JPH02236452A - 活性化ヒトプロテインｃとヒトプロテインｃインヒビターの複合体の測定方法および測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は活性化ヒトプロテインＣとヒトプロテインＣイ
ンヒビターの複合体（以下ＡＰＣ−ＰＣＩＣｏｍｐｌｅ
ｘまたはＣＩＣと略記する）の測定方法および測定試薬
に関する。さらに詳し《は、ＡＰＣＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌ
ｅｘ　（ＣＩＣ）を二抗体サンドイッチ法を利用する酵
素免疫測定法によって測定する測定方法および測定試薬
に関する。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする課題〕ヒトプ
ロテインＣ（以下ＰＣと略記する）はビタミンＫ依存性
血漿蛋白質の一つで、糖含量２３％の二本鎖から成る分
子量約６２０００の蛋白質であり、血液凝固の生理的制
御因子として、非常に重要な役割を果たしている。ＰＣ
は循環血液中では通常、不活性型の前駆酵素として存在
する。

なんらかの原因により凝固系が作動しトロンビンが生成
されると、トロンビンは速やかに血管内皮細胞表層に存
在するトロンボモジュリンと結合し、トロンビンートロ
ンボモジュリン複合体を形成する。ＰＣは、このトロン
ビンートロンポモジュリン複合体により活性化され、活
性化ヒトプロテインＣ（以下ＡＰＣと略記する）となる
。ＡＰＣは凝固反応の補酵素である活性化第■因子と活
性化第■因子を分解し凝固反応を制御する。

血液中にはＡＰＣに対するインヒビターとしてプロテイ
ンＣインヒビター（以下ＰＣＩ　と略記する）が存在す
る。ｐｃｒは分子量５７０００の一本鎖塘蛋白質で、Ａ
ＰＣと等モルのアシル結合による複合体を形成し、ＡＰ
Ｃを阻害する。

ヒトの血中ｐｃの測定法には、生物活性測定法と免疫学
的測定法とが報告されている。また、ＰＣＩについても
生物活性測定法と免疫学的測定法とが確立されている。

しかし、ＡＰＣ−Ｐｃｔ　Ｃｏｍ−ｐ．ｌｅｘ　（ＣＩ
Ｃ）の測定については未だ有用かつ実用的な方法ならび
に試薬が提供されていない。なお、ＰＣおよびＰＣＩの
精製および測定法について参考のために下記文献１）〜
３）を列挙する。

１）　　Ｓｕｚｕｋｉ　Ｋ．　Ｎｉｓｈｉｏｋａ　Ｊ．
　Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｓ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃ　
　ｒｎｈｉｂｉｔｏｒ，　　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　　ｆｒｏｍ■ｕｍａｎ　　Ｐｌａｓｍａ　　ａｎｄ　
　ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎＪ，　Ｂｉｏｌ．
　Ｃｈｅｍ．．　１９８３；２５８：１６３２）　　Ｓ
ｕｚｕｋｉ　Ｋ．　Ｓｔｅｎｆｌｏ　Ｊ．　Ｄａｈｌｂ
ａｃｋ　Ｂ．　Ｔｅｏｄｏｒｓｓｏｎ　　Ｂ．， Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｏａ
ｇｕｌａｔｉｏｎ　ＦｏｃｔｏｒＶ　　ｂｙ　　Ａｃｔ
ｉｖａｔｅｄ　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｃ，Ｊ．　Ｂｉｏ
ｌ．　Ｃｈｅｗ．　　１９８３；２５８：１９１８３）
鈴木　宏治， プロテインＣ， 臨床検査．　１９８４；２８：２５ さて、播種性血管内凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔ
ｅｄｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｃｏａｇｕｌａｔｉ
ｏｎ：　ＤＩＣと略す）とは、全身の主として細小血管
内に血栓が多発し、止血障害、血栓による諸臓器障害・
ショック・末梢循環不全を呈する病態である。ＤＩＣ発
症の基礎疾患としては、悪性腫瘍が４５．２％と最も多
く、次いで感染症、白血病、肝疾患の順となっており、
これらの疾患において早期にＤＩＣを発見し、早期に治
療することがＤＩＣに対する最善の対策である。

