JPH07194397A - 活性化プロテインｃに対する感受性を測定するためのアッセイ - Google Patents
活性化プロテインｃに対する感受性を測定するためのアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 試験サンプル中の活性化プロテインＣに対す
る感受性を測定するための改良されたアッセイを提供す
る。 【構成】 本発明のアッセイは、試験サンプル中の活性
化ＶIII因子による、添加したＸ因子のその活性型への
転化を測定することに基づく。対照と比較して、Ｘ因子
転化が相対的に阻害されることにより、試験サンプルの
活性化プロテインＣ感受性を測定する。活性化プロテイ
ンＣに対する感受性が弱められた試験サンプルは、比較
的弱い阻害を示し、また活性化プロテインＣに対する感
受性が強められた試験サンプルは、比較的強い阻害を示
す。
る感受性を測定するための改良されたアッセイを提供す
る。 【構成】 本発明のアッセイは、試験サンプル中の活性
化ＶIII因子による、添加したＸ因子のその活性型への
転化を測定することに基づく。対照と比較して、Ｘ因子
転化が相対的に阻害されることにより、試験サンプルの
活性化プロテインＣ感受性を測定する。活性化プロテイ
ンＣに対する感受性が弱められた試験サンプルは、比較
的弱い阻害を示し、また活性化プロテインＣに対する感
受性が強められた試験サンプルは、比較的強い阻害を示
す。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は、試験サンプル中の活性化プロテインＣ(「Ａ
ＰＣ」)の作用を測定するためのアッセイであって、迅
速かつ正確な評価を確実なものとするよう改良されたア
ッセイに関する。試験サンプルには、活性化プロテイン
Ｃと共に作用する能力があると考えられる幾つかの物質
が含まれる。一般的に、これらの物質は血漿または血漿
分画である。
ＰＣ」)の作用を測定するためのアッセイであって、迅
速かつ正確な評価を確実なものとするよう改良されたア
ッセイに関する。試験サンプルには、活性化プロテイン
Ｃと共に作用する能力があると考えられる幾つかの物質
が含まれる。一般的に、これらの物質は血漿または血漿
分画である。
【０００２】本発明のアッセイは、試験溶液中に存在す
る活性化ＶIII因子(「ＶIIIa因子」)によるＸ因子の活
性化Ｘ因子(「Ｘa因子」)への転化を測定することに基
づく。ＡＰＣはこの転化を阻害する。
る活性化ＶIII因子(「ＶIIIa因子」)によるＸ因子の活
性化Ｘ因子(「Ｘa因子」)への転化を測定することに基
づく。ＡＰＣはこの転化を阻害する。
【０００３】プロテインＣは、肝臓で合成されるビタミ
ンＫ依存性の糖タンパクであり、不活性チモーゲンとし
て血漿中を約４μg／mlの濃度で循環する。このタンパ
クは、血管壁の表面(内皮)でトロンビン−トロンボモジ
ュリン複合体により活性セリンプロテアーゼ(ＡＰＣ)へ
と転化される。プロテインＣはまた、へび毒液因子［プ
ロタック(Ｐrotac) Ｃ〈商標〉，ペンタファーム(Ｐent
apharm)，スイス］といったような非生理的酵素によっ
て活性化することもできる。
ンＫ依存性の糖タンパクであり、不活性チモーゲンとし
て血漿中を約４μg／mlの濃度で循環する。このタンパ
クは、血管壁の表面(内皮)でトロンビン−トロンボモジ
ュリン複合体により活性セリンプロテアーゼ(ＡＰＣ)へ
と転化される。プロテインＣはまた、へび毒液因子［プ
ロタック(Ｐrotac) Ｃ〈商標〉，ペンタファーム(Ｐent
apharm)，スイス］といったような非生理的酵素によっ
て活性化することもできる。
【０００４】ＡＰＣはフィブリン溶解性を有するが、こ
れはプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビターを
不活性化するというＡＰＣの能力により与えられる。Ａ
ＰＣはまた抗凝固作用を有するが、これはＡＰＣがタン
パク分解によりＶa因子およびＶIIIa因子を分解するこ
とができるからである。Ｖa因子は、Ｘa因子に誘導され
るプロトロンビンのトロンビンへの活性化のための補助
因子である。ＶIIIa因子は、Ｘa因子へのＸ因子転化の
補助因子である。上述のとおり、Ｘa因子はＶa因子と共
に、プロトロンビンをトロンビンへと転化する際に必要
である。従って、ＡＰＣを生成するためのインビボにお
けるプロテインＣの活性化は、Ｖa因子およびＶIIIa因
子の分解を介してのトロンビン生成における負のフィー
ドバック反応より成る。
れはプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビターを
不活性化するというＡＰＣの能力により与えられる。Ａ
ＰＣはまた抗凝固作用を有するが、これはＡＰＣがタン
パク分解によりＶa因子およびＶIIIa因子を分解するこ
とができるからである。Ｖa因子は、Ｘa因子に誘導され
るプロトロンビンのトロンビンへの活性化のための補助
因子である。ＶIIIa因子は、Ｘa因子へのＸ因子転化の
補助因子である。上述のとおり、Ｘa因子はＶa因子と共
に、プロトロンビンをトロンビンへと転化する際に必要
である。従って、ＡＰＣを生成するためのインビボにお
けるプロテインＣの活性化は、Ｖa因子およびＶIIIa因
子の分解を介してのトロンビン生成における負のフィー
ドバック反応より成る。
【０００５】活性化プロテインＣの正常活性に対する個
体の感受性は、「ＡＰＣ感受性」として定義される。Ａ
ＰＣ感受性は、ある一定個体から得られる血漿サンプル
または分画といったような試験サンプルを用いて評価す
ることができる。ＡＰＣに対する感受性が非常に強い人
々から得られる血漿サンプルまたは分画は、ＡＰＣを投
与すると著しい抗凝固活性を示す。ＡＰＣ感受性が弱い
人々から得られる血漿サンプルは、最低の抗凝固活性し
か示さない。
体の感受性は、「ＡＰＣ感受性」として定義される。Ａ
ＰＣ感受性は、ある一定個体から得られる血漿サンプル
または分画といったような試験サンプルを用いて評価す
ることができる。ＡＰＣに対する感受性が非常に強い人
々から得られる血漿サンプルまたは分画は、ＡＰＣを投
与すると著しい抗凝固活性を示す。ＡＰＣ感受性が弱い
人々から得られる血漿サンプルは、最低の抗凝固活性し
か示さない。
【０００６】補助因子であるプロテインＳは、ＡＰＣの
最適活性を発現させるのに必要である。プロテインＳ
は、ＡＰＣの抗凝固特性および前フィブリン溶解特性に
関する非酵素性補助因子である。血漿中、プロテインＳ
は種々の型で存在する。これらの型には、遊離活性型お
よび不活性型が包含され、これが非共有結合的にＣ４ｂ
−結合タンパクと複合体を形成する。プロテインＳを除
去した血漿中では、ＡＰＣはその正常活性を発現するこ
とはできない。プロテインＳを添加することにより初め
て、ＡＰＣはその正常活性を取り戻す。
最適活性を発現させるのに必要である。プロテインＳ
は、ＡＰＣの抗凝固特性および前フィブリン溶解特性に
関する非酵素性補助因子である。血漿中、プロテインＳ
は種々の型で存在する。これらの型には、遊離活性型お
よび不活性型が包含され、これが非共有結合的にＣ４ｂ
−結合タンパクと複合体を形成する。プロテインＳを除
去した血漿中では、ＡＰＣはその正常活性を発現するこ
とはできない。プロテインＳを添加することにより初め
て、ＡＰＣはその正常活性を取り戻す。
【０００７】ＡＰＣは、用量依存的に血漿凝固時間を増
大する。ＡＰＣの病態生理的役割は、先天性プロテイン
ＳまたはプロテインＣ欠乏症により起こる血栓発現傾向
を患っている人々において実証される。先天性プロテイ
