattiplasmaa. Neljä testireagenssia olivat: (i) Neoplastine CL Plus, luett. nro 00376 (kanin aivojen tromboplastiini, Diagnostica Stago), erä 031581, ISI 1,30 (laitetta ei mainittu), ISI-arvot 1,42; (ii) PT-Fibrinogen Recombinant, luett. nro 20005000 (rekombinanttinen kanin kudoksen tromboplastiini, Instrumentation Laboratory, IL), erä NO 425869, ISI 1,03 ACL:lle, ISI-arvo 1,08; (iii) PT-Fibrinogen HS Plus, luett. nro 08469810 (kanin aivojen tromboplastiini,

Instrumentation Laboratory, IL), eräN0325729, ISI 1,13 ACLrlle, ISI-arvo 1,25; (iv) Dade Innovin luett. nro B4212-50 (rekombinanttinen ihmisen kudoksen tromboplastiini, DadeBehring Marburg GmbH), erä 526987, ISI BCS:lle 0,90, ISI-arvo 1,04.

Owrenin PT-testille (yhdistetty tromboplastiinireagenssi) koagulaatioreaktio sisälsi 10 μΐ . ·, ·, sitraattinäyteplasmaa, 50 μΐ laimennusainetta ja 150 μΐ reagenssia. Kolme testireagenssia • · • · olivat: * » » • · • · · • ·* • · .··*, (v) Owrenin PT, luett. nro GHI (Global Hemostasis Institute) 131-10 (kanin aivojen * * • · · : .·. tromboplastiini), joka sisälsi 25 mmoolia CaCl2:ta/l (luett. nro. GHI 155) ja ··· ·

,*··. laimennusainetta (Owrenin puskuri, luett. nro GHI 150) GHI-yhtiöltä, erä C414F, ISI

t 9 1,09 optisille menetelmille, ISI-arvo 1,17; • · · • · 9 »·· • *' *: (vi) Nycotest PT, luett. nro 1002488 (kanin aivoj en tromboplastiini) j a laimennusaine .* , (Nycotest PT, laimennusneste, luett. nro 1002485) Axis-Shield as -yhtiöltä, erä 10107353, *,, * ISI 1,13 Thrombotrackille, ISI-arvo 0,95; • « • · ··· e * t · · 9 · 9 • · « »·· f · • · *99 8 119203 (vii) SPA 50, luett nro 00105 (kudostromboplastiini) ja laimennusaine (SPA-puskuri, luett. nro 00124) Diagnostica Stagolta, erä 022071, ISI 0,98 (laitetta ei mainittu), ISI-arvo 0,93.

Kaksi menetelmää (4 + 3 reagenssia) kalibroitiin ISI-arvon suhteen samoilla kalibraattoreilla Etaloquick luett. nro 00496 Diagnostica Stagolta, erä 021964.

Plasmalaimennokset 1:2 valmistettiin Kabin fysiologiseen suolaliuokseen (natriumkloridi 9 mg/ml, 500 ml).

PT-määritysten analyyttinen epätarkkuus

Seitsemän PT-testin ajon sisäinen epätarkkuus mitattiin käyttämällä yhden potilaan plasmanäytettä (n = 10 määritystä), jonka INR-arvo oli terapeuttisella alueella eli noin 2,2 INR. Vastaavat CV:t olivat: 2,3 % Neoplastine CL Plusdle, 2,7 % PT-Fibrinogen Recombinantille, 1,1 % PT-Fibrinogen HS Plusdle, 2,6 % Dade Innovinille, 1,4 %

Owrenin PT:lle, 1,6 % Nycotest PT:lle ja 1,0 % SPA:lle.

t·'·' Pivka-määritys ja tilastotiedot • · 1 • · «M • · · *·2 1 . 2. · Piirsimme käyrän hyytymisaika (s) y-akselilla ja plasmalaimennos x-akselilla *· 1' ,···[ normaaleille ja OAT-plasmoille. Suoran yhtälöstä saimme suoran leikkauspisteen y-• 2 : , ·. akselilla, joka leikkauspiste on niin kutsuttu pienin mahdollinen hyytymisaika (tmin) • · 1 . · · 2, äärettömällä määrällä hyytymistekijöitä yhdessä näytteessä (3. ID. Normaalin plasman ja • · • · 1 OAT-plasman välinen leikkauspisteiden (y-akseli) ero osoittaa Pivkan vaikutuksen . sekunneissa ilman kalibraatiovaikutusta. Laskimme leikkauspisteiden eron INR- • · e ·2♦ .3. yksiköinä (OAT-leikkauspiste - normaalin plasman leikkauspiste, kuvio 1).