現在、ＤＩＣのスクリーニング方法としては、血小板数
、プロトロンビン時間、血漿フイブリノゲン・血清ＦＤ
Ｐ　（フィブリンーフィブリノゲン分解物）が測定され
ている。その他補助診断として、血漿アンチトロンビン
■、血漿α２−プラスミンインヒビターが測定されてい
る。また、ＤＩＣにおいては、ＰＣおよびＰＣＩが正常
人に比較して低下している。

しかしながら、これらのスクリーニング方法により早期
に旧Ｃを診断することは困難であり、より早期に診断を
可能とする臨床検査方法が求められていた。

〔課題を解決するための手段〕

かかる実情に鑑み本発明者は、ＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍ
−ｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）を簡便に測定することができ、
とりわけ臨床検査の場において多数の検体を同時に処理
することのできる実用的な方法を求めて検討を行った。

その結果、抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体（以
下抗ｐｃ抗体と略記する）および抗ヒトプロテインＣイ
ンヒビターモノクローナル抗体（以下抗ＰＣＩ抗体と略
記する）を使用する二抗体サンドイッチ酵素免疫測定法
を実施することにより課題が解決されることを見出し、
また、本発明試薬は、ｏｒｃの早期診断を可能とするこ
とも知るに至り、本発明を完成した。

即ち、本発明は、ＡＰＣ−Ｐｃｔ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（
ＣＩＣ）を二抗体サンドイツ千法を利用する酵素免疫測
定法によって測定するにあたり、当該測定に係わる固相
化用抗体として抗ＰＣＩ抗体を使用し、酵素標識抗体用
として抗ｐｃ抗体を使用することを特徴とする測定方法
、及びＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＣＩＣ）を二
抗体サンドイツ千法を利用する酵素免疫測定法によって
測定する試薬において、当該測定に係わる固相化用抗体
として抗ＰＣＩ抗体が含まれ、酵素標識抗体用として抗
ＰＣ抗体が含まれることを特徴とする測定試薬を提供す
るものである。

以下に本発明を詳細に説明する。

ＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）を二抗体
サンドイッチ酵素免疫測定法で測定するためには、ＡＰ
Ｃと反応する抗ＡＰＣ抗体と、ＰＣＩ　と反応する抗Ｐ
ＣＩ抗体が必要である。八ＰＣとｐｃは共通抗原性を持
つので抗ＰＣ抗体の使用が可能である。

本発明に係わる抗ｐｃ抗体は例えば次のように製造され
るが、市販の抗ｐｃ抗体を使用することもできる。

まずＰＣを用意する。このためにはヒト血漿にバリウム
塩を加えて沈澱後、エチレンジアミン四酢酸塩（ＥＤＴ
Ａ）　溶出し、ＤＥＡε−Ｓｅｐｈａｃｅｌ、ｔｌｅｐ
ａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製する。精製方
法は前記文献２）に詳細に述べられている。

用意したＰＣ　５０　ｕ１１を同容量のフロイント完全
アジュバントと共にＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与
し、さらに１５μｓを２週間後に尾静脈内へ投与し、３
日後に牌臓細胞を採取し、Ｘｏｈ１ｅｒ　ａｎｄＭｉｌ
ｓｔｅｉｎの方法（下記文献４）参照）によりミエロー
マ細胞株Ｐ３Ｕｌと細胞融合し、限界希釈法により３回
クローニングを行い、抗ＰＣ抗体産生セルラインとして
確立される。