ンＳ欠乏症は常染色体の優性遺伝によるものであり、青
年初期における静脈および動脈血栓塞栓症の発生を特徴
とする。ＡＰＣの先天性異常により起こる他の悪影響に
は、微小血管系凝固、再潅流傷害および敗血症性ショッ
クが包含される［エスモン(Ｅsmon)，ＴＣＭ２：２１４
−１９（１９９２）を参照］。
大する。ＡＰＣの病態生理的役割は、先天性プロテイン
ＳまたはプロテインＣ欠乏症により起こる血栓発現傾向
を患っている人々において実証される。先天性プロテイ
ンＳ欠乏症は常染色体の優性遺伝によるものであり、青
年初期における静脈および動脈血栓塞栓症の発生を特徴
とする。ＡＰＣの先天性異常により起こる他の悪影響に
は、微小血管系凝固、再潅流傷害および敗血症性ショッ
クが包含される［エスモン(Ｅsmon)，ＴＣＭ２：２１４
−１９（１９９２）を参照］。
【０００８】種々の原因がＡＰＣ感受性を弱める原因と
なり得る。例えば、ダールベック(Ｄahlbaeck)らは、Ａ
ＰＣに対する弱い抗凝固応答を特徴とする症候群を発見
した［プロシーディング・オブ・ネイショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ(Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓc
i.) ＵＳＡ ９０：１００４−０８（１９９３）を参
照］。この症候群を患っている患者の血液は、正常レベ
ルのアンチトロンビン III、プロテインＣ、プロテイン
Ｓ、プラスミノーゲン、フィブリノーゲンおよび他の凝
固因子を有することが見いだされた。ダールベックら
は、今だ認識されていないＡＰＣの補助因子が、この症
候群を患っている患者の血漿中に欠乏していると仮定し
た。この症候群は遺伝によるものと考えられる。そのよ
うな症候群が存在することから、ＡＰＣを測定するため
の確実なアッセイが必要とされる。
なり得る。例えば、ダールベック(Ｄahlbaeck)らは、Ａ
ＰＣに対する弱い抗凝固応答を特徴とする症候群を発見
した［プロシーディング・オブ・ネイショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ(Ｐroc.Ｎat'l Ａcad.Ｓc
i.) ＵＳＡ ９０：１００４−０８（１９９３）を参
照］。この症候群を患っている患者の血液は、正常レベ
ルのアンチトロンビン III、プロテインＣ、プロテイン
Ｓ、プラスミノーゲン、フィブリノーゲンおよび他の凝
固因子を有することが見いだされた。ダールベックら
は、今だ認識されていないＡＰＣの補助因子が、この症
候群を患っている患者の血漿中に欠乏していると仮定し
た。この症候群は遺伝によるものと考えられる。そのよ
うな症候群が存在することから、ＡＰＣを測定するため
の確実なアッセイが必要とされる。
【０００９】個体の血液凝固障害を評価するための試験
が以前に開発された。方法は、ＷＯ９３／１０２６１に
記載されている。このアッセイは、血液凝固系のアクチ
ベータをＡＰＣおよび、リン脂質やカルシウムイオンと
いったような補助物質と混合することに基づく。この方
法では、IＸa因子およびＸa因子を基礎とする凝固アッ
セイにより、ヒトＡＰＣに対する抗凝固応答を評価す
る。この試験は、プロテインＳ欠乏症、もしくはＡＰＣ
耐性Ｖa因子およびＶIIIa因子によっては起こらない障
害の発見を可能とすると言われている。
が以前に開発された。方法は、ＷＯ９３／１０２６１に
記載されている。このアッセイは、血液凝固系のアクチ
ベータをＡＰＣおよび、リン脂質やカルシウムイオンと
いったような補助物質と混合することに基づく。この方
法では、IＸa因子およびＸa因子を基礎とする凝固アッ
セイにより、ヒトＡＰＣに対する抗凝固応答を評価す
る。この試験は、プロテインＳ欠乏症、もしくはＡＰＣ
耐性Ｖa因子およびＶIIIa因子によっては起こらない障
害の発見を可能とすると言われている。
【００１０】ＷＯ ９３／１０２６１のアッセイには、
凝固カスケード全体が包含され、また１つ以上のインキ
ュベーション段階を使用する。このアッセイでは、高濃
度の血漿を必要とするが、これはこのアッセイが凝固カ
スケードの開始(カリクレイン)を伴うからである。これ
らの濃度は、血漿サンプル１０％ｖ／ｖ以上であって、
通常、２０〜３５％ｖ／ｖ程に高い。反応混合物中の血
漿が高濃度であれば、サンプル中の因子がアッセイを妨
げ、それによってアッセイの感受性や特異性を弱める。
凝固カスケード全体が包含され、また１つ以上のインキ
ュベーション段階を使用する。このアッセイでは、高濃
度の血漿を必要とするが、これはこのアッセイが凝固カ
スケードの開始(カリクレイン)を伴うからである。これ
らの濃度は、血漿サンプル１０％ｖ／ｖ以上であって、
通常、２０〜３５％ｖ／ｖ程に高い。反応混合物中の血
漿が高濃度であれば、サンプル中の因子がアッセイを妨
げ、それによってアッセイの感受性や特異性を弱める。
【００１１】ＶIII因子活性のアッセイには、ＡＰＣ感
受性の評価における適用可能性が幾分ある。そのような
アッセイの１つは、米国特許出願第０７／８１９,４５
６号に記載されている。このアッセイで使用する試薬に
は、IＸaβ因子、Ｘ因子、カルシウムイオン、トロンビ
ン、リン脂質、また所望によりＸIa因子およびＸIIa因
子が含まれる。このアッセイは、サンプル中に含まれる
ＶIII因子の作用であるＸ因子の活性化に基づく。次い
で、Ｘa因子を定量的に測定する。
受性の評価における適用可能性が幾分ある。そのような
アッセイの１つは、米国特許出願第０７／８１９,４５
６号に記載されている。このアッセイで使用する試薬に
は、IＸaβ因子、Ｘ因子、カルシウムイオン、トロンビ
ン、リン脂質、また所望によりＸIa因子およびＸIIa因
子が含まれる。このアッセイは、サンプル中に含まれる
ＶIII因子の作用であるＸ因子の活性化に基づく。次い
で、Ｘa因子を定量的に測定する。
【００１２】このアッセイをＡＰＣやその補助因子であ
るプロテインＳといったようなＶIII因子と反応するタ
ンパクを評価するために利用する場合には、過剰量のＶ
III因子をサンプルに添加して反応させる。その反応で
ＶIII因子の活性を弱めた後、ＶIII因子の色素産生試薬
を用いて、残っているＶIII因子の量を測定する。しか
し、ＡＰＣ感受性を測定することに関しては、ＶIII因
子といったような、この活性に影響を及ぼす物質の比率
を血漿中で見られるレベルと同程度に維持するのが望ま
しい。さらに、ＡＰＣ感受性に関し、この方法は、１つ
よりも多いインキュベーション段階を必要とする。
るプロテインＳといったようなＶIII因子と反応するタ
ンパクを評価するために利用する場合には、過剰量のＶ
III因子をサンプルに添加して反応させる。その反応で
ＶIII因子の活性を弱めた後、ＶIII因子の色素産生試薬
を用いて、残っているＶIII因子の量を測定する。しか
し、ＡＰＣ感受性を測定することに関しては、ＶIII因
子といったような、この活性に影響を及ぼす物質の比率
を血漿中で見られるレベルと同程度に維持するのが望ま
しい。さらに、ＡＰＣ感受性に関し、この方法は、１つ
よりも多いインキュベーション段階を必要とする。
【００１３】発明の概要 本発明の目的は、個体のＡＰＣ感受性を測定するための
改良されたアッセイを提供することである。
改良されたアッセイを提供することである。
【００１４】本発明の目的はまた、ＡＰＣ感受性を測定
するための改良されたアッセイであって、ＶIII因子を
試験サンプルに添加する必要のないアッセイを提供する
ことである。
するための改良されたアッセイであって、ＶIII因子を