**· • 1 • · · • 1· *,.1 INR-tulokset laskettiin sekunneissa käyttämällä kaavaa: • · • · • f· · i. 1 INR = (näytejek/normaalisek)181 ··· • · 2 • · 3 9 119203

Korrelaatiofunktioiden ja INR-tulosten saamiseksi käytettiin Microsoft Excel 5.0 -ohjelmaa.

Tulokset f

Keskimääräinen leikkauspiste vaihtelee Quickin PT-testiä käyttämällä 0,03 - 0,14 INR ja Owrenin PT-testiä käyttämällä 0,01 - 0,03 INR normaaleilla plasmoilla. Keskimääräinen leikkauspiste vaihtelee Quickin PT-testiä käyttämällä 0,40 -1,46 INR ja Owrenin PT-testiä käyttämällä 0,20 - 0,28 INR OAT-plasmoilla. Leikkauspisteiden keskimääräiset SD:t normaaliplasmoilla (0,07 INR) ja OAT-plasmoilla (0,72 INR) Quickin PT-menetelmää ja Omenin PT-testiä käyttämällä olivat 0,02 INR; 0,23 INR.

Keskimääräinen Pivka-vaikutus Quickin PT-testillä on 0,36 INR (SD 0,43 INR) (ilman Innovin-reagenssia 0,15 INR; SD 0,14) ja Owrenin PT-testillä 0,36 INR (SD 0,24 INR). Keskimääräiset INR-tulokset OAT-plasmoilla Pivka-koijausta käyttämällä olivat Quickin PT-testillä 2,58 INR (SD 0,11) ja Owrenin PT-testillä 2,51 (SD 0,16) (taulukko 1).

Pohdinta

• o •OO

• o · • · . *: *, INR-tulosten harmonisointi on oleellinen tavoite potilaan hoidon ja tieteellisen • · · ,·, : kirjallisuuden käyttökelpoisuuden parantamisessa. Terapeuttiset alueet potilaiden hoitoon • *♦ . * * *. INR-yksiköinä harmonisoidaan ja ovat lääkäreille helppoja käyttää. Ongelmana on ··· : . *. yhdenmukaistaa INR-tulokset kaikkialla maailmassa, ja tämä on kliinisten • o· * . * * *. laboratorioiden tehtävä. Käytännössä laboratoriot käyttävät valmistajan ISI-arvoa ··· laitteelle, valmistajan tai "paikallisille" (tietyn maan tai alueen) . kalibraattorireagenssipakkauksille. Samasta näytteestä saatujen INR-tulosten pitäisi • · · . * * *. kuitenkin olla samat. ISI-kalibraatio on avainasemassa INR-tulosten harmonisoinnissa.

• m • · · / . PT-reagenssien (tromboplastiini, pH, ionikonsentraatiot ja -laatu, lisäaineet jne,) vaihtelu on maailmanlaajuisesti huomattavaa, ja tämä tekee INR-arvon harmonisoinnista hyvin • · *·* vaikeaa.

• · · • « · *·· 1 • · • · ··« 10 119203 PT-reagensseilla pitäisi olla alhainen ISI, lähellä l,0:aa. Tästä syystä valitsimme tähän tutkimukseen herkkiä Owrenin ja Quickin reagensseja. ISI-arvon vaikutus (kalibraatio) voimafunktiona kasvaa terapeuttisella alueella ja korkeammilla INR-arvoilla (9). Tämä tekee tulosten harmonisoinnista vaativampaa terapeuttisella alueella. Analyyttiset kriteerit PT-mittaukselle ovat hyvin tiukat (poikkeama <0,20 INR ja CV < 5 %) johtuen osaksi merkittävästä biologisesta vaihtelusta OAT-potilailla (12).

Pivka-tekijöillä on merkittävä rooli INR-tulosten harmonisoinnissa johtuen niiden vaikutuksesta kalibraatioon terapeuttisella alueella ja mittaukseen itseensä. Voimme havaita Pivkan ja PT-menetelmän suhteen, jos jätämme pois Innovin-tulokset (ihmisen tromboplastiini): Pivkan keskiarvo Quickin PT-testillä on 0,15 INR ja Owrenin PT-testillä 0,36 INR. Tämä merkitsee enemmän PIVKA-herkkyyttä ja enemmän inhibitiota (0,21 INR) Owrenin PT-menetelmällä (taulukko 1). Tämä selittää matalammat INR-tulokset Owrenilla verrattuna Quickin PT-testiin (6.13.14). Antikoagulanttiterapiassa potilaat saavat enemmän lääkitystä (0,21 INR), kun hoitokontrolliin käytetään Owrenin PT-testiä.