本発明に係わるモノクローナル抗Ｐｃｒ抗体は次のよう
に製造される。

まずＰＣＩを用意する。このためにはヒト血漿にバリウ
ム塩を加え、ＰＣなどのビタミンＫ依存性蛋白質を除き
、その上清にＰＥＧ−６０００を加え、その沈澱を集め
、溶出し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，硫酸アンモ
ニウム分画、Ｄｅｘｔｒａｎ　Ｓｕｌ．ｆａｔｅ−Ａｇ
ａｒｏｓｅＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，υｌｔｒｏ
ｇｅｌ　ＡｃＡ４４、ＤＥＡＲ−ＳｅｐｈａｃｅｌＣｈ
ｒｏｍａ　ｔｏｇｒａｐｈｙにより精製する。精製方法
は前記文献１）に詳細に述べられている。

用意したＰＣＩ　５０Ｉｌ，ｙを同容量のフロイント完
全アジュバントと共にＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投
与し、さらにＬ５μ９を２週間後に尾静脈内へ投与し、
３日後に肺臓細胞を採取し、Ｋｉｊｈｌｅｒ　ａｎｄＭ
ｉｌｓｔｅｊｎの方法（下記文献４）参照）によりミエ
ローマ細胞株Ｐ３Ｕ１と細胞融合し、限界希釈法により
３回クローニングを行い、抗ＰＣＩ抗体産生セルライン
として確立される。

４）　　Ｋ６ｈｌｅｒ　Ｇ．　Ｍｆｌｓｔｅｔｎ　Ｃ．
，Ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ　ａ
ｎｄ　ｔｕｍｏｒ　ｌｉｎｅｓ　ｂｙ　ｃｅｌｌ　ｆｕ
ｓｉｏｎ＋Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，　１９
７６；６：５１１次に本発明における二抗体サンドイッ
チ法を利用するＡＰＩ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（Ｃ
ＩＣ）の酵素免疫測定法は次のように実施される。

測定系全体の構成要素は固相、固相コート用の抗ＰＣＩ
抗体（第一抗体）、標準抗原、標識用抗ｐｃ抗体（第二
抗体）、酵素および基質である。

固相としては、例えばエンザイムイムノアッセイ用マイ
クロタイタープレートのウェルあるいはボリスチレン等
のプラスチックビーズを用いればよい。測定に先立ち抗
ＰＣＩモノクローナル抗体を炭酸緩衝液に溶解し、４゜
Ｃで一夜放置すれば固相表面はコートされる。しかし、
モノクローナル抗体によってコートされていない表面部
分もあるので、この部分に対しては牛血清アルブミンを
リン酸緩衝液に溶解してウェルに加え、二時間室温に放
置して牛血清アルブミンによってコートする。

酵素標識抗ｐｃ抗体（抗ｐｃ抗体はｒ抗ヒトプロテイン
ＣＪとしてバイオスコット社一コスモ・バイオ株式会社
販売より人手することもできる）は次のように製造すれ
ば良い。酵素としてはアルカリホスファターゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、ベルオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ等を使用することができる。測定に先立ち、酵素
を抗ＰＣ抗体にグルタールアルデヒド、あるいはマレイ
ミド化合物により結合せしめてコンジュゲートとし、本
発明の測定方法の実施のための試薬の一部として予め準
備しておくことができる。結合方法は、例えば下記文献
５）のマレイミド法により標識すれば良い。

５）　　ＹｏｓｈｉＬａｋｅ　Ｓ．　Ｉｍａｇａｗａ　
Ｍ．　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｅ．　ｅｔａｌ．，　Ｍｉｌ
ｄ　ａｎｄ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉ
ｏｎ　ｏｆＲａｂｂｉｔ　Ｆａｂ’　ａｎｄ　Ｉｌｏｒ
ｓｅｒａｄｉｓｈ　ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＬｌｓｉｎｇ
　ａ　Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ａｎｄ
　Ｉｔｓ　ＩＪｓｅｆｏｒ　Ｅｎｚｙｍｅ　　Ｉｍｍｕ
ｎｏａｓｓａｙ，Ｊ．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．．　　１９
８２；９２：１４１３基質は選択した酵素に応じて適宜
使用すれば良い。例えば酵素としてアルカリフオスファ
ターゼを選択した場合においてｐ一二トロフエニルフォ
スフェートを、またベルオキシダーゼを選択した場合に
おいては０−フエニレンジアミン、あるいはＡＢＴＳ　
（２．２゜−アジノービス（３′一エチルベンゾチアゾ
リンスルホン酸））を発色剤として使用し、過酸化水素
を基質として使用すれば良い。