試験サンプルに添加する必要のないアッセイを提供する
ことである。
【００１５】本発明の他の目的は、ＡＰＣ感受性を測定
するための改良されたアッセイであって、１つのインキ
ュベーション段階を必要とするだけのアッセイを提供す
ることである。
するための改良されたアッセイであって、１つのインキ
ュベーション段階を必要とするだけのアッセイを提供す
ることである。
【００１６】本発明のさらなる目的は、ＡＰＣ感受性を
測定するための改良されたアッセイであって、凝固カス
ケード全体を伴わないアッセイを提供することである。
測定するための改良されたアッセイであって、凝固カス
ケード全体を伴わないアッセイを提供することである。
【００１７】本発明のまたさらなる目的は、ＡＰＣ感受
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
サンプルと共に存在する全ての血液凝固因子を測定する
必要のないアッセイを提供することである。
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
サンプルと共に存在する全ての血液凝固因子を測定する
必要のないアッセイを提供することである。
【００１８】本発明のまたさらなる目的は、ＡＰＣ感受
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
を行うために最小限量の試験サンプルしか必要としない
アッセイを提供することである。
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
を行うために最小限量の試験サンプルしか必要としない
アッセイを提供することである。
【００１９】これらの目的を達成するという点で、本発
明の一態様により、血漿サンプルまたは分画といったよ
うな試験サンプルの活性化プロテインＣに対する感受性
を測定するためのアッセイが提供された。本発明の一態
様により、そのアッセイでは、活性化IＸ因子(「IＸa因
子」)、Ｘ因子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオ
ンおよびリン脂質を使用する。好ましくは、IＸa因子は
成熟型であり、これはIＸaβ因子として知られている。
本発明のアッセイで使用する血漿の量は１０％ｖ／ｖ以
上も必要ない。好ましい態様において、そのアッセイで
使用する血漿の量は２％未満であり、またさらに好まし
い態様において、血漿の量は０.８〜１.６％である。
明の一態様により、血漿サンプルまたは分画といったよ
うな試験サンプルの活性化プロテインＣに対する感受性
を測定するためのアッセイが提供された。本発明の一態
様により、そのアッセイでは、活性化IＸ因子(「IＸa因
子」)、Ｘ因子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオ
ンおよびリン脂質を使用する。好ましくは、IＸa因子は
成熟型であり、これはIＸaβ因子として知られている。
本発明のアッセイで使用する血漿の量は１０％ｖ／ｖ以
上も必要ない。好ましい態様において、そのアッセイで
使用する血漿の量は２％未満であり、またさらに好まし
い態様において、血漿の量は０.８〜１.６％である。
【００２０】本発明の他の態様により、試験サンプル中
の活性化プロテインＣに対する感受性を測定する方法で
あって、（ａ）カルシウムイオンおよびリン脂質を含有
する試験溶液中で、Ｘ因子、活性化IＸ因子、活性化プ
ロテインＣおよびトロンビンを試験サンプルと反応さ
せ、（ｂ）段階(ａ)の反応で生成した活性化Ｘ因子の量
を測定し、そして段階(ｂ)の測定に基づいて、対照と比
較することにより、活性化プロテインＣに対する試験サ
ンプルの感受性を評価するという段階から成る方法が提
供される。対照は、活性化プロテインＣが存在していな
い状態で、該試験サンプルを活性化IＸ因子、Ｘ因子、
トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と反応さ
せることを伴うのが好ましい。対照はまた、確立された
範囲の血液成分および活性に基づいた歴史的対照といっ
たような既知の知識を基礎としてもよい。
の活性化プロテインＣに対する感受性を測定する方法で
あって、（ａ）カルシウムイオンおよびリン脂質を含有
する試験溶液中で、Ｘ因子、活性化IＸ因子、活性化プ
ロテインＣおよびトロンビンを試験サンプルと反応さ
せ、（ｂ）段階(ａ)の反応で生成した活性化Ｘ因子の量
を測定し、そして段階(ｂ)の測定に基づいて、対照と比
較することにより、活性化プロテインＣに対する試験サ
ンプルの感受性を評価するという段階から成る方法が提
供される。対照は、活性化プロテインＣが存在していな
い状態で、該試験サンプルを活性化IＸ因子、Ｘ因子、
トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と反応さ
せることを伴うのが好ましい。対照はまた、確立された
範囲の血液成分および活性に基づいた歴史的対照といっ
たような既知の知識を基礎としてもよい。
【００２１】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第１および第２試薬成分から成る試験キットで
あって、該第１試薬成分がIＸa因子およびＸ因子、また
該第２試薬成分が活性化プロテインＣから成る試験キッ
トが提供される。トロンビン、カルシウムイオンおよび
リン脂質は該第１試薬成分または該第２試薬成分のいず
れかに存在する。
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第１および第２試薬成分から成る試験キットで
あって、該第１試薬成分がIＸa因子およびＸ因子、また
該第２試薬成分が活性化プロテインＣから成る試験キッ
トが提供される。トロンビン、カルシウムイオンおよび
リン脂質は該第１試薬成分または該第２試薬成分のいず
れかに存在する。
【００２２】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第１、第２および第３試薬成分から成る試験キ
ットであって、第１試薬成分がIＸa因子、Ｘ因子および
カルシウムイオン、第２試薬成分が活性化プロテイン
Ｃ、また第３試薬成分がリン脂質から成る試験キットが
提供される。またトロンビンは第１試薬成分または第３
試薬成分に存在する。
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第１、第２および第３試薬成分から成る試験キ
ットであって、第１試薬成分がIＸa因子、Ｘ因子および
カルシウムイオン、第２試薬成分が活性化プロテイン
Ｃ、また第３試薬成分がリン脂質から成る試験キットが
提供される。またトロンビンは第１試薬成分または第３
試薬成分に存在する。
【００２３】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための試験試薬であって、IＸa因子、Ｘ因子、トロンビ
ン、活性化プロテインＣ、リン脂質およびカルシウムイ
オンから成る試験試薬が提供される。好ましくは、その
試験試薬は、ＶIII因子を含まない。
プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための試験試薬であって、IＸa因子、Ｘ因子、トロンビ
ン、活性化プロテインＣ、リン脂質およびカルシウムイ
オンから成る試験試薬が提供される。好ましくは、その
試験試薬は、ＶIII因子を含まない。
【００２４】好ましい態様の詳細な説明 個体のＡＰＣ感受性を測定するための確実かつ正確なア
