NO844053L - Fremgangsmaate for aa bestemme basis-fetoprotein og middel for dette - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av basisk fetoprotein ved hjelp av sandwich-metoden under anvendelse av to antistoffer og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at de nevnte to antistoffer velges fra monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som hver reagerer med antigeniske determinanter av det basiske fetoprotein som er forskjellige fra hverandre.

Oppfinnelsen vedrører også et reagens for bestemmelse

av basisk fetoprotein ved hjelp av sandwich-metoden under anvendelse av to antistoffer, og det særegne ved reagenset i henhold til oppfinnelsen er at de nevnte to antistoffer velges fra monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som hver reagerer med antigeniske determinanter av det basiske fetoprotein som er forskjellige fra hverandre.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Basisk fetoprotein (BFP) som er et basisk protein med molekylvekt 73.000 og som har et isoelektrisk punkt på

9,3 og vandrer i y-globulinområdet ved elektroforese,

er blitt funnet i serum, intestinum og hjernevev i humant fetus.

Det er spesielt benevnt basisk fetoprotein da det er basisk i motsetning til det kjente sure fetoprotein.

Videre er det etablert et radioimmuno-bestemmelsessystem for det nevnte protein og det er funnet at bestemmelse av det nevnte protein i serum ville være til hjelp ved diagnosering av cancer og til å bedømme dens tilstand og den terapeutiske virkning på denne. Det er spesielt funnet at det nevnte fetoprotein er nyttig for å

undersøke nærvær av cancer til forskjell fra a-fetoprotein som er nyttig for diagnose av cancer i et spesielt organ.

Disse tidligere funn er beskrevet i de følgende

referanser (1) til (7), nærmere angitt med:

(1) Ishii, M. et al.: Studies on feto-neoplastic antigen. Proceedings of the 34th General Meeting og Japan Cancer Society, side 173 (1975). (2) Ishii, M.: Studies on novel basic fetoprotein found in various malignant tumors. Ikagu no Ayumi, 100 (3) , 344 - 346 (1977) . (3) Ushii, M. : Basic fetoprotein. Igaku no Ayumi, 106, (5) , 273 - 281 (1978) . (4) Ishii, M.: A new carcinoembryonic proteincharacterized bybasis property. Scandinav. J. Immunol., 8 (Suppl. 8), 611 - 620 (1978). (5) Ishii, M. : Characterization of basic fetoprotein and clinical usefulness of BFP for immunodiagnosis of human cancer. Carcino-Embyonic Proteins. Chemistry, Biology, Clinical Application, bind 1, Lehmann, F. - G.

(ed.), Elisevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 333 - 340 (1979).

(6) Ishii, M.: Nishimura, K. Hattori, M. Kanda, Y.

og Ishihara, A.: Postoperative surveillance in patients with stomach cancer and monitoring of immuno- and polychemotherapy in patients with Leukemia by basic fetoprotein, Carcino-Embryonic Proteins. Chemistry, Biological, Clinical Appplication, bind 2, Lehmann,

F. - G. (ed.) Elisevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, 603 - 606 (1979). (7) Ishii, M.: Clinical usefulness of basic fetoprotein for immunodiagnosis of human cancer. Compendium of Assay for Immunodiagnosis of Human Cancer, Development in Cancer Research, Herberman, R.B. (ed.) bind 1, Elisevier/North-Holland Biomedical Press, New York, 45 - 50 (1979).

Siden basisk fetoprotein er tilstede i serum av cancerpasienter i spormengder, er det nødvendig for å etablere et meget sensitivt bestemmelsessystem for å bestemme dette. RIA-og EIA-metoder er hovedsakelig blitt utviklet for dette. Detaljerte beskrivelser av RIA-metoden finnes i henvisninger (3) til (5) som angitt i det foregående. Detaljerte beskrivelser av EIA-metoden finnes i følgende referanser (8) og (9) , ' mer detaljert angitt med: (8) Ishii, M. et al.: Basic fetoprotein, present clinical function test - enforcement and interpretation thereof. Nippon Rinsho 37, 1536 - 1539 (1979).

(9) Ishii, M.: Basic fetoprotein: Rinsho Kensa 24

(8), 931 - 936 (1980).