Molemmissa menetelmissä samalla valmistajalla, Diagnostics Stagolla, on reagensseja, joilla on hyvin alhainen Pivka-herkkyys. Havaitsimme suurimman Pivka-vaikutuksen • * e • · , ·: ·, Innovinia käyttämällä (0,98 INR), joka reagenssi sisältää rekombinanttista ihmisen • · · , ·, · kudoksen tromboplastiinia, kun taas kaikki muut reagenssit sisältävät kaniperäistä • ·# • · .···. tromboplastiinia. Pivka vaihtelee erilaisia reagensseja käyttämällä ja on osaksi • · • 41 : .·. tromboplastiinista riippuvaa. Leikkauspisteen SD:t normaaleilla ja OAT-plasmoilla • · · ,···. vaihtelevat selvästi enemmän Quickin PT-testillä (0,03 - 0,14 INR, 0,40 - 1,46 INR) kuin ·

Owrenin PT-testillä (0,01 - 0,03 INR, 0,20 - 0,28 INR) (taulukko 1). Nämä tulokset . vahvistavat näkemyksemme, että Owrenin PT-menetelmää käyttämällä voimme ··· , · · \ harmonisoida INR-tuloksia paremmin maailmanlaajuisesti eri reagensseilla.

M·* , Aikaisempien havaintojemme mukaisesti päättelimme, että Owrenin PT-menetelmät ovat * · · • · · !„ ylivoimaisia (6. 7. 81.

e * • m Φ·* • • · · • · · **· ··· • m Φ «

• M

119203 π

Taulukossa 1 näemme lähes samat tulokset ja pienimmän mahdollisen hajonnan keskiarvojen välillä INR-tuloksissa OAT-plasma miinus Pivka-inhibitio käyttämällä erilaisia PT-reagensseja ja menetelmiä. Tämä vahvistaa, että Pivka-laskelmat ovat oikeita (sama kalibraatio kaikilla reagensseilla). Pivka-inhibitio aiheuttaa ongelmia INR-tulosten harmonisoinnissa maailmanlaajuisesti (kalibraatio, erilaiset reagenssit, laitteet ja PT-menetelmät) (9). ISI-kalibraattorit (korkeammat INR-arvot) OAT-potilailta sisältävät myös Pivka-koagulaatiotekijöitä, mikä monimutkaistaa INR-jäijestelmää. Kalibraattorien INR-arvojen tulisivat olla ilman Pivka-vaikutusta,

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä tarvitaan vain vähintään kaksi PT-mittausta yhden potilasnäytteen eri laimennoksille, ja yksinkertaisia matemaattisia laskutoimituksia. Menetelmä on siis helppo sovittaa erilaisille laitteille. Teoreettisesti PT-menetelmien pitäisi mitata antikoagulanttilääkkeiden kokonaisvaikutus veren hyytymiseen, mukaan lukien aktiiviset K:sta riippuvat hyytymistekijät ja inaktiiviset tekijät (Pivka-inhibitio). Tämä metodologinen vaihtoehto merkitsee Pivka-herkän tromboplastiinin käyttöä ja menetelmää aktiivisten ja inaktiivisten koagulaatiotekijöiden summan mittaamiseksi. Toinen metodologinen mahdollisuus on mitata vain aktiiviset koagulaatiotekijät ilman koagulaatioinhibiittoreita, kuten tässä tutkimuksessa. Tämä uusi menetelmä auttaa INR-järjestelmän kehittämistä parhaaksi pääasialliseksi • · ♦ • · . 1: ·. mahdollisuudeksi harmonisoida INR-arvot oraaliseen antikoagulanttihoitoon • » · .·, : maailmanlaajuisesti.

