JP2007101362A - Eiaプレート及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】APC、好ましくは凍結乾燥保存されたAPCがコーティングされており、試料、好ましくは患者血液より調製した血漿試料のAPC感受性の測定に利用できるEIAプレート。このEIAプレートに対して試料を添加してから反応液を加えてAPC感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるEIAプレートの利用方法。
【選択図】なし
Description
を利用して、APC感受性の測定を行うことも考えられる。しかしこの場合には、採取した患者血液に対して、遠心分離、及び血小板除去の操作に加えて、フィブリノーゲン除去(レプチラーゼ処理)等のかなり煩雑な前処理を行ってサンプルを調製する必要がある。しかも、このサンプルを EIAプレートに加えた後に、APCを添加し、更に組織因子、合成基質(トロンビンに対する合成基質であるS-2238)及び塩化カルシウム(CaCl2 )を順次添加すると言う非常に多数のステップが必要である。従って非常に煩雑であり、臨床の場での即応性のある使用は困難であった。
上記課題を解決するための本願第1発明の構成は、活性化プロテインC(APC)がコーティングされており、試料のAPC感受性の測定に利用できる、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第2発明の構成は、前記第1発明に係るAPCが、凍結乾燥した状態でコーティングされている、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第3発明の構成は、前記第1発明又は第2発明に係るAPCが、反応液中での最終濃度が5〜15ナノモルとなるようにコーティングされている、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第4発明の構成は、前記第1発明〜第3発明のいずれかに係るEIAプレートが、APCがコーティングされたウェル領域と、APCがコーティングされていないウェル領域とを併せ備える、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第5発明の構成は、前記第1発明〜第4発明のいずれかに係るAPC感受性の測定が、患者血液より調製した試料について行われ、かつ、血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出のために行われるものである、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第6発明の構成は、前記第5発明に係る患者血液が妊娠産褥期の患者血液であり、及び/又は、前記血栓症が少なくとも深部静脈血栓(DVT)及び/又は肺塞栓症(PTE)を包含する静脈血栓症である、EIAプレートである。
上記課題を解決するための本願第7発明の構成は、第1発明〜第6発明のいずれかに係るEIAプレートに対して、試料を添加してから反応液を加えてAPC感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるプロセスを行う、EIAプレートの利用方法である。
上記課題を解決するための本願第8発明の構成は、前記第7発明に係るAPC感受性測定により、以下のいずれかについての、早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行う、EIAプレートの利用方法である。
(1)血栓症
(2)静脈血栓症
(3)深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症
(4)妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症。
第1発明のEIAプレートにはAPCがコーティングされている。その形態として、例えば第4発明のようにAPCをコーティングしたウェル領域並びにAPC非コーティングのウェル領域を設けた場合について述べると、EIAプレートのこれらのウェル領域に対して試料、例えば患者血液より調製した血漿を加え、組織因子、リン脂質、CaCl2 、トロンビンに対する発色基質の混合液を添加しトロンビンを産生させ、発色を経時的に測定することでトロンビン産生を定量する。
第2発明のEIAプレートにおいては、APCが凍結乾燥した状態でコーティングされているので、比較的長期の4°C保管中などにおいてもAPCが失活し難いと言う利点がある。その他にも、測定時の用時調整が不要である等の利点もある。
EIAプレートにおけるAPCのコーティング密度は任意に設定することができるが、例えば反応液最終濃度で5〜15ナノモル程度であることが好ましい。5ナノモル未満であれば、APC感受性の測定感度が不十分となる場合があり得る。15ナノモルを超えると、APC自身の酵素活性により合成基質を切断し、トロンビン活性を正確に測定できない場合があり得る。
第4発明のように、EIAプレートが、APCがコーティングされたウェル領域と、APCがコーティングされていないウェル領域とを併せ備えることにより、後述するように、EIAプレートによるAPC感受性の測定が、より簡便化される。
EIAプレートによるAPC感受性の測定を行う目的は限定されないが、とりわけ、患者血液より調製した試料(例えば、血球を遠心分離した試料)を用いて、血栓傾向あるいは血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出等の目的のために行うことが有用である。