ッセイに対する必要性が長期にわたって容認されてき
た。ＡＰＣ感受性異常を患っている人々は、血栓症や血
栓塞栓性疾患といったような障害を起こしやすい。ＡＰ
Ｃ感受性異常は、プロテインＳ欠乏症、ＡＰＣ阻害剤ま
たは補助因子、およびＡＰＣ耐性Ｖa因子またはＶIIIa
因子の欠乏または過剰により起こり得る。ＡＰＣ感受性
異常は、血液凝固カスケードにおける種々の欠陥により
起こり得るので、改良されるアッセイは、原因とは無関
係にＡＰＣ感受性を測定することが可能であるべきであ
る。
ッセイに対する必要性が長期にわたって容認されてき
た。ＡＰＣ感受性異常を患っている人々は、血栓症や血
栓塞栓性疾患といったような障害を起こしやすい。ＡＰ
Ｃ感受性異常は、プロテインＳ欠乏症、ＡＰＣ阻害剤ま
たは補助因子、およびＡＰＣ耐性Ｖa因子またはＶIIIa
因子の欠乏または過剰により起こり得る。ＡＰＣ感受性
異常は、血液凝固カスケードにおける種々の欠陥により
起こり得るので、改良されるアッセイは、原因とは無関
係にＡＰＣ感受性を測定することが可能であるべきであ
る。
【００２５】ＡＰＣ感受性のための本発明のアッセイ
は、Ｘ因子のＸa因子への活性化に基づく。IＸa因子お
よびＶIIIa因子の存在下、Ｘ因子はＸa因子へと活性化
される。Ｘa因子は、Ｘa因子の色素産生基質を使用する
ことにより検出され得る。Ｘa因子の存在はまた、プロ
トロンビンのトロンビンへの転化により、もしくは凝固
時間を測定することにより評価することができる。
は、Ｘ因子のＸa因子への活性化に基づく。IＸa因子お
よびＶIIIa因子の存在下、Ｘ因子はＸa因子へと活性化
される。Ｘa因子は、Ｘa因子の色素産生基質を使用する
ことにより検出され得る。Ｘa因子の存在はまた、プロ
トロンビンのトロンビンへの転化により、もしくは凝固
時間を測定することにより評価することができる。
【００２６】本発明のアッセイは、血漿サンプルまたは
分画といったような試験サンプルを、精製IＸa因子、Ｘ
因子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオンおよびリ
ン脂質を含んでいる溶液に添加することを必要とする。
好ましくは、IＸaβ因子として知られている成熟型のI
Ｘa因子をこのアッセイに使用する。IＸa因子、Ｘ因
子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオンおよびリン
脂質を「試験試薬」の形に組み合わせることができ、こ
れに試験サンプルを添加して「試験溶液」とする。ＶII
I因子は試験溶液に添加せず、ＶIII因子は試験サンプル
中に既存しているものを利用する。一般的に、試験試薬
中のこれらの物質は、２つまたはそれ以上の「試薬成
分」として予めパッケージした後、試験サンプルを添加
する直前に混合することができる。試験試薬を製造した
後は、１つのインキュベーション段階を行うだけで、試
験サンプルの評価を行うことができる。
分画といったような試験サンプルを、精製IＸa因子、Ｘ
因子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオンおよびリ
ン脂質を含んでいる溶液に添加することを必要とする。
好ましくは、IＸaβ因子として知られている成熟型のI
Ｘa因子をこのアッセイに使用する。IＸa因子、Ｘ因
子、トロンビン、ＡＰＣ、カルシウムイオンおよびリン
脂質を「試験試薬」の形に組み合わせることができ、こ
れに試験サンプルを添加して「試験溶液」とする。ＶII
I因子は試験溶液に添加せず、ＶIII因子は試験サンプル
中に既存しているものを利用する。一般的に、試験試薬
中のこれらの物質は、２つまたはそれ以上の「試薬成
分」として予めパッケージした後、試験サンプルを添加
する直前に混合することができる。試験試薬を製造した
後は、１つのインキュベーション段階を行うだけで、試
験サンプルの評価を行うことができる。
【００２７】上記精製血液因子を試験溶液に添加するの
で、凝固カスケード全体によらず、そのアッセイを行う
ことができる。このことは、より簡単かつ確実なアッセ
イを可能とし、またより低濃度の試験サンプルの使用を
可能とする。そのアッセイで使用する試験サンプルの量
を減らすことで、サンプル中のある血液因子が及ぼす阻
害作用が最小となり、もしくは排除される。
で、凝固カスケード全体によらず、そのアッセイを行う
ことができる。このことは、より簡単かつ確実なアッセ
イを可能とし、またより低濃度の試験サンプルの使用を
可能とする。そのアッセイで使用する試験サンプルの量
を減らすことで、サンプル中のある血液因子が及ぼす阻
害作用が最小となり、もしくは排除される。
【００２８】本発明のアッセイに関する他の有利な点
は、クマリンやヘパリンといったような物質を用いる抗
凝固療法によって、その結果が影響を受けないという点
であり、このことから患者のサンプルを試験することが
できる。この有利な点は、血栓塞栓性障害に対する抗凝
固療法を受けている患者を検査する際、またモニターす
る際に重要である。それらのＡＰＣ感受性状態に関する
正確な診断とモニタリングには、抗凝固療法がアッセイ
の結果に何ら不適当な影響を及ぼさないということが必
要である。
は、クマリンやヘパリンといったような物質を用いる抗
凝固療法によって、その結果が影響を受けないという点
であり、このことから患者のサンプルを試験することが
できる。この有利な点は、血栓塞栓性障害に対する抗凝
固療法を受けている患者を検査する際、またモニターす
る際に重要である。それらのＡＰＣ感受性状態に関する
正確な診断とモニタリングには、抗凝固療法がアッセイ
の結果に何ら不適当な影響を及ぼさないということが必
要である。
【００２９】本発明のアッセイで使用するＡＰＣの量
は、試験サンプル中に存在するＶIIIa因子の約５０％に
減らすべきである。ＡＰＣは、０.０５〜５Ｕ／mlの範
囲内であるのが好ましく、０.２〜０.４Ｕ／mlの範囲内
であるのが最も好ましい。試験サンプル中に存在するＶ
III因子の量は、本発明のアッセイに関する対照といっ
たような、種々の方法により測定することができる。試
験サンプル中に存在するＶIII因子の量は、使用するＡ
ＰＣの量に影響する。そのアッセイで使用するＸ因子の
量は、約０.０１〜１０Ｕ／mlであるべきである。
は、試験サンプル中に存在するＶIIIa因子の約５０％に
減らすべきである。ＡＰＣは、０.０５〜５Ｕ／mlの範
囲内であるのが好ましく、０.２〜０.４Ｕ／mlの範囲内
であるのが最も好ましい。試験サンプル中に存在するＶ
III因子の量は、本発明のアッセイに関する対照といっ
たような、種々の方法により測定することができる。試
験サンプル中に存在するＶIII因子の量は、使用するＡ
ＰＣの量に影響する。そのアッセイで使用するＸ因子の
量は、約０.０１〜１０Ｕ／mlであるべきである。
【００３０】そのアッセイ中に血餅形成が起こるのを防
ぐため、テトラペプチド(ＡcＯＨ−Ｇly−Ｐro−Ａrg−
Ｐro−ＯＨ)を試薬に添加することが多い。またポリブ
レンといったようなヘパリン中和剤をそのアッセイに使
用することもできる。
ぐため、テトラペプチド(ＡcＯＨ−Ｇly−Ｐro−Ａrg−
Ｐro−ＯＨ)を試薬に添加することが多い。またポリブ
レンといったようなヘパリン中和剤をそのアッセイに使
用することもできる。
【００３１】本発明のアッセイはＶIII因子の添加を必
要としない。試験サンプルがＶIII因子を正常量の０.３
〜１.５倍含んでいるなら、そのアッセイは試験サンプ
ル中に通常存在するＶIII因子に依存することができる
