JPH07209293A - 活性化プロテインｃの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 動物血漿中のＡＰＣの高感度検出系の提供。 【構成】 ａ）プロテアーゼ・フリーの抗ＡＰＣ抗体を
固相化抗体として用い、 ｂ）ＡＰＣに対する可逆的プロテアーゼ阻害剤存在下で
免疫反応させ、 ｃ）バッファーで洗浄して該阻害剤を除去し、 ｄ）蛍光基質を反応させて蛍光強度を測定する、 ことからなるＡＰＣの測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、体液中の活性化ヒト・
プロテインＣの測定方法に関する。更に詳しくは、活性
化ヒト・プロテインＣに対する抗体、特にモノクローナ
ル抗体を用いて、活性化ヒト・プロテインＣを含む体液
中の活性化ヒト・プロテインＣ濃度を高感度に測定する
方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び問題点】従来ヒト・プロテインＣの測
定方法に関しては、グルーバーら（Gruber et al. ）が
１９８９年に動物へのＡＰＣ投与後の血中濃度をＥＣＡ
（Enzyme Captured Assay ）法により、可逆的阻害剤
（reversible inhibitor）：ベンザミジンを用い測定し
ている（Blood, Vol. ７３，６３９，１９８９）。ヒト
血中のＡＰＣに関しても同じくグルーバーらが血中濃度
を測定している（Blood, Vol. ７９，２３４０，１９９
２）。しかしながら、これらの方法は感度が非常に悪
く、正常人血中のＡＰＣの測定には１０日以上の時間が
かかった。この従来法では正常人血中のＡＰＣをかろう
じて測定できる程度の感度しかなく、ましてやＰＣ欠損
症患者の血中ＡＰＣ濃度を測定しうるものではない。ま
たこの方法においては用いる抗体に混入したプロテアー
ゼの影響を除くために、多種類の不可逆的プロテアーゼ
阻害剤（irreversible protease inhibitor ）を用いる
必要があるなどの点が実用上非常に問題であった（ＷＯ
９３／０１３０９）。

【０００３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の如
き欠点のない体液中のＡＰＣの測定法を開発すべく鋭意
研究した結果、（ｉ） 使用する抗体中のプロテアーゼ
を極力少くすること、（ii） 固相抗体と検体（体液）
とを接触させる際に、免疫反応調節剤を共存させるこ
と、（iii ）ＡＰＣの検出を蛍光基質を用いて行うこ
と、により、極めて高感度に体液中のＡＰＣを検出する
ことができることを見出し、本発明に到達した。

【０００４】すなわち、本発明は、体液中のＡＰＣを測
定する方法であって、 ａ）プロテアーゼが実質的に混在しない抗ＡＰＣ抗体を
固相担体に固定し、 ｂ）この抗体固定化担体、ＡＰＣに対する可逆的プロテ
アーゼ阻害剤、免疫反応調節剤及びＡＰＣを含有すると
予想される体液をバッファー液中で、免疫反応を効果な
らしめる条件下に接触させ、 ｃ）次いで、上記反応後の担体を、ＡＰＣに対する可逆
的プロテアーゼ阻害剤を含有しないバッファーで洗浄し
て、ＡＰＣに結合した該プロテアーゼインヒビターを離
脱・除去し、 ｄ）次いで、上記担体に結合されたＡＰＣに、ＡＰＣに
対する蛍光基質を接触させ、その結果酵素反応により発
生する蛍光強度を測定し、標準のＡＰＣと比較して定量
することからなるＡＰＣの測定方法である。

【０００５】本発明の抗ＡＰＣ抗体はプロテアーゼが実
質的に混在しないものである。かかる抗体を取得するに
は、抗血清の場合、予めプロテインＣを結合させたカラ
ムで処理して精製すればよい。更に抗体としてモノクロ
ーナル抗体を用いる場合、ハイブリドーマを無血清培地
で培養して取得すれば、自ずからプロテアーゼが含有さ
れないので一層好適である。

【０００６】また上記抗体は、その結合によりＡＰＣの
活性を阻害するものであってはならない。

【０００７】抗血清の場合、ＡＰＣの活性部位が存在し
ないＰＣ部分、例えばＰＣの軽鎖を担持したアフィニテ
ィ・クロマトで処理して、抗血清中のＰＣ軽鎖結合性の
抗体を取得すれば、目的の抗体が得られる。一方、モノ
クローナル抗体の場合は簡単であって、クローン化され
たハイブリドーマが産生する抗体をＡＰＣに結合せし
め、ＡＰＣ活性が阻害されるかどうかを例えば蛍光基質
法で測定すればよい。