測定は二抗体サンドイッチ法を利用する酵素免疫測定法
における手順に従って行う。測定に先立って血清、血漿
等の検体の前処理としてバリウム塩を添加する。添加後
１時間撹拌し遠心分離して沈澱を得る。この操作により
γ一カルボキシグルタミン酸を有するＰＣ，　ＡＰＣ，
ΔＰＣ−ＰＣＩＣｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）はバリウム
塩と結合して沈澱し、検体中の大部分の未反応のＰＣＩ
は上清に残り、ＡＰＣ−Ｐｃｔ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（Ｃ
ＩＣ）と分離される。この操作を行わない場合には、大
部分の未反応のＰＣＩが固相の抗ＰＣＩ抗体と反応する
ために八ＰＣ−ＰＣＩＣｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）の測
定は不可能である。沈澱にＥＤＴＡ含有トリス緩衝液を
加えて溶解し検体とする。検体の測定は後記実施例に示
されるごとく抗ＰＣＩ抗体をコートした固相に検体を加
えてインキエベートする。固相を洗浄後、酵素標識抗Ｐ
Ｃ抗体を加えて再びインキエヘートし、洗浄し、最後に
基質を加えてインキユベートする。反応を停止せしめて
から、基質の分解量を分光光度計を用いて測定する。

次に、本発明の測定試薬は本発明の測定方法の実施に直
接使用する試薬であり、測定方法におけると同一の目的
を達成するものである。従って本発明測定試薬の具体的
態様を示せば次のごとくなる。

即ち、本発明測定試薬は固相化抗ＰＣＩ抗体、酵素標識
抗ｐｃ抗体を必須の構成要素として含み、また測定の実
施の便益のために適当なる標準抗原、前処理剤、抗原希
釈液、反応溶液、基質、基質溶解液、反応停止液等がセ
ット中に添付されることは自由であり、これらは本発明
を限定するものではない。

後記実験例によって示されるごとく、本発明測定試薬に
よって旧Ｃの早期診断が可能であり、本発明測定試薬は
ＤＩＣの診断試薬として使用することができる。

本発明の効果は次のごとく要約される。

まず本発明は従来測定が不可能であったＡＰＣ−ＰＣＩ
　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）を、二抗体サンドイツ千
法を利用する酵素免疫測定法により測定するものであり
、操作が単純簡明であり、臨床検査の場に対して実用性
が高い。また、ＤＩＣないし深部静脈血栓の早期診断を
可能とする。

〔実施例］ 以下に記載する実施例をもって本発明を更に具体的に説
明する。

実施例１ １）新鮮血漿４ｌに塩酸ペンザミジン（　１０ｎ＋Ｍ）
、フルオロリン酸ジイソプ口ピル（ＤＦＰ）　（１ｍＭ
）、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）　（
１ｍＭ）およびダイズトリブシンインヒビター（５０ｍ
ｇ／ｌ）を加え、ＬＭ　ＢａＣｌｇを３２０一滴下した
。

以下の精製操作は、すべて４゜Ｃで行った。１時間撹拌
後、５０００回転で３０分間遠心し、上清を採取し固形
ＰＥＧ−６０００を６０ｇ／　１加えた。１時間撹拌後
、５０００回転で１５分間遠心し、沈澱を廃棄した。更
に上清に固形ＰＥＧ−６０００を６０ｇ／　１加え、１
時間撹拌後、５０００回転で３０分間遠心し沈澱を採取
した。沈澱に０．０５Ｍ　　｝リスー塩酸緩衝液ｐＨ７
．５（０．１Ｍ　，ＮＩＩ４Ｇ！、塩酸ペンザミジン（
１０ｍＭ）　、ＤＦＰ（１ｍＭ）、ＰＭＳＦ　（１ｎ＋
Ｍ）　）を５００　ｍＺ加えて溶解した。溶解に使用し
た緩衝液と同一の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−６Ｂカラムにかけ、素通り画分を
採取した。採取液に硫酸アンモニウム粉末を加えて５０
％飽和とし、１時間撹拌後、８０００回転で１５分間遠
心し、上清を採取した。更に硫酸アンモニウム粉末を加
えて７０％飽和とし、１時間撹拌後、８０００回転で３
０分間遠心し、沈澱を採取した。