が、このことは本発明のアッセイに関する対照により、
もしくは他の方法により測定することができる。試験サ
ンプル中に存在するＶIII因子は、そのアッセイで添加
するトロンビンにより活性化される。さらに、試験サン
プルまたは試験溶液は、正常レベルの少なくとも５０％
のプロテインＳを含有すべきであるが、このことは機能
的アッセイにより測定することができる。プロテインＳ
欠乏症であることが知られている、もしくは疑われてい
る場合には、プロテインＳを試験溶液に添加することが
できるが、この場合には他の血液因子の評価が望まれ
る。
要としない。試験サンプルがＶIII因子を正常量の０.３
〜１.５倍含んでいるなら、そのアッセイは試験サンプ
ル中に通常存在するＶIII因子に依存することができる
が、このことは本発明のアッセイに関する対照により、
もしくは他の方法により測定することができる。試験サ
ンプル中に存在するＶIII因子は、そのアッセイで添加
するトロンビンにより活性化される。さらに、試験サン
プルまたは試験溶液は、正常レベルの少なくとも５０％
のプロテインＳを含有すべきであるが、このことは機能
的アッセイにより測定することができる。プロテインＳ
欠乏症であることが知られている、もしくは疑われてい
る場合には、プロテインＳを試験溶液に添加することが
できるが、この場合には他の血液因子の評価が望まれ
る。
【００３２】好ましい態様において、そのアッセイは、
ＡＰＣの存在下、またＡＰＣが存在していない状態(対
照)で、試験サンプルをＸ因子、IＸa因子(IＸaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と
反応させることから成る。Ｘ因子、IＸa因子(IＸaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質および
ＡＰＣと反応させた試験サンプルを含んでいる試験バイ
アルならば、Ｘa因子に関して評価できよう。これらの
結果を、ＡＰＣを添加せずに、IＸa因子(IＸaβ因子)、
Ｘ因子、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質と反
応させた試験サンプルを含んでいる対照バイアルから得
られる結果と比較する。対照において生成したＸa因子
の量を、試験において生成したＸa因子の量で割ること
に基づく比率が、試験サンプルのＡＰＣ感受性を示す。
ＡＰＣの存在下、またＡＰＣが存在していない状態(対
照)で、試験サンプルをＸ因子、IＸa因子(IＸaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と
反応させることから成る。Ｘ因子、IＸa因子(IＸaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質および
ＡＰＣと反応させた試験サンプルを含んでいる試験バイ
アルならば、Ｘa因子に関して評価できよう。これらの
結果を、ＡＰＣを添加せずに、IＸa因子(IＸaβ因子)、
Ｘ因子、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質と反
応させた試験サンプルを含んでいる対照バイアルから得
られる結果と比較する。対照において生成したＸa因子
の量を、試験において生成したＸa因子の量で割ること
に基づく比率が、試験サンプルのＡＰＣ感受性を示す。
【００３３】ＡＰＣ感受性異常の原因に関係なく、本発
明のアッセイは、ＡＰＣの作用を評価するのに利用する
ことができる。例えば、本発明のアッセイは、ＡＰＣ耐
性ＶIIIa因子が存在している場合でも、弱められたＡＰ
Ｃ感受性を検出することができる。そのような場合、Ｖ
IIIa因子はＡＰＣにより分解され得ないが、それでもな
おＶIIIa因子は、Ｘ因子をＸa因子に転化するという、
その正常機能を行うことができる。このアッセイはま
た、ＡＰＣの天然阻害剤が関係する先天性異常を検出す
るのにも適当である。
明のアッセイは、ＡＰＣの作用を評価するのに利用する
ことができる。例えば、本発明のアッセイは、ＡＰＣ耐
性ＶIIIa因子が存在している場合でも、弱められたＡＰ
Ｃ感受性を検出することができる。そのような場合、Ｖ
IIIa因子はＡＰＣにより分解され得ないが、それでもな
おＶIIIa因子は、Ｘ因子をＸa因子に転化するという、
その正常機能を行うことができる。このアッセイはま
た、ＡＰＣの天然阻害剤が関係する先天性異常を検出す
るのにも適当である。
【００３４】本発明のアッセイの利用は、予めパッケー
ジされた試験キットと試薬成分により容易とすることが
できる。その因子と他の物質は、分解度に応じて保存す
るのが好ましい。例えば、多成分から成るアッセイ用の
試験キットは、簡用性を確実にし、貯蔵期間を最大にす
るために開発された。
ジされた試験キットと試薬成分により容易とすることが
できる。その因子と他の物質は、分解度に応じて保存す
るのが好ましい。例えば、多成分から成るアッセイ用の
試験キットは、簡用性を確実にし、貯蔵期間を最大にす
るために開発された。
【００３５】これらの試験キットは、２つまたは３つの
試薬成分から成るのが好ましい。３つの試薬成分から成
る試験キットが好ましいが、これはそのようなキットで
は、ＡＰＣを分けて保存するので、容易に利用できるか
らである。試験キットに関する製剤例を以下に示す。
試薬成分から成るのが好ましい。３つの試薬成分から成
る試験キットが好ましいが、これはそのようなキットで
は、ＡＰＣを分けて保存するので、容易に利用できるか
らである。試験キットに関する製剤例を以下に示す。
【００３６】本発明のアッセイは、本発明の試薬を製造
するための第１試薬成分Ａと第２試薬成分Ｂを含む試験
キットを用いると行いやすい。試薬成分Ａは、IＸa因子
およびＸ因子並びにカルシウムイオンを含み、また試薬
成分Ｂは、トロンビン、リン脂質およびＡＰＣを含む。
するための第１試薬成分Ａと第２試薬成分Ｂを含む試験
キットを用いると行いやすい。試薬成分Ａは、IＸa因子
およびＸ因子並びにカルシウムイオンを含み、また試薬
成分Ｂは、トロンビン、リン脂質およびＡＰＣを含む。
【００３７】また本発明の試薬を製造するための試薬成
分Ｃと試薬成分Ｄから成る試験キットを使用することも
できる。試薬成分Ｃは、IＸa因子およびＸ因子、カルシ
ウムイオン並びにトロンビンを含み、また試薬成分Ｄ
は、リン脂質およびＡＰＣを含む。
分Ｃと試薬成分Ｄから成る試験キットを使用することも
できる。試薬成分Ｃは、IＸa因子およびＸ因子、カルシ
ウムイオン並びにトロンビンを含み、また試薬成分Ｄ
は、リン脂質およびＡＰＣを含む。
【００３８】本発明のアッセイはまた、３成分から成る
試験キットを使用することもできる。個体成分としてＡ
ＰＣを含み、３成分から成る試験キットが好ましいが、
これはそのキットが試験サンプルや対照サンプルを評価
するのに容易に適合させることができるからである。Ａ
ＰＣがそのバイアル自体に含まれているので、ＡＰＣ
(試薬成分)を同体積の緩衝剤に置き換えることにより、
対照を簡単に行うことができる。
試験キットを使用することもできる。個体成分としてＡ
ＰＣを含み、３成分から成る試験キットが好ましいが、
これはそのキットが試験サンプルや対照サンプルを評価
するのに容易に適合させることができるからである。Ａ
ＰＣがそのバイアル自体に含まれているので、ＡＰＣ
(試薬成分)を同体積の緩衝剤に置き換えることにより、
対照を簡単に行うことができる。
【００３９】ある３成分から成る試験キットは、本発明
の試薬を製造するための第１試薬成分Ｅ、第２試薬成分