I oppfinnelsens sammenheng er det fremstilt monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer for masseproduksjon av antistoffene som anvendes ved RIA- og EIA-metodene og ytterligere forhøye følsomheten for disse metoder ved bruk av de nevnte antistoffer. Fremstilling og bedømmelse av de nevnte monoclonale antistoffer er beskrevet i følgende henvisning (10), mer detaljert: (10) Proceedings of the 10th Japan Clinical Immunology Assoc. (Osaka). Fremstilling av monoclonale antistoffer for basisk fetoprotein.

Reaksjons-spesifisitetene for basisk fetoprotein av de monoclonale antistoffer oppnådd på denne måte ble undersøkt ved hjelp EIA- og MO-metoder. Det ble følgelig funnet at der er minst tre forskjellige antigeniske determinanter på det basiske fetoproteinmolekyl og at de monoclonale antistoffer kan klassifiseres i tre typer tilsvarende hver antigenisk determinant. Eksempler på monoclonale antistoffer tilsvarende de tre antigeniske determinanter A, B og C er som følger:

Under disse forhold ble det forsøkt etablert en meget sensitiv metode for bestemmelse av basisk fetoprotein ved hjelp av en sandwich-metode med bruk av monoclonale antistoffer fra forskjellige synsvinkler. Som et resultat ble det funnet at monoclonale antistoffer som reagerer med antigeniske determinanter forskjellige fra hverandre burde kombineres som de to antistoffer anvendt ved sandwich-metoden. Det vil si at kombinasjoner av 5C4 og 5C2 eller Kl og 5B3 monoclonale antistoffer i det foregående eksempel kan selekteres. Den foreliggende oppfinnelse er således egnet til å tilveiebringe en fremgangsmåte for bedømmelse av basisk fetoprotein basert på disse funn.

Oppfinnelsen har således tilveiebragt en meget følsom metode for bestemmelse av basisk fetoprotein ved hjelp av en sandwich-metode på grunnlag av en teknikk for seleksjon av monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som reagerer med antigeniske determinanter forskjellige fra hverandre som de to antistoffer anvendt ved sandwich-metoden for dermed å oppnå oppfinnelsens formål.

Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert.

Som.tidligere nevnt er det basiske fetoprotein som bestemmes ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse et basisk protein med molekylvekt på 73.000 og et isoelektrisk punkt på 9,3 og som vandrer i T-globulin-området ved elektroforese og tjener som en tumor-markør med en lav organ-spesifisitet. Monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som anvendes ved oppfinnelsen kan f.eks. fremstilles på følgende måte. Antistoff-dannende celler oppnådd fra en BALB/C mus som er sensitivert med basisk fetoprotein fusjoneres med myelom-celler, P3-X63-Ag8-Ul ved en variant av metoden angitt av Herzenberg et al. Deretter ble antistoffinnholdet av de fusjonerte celler selektert ved hjelp av et HAT-medium bestemt ved plate-bindings-bestemmelse ved bruk av basisk fetoprotein merket

125

med I. Noen cellestammer som viste høyt antistoff innhold oppnås ved kloning av fusjonerte celler som fremviser et høyt antistoffinnhold og utmerket formering ved begrensende fortynning. Endelig blir hver således oppnådd cellestamme transplantert inn i abdominal-hulrommet i en mus og dens hydroperitoneum oppnådd på

denne måte utsaltes med ammoniumsulfat, dialyseres og underkastes DEAE-cellulose-kolonne-kromatogragering for å samle en IgG-komponent, slik at man oppnår noen monoclonale antistoffer som er tilgjengelige ved den foreliggende oppfinnelse. De således oppnådde monoclonale antistoffer kan klassifiseres til tre typer tilsvarende de tre antigeniske determinanter av basisk fetoprotein ved hjelp av MO og EIA metoder som beskrevet i det følgende.

MO- metode:

Blandinger av alle kombinasjoner av to monoclonale antistoffer i et forhold på 1:1 fremstilles. Dannelse av en sedimenteringslinje og nærvær av fusjonering mellom disse blandinger og basisk fetoprotein iakttas ved hjelp av MO-metoden. Når en klar sedimenteringslinje iakttas blir de monoclonale antistoffer som utgjør blandingen klassifisert i forskjellige grupper som reagerer med antigeniske determinanter som er forskjellige fra hverandre. På den annen side, når ingen sedimenteringslinje iakttas, hører de til den samme gruppe som reagerer med en antigenisk determinant. Når en uklar sedimenteringslinje gjør det umulig å foreta en klar bedømmelse, kan den

følgende EIA-metode anvendes.