【０００８】本発明においてはＡＰＣに対する可逆的プ
ロテアーゼ阻害剤が用いられる。可逆的プロテアーゼ阻
害剤とは、ある条件下ではプロテアーゼに結合してプロ
テアーゼ活性を阻害するが、別の条件下ではその結合を
解いてプロテアーゼ活性を回復させるような薬剤のこと
である。この条件は種々ありうるであろうが、簡単には
阻害剤の濃度を調節することにより制御する方法があ
る。すなわち雰囲気中の阻害剤の濃度を上げることによ
りプロテアーゼとの結合を促進させて活性を阻害し、逆
に雰囲気中の阻害剤の濃度を下げることにより、端的に
は阻害剤が存在しない雰囲気にすることにより、プロテ
アーゼとの結合を解き、活性を復活させる方法である。

【０００９】かかる薬剤を例示すれば、ベンザミジン、
アプロチニン、メシル酸ガベキサート、メシル酸ナファ
モスタット、メシル酸カモスタット、トラネキサム酸等
である。

【００１０】本発明で用いる免疫反応調節剤とは、免疫
反応の特異性を維持しつつ、非特異的反応又は非特異的
吸着を抑制させる薬剤である。

【００１１】かかる薬剤は免疫反応を用いる検出技術分
野において種々知られており、本発明においてはスキム
・ミルクが好適なものとして挙げることができる。免疫
反応調節剤の濃度は反応の場における濃度（最終濃度）
として、０．２〜０．８ｗｔ％が好ましい。この薬剤は
検体中のプロテアーゼが固相担体に結合するのを防止
し、かくしてＡＰＣの蛍光基質反応による検出におい
て、偽陽性（false positive）を防止する作用もある。

【００１２】“免疫反応を効果ならしめる条件”とは、
抗ＡＰＣ抗体とＡＰＣの特異的結合を達成させる条件の
ことであり、通常は４〜５℃かつ３０分〜５時間であ
る。好ましくは１５〜３７℃かつ６０分〜３時間であ
る。この条件には場合によっては、検体が稀釈されると
いう条件も付加される。これは検体中に含有される阻害
物質すなわち抗ＡＰＣ抗体とＡＰＣとの結合を妨害する
物質の影響を除く、あるいは軽減するために必要であ
る。反応の場において検体が何倍に稀釈されているかと
いう値を最終稀釈倍率と定義すると、この最終稀釈倍率
は８０倍以上、好ましくは１００〜１０００倍が好まし
い。

【００１３】上記免疫反応はバッファー液中で実施され
る。バッファー液とは、ｐＨを所定の値に制御すること
ができる酸、アルカリ及び／又は塩の水溶液である。か
かるバッファー液としては、トリスバッファー、酢酸バ
ッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、ヘ
ペスバッファー、Ｇｏｏｄバッファーが例示される。ｐ
Ｈは５．５〜９．０、好ましくは６．５〜８．５であ
る。

【００１４】このバッファー液は、可逆的プロテアーゼ
阻害剤及び／又は免疫反応調節剤を溶液状態で利用する
場合、その溶媒として用いることもできる。可逆的プロ
テアーゼ阻害剤及び／又は免疫反応調節剤を溶液状態で
利用する場合、前記“最終稀釈倍率”はこれらの溶液も
加味して算出されるべきことは言うまでもない。

【００１５】かかる免疫反応が実施されると、抗ＡＰＣ
抗体を担持した固相単体上には、抗ＡＰＣ抗体―ＡＰＣ
―可逆的プロテアーゼ阻害剤の複合体が結合しているこ
とになる。本発明においては、この複合体から可逆的プ
ロテアーゼ阻害剤を離脱・除去せしめてＡＰＣの活性が
発現できるようにし、次いでＡＰＣに対する蛍光基質を
反応せしめる。

【００１６】可逆的プロテアーゼ阻害剤の離脱・除去は
いかなる方法であってもよいのであるが、簡単には可逆
的プロテアーゼ阻害剤を含有しないバッファー液で洗浄
することにより達成できる。可逆的阻害剤であるために
その剤を含有しないバッファー液を接触させると可逆反
応により阻害剤はバッファー液中に解離してゆく。従っ
て十分なバッファー液で洗浄することにより前記複合体
から可逆的阻害剤が実質的に完全に除去されることとな
る。この洗浄に要する量は簡単な実験により容易に定め
ることができる。通常用いた可逆的阻害剤０．４ｍｌに
対し、２〜２０ｃｃ、好ましくは３〜１０ｃｃのバッフ
ァー液で洗浄すればよい。もちろんこの量はＡＰＣを可
逆的阻害剤の結合定数によって増減するものであること
は当業者には容易に理解できることであろう。