Ｆおよび第３試薬成分Ｇから成る。試薬成分Ｅは、IＸa
因子およびＸ因子並びにカルシウムイオンを含む。試薬
成分Ｆは、トロンビンおよびリン脂質を含む。試薬成分
Ｇは、ＡＰＣを含む。
の試薬を製造するための第１試薬成分Ｅ、第２試薬成分
Ｆおよび第３試薬成分Ｇから成る。試薬成分Ｅは、IＸa
因子およびＸ因子並びにカルシウムイオンを含む。試薬
成分Ｆは、トロンビンおよびリン脂質を含む。試薬成分
Ｇは、ＡＰＣを含む。
【００４０】３成分から成る最も好ましいキットでは、
リン脂質もまた他の全ての物質から分けられている。こ
の分離はさらに、試薬成分の安定性を高める。３成分か
ら成る好ましいキットは、本発明の試薬を製造するため
の第１試薬成分Ｈ、第２試薬成分Ｉおよび第３試薬成分
Ｊから成る。試薬成分Ｈは、IＸa因子およびＸ因子、カ
ルシウムイオン並びにトロンビンを含む。試薬成分Ｉ
は、リン脂質を含む。試薬成分Ｊは、ＡＰＣを含む。
リン脂質もまた他の全ての物質から分けられている。こ
の分離はさらに、試薬成分の安定性を高める。３成分か
ら成る好ましいキットは、本発明の試薬を製造するため
の第１試薬成分Ｈ、第２試薬成分Ｉおよび第３試薬成分
Ｊから成る。試薬成分Ｈは、IＸa因子およびＸ因子、カ
ルシウムイオン並びにトロンビンを含む。試薬成分Ｉ
は、リン脂質を含む。試薬成分Ｊは、ＡＰＣを含む。
【００４１】試薬にはIＸaβ因子を使用するのが好まし
いが、これは確実に安定な試薬とするからである。IＸa
β因子は、セライト〈商標〉［ジョン−マンビラ社(Ｊo
hn−Ｍanville Ｃorp.)］を使用する標準的な技術によ
りヒトの血漿から得られる。さらなる凝固因子であるＸ
Ia因子およびＸIIa因子が存在するということはまた、I
Ｘa因子の活性を維持するのにも有用となり得る。
いが、これは確実に安定な試薬とするからである。IＸa
β因子は、セライト〈商標〉［ジョン−マンビラ社(Ｊo
hn−Ｍanville Ｃorp.)］を使用する標準的な技術によ
りヒトの血漿から得られる。さらなる凝固因子であるＸ
Ia因子およびＸIIa因子が存在するということはまた、I
Ｘa因子の活性を維持するのにも有用となり得る。
【００４２】本発明の試薬は、IＸaβ因子を０.０５〜
５Ｕ／mlの範囲内で、Ｘ因子を０.０１〜１０Ｕ／mlの
範囲内で、トロンビンを０.０１〜２.０Ｕ／mlの濃度範
囲内で、リン脂質を０.０１〜１００nmol／mlの範囲内
で、カルシウムイオンを１〜５０μmol／mlの範囲内
で、またＡＰＣを０.０５〜５Ｕ／mlの範囲内で含有す
るのが好ましい。
５Ｕ／mlの範囲内で、Ｘ因子を０.０１〜１０Ｕ／mlの
範囲内で、トロンビンを０.０１〜２.０Ｕ／mlの濃度範
囲内で、リン脂質を０.０１〜１００nmol／mlの範囲内
で、カルシウムイオンを１〜５０μmol／mlの範囲内
で、またＡＰＣを０.０５〜５Ｕ／mlの範囲内で含有す
るのが好ましい。
【００４３】ヒトの血液凝固因子、トロンビンおよび活
性化プロテインＣを使用するのが好ましい。これらの成
分を感染物質不活化処置しておくことがさらに好まし
い。
性化プロテインＣを使用するのが好ましい。これらの成
分を感染物質不活化処置しておくことがさらに好まし
い。
【００４４】以下の実施例には、種々の試験サンプルで
のＡＰＣ感受性測定から得られた結果が含まれる。
のＡＰＣ感受性測定から得られた結果が含まれる。
【００４５】
〈実施例 １〉 ３成分から成る試験キットを用いてのＡ
ＰＣ感受性アッセイ 以下の試験キットを使用した。 試薬成分Ｈ(１００μl) ： IＸaβ因子、Ｘ因子、カ
ルシウムイオン、トロンビンおよびアルブミン 試薬成分Ｉ(１００μl) ： リン脂質およびアルブミ
ン 試薬成分Ｊ (５０μl) ： 活性化プロテインＣ(ＡＰ
Ｃ)(２Ｕ／ml) 各々の試薬成分の成分物質は、米国特許出願第０７／８
１９,４５６号および同第０７／９０５,５４１号により
調製することができる。これらの成分物質を調製する方
法は、他にも広く知られている。またこれらの成分物質
は、市販されているものもある。例えば、成分Ｈと成分
Ｉは、イムノクロム［(ＩＭＭＵＮＯＣＨＲＯＭ)〈商
標〉 Ｆ ＶIII：Ｃ，イムノ社(ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ)］と
いう商品名で市販されている。
ＰＣ感受性アッセイ 以下の試験キットを使用した。 試薬成分Ｈ(１００μl) ： IＸaβ因子、Ｘ因子、カ
ルシウムイオン、トロンビンおよびアルブミン 試薬成分Ｉ(１００μl) ： リン脂質およびアルブミ
ン 試薬成分Ｊ (５０μl) ： 活性化プロテインＣ(ＡＰ
Ｃ)(２Ｕ／ml) 各々の試薬成分の成分物質は、米国特許出願第０７／８
１９,４５６号および同第０７／９０５,５４１号により
調製することができる。これらの成分物質を調製する方
法は、他にも広く知られている。またこれらの成分物質
は、市販されているものもある。例えば、成分Ｈと成分
Ｉは、イムノクロム［(ＩＭＭＵＮＯＣＨＲＯＭ)〈商
標〉 Ｆ ＶIII：Ｃ，イムノ社(ＩＭＭＵＮＯ ＡＧ)］と
いう商品名で市販されている。
【００４６】試薬成分を血漿サンプル５０μlと混合
(１：２０で希釈)して、３７℃で５分間インキュベート
する。次いで、色素産生基質の希釈溶液２００μl［イ
ムノクロム〈商標〉 Ｆ ＶIII：Ｃ，イムノ社の取扱説
明書より、ＣＨ3ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−ＧＬＹ−ＡＲＧ
−pＮＡ−ＡcＯＨ(４mmol／ｌ)］を用いて、生成したＸ
a因子を測定する。この溶液はまた、トロンビンを阻害
するためのα−ＮＡＰＡＰと、Ｘ因子のさらなる活性化
を停止するためのＥＤＴＡを含む。５分間インキュベー
ションした後、酢酸(水溶液，５０％ｖ／ｖ)１００μl
を用いて反応を停止し、終点法評価を行った。試験中に
生成したＸa因子の量を示すために、吸光度を４０５nm
で測定した。対照実験では、血漿サンプルを試薬成分Ｈ
および試薬成分Ｉ並びに緩衝剤５０μlのみと共にイン
キュベートする。対照は添加ＡＰＣを欠いている。２つ
のアッセイ混合物(ＡＰＣを含むものと含まないもの)に
関する吸光度の比率を計算する。
(１：２０で希釈)して、３７℃で５分間インキュベート
する。次いで、色素産生基質の希釈溶液２００μl［イ
ムノクロム〈商標〉 Ｆ ＶIII：Ｃ，イムノ社の取扱説
明書より、ＣＨ3ＯＣＯ−Ｄ−ＣＨＡ−ＧＬＹ−ＡＲＧ
−pＮＡ−ＡcＯＨ(４mmol／ｌ)］を用いて、生成したＸ
a因子を測定する。この溶液はまた、トロンビンを阻害
するためのα−ＮＡＰＡＰと、Ｘ因子のさらなる活性化
を停止するためのＥＤＴＡを含む。５分間インキュベー
ションした後、酢酸(水溶液，５０％ｖ／ｖ)１００μl
を用いて反応を停止し、終点法評価を行った。試験中に
生成したＸa因子の量を示すために、吸光度を４０５nm
で測定した。対照実験では、血漿サンプルを試薬成分Ｈ
および試薬成分Ｉ並びに緩衝剤５０μlのみと共にイン
キュベートする。対照は添加ＡＰＣを欠いている。２つ
のアッセイ混合物(ＡＰＣを含むものと含まないもの)に
関する吸光度の比率を計算する。
【００４７】〈実施例 ２〉 サンプル試験 実施例Ｉで使用した３成分から成る試験キット用いて、
以下の試験サンプルを試験した。 (１) クエン酸を添加した正常血漿(Ｃ−npl)（サンプ
ルナンバー：１８） − 凍結乾燥した標準血漿 １００％ ［イムノ社，ウイ
ーン］ − 凍結した正常対照血漿 ［ジョージ・キング(Ｇeorg
