JPH07194397A - 活性化プロテインcに対する感受性を測定するためのアッセイ - Google Patents

活性化プロテインcに対する感受性を測定するためのアッセイ

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JPH07194397A JP6300847A JP30084794A JPH07194397A JP H07194397 A JPH07194397 A JP H07194397A JP 6300847 A JP6300847 A JP 6300847A JP 30084794 A JP30084794 A JP 30084794A JP H07194397 A JPH07194397 A JP H07194397A
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カタリン・ヴァラディ
Hans Peter Schwarz
ハンス・ピーター・シュヴァルツ
Hartmut Lang
ハルトムート・ラング
Berta Moritz
ベルタ・モリッツ
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Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 試験サンプル中の活性化プロテインCに対す
る感受性を測定するための改良されたアッセイを提供す
る。 【構成】 本発明のアッセイは、試験サンプル中の活性
化VIII因子による、添加したX因子のその活性型への
転化を測定することに基づく。対照と比較して、X因子
転化が相対的に阻害されることにより、試験サンプルの
活性化プロテインC感受性を測定する。活性化プロテイ
ンCに対する感受性が弱められた試験サンプルは、比較
的弱い阻害を示し、また活性化プロテインCに対する感
受性が強められた試験サンプルは、比較的強い阻害を示
す。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】発明の背景 本発明は、試験サンプル中の活性化プロテインC(「A
PC」)の作用を測定するためのアッセイであって、迅
速かつ正確な評価を確実なものとするよう改良されたア
ッセイに関する。試験サンプルには、活性化プロテイン
Cと共に作用する能力があると考えられる幾つかの物質
が含まれる。一般的に、これらの物質は血漿または血漿
分画である。
【0002】本発明のアッセイは、試験溶液中に存在す
る活性化VIII因子(「VIIIa因子」)によるX因子の活
性化X因子(「Xa因子」)への転化を測定することに基
づく。APCはこの転化を阻害する。
【0003】プロテインCは、肝臓で合成されるビタミ
ンK依存性の糖タンパクであり、不活性チモーゲンとし
て血漿中を約4μg/mlの濃度で循環する。このタンパ
クは、血管壁の表面(内皮)でトロンビン−トロンボモジ
ュリン複合体により活性セリンプロテアーゼ(APC)へ
と転化される。プロテインCはまた、へび毒液因子[プ
ロタック(Protac) C〈商標〉,ペンタファーム(Pent
apharm),スイス]といったような非生理的酵素によっ
て活性化することもできる。
【0004】APCはフィブリン溶解性を有するが、こ
れはプラスミノーゲン・アクチベータ・インヒビターを
不活性化するというAPCの能力により与えられる。A
PCはまた抗凝固作用を有するが、これはAPCがタン
パク分解によりVa因子およびVIIIa因子を分解するこ
とができるからである。Va因子は、Xa因子に誘導され
るプロトロンビンのトロンビンへの活性化のための補助
因子である。VIIIa因子は、Xa因子へのX因子転化の
補助因子である。上述のとおり、Xa因子はVa因子と共
に、プロトロンビンをトロンビンへと転化する際に必要
である。従って、APCを生成するためのインビボにお
けるプロテインCの活性化は、Va因子およびVIIIa因
子の分解を介してのトロンビン生成における負のフィー
ドバック反応より成る。
【0005】活性化プロテインCの正常活性に対する個
体の感受性は、「APC感受性」として定義される。A
PC感受性は、ある一定個体から得られる血漿サンプル
または分画といったような試験サンプルを用いて評価す
ることができる。APCに対する感受性が非常に強い人
々から得られる血漿サンプルまたは分画は、APCを投
与すると著しい抗凝固活性を示す。APC感受性が弱い
人々から得られる血漿サンプルは、最低の抗凝固活性し
か示さない。
【0006】補助因子であるプロテインSは、APCの
最適活性を発現させるのに必要である。プロテインS
は、APCの抗凝固特性および前フィブリン溶解特性に
関する非酵素性補助因子である。血漿中、プロテインS
は種々の型で存在する。これらの型には、遊離活性型お
よび不活性型が包含され、これが非共有結合的にC4b
−結合タンパクと複合体を形成する。プロテインSを除
去した血漿中では、APCはその正常活性を発現するこ
とはできない。プロテインSを添加することにより初め
て、APCはその正常活性を取り戻す。
【0007】APCは、用量依存的に血漿凝固時間を増
大する。APCの病態生理的役割は、先天性プロテイン
SまたはプロテインC欠乏症により起こる血栓発現傾向
を患っている人々において実証される。先天性プロテイ
ンS欠乏症は常染色体の優性遺伝によるものであり、青
年初期における静脈および動脈血栓塞栓症の発生を特徴