EIA- metode:

Metoden i eksempel 1 følges med unntagelse av at to monoclonale antistoffer som er vilkårlig valgt anvendes i stedet for Kl og 5C2 antistoffer for fremstilling av reagenser av hver kombinasjon av de monoclonale antistoffer. Farveverdien (0D.o(- ) bestemmes ved hjelp

405nm J *

av EIA-operasjoner. Når farving iakttas blir de monoclonale antistoffer som utgjør kombinasjonen klassifisert til forskjellige grupper som reagerer med antigeniske determinanter som er forskjellige fra hverandre. I motsetning dertil, når ingen farving iakttas, hører de til den samme gruppe som reagerer med en antigenisk determinant.

De monoclonale antistoffer kan således klassifiseres til tre grupper tilsvarende de tre forskjellige typer av antigeniske determinanter av basisk fetoprotein ved hjelp av MO og EIA metodene.

Fremgangsmåten for bestemmelse i samsvar med oppfinnelsen skal nå beskrives detaljert.

Fremgangsmåten for bedømmelse i samsvar med oppfinnelsen

er en sandwich-metode med bruk av to antistoffer og som gjennomføres ved å utnytte enten enzym-immunobestemmelse eller radio-immunobestemmelse. Vanlige metoder for disse bestemmelser er i og for seg velkjente. Fremgangsmåten med bestemmelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse ved hjelp av enzym-immunobestemmelse kan gjennomføres som følger.

Hele bestemmelsessystemet består av en fast fase, et antigen for belegning av den faste fase (det første antigen) basisk fetoprotein (et standard antigen og testserum), et markør-antistoff (det annet antistoff),

et enzym og et substrat. En fordypning i en mikrotiter-

plate for enzym-immunobestemmelse kan anvendes som den faste fase. Før bestemmelsen selekteres et av de monoclonale antistoffer ved oppfinnelsen vilkårlig som antistoffet for belegning av den faste fase (dvs. det første antistoff), oppløst i en 0,1 M fosfatbuffer-fysiologisk saltløsning (pH 7,2) til å gi en proteinkonsentrasjon på ODOOApå 0,050, lagret f.eks. i en

280 nm ^

polystyrenfordypning for enzym-immunobestemmelse og som fikk stå over natten ved 4°C for derved å belegge overflaten av den faste fase med det første antigen. Det standard antigen kan fremstilles ved rensing av hydroperitoneum oppnådd fra en pasient som lider av heptaton for fremstilling av renset basisk fetoprotein og fortynning av dette til en viss konsentrasjon med et standard antigen-fortynningsmiddel.

Et foretrukket markør-antistoff (dvs. det annet antistoff) er et monoclonalt antistoff ved den foreliggende oppfinnelse som reagerer med en antigenisk determinant forskjellig fra den med hvilken det første antistoff reagerer. Eksempel på tilgjengelige enzymer er alkali-fosfatase, glukoseoksydase, peroksydase og 3-galactosidase. Før bestemmelsen kan markør-antistoffet bindes til

enzymet ved hjelp av et bindingsmiddel som f.eks. glutaraldehyd til å danne et konjugat som kan anvendes som en del av reagenset som anvendes ved oppfinnelsen. Substratet kan vilkårlig selekteres avhengig av det

enzym som skal anvendes. F.eks. kan p-nitrofenylfosfat anvendes når alkalifosfatase selekteres som enzymet.

Bestemmelsen kan gjennomføres på en konvensjonell måte

ved enzym-immunobestemmelse. Som vist i de etterfølgende eksempler kan bestemmelsen gjennomføres ved å innføre et standard antigen eller testserum i en fordypning belagt med et første antistoff for inkubasjon, deretter tilsettes et enzym-markørantistoff (f.eks. det annet antistoff/alkalifosfatasekonjugat) for inkubasjon, til slutt tilsettes substratet (f.eks. p-nitrofenylfosfat) for inkubasjon og mengden av et spaltet substrat bestemmes

ved hjelp av et spektrofotometer.

Det første antistoff som anvendes for belegging av den faste fase kan enten være et enkelt monoclonalt antistoff eller en blanding av flere monoclonale antistoffer. Dvs. at den bestemmende faktor ved den foreliggende oppfinnelse ikke er om det første og det annet antistoff består av et enkelt eller flere monoclonale antistoffer så lenge det første og det annet antistoff reagerer med antigeniske determinanter som er forskjellige fra hverandre.