【００１７】かかる洗浄が終了した後で、ＡＰＣに対す
る蛍光基質を用いる検出を行う。かかる蛍光基質として
はpeptidyl―４―methylcoumaryl―７―amide(peptidyl
MCA）が用いられる。例えばＢｏｃ―Ｌｅｕ―Ｓｅｒ―
Ｔｈｒ―Ａｒｇ―ＭＣＡ、Ｂｚ―Ｔｈｒ―Ｔｈｒ―Ａｒ
ｇ―ＭＣＡ、Ｂｏｃ―Ｌｅｕ―Ｔｈｒ―Ａｒｇ―ＭＣＡ
である。この中でＢｏｃ―Ｌｅｕ―Ｓｅｒ―Ｔｈｒ―Ａ
ｒｇ―ＭＣＡが好ましく用いられる。

【００１８】かかる蛍光基質との反応はバッファー液中
で実施される。バッファー液としては、５０ｍＭ Ｔｒ
ｉｓ―ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌに、ＣａＣｌ₂ が
含有されているバッファーを用いることができる。基質
は、２〜２０ｍｇ／ｄｌの濃度で用いられる。

【００１９】反応温度は４〜４０℃、反応時間は３０分
〜２４時間の範囲であり、検出方法は従来公知の方法を
採用することができる。

【００２０】標準物質としては測定対象の物質と同一の
ものを用いるのが好ましい。ＡＰＣ自体の製造方法とし
ては、血液から精製した、又は遺伝子工学的手法で製造
したプロテインＣ（ＰＣ）をトロンビン又はトロンビン
―トロンボモジュリン複合体等で活性化して得る方法、
あるいは遺伝子工学的手法で直接ＡＰＣを得る方法が挙
げられる。

【００２１】ヒトあるいは動物にＡＰＣ製剤を投与して
その血中動態を調べる場合、標準物質としては投与製剤
中のＡＰＣを用いるのが好ましい。

【００２２】次に本発明における抗ＡＰＣ抗体としてモ
ノクローナル抗体を用いる場合に関し、当該モノクロー
ナル抗体の製造方法について詳しく説明する。

【００２３】本発明方法に用いられるモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞は、ケーラーとミルシ
ュタインの方法［Kohler & Milstein, Nature;２５６４
９５―４９７（１９７５）］として知られた方法によっ
て得られる。すなわち、ヒトプロテインＣでマウスを免
疫した後、このマウスの脾細胞をマウス・ミエローマ細
胞と融合させる。得られたハイブリドーマ細胞を、それ
が産生する抗体がマイクロタイタープレートに固定され
たヒト・プロテインＣと反応するかどうか調べることに
より、系統的に検査し選択される。

【００２４】ＭＣＡの結合によってＡＰＣ活性を阻害し
ないＭＣＡ 培養上清中に産生される抗体がヒト・プロテインＣ（Ｐ
Ｃ）に結合することが確認されたクローンの無血清培養
上清、又は精製ＩｇＧを用いてこの抗体がＡＰＣ活性を
阻害しないかどうかを確認することができる。活性化ヒ
ト・プロテインＣ（ＡＰＣ）と無血清培養上清又は精製
ＩｇＧとをモル比においてＩｇＧが過剰になるような割
合で混合し、免疫複合体を形成するのに十分な条件でイ
ンキュベーション後、この混合液に合成基質を加え一定
時間反応後の発色量からＡＰＣの合成基質分解活性を測
定する。ＰＣで免疫していないマウスのＩｇＧ又はミエ
ローマ細胞の培養上清を加えたＡＰＣ混合液の発色量を
対照とし、発色量の低下からＡＰＣ活性の阻害を検出す
ることができる。

【００２５】また、ＰＣと無血清培養上清又は精製Ｉｇ
Ｇを上記と同様にインキュベーションし、トロンビン又
はトロンビン―トロンボモジュリン複合体を用いた活性
化後に、上記と同様に合成基質分解活性を測定すればＰ
Ｃ活性化への影響とＡＰＣ活性への影響を会わせて検出
することができる。