沈澱に０．０５Ｍ　ｌ−リスー塩酸緩衝液ｐＨ７．０　
（０．１Ｍ　ＮａＣｌ、塩酸ペンザミジン（１１）、叶
Ｐ　（０．１ｍＭ）　、ＰＭＳＦ（０．１ｍＭ））を加
えて溶解し、同一緩衝液に対して透析した。Ｄｅｘｔｒ
ａｎ　ＳｕｌｆａｔｅＡｇａｒｏｓｅ力ラムにかけ、Ｐ
ＣＩ画分に硫酸アンモニウム粉末を加えて８０％飽和と
した。１００００回転で１５分間遠心し沈澱を採取し、
溶解可能な最小液量の０．０５Ｍ　　ｌ−リスー塩酸緩
衝液ｐｌｌ７．５（０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）に溶解した
後、ＡｃＡ−４４　Ｌｌｌｔｒｏｇｅｌカラムにかけ、
Ｐｃｔ両分を集め０．０５Ｍ　　ｌ−リス塩酸緩衝液ｐ
ｌｌ９．０に透析した。透析後、ＤＥ且Ｓｅｐｈａｃｅ
ｌにかけ、精製ＰＣＩを得た。その最終回収率は９％で
あった。

２）　精製したＰＣＩ　５０ｐｙを同容量のフロイント
完全アジュバントと共にＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８
週齢）の腹腔内に投与し、更に１５μ９を２週間後に尾
静脈内へ投与し、３日後に牌臓細胞を摘出し、ミエロー
マ細胞株Ｐ３ｔｌｌと細胞融合した。細胞融合はポリエ
チレングリコール４０００を用いてκｉｊｈｌｅｒ　ａ
ｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（文献４））で行った。

次に９６ウエルマイクロプレートを用いて限界希釈法に
よりＰＣｉ　と反応するハイブリドーマを３回クローニ
ングし、抗ＰＣＩ抗体産生セルラインとして確立した。

セルラインの保存培地としては牛胎児血清を１０％に含
むＲＰＭＩ１．６４０培地を使用した。セルラインより
モノクローナル抗ＰＣＩ抗体を常法により得た。

３）　得られた抗ＰＣＩ抗体をＯ．　ＩＭ炭酸緩衝液ｐ
Ｈ９．３で３μ９／ＩＩ１７に希釈し、９６ウエルマイ
クロプレートに１ウエルにつき１００〃ずつ注入し、４
゜Ｃで一夜放置した。０．０５Ｍ　　トＩＪスー塩酸緩
衝液ｐＨ７．５　（０．２Ｍ　ＮａＣｌ、０．５％牛血
清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５
ｍＭ　ＥＤＴＡ　，　０．０２％チメロサル）で三回洗
浄後、５％牛血清アルブミン（０．５％ゼラチン、リン
酸緩衝液ｐｉｆ７．５）１５０４を注入して２時間放置
し、前記緩衝液で三回洗浄して、抗体コート固相を用意
した。

実施例２ １）新鮮血漿４．，１４２に塩酸ペンザミジン（１０ｍ
Ｍ）、ＤＦＰ　（１＋ｓＭ）　、ＰＭＳＦ　（ＬｍＭ）
およびダイズトリブシンインヒビター（５０ｍｇ／　ｌ
　）を加え、ＩＭ　ＢａＣ１，を３５０　ｍ７滴下した
。以下の精製操作はすべて４゜Ｃで行った．１時間撹拌
後、５０００回転で３０分間遠心し、沈澱を採取した。