Som vist i forsøkseksemplet som beskrevet i det følgende

er fremgangsmåten for bestemmelsen i samsvar med oppfinnelsenkarakterisert vedat lignende effekter kan oppnås ved bestemmelse av farveverdien for det standard antigen og verdien for basisk fetoprotein (BFP-verdi)

i normalt humanserum som de effekter som oppnås ved anvendelse av polyclonale antistoffer.

Reagenset i samsvar med oppfinnelsen er direkte tilgjengelig for den nevnte fremgangsmåte for bestemmelse i samsvar med oppfinnelsen for å oppnå det samme formål som fremgangsmåten. Følgelig kan reagenset anvendes ved sandwich-metoden med bruk av to antistoffer ved å

utnytte fordelen med enten enzym-immunobestemmelse eller radio-immunobestemmelse. I det følgende skal det beskrives et eksempel på en utførelsesform av reagenset i samsvar med oppfinnelsen anvendt ved enzym-immunobestemmelse. Reagenset i samsvar med oppfinnelsen er et sett som hovedsakelig består av et antistoff for belegging av en fast fase (dvs. det første antistoff) og et markørantistoff (dvs. det annet antistoff) eventuelt med annen eller andre komponenter valgt fra en fast fase, et standard antigen, et enzym og et substrat. Når en fast fase inkluderes i settet kan den nevnte faste fase overtrekkes med et første antigen. Når et enzym inkluderes i settet kan dette enzym bindes til det annet antistoff for å danne et konjugat dermed. Disse sett kan også refereres til som reagenset i samsvar med oppfinnelsen.

Videre kan andre midler egnet for gjennomføring av bestemmelse på en grei måte, f.eks. et antigen-fortynningsmiddel, et reaksjons-fortynningsmiddel, en reaksjons-avsluttende oppløsning, en substrat-oppløsning eller en buffer-oppløsning, inkluderes i settet fritt valgt i avhengighet av forholdene.

Oppfinnelsen skal også beskrives ved hjelp av den vedføyde figur som er beskrevet i forsøkseksempel 1 og er en grafisk fremstilling som viser samsvarighet mellom BFP-verdier hver bestemt ved bestemmelse med bruk av monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer og bestemmelse ved bruk av polyclonale antibasiske fetoproteinantistoffer.

For å illustrere oppfinnelsen gis følgende forsøks-eksempel.

Forsøkseksempel 1

Prøve:

Et første fastfase-antistoff og et enzym-markørantistoff ble fremstilt fra monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer på lignende måte som beskrevet i eksempel 1

i det følgende.

På den annen side ble et annet første fastfase-antistoff og et enzym-markørantistoff fremstilt fra polyclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer på følgende måte.

Serum som var separert fra blod oppnådd fra en kanin immunisert med basisk fetoprotein tre ganger ble saltet ut og renset ved hjelp av affinitets-kolonnekromatografering under anvendelse av basisk fetoprotein for derved å oppnå polyclonalt antibasisk fetoprotein. Deretter ble en del derav oppløst i en 0,1 M PB (pH 7,2) for å gi en proteinkonsentrasjon på 0D„o~på 0,05,helt ut i en1j-t- 280 nm ^

fordypning i en mikrotiterplate for enzymimmunobestemmelse

og ble satt bort over natten. Væsken ble fjernet og resten ble vasket med avmineralisert vann og tørket ved hjelp av en skåltørke til å gi et første fastfase-antistof f. En annen del av polyclonalt antibasisk fetoprotein ble blandet med alkalifosfatase til å gi en konsentrasjon på omtrent 1 mg/ml og 2% glutaraldehyd ble tilsatt sakte til å gi endelig konsentrasjon på

0,2%. Etter at blandingen hadde fått reagere i 30 min.

ved romtemperatur ble reaksjonsblandingen dialysert mot en 0,05 M Tris hydroklorid-bufferoppløsning og 100%

NRS ble tilsatt til å gi en endelig konsentrasjon på 25%. Etter tilpasning til en optimal konsentrasjon ved en

0,05 M Tris hydroklorid-bufferoppløsning (pH 8,0) som inneholdt 10% NRS, ImM MgCl2og 0,9%iNaCl, ble det oppnådd et enzym-markørantistoff.