• ·· • · ** • m • · · · • · • · · • « · *·1 · ·1· • · • Φ ·2 • · · • · · ··· • · « • · • · ··· * · ♦ · · • ·· • · • · · • · • · • · » • · 1 • « · ··· · · ♦ · ♦ · 2 «·· 12 119203 . S i « * I— e « 3 5 o a o t ® r os os co τ- co n> J t ,2 c > rf ίο «ο ίο « T- cd tj- co in T- S 3 8 » c ΐ CN <N cm" cm" cm" o' cm" CM" Cm" CM" o" § Q._2 fc 2 C« a gs ns £ m '5? £ '0 — ί-ooc-cmioco co co cn co os W —Ota «0 O (D OS CO OS OS_ 00 0_ 2 ^ 3 co" cm" cm” cm" cm" o" cm" cm" cm" cm" ©

S H S

SP < :* 3 o» *S eocnf-cNcoco g 3 <o φ j

.2 -e £ OS T- CM o M M o_ if ift CO CM

^ r = d o’ 0’ 9 ο o" o" 0' 0' 0' 0' '8 cd C Φ —1 «β Φ .« a ,¾

jj « φ Q 8) if § P! CM CM CM CM

w a 3 to o' t- ο ο" ο" o" 0 0 o” υ μ n a o x.

S 0 φ ξ .a s S 8.3 8 5 g g |! issf ssa' s s» + ♦ +1 ♦ + ♦ S <0 2 x x x ,S x x x A o. £ m os co $ <5 co (g O Τ' <5 O ICS O) - ID CO “i

« 12 id" cm" 10" tj nmS

—> < 7¾ T- co cm ^ ιη^-γ' .S O g II II II 11 II II 11 a “ >.>.>· '3 c O' o ·,·.· 22 ~ c *5 ··· ^ S c äo co s- c- . . . d 2 c JfD Ot-OOO 0000

*.* * :§ C jj 3 W o o o" o" o" o' o" O O

• · e o q3 : *.: 5* 2 2 • * J2 *5 • ·· ^ — • · fi

···’ C :2 CO CO 00 fesS

; ·. = s us us 3 m o» ··· a E e I m" n oo ^ S2 «- ... ja i j? > + + + ·Μ· + . + :: S js E 2 x x x + x + x ··· E E S2 £ £j t: S x id ,2 co C C W <0 CT> CO ^ 0) T- f·*.

G S 0.2 cm" 00" |C II OS 00 co"

o z g II II II ^ 11 « II

• · · ,£> • * · >1-4

* ♦ · »S Λ W

:·!; I *| tJ|fg t £tg

** ^ » 3. 8 £ > S ® 8 i o .E<gc.roQ

;·": -1 ?| IS II81¾¾° |8s«!«“>

·;· s J 3S I &6S

a 3 ώ * σ 5 -oz 0 z ^ ^ : : : 5 g tt u: **· 3 S h- h

:***: h B

··· 13 119203

Kirjallisuus 1. Hemker HC, Veltkamp JJ, Hensen A, Loeliger EA. Nature of Prothrombin Biosynthesis: Preprothrombinemia in Vitamin K-deficiency. Nature 1963;200:590-8.

2. Hemker HC. Preprothrombin (complex?) a circulating anticoagulant in coumarin treated and vitamin K deficient patients. Thrombos Diathes Haemorrh Suppl 1964;13:380.

3. Hemker HC, Muller AD. Kinetic Aspects of the Interaction of Blood-Clotting Enzymes. VI. Localization of the Site of Blood-Coagulation Inhibition by the Protein Induced by Vitamin K Absence (PIVKA). Thrombos Diathes Haemorrh 1968;20:78-87.

4. Stenflo J. Vitamin K, prothrombin and g-carboxyglutamatic acid. New Eng J Med 1977;296:624.

5. Hirsh J, Dalen JE, Anderson DR, Poller L, Bussey H, Ansell J et al. Oral Anticoagulants Mechanism of Action, Clinical Effectiveness, and Optimal Therapeutic Range. Chest 1998;114:445-69.

• * V 6. Horsti J. Agreement of Owren and Quick Prothrombin Times: Effects of Citrate ·«· V · and Calcium Concentrations and International Sensitivity Index Correction. Clin • · :.'*J Chem 2001;47:940-4.

• * *... * 7. Horsti J. Comparison of Quick and Owren Prothrombin Time with Regard to the * * Σ·ϊ : Harmonisation of the International Normalised Ration (INR) System. Clin Chem ·«·

Lab Med 2002;40:399-403.

8. Horsti J. Has Quick or Owren prothrombin time method the advantage in • · · *···* harmonisation for the International Normalized Ratio system? Blood Coag Fibriol • · * : 2002;13:641-6.