【００２６】立体構造を認識するＭＣＡ 抗体の認識部位がＰＣ分子上のＬ鎖であるかＨ鎖である
か、又は両鎖にかかる立体構造であるかはイムノブロッ
ティングにより判定することができる。ＰＣを還元条件
下で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写後、核クロ
ーンの無血清培養上清又は精製ＩｇＧと反応させ、次い
でＨＲＰ標識羊抗マウスＩｇＧと反応させ抗体が結合し
ているバンドを検出する。還元条件下のイムノブロッテ
ィングにおいてＬ鎖にもＨ鎖にも結合が認められないも
のを選択することにより立体構造を認識する抗体を得る
ことができる。

【００２７】Ｇｌａドメイン認識ＭＣＡ Ｇｌａドメイン認識ＭＣＡは次の２つのステップで見出
すことができる。

【００２８】（１）ＰＣとの結合におけるＣａ²⁺依存性 ＰＣをコーティングしたマイクロタイタープレートを用
いたＥＬＩＳＡにおいてＣａ²⁺イオン存在下でＰＣ結合
陽性を示し、Ｃａ²⁺イオン非存在下ではＰＣ結合陽性を
示さない抗体（を産生するクローン）を選択する。

【００２９】（２）Ｇｌａドメイン除去ＰＣとの結合性 キモトリプシンを用いて酵素的にＰＣのＧｌａドメイン
を切断し、このＧｌａドメイン除去ＰＣに対するイムノ
ブロッティングにおいて結合性を示さない抗体（を産生
するクローン）を選択する。

【００３０】上記（１）及び（２）において選択された
クローンはＧｌａドメイン認識と判定することができ
る。ＧｌａドメインはＰＣ及びＡＰＣで共通であるの
で、この段階で終了してもよいが、更にこれらがＡＰＣ
にも結合することを確認することによりＡＰＣのＧｌａ
ドメイン認識ＭＣＡであると最終的に確認することもで
きる。

【００３１】抗体固定法 固相への抗体の固定は、抗体を溶解するバッファーのｐ
Ｈに依存し、抗体固定用のバッファーはｐＨが４．０以
下が望ましい。このｐＨで固定すると、高い抗原結合能
を有した固相抗体が調製可能である。所要時間は通常１
時間以上あればよい。温度は常温でもよいが０〜１０℃
で実施するのが好ましい。

【００３２】

【発明の効果】本発明により、体液中の活性化プロテイ
ンＣの濃度を、非常に簡便に、しかも高感度（０．００
２５ｍｇ／ｍｌ）に測定できる。このことにより、従来
では不可能であったプロテインＣ欠損症患者血中のＡＰ
Ｃ濃度が正確に測定可能であり、その結果プロテインＣ
欠損患者の治療に有用な情報を与えうることが明らかに
なった。また、本法は、遺伝的な欠損患者のみでなく、
後天的な欠損（ｅｘ、肝硬変）にも、有力な情報を与え
ることが判った。

【００３３】また、本法は動物へＡＰＣを投与する実験
においても有用な測定方法を与えるものである。

【００３４】以下実施例を掲げ、本発明を詳細に説明す
る。しかしながら本発明は、以下の実施例に限定される
ものではない。

【００３５】

【参考例】

１）抗ヒト・プロテインＣモノクローナル抗体の作成 精製したヒト・ＰＣを雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（４週
齢）２匹に対して１４日間隔で４回免疫した。

【００３６】初回の免疫はＰＢＳに溶解した５０μｇの
ヒト・ＰＣを等量のフロイントの完全アジュバントと混
合し、そのエマルジョンを、腹腔内に投与した（０．５
ｍｇ／ｈｅａｄ）。２回目、３回目は、同じく５０μｇ
のヒト・ＰＣをフロイントの不完全アジュバントと混合
し、同じく腹腔内に投与した。最終免疫は３０μｇのヒ
ト・ＰＣをＰＢＳ溶液のまま、マウス尾静脈から投与し
た。最終免疫の３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を取
り出し、細胞融合に用いた。

【００３７】免疫したマウスの脾臓細胞と、同系マウス
の骨髄腫細胞（Ｐ３Ｕ１）を約２：１〜約１５：１の割
合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５４０
（和光純薬）を融合促進剤としてケーラーとミルシュタ
インの方法に従い細胞融合を行った。融合後の細胞は、
１×１０⁶ ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞濃度となるように１０
％ＦＣＳ←ＲＰＭＩ―１６４０培地に懸濁し、９６ウエ
ルマイクロプレート（Coster）に１ウエル当り１００μ
ｌずつ分注した。