沈澱に０．１５ＭＮａＣｌ　（　５　ｍＭ塩酸ペンザミ
ジン）　ｐＨ７．４を７００一加えて二回洗浄した。バ
リウム塩に吸着した蛋白質は、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐ
ｔ！７．４　（５ｍＭ塩酸ベンザミジン、０．１ｍＭ　
ＤＦＰ）を６６０一添加することにより溶出した。懸濁
液を１時間撹拌後、５０００回転で３０分間遠心し、沈
澱を除去した。上清を０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ｝１６．
０　（１ｍＭ塩酸ペンザミジン）に透析したのち、透析
に使用した緩衝液と同一の緩衝液で平衡化したＤＥ八Ｅ
−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムにかけ、０．１Ｍから０．７
Ｍ　ＮａＣ１までの直線的濃度勾配（０．１Ｍリン酸緩
衝液ｐＨ６．０　、１１塩酸ベンザミジン）で溶出し、
ＰＣ画分を採取した。採取液を０．０５Ｍ　　トリスー
塩酸緩衝液ｐＨ８．０　（１ｍＭ塩酸ペンザミジン）に
対して透析した。透析後、叶Ｐを１＋Ｍになるように、
ＰＭＳＦを０．１１になるように添加した。０．０５Ｍ
　　｝リスー塩酸緩衝液ｐＨ８．０（１ｍＭ塩酸ペンザ
ミジン）で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラ
ムにかけ、ＯＭから０，５Ｍ　ＮａＣ１まで直線的濃度
勾配（０．０５６　トリスー塩酸緩衝液ｐｆ＋８．０　
、１ｍＭ塩酸ペンザミジン、２ｍＭ　ＣａＣｌｇ）で溶
出し、ｐｃ画分を採取した。採取液を５０ｍＭイミダゾ
ール緩衝液ｐＨ６．０　（１ｍＭ塩酸ベンザミジン）に
透析した。透析により生じた沈澱を２００００回転で１
０分間遠心して除去した。上清にＣａＣｌ２を２ｍＭに
なるように加え、５０ｍＭイミダゾール緩衝液ｐｉｌ６
．０（１ｍＭ塩酸ペンザミジン、２ｍＭ　ＣａＣ］．ｚ
）で平衡化したｆｌｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
カラムにかけ、０閃から０．８Ｍ　ＮａＣ１まで直線的
濃度勾配（５０＋ｎＭイミダゾール緩衝液ｐＨ６．０　
、１１ｍＭ塩酸ベンザミジン）で溶出し、精製ＰＣを採
取した。その最終回収率は２５％であった。

２）　精製したＰＣ　５０μ９を同容量のフロイント完
全アジュバンドと共にＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、８遇
齢）の腹腔内に投与し、更に１５μ３を２週間後に尾静
脈内へ投与し、３日後に肺臓細胞を摘出し、ミエローマ
細胞株Ｐ３υ１と細胞融合した。細胞融合はポリエチレ
ングリコール４０００を用いてκｉｊｈｌｅｒ　ａｎｄ
　Ｍｉｌｓｔｅｉｎの方法（文献４））で行った。次に
９６ウエルマイクロプレートを用いて限界希釈法により
ｐｃと反応するハイブリドーマを３回クローニングし、
抗ＰＣ抗体産生セルラインとして確立した。セルライン
の保存培地としては牛胎児血清を１０％に含むＩ？ＰＭ
Ｉ１６４０培地を使用した。セルラインよりモノクロー
ナル抗ＰＣ抗体を常法により得た。