Reaksjons-fortynningsmidler fremstilt på lignende måte

som beskrevet i eksempel 1 ble anvendt i et system med bruk av monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer mens reaksjons-fortynningsmidler fremstilt på følgende måte ble anvendt i et system med bruk av polyclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer. Dvs. at normalt kaninserum, trinatriumetylendiamintetraacetat og natriumklorid ble tilsatt til en 0,1 M karbonat-bufferoppløsning

(pH 9,0) til å gi konsentrasjoner på 12% (20% når et standard antigen ble fortynnet), henhv. 10 mM og 0,9%.

En substratoppløsning og en reaksjons-avsluttende oppløsning ble fremstilt på samme mpte som beskrevet i eksempel 1. 180 eksempler på normalt humanserum og 19 eksempler på serum fra cancerpasienter ble fremstilt som prøver.

Metode:

BFP-verdier (ng/ml) av alle prøver ble bestemt ved bestemmelse med bruk av monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer henhv. polyclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer på følgende måte.

En prøve og et standard antigen med en kjent konsentrasjon ble fortynnet 11 ganger med et reaksjons-fortynningsmiddel og helt inn i fordypninger som på forhånd var blitt vasket med 100 ul porsjoner og inkubert i en time ved 37°C. Etter vasking med destillert vann ble 100 ul av et enzym-markørantistoff med optimal konsentrasjon tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Etter fornyet vasking med destillert vann ble 100 ul av en substratoppløsning tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Deretter ble 100 ml av en 1 N NaOH tilsatt for å stanse reaksjonen og den optimale densitet ble bestemt ved 405 mm (OD.„n N

405nm)

for beregning av BFP-verdien.

Resultater:

Figur 1 viser resultatet. I figur 1 refererer abscissen til BFP-verdien bestemt ved bruk av monoclonale antibasiske fetoproteinantistoffer, mens ordinaten refererer til BFP-verdien bestemt med bruk av polyclonale antibasiske fetoproteinantistoffer. Følgelig er figur 1 en grafisk fremstilling som viser samsvarigheten mellom disse BFP-verdier. Ligningen for regresjonslinjen i den grafiske fremstilling er y = 1,016 x + 0,06 og korrelasjons-koeffisienten y er 0,981. Disse BFP-verdier viser således en utmerket korrelasjon med hverandre, som antyder at fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan medføre et lignende resultat som det som oppnås ved bestemmelse med bruk av polyclonale antistoffer.

For ytterligere illustrering av oppfinnelsen gis de følgende eksempler.

Eksempel 1

Til 5 ml porsjoner av muse-hydroperitoneum som hver inneholdt monoclonale antistoffer Kl og 5C2 som reagerte med antigeniske determinanter i basisk fetoprotein forskjellige fra hverandre, en mettet ammoniumsulfat-oppløsning (4,05 M) ble tilsatt til å gi en endelig konsentrasjon på 1,8 M og ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Hver blanding ble sentrifugert ved 12.000 omdreininger pr. minutt i 20 min. for derved å separere precipitat fra supernatant. Precipitatet ble oppløst i 3 ml av en 0,01 M PBS (pH 8,0) og dialysert mot bufferoppløsningen anvendt for å oppløse precipitatet. Dialysatet ble helt inn i en DEAE-cellulosekolonne for eluering av IgG-komponenten med en 0,1 M PB (pH 8,0). Den eluerte IgG-komponent ble konsentrert ved hjelp av en collodium-pakke (molekylvekt 75.000) for fremstilling av Kl og 5C2. Kl ble oppløst i en 0,1 M PB (pH 7,2) til å gi en proteinkonsentrasjon på OD280nmP^ 0/05 ogoppløsningen ble helt inn i fordypningen i en mikrotiterplate for enzym-immunobestemmelse og fikk stå over natten. Etter fjernelse av væsken ble resten vasket med avmineralisert vann og tørket ved hjelp av skåltørke til å gi et første fastfase-antistoff.

På den annen side ble 5C2 og alkali-fosfatase

(500 U/ml) dialysert mot en 0,075 M PBS. IgG-komponenten ble blandet med alkalifosfatase til å gi en konsentrasjon på omtrent 1 mg/ml og en 2% glutaraldehyd-løsning ble sakte tilsatt ved hjelp av en mikro-byrette til å gi en endelig konsentrasjon på 0,2%. Blandingen fikk reagere ved romtemperatur i 30 min. og ble dialysert mot en 0,05 M Tris hydroklorid-buffer-oppløsning (pH 8,0). Etter tilsetning av 100% NRS til å gi en endelig konsentrasjon på 25% og kalibrering ble den resulterende oppløsning frysetørket til å gi et enzym-markør-antistoff.