【００３８】融合細胞は、ＣＯ₂ インキュベーター（５
％ＣＯ₂ 、３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン；アミ
ノブテリン；チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地
交換を行い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、脾臓細胞と、
骨髄腫細胞からなるハイブリドーマのスクリーニングを
行った。

【００３９】ハイブリドーマの培養上清中の抗体は抗原
ヒト・ＰＣをコーティングしたマイクロタイタープレー
トを用いＥＬＩＳＡ法により検出した。

【００４０】２）抗ＡＰＣモノクローナル抗体の選択 ＰＣをマウスに免疫し、ミエローマ細胞と被免疫マウス
の脾臓細胞を用いて融合を行い、ハイブリドーマを得
た。固相に抗マウスＩｇＧを１０μｇ／ｍｌで固定した
マイクロプレートを用い、ハイブリドーマの培養上清を
入れ、２時間、３７℃でインキュベートし、その後０．
１ｍｇ／ｍｌのＡＰＣを１００μｌ反応させた。洗浄
後、以下の構造式を有する基質を用いて酵素反応を行っ
た。

【００４１】

【化１】

【００４２】酵素反応が進行した上清を提供しうるハイ
ブリドーマを選択した。

【００４３】この選択したハイブリドーマを用いて次の
実験を行った。

【００４４】３）可逆的プロテアーゼ阻害剤に妨害され
ないモノクローナル抗体の選択（ＡＰＣ―阻害剤複合体
でも結合する抗体） ２）において用いたスクリーニング方法に準じて行っ
た。すなわち、０．１ｎｇ／ｍｌのＡＰＣ溶液の代わり
に、５０ｍＭのベンザミジン（可逆的阻害剤）を含有す
る０．１ｎｇ／ｍｌのＡＰＣ溶液を加え、トリス・バッ
ファー・サリーンにより洗浄後、酵素反応を行った。

【００４５】本酵素反応すなわちベンザミジンの入って
いる系での反応と２）における酵素反応が同様に進行し
ているハイブリドーマの上清中に存在する抗体を、ＡＰ
Ｃ阻害剤複合体でも結合する抗体として選択した。

【００４６】他の可逆的阻害剤を用いる場合でも、これ
に準じて行うことができる。

【００４７】４）構造特異的モノクローナル抗体及びＧ
ｌａドメイン特異的モノクローナル抗体の選択 マウス腹水から精製した各クローンの抗体を用いてサブ
クラスＣａ²⁺イオン依存性、ＰＣ活性への影響、Ｈ鎖あ
るいはＬ鎖への結合性を調べた。サブクラスは各クラス
特異性の抗マウス抗血清を用いてオクタロニー法により
決定した。

【００４８】Ｃａ²⁺イオン依存性はＰＣをコーティング
したマイクロタイタープレートを用いＥＬＩＳＡ法によ
り検出した。第２抗体には、アルカリホスファターゼ標
識ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体を用い、カルシウムイオン
存在下非存在下におけるヒト・ＰＣとの結合の違いをみ
るため、一方のサンプルには５ｍＭ ＣａＣｌ₂ を添加
したＴＢＳ（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．１４
Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、またもう一方にはＴＢＳ
を加えた。更に第２抗体の稀釈液、及び洗浄液には、５
ｍＭ ＣａＣｌ₂ 点かＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０、０．０２％ＮａＮ₃ 又はＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０、０．０２％ＮａＮ₃ を使用した。

【００４９】ヒト・ＰＣ活性への影響は、ヒト・ＰＣに
ＩｇＧをモル比１：５で加えて４℃で一夜インキュベー
ションし、トロンビン―トロンボモジュリンコンプレッ
クスによりヒト・ＰＣを活性化し、その活性は次の合成
基質の分解活性測定することにより測定した。この合成
基質としては、

【００５０】

【化２】

【００５１】［ここでＶａｌはＤ形の光学活性のバリ
ン、ＬｅｕはＬ形の光学活性のロイシン、ＡｒｇはＬ形
の光学活性のアルギンを示す。Kabi Vitrum ＡＢ（スウ
エーデン）社製のＳ―２２６６を用いた］を使用した。
Ｌ鎖、Ｈ鎖への結合性はヒト・ＰＣを還元条件で電気泳
動し、ニトロセルロース膜及びＨＲＰ標識羊抗マウスＩ
ｇＧを用いたイムノブロッティングを行って判定した。