妊娠産褥期は過凝固状態であり、妊娠産褥期の2次線溶の亢進の結果、静脈血栓症の凝固学的マーカーとして比較的用いられる FDP-DD 値の上昇の特異性が低い。これに対し、APCに対する感受性が妊娠中から産褥直後にかけて低下するものの、産褥期1月以内に正常に復し(前記非特許文献1にて報告)、血栓症を発症した例では更に低下している(前記の非特許文献2にて報告)。
第7発明のEIAプレートの利用方法によれば、第1発明〜第6発明のいずれかに係るEIAプレートに対して試料(例えば、患者血液より調製した試料)を添加し、反応液を加えてAPC感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップによって測定を行うことが可能である。
上記した第7発明のEIAプレートの利用方法は、任意の目的を以て行うことができるが、特に、下記の(1)〜(4)のいずれかについての早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行う場合に、有用性が高い。
(1)血栓症
(2)静脈血栓症
(3)深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症
(4)妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症。
APCそのものは、抗凝固タンパク質として当業者に良く知られている。従ってAPCのアミノ酸配列、生理活性等の説明は省略する。
本発明のEIAプレートの形状やサイズ等は限定されないが、例えば、通常のEIAプレートと同様に、全体として薄板状で、多くのウェルを備えたプレートとして構成することができる。更に好ましくは、全体として半球形とすることができる。半球形のEIAプレートでは、蛍光発色で見る場合の感度が向上すると言う利点がある。
本発明のEIAプレートを用いてAPC感受性の測定に供する試料の種類は、APC感受性の測定を行うことに何らかの意味がある試料である限りにおいて、限定されない。このような試料としては、少なくとも血漿成分が含まれていれば良い。
本発明に係るEIAプレートの利用方法は、上記したいずれかのEIAプレートに対して、上記したいずれかの試料(好ましくは患者血液より調製した試料)を添加した後、反応液を加えてAPC感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなる。
表1に示すように、DVT/PTEを発症した妊娠産褥期の患者群6名、及びDVT/PTEを発症していない正常妊娠の患者群30名について、それぞれ、本人の了解を得て採血し、それらの血液を3000 r.p.m. で10分間の遠心分離に供して血球を除去することにより、血漿を得た。
〔表1〕
DVT/PTE 群(N=6) 正常妊娠群(N=30)
年齢 28.9 ± 5.3 28.8 ± 4.2 N.S.
BMI 33.5 ± 2.3 24.0 ± 3.0 P <0.05
Ht [%] 34 ± 2.3 34.2 ± 4.5 N.S.
Plt[×104 μl] 32.9 ± 4.7 29.9 ± 6.8 N.S.
FDP-dimer[μg/ml] 11.2 ± 4.6 N.E.
TAT[ng/ml] 8.7 ± 4.2 N.E.
APC-sr 3.34 ± 1.0 2.0 ± 1.1 P <0.05
N.E.: not examined
(実施例2:EIAプレートを用いたAPC感受性の測定)
一方、本発明のEIAプレート(APCを反応液最終濃度で5.9ナノモルとなるように凍結乾燥コーティングしたもの)を必要数準備し、これらの各EIAプレート上におけるAPCコーティングのウェル領域とAPC非コーティングのウェル領域とのそれぞれ等しい数のウェルに対して、上記の合計36名の患者に係る各血漿サンプルをそれぞれ150μLずつ添加した。次いで37°Cの恒温水槽上で15分間静置した。
Claims (8)
- 活性化プロテインC(APC)がコーティングされており、試料のAPC感受性の測定に利用できることを特徴とするEIAプレート。
- 前記APCが、凍結乾燥した状態でコーティングされていることを特徴とする請求項1に記載のEIAプレート。
- 前記APCが、反応液中での最終濃度が5〜15ナノモルとなるようにコーティングされていることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載のEIAプレート。
- 前記EIAプレートが、APCがコーティングされたウェル領域と、APCがコーティングされていないウェル領域とを併せ備えることを特徴とする請求項1〜請求項3のいずれかに記載のEIAプレート。
- 前記APC感受性の測定が、患者血液より調製した試料について行われ、かつ、血栓症の予知、早期診断あるいはハイリスク群の検出のために行われるものであることを特徴とする請求項1〜請求項4のいずれかに記載のEIAプレート。
- 前記患者血液が妊娠産褥期の患者血液であり、及び/又は、前記血栓症が少なくとも深部静脈血栓(DVT)及び/又は肺塞栓症(PTE)を包含する静脈血栓症であることを特徴とする請求項5に記載のEIAプレート。
- 請求項1〜請求項6のいずれかに記載のEIAプレートに対して、試料を添加してから反応液を加えてAPC感受性を測定すると言う、実質的に単一のステップからなるプロセスを行うことを特徴とするEIAプレートの利用方法。
- 前記APC感受性測定により、以下のいずれかについての、早期診断、予知又はハイリスク群の検出を行うことを特徴とする請求項7に記載のEIAプレートの利用方法。
(1)血栓症
(2)静脈血栓症
(3)深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症
(4)妊娠産褥期の患者の深部静脈血栓及び/又は肺塞栓症。
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2005
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