Separat ble reaksjons-fortynningsmiddel, en substrat-oppløsning, en reaksjons-avsluttende oppløsning og standard antigen-fortynningsmidler fremstilt på følgende måte.

Normalt kaninserum, normalt museserum (inaktivert ved 56°C i 30 min.), trinatrium-metylendiamintetraeddiksyre, natriumklorid og natriumtriazid tilsatt til en 0,05 M Tris hydrokloridbufferoppløsning (pH 8,0) til å gi konsentrasjoner på henhv. 11,8%, 2%, lOmM, 015 M og 0,1% for derved å fremstille reaksjons-fortynningsmidler.

p-nitrofenylfosfat ble tilsatt til en 0,05 M karbonat-buf f eroppløsning (pH 9,4) inneholdende 2 mM MgC^ til å

gi en konsentrasjon på 4 mg/ml for derved å fremstille en substratoppløsning. 1 N-NaOh ble fremstilt som en reaksjons-avsluttende løsning.

Normalt museserum (inaktivert ved 50°C i 30 min.), trinatriummetylendiamintetraacetat, natriumklorid og natrium-triazid ble tilsatt til en 0,05 M Tris hydroklorid-bufferoppløsning (pH 8,0) til å gi konsentrasjoner på henhv. 18,1%, 10 mM, 0,15 m og 0,1%

for fremstilling av standard antigen-fortynningsmidler.

Følgelig ble et sett bestående av det i det foregående nevnte første fastfaseantistoff, enzym-markørantistoff, reaksj onsfortynningsmidler, substratoppløsning, reaksjonsavsluttende oppløsning og standard antigen-fortynningsmidler og frysetørket hydroperitoneum av en hepatonpasient som ble anvendt som et standard antigen, oppnådd som et reagens i samsvar med den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 2

Monoklonalt antistoff 5C2 ble oppløst i en 0,05 M fosfat-bufferoppløsning (pH 7,5) til å gi en proteinkonsentrasjon på 1 mg/ml. Til 10 ul av den oppnådde oppløsning, 50 pl

125

av 1 mCi av I-Na og 10 pl av en oppløsning fremstilt ved oppløsning av kloramin T i den nevnte fosfatbuffer-oppløsning til å gi en konsentrasjon på 1,5 mg/ml ble tilsatt i rekkefølge og reaksjonsblandingen ble omrørt i 30 sek. Deretter ble 100 p. 1 av en oppløsning fremstilt ved å oppløse natriummetabisulfitt i den nevnte fosfat-

bufferoppløsning til å gi en konsentrasjon på 2 mg/ml tilsatt for å stanse reaksjonen. Til reaksjonsvæsken ble 100 ul av en oppløsning fremstilt ved å oppløse kaliumjodid i den nevnte fosfatbufferoppløsning til å gi en konsentrasjon på 10 mg/ml tilsatt og reaksjonsblandingen ble med en gang underkastet gel-filtrering med "Sephadex G-50" for derved å separere substansen merket

125 12 5

med I fra I. Spesifikk radioaktivitet av substansen merket med<125>I oppnå. dd på denne måte ■ var omtrent 5 til 20 pCi/ug.

125 Det annet antistoff merket med I oppnådd på denne måte ble kombinert med det første fastfase-antistoff fremstilt på samme måte som beskrevet i eksempel 1 til å gi reagenset i samsvar med oppfinnelsen for radioimmuno-bestemmelse.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av basisk fetoprotein ved hjelp av sandwich-metoden under anvendelse av to antistoffer, karakterisert vedat de nevnte to antistoffer selekteres fra monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som hvert reagerer med antigeniske determinanter av det basiske fetoprotein som er forskjellige fra hverandre.

2. Reagens for bestemmelse av basisk fetoprotein ved hjelp av sandwich-metoden under anvendelse av to antistoffer,karakterisert vedat de to antistoffer er selektert fra monoclonale antibasiske fetoprotein-antistoffer som hvert reagerer med antigeniske determinanter av det basiske fetoprotein som er forskjellige fra hverandre.