３）抗ｐｃ抗体５ｌＩｇを０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐｌ＋４
．２で透析した後、ブタ胃・ペブシン０．２ｎ＋ｇを加
え３７゜Ｃで２４時間インキユヘートした。ｐｌ＋を７
．０に合わせた後、Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４カラ
ムにかけて０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０でゲル濾過
を行い、Ｆ（ａｂ’），を得る。Ｆ（ａｂ’）ｚ　を０
．１Ｍリン酸緩衝液ｐｕｅ．ｏに透析した後、０．１Ｍ
メルカプトエチルアミン（０．１Ｍリン酸緩衝液ｐ［＋
６．０，　５ｍＭ　ＥＤＴ八）５０４を添加し３７゜Ｃ
で９０分間インキユベートした。０．１Ｍリン酸緩衝液
ｐＨ６．０（５ｍＭ　ＩＥＤＴＡ）で平衡化したＳｅｐ
ｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムに通して透析を行い、Ｆａｂ
−ＳＨを得た。一方、酵素として西洋ワサビ・ベルオキ
シダーゼ（ＩＩＲＰと略す）　２ｍｇを０．１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、Ｎ−スクシンイミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）一シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート０．７ｍｇ　（Ｎ，Ｎジメチルホルムア
ミドに溶解する）を添加し３０″Ｃで６０分間インキユ
ベートした。０．１　Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．０で平衡
化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムに通して透析を
行い、マレイミド化ＨＲＰを得た．　Ｆａｂ−ＳＨとマ
レイミド化ＨＲＰとを混合して４　’Ｃで一夜間インキ
ユベートし、０．１阿リン酸緩衝液ｐＨ６．５で平衡化
した０１　ｔｒｏｇｅｌＡｃＡ４４カラムでゲル濾過を
行いＩＩＲＰ標識抗ＰＣ抗体を得た． 実施例１で得られた抗体コート固相および実施例２で得
られた酵素標識抗体を組み合わせてセットとし、本発明
測定試薬とした。

実施例３ 被検血漿あるいは血清の前処理は、次のように行った。

血漿あるいは血清検体１５０４に０．３８％クエン酸ナ
トリウム（０．ＩＭ　Ｉ−リスー塩酸緩衝液ｐＨ７．５
　、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）　６００　ｕｌを加えた後
、１とＢａＣＩｚを６０ＩＪ１滴下し、１時間水冷下で
撹拌後、１５０００回転で５分間遠心し沈澱を得た．沈
澱に０．２Ｍ　ＥＤＴＡ　（０．１Ｍ　　トリスー塩酸
緩衝液ｐＨ７．５、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ）　ｓｏＪ！
１を加えて溶解し、アッセイ緩衝液として、０．０５Ｍ
　トリスー塩酸緩衝液ｐ｝１７．５（０．２Ｍ　ＮａＣ
１　、０．５％牛血清アルブミン、，０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ−２０、０．０５ｍＭ　ＥＤＴＡ　，　０．０２％
チメロサール）を２５０　Ｉ！Ｉ加え、そのうちの１０
０　ｍを被検検体として使用した。

実施例４ 実施例１における抗体コート固相に１ウエル当たり実施
例３の被検検体１００４を注入し、室温で一夜間インキ
ユベートする。０．０５１’！　　トリスー塩酸緩衝液
ｐＨ７．５　（０．２Ｍ　ＮａＣ１、０４５％牛血清ア
ルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０５ｍＭ
　ＥＤＴＡ　，０．０２％チメロサール）で三回洗浄後
、実施例２における酵素標識抗体１００４を加えて室温
で６０分間インキエーベートする。０．０５Ｍ　　トリ
スー塩酸緩衝液ｐｌｌ７．５　（０．２Ｍ　ＮａＣ１、
０．５％生血清アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２
０，　０．０５ｍＭ　［ｉＤＴＡ　．．０．０２％チメ
ロサール）で三回洗浄後、２ｍｇ／ａ／濃度のＯ−フェ
ニレンジアミン（クエン酸緩衝液ｐ　Ｈ　４　．　６　
５、０．０３％過酸化水素）　１００　［を加えて室温
に３０分間放置し、分光光度計により波長４９０ｎｍの
吸光度を測定する。