【００５２】各性質について得られた結果を下記表に示
した。カルシウムイオン依存性抗体はいずれもＬ鎖結合
性であり、ヒト・ＡＰＣの活性には影響を及ぼさなかっ
た。これらの抗体として７Ｂ１２、１０Ｅ１２、９Ｈ１
２が挙げられる。これらの抗体はいずれもキモトリプシ
ンによりＧｌａドメインを切断除去したＰＣに対するイ
ムノブロッティングにおいて結合性を示さずＧｌａドメ
イン認識抗体であると判定した。一方６Ｂ１０―１、６
Ｅ２、６Ｂ１０―２は還元条件下イムノブロッティング
においてＬ鎖、Ｈ鎖両者ともに反応性を示さず、構造特
異的抗体（Ｃ）であると判定された。これらの抗体はＡ
ＰＣ活性にほとんど影響を及ぼさなかった。そして、こ
れらは、ＡＰＣ―阻害剤複合体にも結合しうる抗体であ
った。今後のＡＰＣの測定に用いる抗体としてＧｌａド
メイン特異抗体として７Ｂ１２、立体構造を認識する抗
体として６Ｂ１０―１を選択した。

【００５３】

【表１】

【００５４】［実施例１］活性化ヒト・プロテインＣ活
性の測定（ＥＣＡ法） （１）モノクローナル抗体の固定 本実施例におけるモノクローナル抗体の固定は以下の方
法で行った。ｐＨ３．０のクエン酸緩衝液（０．１Ｍ）
に、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗プロテインＣモノクロー
ナル抗体をポリスチレンボール（セキスイ；６ｍｍφ）
に固定し（４℃、１６ｈｒ）、洗浄後１％のＢＳＡにて
アフター・コートを行う。

【００５５】（２）プロテインＣの立体構造を認識する
固定担体を用いた活性化ヒト・プロテインＣ活性の測定 血液から精製したＡＰＣ（比活性２７５００／ｍｇ）
を，０、０．００２５、０．００５、０．０１、０．０
２、０．０５、０．１０ｎｇ／ｍｌになるように、免疫
反応調節剤含有緩衝液（ベンザミジン、０．０５Ｍ、Ｂ
ＳＡ０．２％、スキムミルク０．３％／Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．２））にて稀釈した。その各４００μｌと
立体構造を認識する抗プロテインＣモノクローナル抗体
（６Ｂ１０―１）を固定したポリスチレンボールとをガ
ラスチューブに各々加え、３７℃、２時間反応させた。

【００５６】反応終了後、Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．
２）により、４回洗浄後、ガラスチューブを交換し、蛍
光基質溶液（Ｂｏｃ―Ｌｅｕ―Ｓｅｒ―Ｔｈｒ―Ａｒｇ
―ＭＣＡ；６０μｇ／ｍｌ；Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（５０ｍ
Ｍ）、ｐＨ８．０、０．１ＭＮａＣｌ、０．０１Ｍ Ｃ
ａＣｌ₂ 含有）を１ｍｌ加え、４℃で１６時間反応させ
た。

【００５７】酵素反応終了後、２０％の酢酸を１ｍｌ加
え、蛍光強度（ｅｘ；３８０ｎｍ，ｅｍ，４６０ｎｍ)
を測定した。その結果を図１（ａ）に示す。チューブ当
り０．００２５ｎｇ／ｍｌ（２．５ｐｇ／ｍｌ）まで測
定が可能であった（従来法に比較して１〜２オーダー感
度が上昇した。）。

【００５８】（３）プロテインＣのＧｌａドメインを認
識する固相担体を用いた活性化ヒト・プロテインＣ活性
の測定 ７Ｂ１２を固定したポリスチレンボールと、（２）のＡ
ＰＣ各濃度と５ｍＭＣａＣｌ₂ を添加した免疫反応調節
剤含有緩衝液４００μｌを、ガラスチューブに入れ、３
７℃、２時間反応させた。（２）と同様に蛍光強度を測
定した結果、２．５ｐｇ／ｍｌまで測定可能であった。
（図１ｂ）