e Ｋing)，米国］ − 健康な有志者の凍結した血漿サンプル （ＶIII因子の正常レベルの４０〜１２０％） (２) ヘパリン処理した正常血漿(Ｈ−npl) − ヘパリン対照血漿 ［イムノ社，ウイーン］ (３) プロテインＳの正常含量を有するＡＰＣ耐性血漿 − 「コーテスト(ＣＯＡＴＥＳＴ) ＡＰＣ耐性キッ
ト」 ［クロモゲニックス(Ｃhromogenix)，スェーデン］から
得られる 対照血漿レベル ２(Ｃopl ２) (４) 患者の血漿(Ｐ)、これらの患者には血栓発現傾向
があるが、プロテインＣおよびプロテインＳの正常レベ
ルを有する。
以下の試験サンプルを試験した。 (１) クエン酸を添加した正常血漿(Ｃ−npl)（サンプ
ルナンバー：１８） − 凍結乾燥した標準血漿 １００％ ［イムノ社，ウイ
ーン］ − 凍結した正常対照血漿 ［ジョージ・キング(Ｇeorg
e Ｋing)，米国］ − 健康な有志者の凍結した血漿サンプル （ＶIII因子の正常レベルの４０〜１２０％） (２) ヘパリン処理した正常血漿(Ｈ−npl) − ヘパリン対照血漿 ［イムノ社，ウイーン］ (３) プロテインＳの正常含量を有するＡＰＣ耐性血漿 − 「コーテスト(ＣＯＡＴＥＳＴ) ＡＰＣ耐性キッ
ト」 ［クロモゲニックス(Ｃhromogenix)，スェーデン］から
得られる 対照血漿レベル ２(Ｃopl ２) (４) 患者の血漿(Ｐ)、これらの患者には血栓発現傾向
があるが、プロテインＣおよびプロテインＳの正常レベ
ルを有する。
【００４８】
【表１】
【００４９】上記実験に基づくと、正常なＡＰＣ感受性
を有する血漿に対する比率範囲は、１.６５〜２.０５で
ある(平均 ± 標準偏差(ＳＤ)）。この範囲より値が小
さい場合は、ＡＰＣ感受性が弱められていることを示
す。この範囲より値が大きい場合は、ＡＰＣ感受性が強
められていることを示す。
を有する血漿に対する比率範囲は、１.６５〜２.０５で
ある(平均 ± 標準偏差(ＳＤ)）。この範囲より値が小
さい場合は、ＡＰＣ感受性が弱められていることを示
す。この範囲より値が大きい場合は、ＡＰＣ感受性が強
められていることを示す。
【００５０】本発明の好ましい態様について説明した
が、本明細書中に記載した説明および実施例は説明とし
て掲げたものであって、本発明を制限するものではな
い。本発明の範囲と精神を逸脱することなく、種々に変
更したり、改正したりすることができる。
が、本明細書中に記載した説明および実施例は説明とし
て掲げたものであって、本発明を制限するものではな
い。本発明の範囲と精神を逸脱することなく、種々に変
更したり、改正したりすることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハルトムート・ラング オーストリア、アー−2560グリレンベル ク、シュタインホーフシュトラーセ15番 (72)発明者 ベルタ・モリッツ オーストリア、アー−1030ヴィーン、ベア トリクスガッセ20番
Claims (19)
- 【請求項１】 試験サンプル中の活性化プロテインＣに
対する感受性を測定する方法であって、（ａ） カルシ
ウムイオンおよびリン脂質を含有する試験溶液中で、Ｘ
因子、活性化IＸ因子、活性化プロテインＣおよびトロ
ンビンを該試験サンプルと反応させ、（ｂ） 段階(ａ)
の反応で生成した活性化Ｘ因子の量を測定し、（ｃ）
段階(ｂ)の測定に基づいて、対照と比較することによ
り、活性化プロテインＣに対する試験サンプルの感受性
を評価するという段階から成る方法。 - 【請求項２】 該対照が、カルシウムイオンおよびリン
脂質の存在下、活性化プロテインＣを添加せずに、該試
験サンプルをＸ因子、活性化IＸ因子およびトロンビン
と反応させることにより製造した対照溶液から成り、ま
たそれによって生成した活性化Ｘ因子の量を測定する、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該IＸa因子がIＸaβ因子である、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項４】 色素産生基質を添加することにより該測
定段階を行う、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 Ｘ因子の濃度が０.０１〜１０Ｕ／ml、
また活性化プロテインＣの濃度が０.０５〜５Ｕ／mlで
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 IＸa因子の濃度が０.０５〜５Ｕ／ml、
またトロンビンの濃度が０.０１〜２.０Ｕ／mlである、
請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 リン脂質の濃度が０.０１〜１００nmol
／ml、またカルシウムイオンの濃度が１〜５０μmol／m
lである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 該試験サンプルが該試験溶液の１０％ｖ
／ｖ未満である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 該試験サンプルが該試験溶液の２％ｖ／
ｖ未満である、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１０】 該試験サンプルが該試験溶液の０.８
〜１.６％ｖ／ｖである、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 第１および第２試薬成分から成る、活
性化プロテインＣに対する試験サンプルの感受性を測定
するための試験キットであって、該第１試薬成分がIＸa
因子およびＸ因子、また該第２試薬成分が活性化プロテ
インＣから成る試験キット。 - 【請求項１２】 該第１試薬成分がさらにカルシウムイ
オン、また該第２試薬成分がさらにトロンビンおよびリ
ン脂質を含有する、請求項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１３】 該第１試薬成分がさらにカルシウムイ
オンおよびトロンビン、また該第２試薬成分がさらにリ
ン脂質を含有する、請求項１１に記載の試験キット。 - 【請求項１４】 第１、第２および第３試薬成分から成
る、活性化プロテインＣに対する試験サンプルの感受性
を測定するための試験キットであって、該第１試薬成分
がIＸa因子、Ｘ因子およびカルシウムイオン、該第２試
薬成分が活性化プロテインＣ、また該第３試薬成分がリ
ン脂質から成る試験キット。 - 【請求項１５】 該第１試薬成分がさらにトロンビンを
含有する、請求項１４に記載の試験キット。 - 【請求項１６】 該第３試薬成分がさらにトロンビンを
含有する、請求項１４に記載の試験キット。 - 【請求項１７】 活性化プロテインＣに対する試験サン
プルの感受性を測定するための試験試薬であって、IＸa
因子、Ｘ因子、トロンビン、活性化プロテインＣ、リン
脂質およびカルシウムイオンから成る試験試薬。 - 【請求項１８】 ＶIII因子を含まない、請求項１７に
記載の試験試薬。 - 【請求項１９】 IＸa因子の濃度が０.０５〜５Ｕ／m
l、Ｘ因子の濃度が０.０１〜１０Ｕ／ml、トロンビンの
濃度が０.０１〜２.０Ｕ／ml、活性化プロテインＣの濃
度が０.０５〜５Ｕ／ml、リン脂質の濃度が０.０１〜１
００nmol／ml、またカルシウムイオンの濃度が１〜５０
μmol／mlである、請求項１８に記載の試験試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US16087793A | 1993-12-03 | 1993-12-03 | |