• · • t * · j 9. Horsti J, Uppa H, Vilpo J. Poor agreement between different prothrombin time • · · • * * ·; · * International Normalized Ratio (INR) methods: comparison of seven commercial Σ.·.! reagents. Clin Chem 2005;51:553-60.

• · · • · • · • · · 14 119203 10. Jackson CM, Esnouf MP. Has the Time Arrived to Replace the Quick Prothrombin Time Test for Monitoring Oral Anticoagulant Therapy. Clin Chem 2005;51:483-5.

11. Hemker HC, Veltkamp JJ, Loeliger EA. Kinetic aspects of the interaction of blood clotting enzymes.3. Demonstration of an inhibitor of prothrombin conversion in vitamin K deficiency. Thromb Diath Haemorrh. 1968;19:346-63.

12. Kjeldsen J, Lassen JF, Petersen PH, Brandslund I. Biological variation of International Normalised Ratio for prothrombin times, and consequences in monitoring oral anticoagulant therapy: computer simulation of serial measurements with goal-setting for analytical quality. Clin Chem 1997;43:2175-82.

13. Horsti J. The Quick and Owren prothrombin time methods for oral anticoagulant therapy do not agree well using the International Normalized Ratio (INR) units.

Scand J Clin Lab Invest 2003;63:455-6.

14. Oden A, Fahlen M. Oral anticoagulation and risk of death: a medical record linkage study. BMJ 2002;325:1073-5.

15. Talstad I. Prothrombin time standardization by correction of the Pivka inhibitor. Haemostasis 1996; 25(5):266-275.

• · · • * . 16. Talstad I. Why is the standardization of prothrombin time a problem? .*. ; Haemostasis 2000; 30(5):258-267.

·· • · ··· • · · ··♦ • ♦ • « · • · · ·· · · ·♦·

• V

• · ··♦ • · * I · I • · · **· • » • · * ·· • » • * · • · · • ♦ ** * · • · *·* m • # · • · · «·· ··· • · • · • · ·

Claims

119203

1. Menetelmä Pivkalla koijatun protrombiiniajan (PT) määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet: a) mitataan oraalisessa antikoagulanttiterapiassa (OAT) olevalta potilaalta tai hepatosellulaarisen karsinooman (HCC) omaavalta potilaalta otetun plasma- tai kokoverinäytteen tai kalibraattori- tai kontrolliplasmanäytteen vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika tmin- tai INRmin-arvon määrittämiseksi näytteelle; b) mitataan terveeltä kohteelta otetun plasma- tai kokoverinäytteen (eli normaali plasmanäyte) vähintään kahden eri laimennoksen protrombiiniaika W,- tai INRmin-arvon määrittämiseksi normaalille plasmalle; c) lasketaan tpiVka- tai ENRpjvka- arvo vaiheiden a) ja b) tuloksista; d) määritetään Pivkalla koijattu PT vaiheen a) näytteelle vähentämällä vaiheessa c) saatu tpjVka- tai INRpivka- arvo vaiheessa a) mitatusta protrombiiniajasta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa Pivkalla korjattu PT vaiheen a) näytteelle määritetään vaiheessa d) käyttämällä yhtä seuraavista yhtälöistä: INRkoijattu= INRpotilas,kalibraattori,kontrolli· INRpivka tai tkoijattu = tpotilas,kalibraattori,kontrolli " tpivka joissa INRpotiias,kalibraattori,kontrolli täi tpotiias,kalibraattori,kontrolli on menetelmän vaiheessa a) mitattu näytteen PT ja joissa INRpivka tai tpivka on menetelmän vaiheessa e) laskettu arvo. • · * 1 1 *. 1. 1

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jolloin se suoritetaan täysin automaattisella koagulaatioanalysaattorilla, joka on ohjelmoitu ajamaan menetelmän täytäntöönpanoon vaadittavat ,·, : näyteryhmitys ja laskutoimitukset.

• · · • · ! |: 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa vaihe b) suoritetaan kerran tietylle : , ·, koagulaatioreagenssille (eli tromboplastiinille) ja saatua tulosta käytetään vaiheessa c) samalla reagenssilla testatulle suurelle määrälle potilas- kalibraatio- tai kontrollinäytteitä. ··«

5. Koagulaatioanalysaattorin käyttö patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi. • · • · ® · 1 • · • · · • · « • · · m ·«· **·· • · • · • » · • · · • · 1 • · ·· • · # · ·«« Patentkrav 1 1 9203