【００５９】（４）先行技術との比較 グルーバーらの測定系と本発明の測定系の総合的な効率
を下式に従って求めた。

【００６０】

【数１】

【００６１】

【表２】

【００６２】［実施例２］ヒト・血漿中のＡＰＣ測定
（条件検討） （１）免疫反応調節剤の添加剤の検討 血液由来からの非特異反応を除去する目的で、種々の添
加剤（スキムミルク、卵アルブミン、牛血清アルブミ
ン、Ｔｗｅｅｎ２０）を検討した。基本の免疫反応調節
剤含有緩衝液（スキムミルク０．０２％、牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）０．２％の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ
（ｐＨ７．２））に、スキムミルク０．０５％、０．２
％、卵アルブミン（ＯＡ）０．０５％、０．２％、ＢＳ
Ａ０．２５％、１％、Ｔｗｅｅｎ２０ ０．０１２５
％、０．０５％にそれぞれなるように添加し、実施例１
に従い免疫反応（免疫反応調節剤含有緩衝液４００μ
ｌ、ヒト血漿５μｌ）を行った。その結果を図２に示
す。

【００６３】図２から明らかなように、ＯＡ、ＢＳＡは
免疫反応はおとさないが、血液由来の非特異吸着は防止
できなかった。また、Ｔｗｅｅｎ２０を添加すると免疫
反応自身を低下させてしまった。しかしながら、スキム
ミルクを加えると、免疫反応を下げることなく、血液由
来の非特異吸着をスキムミルクの濃度依存的に低下せし
めることが明らかになった。

【００６４】次いで、スキムミルクの濃度を最終濃度で
０．１％、０．２％、０．３％として、実施例１に従い
ヒト血漿検体（ヘテロのＰＣ欠損患者の血漿）を測定し
た。その結果を図３に示す。図３から明らかなようにス
キムミルクが再終濃度で、０．２％以上存在すると、血
液由来の非特異的吸着を低下せしめることが明らかにな
った。

【００６５】（２）ヒト血漿の稀釈倍率に関する検討 ヒト血漿の最適な稀釈倍率を検討すべく、免疫反応調節
剤含有緩衝液（スキムミルク０．３％含有）４００μｌ
に血漿２０μｌ、１０μｌ、５μｌ、２．５μｌ、１．
２５μｌを加え、その測定値を検討した。その結果を図
４に示す。図４より明らかなように、血漿５μｌ以下
（稀釈倍率８０倍以上）でその測定値は一定の値をと
り、それゆえに、稀釈倍率８０倍以上が本免疫反応で最
適な稀釈倍率であることが判った。以上により、本測定
系で測定しうるヒト血漿中のＡＰＣ濃度は、０．４ｎｇ
／ｍｌ（稀釈倍率８０倍、チューブ当りの測定感度０．
００５ｎｇ、従ってに８０×０．００５＝０．４ｎｇ／
ｍｌ）であることが明らかになった。

【００６６】［実施例３］抗プロテインＣモノクローナ
ル抗体をｐＨ３．０で固定化し、実施例１に準じてＰＣ
欠損患者の血漿中ＡＰＣ濃度を測定した。その結果を図
５に示す。図５から明らかなように健常人（ＡＰＣ）値
に比して、欠損患者ＡＰＣ値が低下していることが判
る。

【００６７】［実施例４］プロテアーゼを含有している
と考えられるマウス腹腔液由来抗ＡＰＣ抗体のモデルと
して、無血清培養抗ＡＰＣ抗体（６Ｂ１０―１）２０μ
ｇ／ｍｌにプロテアーゼの１種トロンビンを１μｇ／ｍ
ｌ添加し（５％含有）、これに不可逆のプロテアーゼイ
ンヒビターであるＰＭＳＦ ５ｍＭを含有させたものと
ＰＭＳＦ不含のものとを、別々にポリスチレンボールに
固定した。一方、コントロール実験として無血清培養抗
ＡＰＣ抗体（６Ｂ１０―１）に、ＰＭＳＦ ５ｍＭの添
加、非添加溶液を固定した。

【００６８】これらの４種の固定ボールを用いて、実施
例１の反応を行った。その結果プロテアーゼを含有する
抗体ではベースが非常に高くなってしまい、ＰＭＳＦを
添加したボールは多少の非特異反応がおさえられた。一
方、無血清培養６Ｂ１０―１固定ボールでは、非特異反
応がほとんどみられず、高感度測定が可能であった。一
方、これにＰＭＳＦを入れると非特異反応が上昇し、一
方、特異反応もおさえられる結果が得られた。（図６）