| US160877 | 1993-12-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07194397A true JPH07194397A (ja) | 1995-08-01 |
Family
ID=22578845
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6300847A Pending JPH07194397A (ja) | 1993-12-03 | 1994-12-05 | 活性化プロテインｃに対する感受性を測定するためのアッセイ |
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|---|---|
| US (1) | US5643739A (ja) |
| EP (1) | EP0656424B1 (ja) |
| JP (1) | JPH07194397A (ja) |
| AT (2) | AT402824B (ja) |
| CA (1) | CA2137041C (ja) |
| DE (1) | DE59410041D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007101362A (ja) * | 2005-10-04 | 2007-04-19 | Hamamatsu Univ School Of Medicine | Ｅｉａプレート及びその利用方法 |
| JP2009198506A (ja) * | 2009-04-10 | 2009-09-03 | Shino Test Corp | 血液凝固反応抑制血漿タンパク質の活性測定方法及び活性測定試薬 |
| JP2017003307A (ja) * | 2015-06-05 | 2017-01-05 | 公立大学法人奈良県立医科大学 | 凝固第ｖｉｉｉ因子の複合体形成能に関する情報の取得方法および試薬キット |
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|---|---|---|---|---|
| EP0690991B2 (en) * | 1993-01-29 | 2004-01-14 | T.A.C. Thrombosis and Coagulation Aktiebolag | Novel anticoagulant cofactor activity |
| US5863896A (en) | 1995-11-09 | 1999-01-26 | Immuno Ag | Evaluation of substances for altering and for increasing APC response |
| AT403289B (de) * | 1996-01-30 | 1997-12-29 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines standardisierten plasmapools für diagnostische zwecke |
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| AUPP159698A0 (en) * | 1998-02-02 | 1998-02-26 | Life Therapeutics Limited | Improved blood coagulation test |
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| CA2864868A1 (en) | 2011-02-25 | 2012-11-15 | Wellstat Diagnostics, Llc | Assays for detecting enzymatic activity |
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|---|---|---|---|---|
| DE3407280A1 (de) * | 1984-02-28 | 1985-09-19 | Gödecke AG, 1000 Berlin | Testsatz zur bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit (ptt) mit erhoehter heparinempfindlichkeit |
| SE464135B (sv) * | 1989-07-14 | 1991-03-11 | Kabivitrum Ab | Foerfarande foer bestaemning av funktionell aktivitet av fritt protein s eller protein c i ett plasmaprov |
| US5169786A (en) * | 1989-12-19 | 1992-12-08 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Method of determining levels of extrinsic and intrinsic clotting factors and protein c |
| AT395597B (de) * | 1991-01-25 | 1993-01-25 | Immuno Ag | Reagens zur bestimmung von faktor viii-aktivitaet |
| CA2119761C (en) * | 1991-11-13 | 1997-12-16 | Bjorn Dahlback | Method for the diagnosis of blood coagulation disorders |
| US5308756A (en) * | 1991-11-20 | 1994-05-03 | Baxter Diagnostics Inc. | Protein S chromogenic assay |
-
1994
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- 1994-11-30 AT AT94890199T patent/ATE213023T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-11-30 CA CA002137041A patent/CA2137041C/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-11-30 EP EP94890199A patent/EP0656424B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-05 JP JP6300847A patent/JPH07194397A/ja active Pending
-
1995
- 1995-05-01 US US08/432,018 patent/US5643739A/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| ATE213023T1 (de) | 2002-02-15 |
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| AT402824B (de) | 1997-09-25 |
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