〔発明の効果） 以下に記載する実験例をもって本発明の効果を説明する
。

実験例１ 拭且互よ堕友汰 正常ヒト血漿１一当たりＩＭ　ＢａＣ１ｚ　０．４　ｍ
ｌを加えて水冷下６０分間撹拌し、＾ＰＣ−ＰＣＩ　Ｃ
ｏｍｐｌｅｘ（ＣＩＣ）を吸着除去した血漿（試料ａ）
を用意した。次に試料ａに、前記実施例２で得られたＰ
Ｃを活性化したＡＰＣと実施例１で得られたＰＣＩを反
応させて調製したＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（
ＣＩＣ）の標準品を１６０ｎｇ／一になるように加え、
標準抗原溶液とした。前記実施例３および４におけると
同じ手順に従って測定を行った。

猪一果 結果を図１に示す。図１の横軸は、被検検体中のＡＰＣ
−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）の濃度を表し、
縦軸は波長４９０ｎｍの吸光度値を表す。図１より本発
明はＡＰＣ−Ｐｃｔ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）に対
して特異性が高く、かつ検量性が良いことが判明した。

実験例２ 試料五圭堕方抜 ＤＩＣ患者血漿５０例、ワーファリン服用患者血漿１９
例、肝臓疾患患者血漿１０例および健康成人血漿２０例
について前記実施例３および４におけると同じ手順に従
って測定を行った。

猪一来 結果を図２に示す。図２の左欄は健康成人血漿について
であり、ＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣｒＣ）
の測定値の平均は０．５７ｎｇ／ｍ７であった。また、
ワ一ファリン服用患者血漿および肝臓疾患患者血漿の八
ＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（（ｊｃ）の測定値の
平均は、それぞれ０．３７ｎｇ／ｍ７、１．６４ｎｇ／
ｍ７であった。それに対して、ＤＩＣ患者血漿のＡＰＣ
−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＣＩＣ）の測定値の平均は
３．２３　ｎｇ／一であり、高い値を示し、ＤＩＣの診
断に有用であることが判明した。

実験例３ 試料並走版方汰 急性前骨髄球性白血病患者１例の経過観察を４０日にわ
たる長期間行い、ＦＤＰ　，　ＰＣＩ　，　ＰＣの測定
と同時に、前記実施例３および４におけると同じ手順に
従ってＡＰＣ−ＰＣＴ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）の
測定を行った。

叔一来 結果を図３に示す．ＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　
（ＣＴＣ）の測定値は、他の凝固検査の測定値に比較し
て早期に高値を示し、ＤＩＣの早期診断が可能となるこ
とが判明した。

【図面の簡単な説明】

図１は実験例１の結果を示すグラフであり、本発明測定
方法によるＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ
）と波長４９０ｎｍの吸光度値との間の関係を表すグラ
フである。 図２は実験例２の結果を示すグラフであり、健康成人お
よび各種疾患患者のＡＰＣ−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ（
ＣＩＣ）の測定値を表すものである。 図３は実験例３の結果を示すグラフであり、一人の急性
前骨髄球性白血病患者のＦ叶、ＰＣＩ、ＰＣ，　ＡＰＣ
−ＰＣＩ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　（ＣＩＣ）の測定値を経時
的に追跡した結果である。 図１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、活性化ヒトプロテインＣとヒトプロテインＣインヒ
   ビターの複合体を二抗体サンドイッチ法を利用する酵素
   免疫測定法によって測定するにあたり、当該測定に係わ
   る固相化用抗体として抗ヒトプロテインＣインヒビター
   モノクローナル抗体を使用し、酵素標識抗体用として抗
   ヒトプロテインＣモノクローナル抗体を使用することを
   特徴とする測定方法。 ２、活性化ヒトプロテインＣとヒトプロテインＣインヒ
   ビターの複合体を二抗体サンドイッチ法を利用する酵素
   免疫測定法によって測定する試薬において、当該測定に
   係わる固相化用抗体として抗ヒトプロテインＣインヒビ
   ターモノクローナル抗体が含まれ、酵素標識抗体用とし
   て抗ヒトプロテインＣモノクローナル抗体が含まれるこ
   とを特徴とする測定試薬。 ３、測定試薬が播種性血管内凝固症候群の診断試薬であ
   る請求項２記載の測定試薬。