【００６９】［実施例５］動物血漿成分の測定系への影
響 ウサギ、ラット、マウス及びサルの血漿を基本の免疫反
応緩衝液を用いて稀釈した試料を調製した。これらの試
料の一部に各動物種毎に一定濃度のヒトＡＰＣを添加
し、ＡＰＣ無添加の試料とともに実施例１に従って免疫
反応を行った。その結果を図７に示す。図に示した通
り、ラット、マウス、サルの血漿中には交差反応を示す
成分が存在するが、その影響はラット、マウス血漿で１
００倍以上、サルの血漿で８０倍以上稀釈することによ
って回避できた。ウサギの血漿では他の動物種でみられ
た血漿成分の交差反応はなく、３倍以上の稀釈で測定が
可能であった。

【００７０】なお、本発明の実施態様として以下のもの
が挙げられる。 １）該体液サンプルと混合したバッファー溶液が、ベン
ザミジンと抗凝固剤を含む採血管に直接人体から体液が
導入されて形成されたものである請求項１の方法。 ２）抗ＡＰＣ抗体が、その結合によってＡＰＣ活性を阻
害しない抗体である請求項１の方法。 ３）抗ＡＰＣ抗体が、Ｇｌａドメイン又は立体構造認識
抗体である請求項１の方法。 ４）抗ＡＰＣ抗体が、ｐＨ４．０以下の緩衝液で固定担
体に固定された固定担体を用いる請求項１の方法。 ５）該体液サンプルと混合するバッファー溶液中の免疫
反応調節剤がスキムミルクであり、その濃度が最終濃度
０．２〜０．８ｗｔ％であるところの請求項１の方法。 ６）該可逆的プロテアーゼ阻害剤がベンザミジン（benz
amidine ）であるところの請求項１の方法。 ７）ＡＰＣ用蛍光基質が、ペプチド系蛍光基質である請
求項１の方法。 ８）該ペプチド系蛍光基質が構造式Ｂｏｃ―Ｌｅｕ―Ｓ
ｅｒ―Ｔｈｒ―Ａｒｇ―ＭＣＡである請求項７の方法。 ９）該免疫反応が、温度４〜３７℃で、２４〜２時間で
実施される請求項１の方法。 １０）該酵素反応が４〜３７℃、２４〜２時間で実施さ
れる請求項１の方法。 １１）該体液サンプルが、ヒト血漿で、最終稀釈倍率８
０倍以上であることを特徴とする請求項１の方法。 １２）該体液サンプルが動物血漿で、最終稀釈倍率１０
０倍以上であることを特徴とする請求項１の方法。 １３）該動物血漿が、ラット、マウス、イヌ、サル血漿
であることを特徴とする請求項１２の方法。 １４）標準物質（ＡＰＣ）が、ヒト血漿から精製して得
られることを特徴とする請求項１の方法。 １５）標準物質が、遺伝子工学的手法を用いて得られる
ことを特徴とする請求項１の方法。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において得られた測定系の感度を示す
図である。

【図２】実施例２において得られた添加剤の効果を表わ
す図である。

【図３】実施例２において得られたスキムミルクの添加
剤効果を表わす図である。

【図４】実施例２において得られた検体稀釈倍率の効果
を表わす図である。

【図５】ＰＣ欠損症患者の測定例である。

【図６】プロテアーゼ含有の影響を表わす図である。

【図７】種々の動物血漿における検体稀釈倍率の効果を
表わす図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 勝浦 保宏 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 体液中の活性化プロテインＣ（以下ＡＰ
   Ｃ）を測定する方法であって、 ａ）プロテアーゼが実質的に混在しない抗ＡＰＣ抗体を
   固相担体に固定し、 ｂ）この抗体固定化担体、ＡＰＣに対する可逆的プロテ
   アーゼ阻害剤、免疫反応調節剤及びＡＰＣを含有すると
   予想される体液を、バッファー液中で免疫反応を効果な
   らしめる条件下に接触させ、 ｃ）次いで、上記反応後の担体を、ＡＰＣに対する可逆
   的プロテアーゼ阻害剤を含有しないバッファーで洗浄し
   て、ＡＰＣに結合した該プロテアーゼ阻害剤を離脱・除
   去し、 ｄ）次いで、上記担体に結合されたＡＰＣに、ＡＰＣに
   対する蛍光基質を接触させ、その結果酵素反応により発
   生する蛍光強度を測定し、標準のＡＰＣと比較して定量
   することからなるＡＰＣの測定方法。