とする。APCの先天性異常により起こる他の悪影響に
は、微小血管系凝固、再潅流傷害および敗血症性ショッ
クが包含される[エスモン(Esmon),TCM2:214
−19(1992)を参照]。
【0008】種々の原因がAPC感受性を弱める原因と
なり得る。例えば、ダールベック(Dahlbaeck)らは、A
PCに対する弱い抗凝固応答を特徴とする症候群を発見
した[プロシーディング・オブ・ネイショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシーズ(Proc.Nat'l Acad.Sc
i.) USA 90:1004−08(1993)を参
照]。この症候群を患っている患者の血液は、正常レベ
ルのアンチトロンビン III、プロテインC、プロテイン
S、プラスミノーゲン、フィブリノーゲンおよび他の凝
固因子を有することが見いだされた。ダールベックら
は、今だ認識されていないAPCの補助因子が、この症
候群を患っている患者の血漿中に欠乏していると仮定し
た。この症候群は遺伝によるものと考えられる。そのよ
うな症候群が存在することから、APCを測定するため
の確実なアッセイが必要とされる。
【0009】個体の血液凝固障害を評価するための試験
が以前に開発された。方法は、WO93/10261に
記載されている。このアッセイは、血液凝固系のアクチ
ベータをAPCおよび、リン脂質やカルシウムイオンと
いったような補助物質と混合することに基づく。この方
法では、IXa因子およびXa因子を基礎とする凝固アッ
セイにより、ヒトAPCに対する抗凝固応答を評価す
る。この試験は、プロテインS欠乏症、もしくはAPC
耐性Va因子およびVIIIa因子によっては起こらない障
害の発見を可能とすると言われている。
【0010】WO 93/10261のアッセイには、
凝固カスケード全体が包含され、また1つ以上のインキ
ュベーション段階を使用する。このアッセイでは、高濃
度の血漿を必要とするが、これはこのアッセイが凝固カ
スケードの開始(カリクレイン)を伴うからである。これ
らの濃度は、血漿サンプル10%v/v以上であって、
通常、20〜35%v/v程に高い。反応混合物中の血
漿が高濃度であれば、サンプル中の因子がアッセイを妨
げ、それによってアッセイの感受性や特異性を弱める。
【0011】VIII因子活性のアッセイには、APC感
受性の評価における適用可能性が幾分ある。そのような
アッセイの1つは、米国特許出願第07/819,45
6号に記載されている。このアッセイで使用する試薬に
は、IXaβ因子、X因子、カルシウムイオン、トロンビ
ン、リン脂質、また所望によりXIa因子およびXIIa因
子が含まれる。このアッセイは、サンプル中に含まれる
VIII因子の作用であるX因子の活性化に基づく。次い
で、Xa因子を定量的に測定する。
【0012】このアッセイをAPCやその補助因子であ
るプロテインSといったようなVIII因子と反応するタ
ンパクを評価するために利用する場合には、過剰量のV
III因子をサンプルに添加して反応させる。その反応で
VIII因子の活性を弱めた後、VIII因子の色素産生試薬
を用いて、残っているVIII因子の量を測定する。しか
し、APC感受性を測定することに関しては、VIII因
子といったような、この活性に影響を及ぼす物質の比率
を血漿中で見られるレベルと同程度に維持するのが望ま
しい。さらに、APC感受性に関し、この方法は、1つ
よりも多いインキュベーション段階を必要とする。
【0013】発明の概要 本発明の目的は、個体のAPC感受性を測定するための
改良されたアッセイを提供することである。
【0014】本発明の目的はまた、APC感受性を測定
するための改良されたアッセイであって、VIII因子を
試験サンプルに添加する必要のないアッセイを提供する
ことである。
【0015】本発明の他の目的は、APC感受性を測定
するための改良されたアッセイであって、1つのインキ
ュベーション段階を必要とするだけのアッセイを提供す
ることである。
【0016】本発明のさらなる目的は、APC感受性を
測定するための改良されたアッセイであって、凝固カス
ケード全体を伴わないアッセイを提供することである。
【0017】本発明のまたさらなる目的は、APC感受
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
サンプルと共に存在する全ての血液凝固因子を測定する
必要のないアッセイを提供することである。
【0018】本発明のまたさらなる目的は、APC感受
性を測定するための改良されたアッセイであって、試験
を行うために最小限量の試験サンプルしか必要としない
アッセイを提供することである。
【0019】これらの目的を達成するという点で、本発
明の一態様により、血漿サンプルまたは分画といったよ
うな試験サンプルの活性化プロテインCに対する感受性
を測定するためのアッセイが提供された。本発明の一態
様により、そのアッセイでは、活性化IX因子(「IXa因
子」)、X因子、トロンビン、APC、カルシウムイオ
ンおよびリン脂質を使用する。好ましくは、IXa因子は
成熟型であり、これはIXaβ因子として知られている。
本発明のアッセイで使用する血漿の量は10%v/v以
上も必要ない。好ましい態様において、そのアッセイで
使用する血漿の量は2%未満であり、またさらに好まし
い態様において、血漿の量は0.8〜1.6%である。
【0020】本発明の他の態様により、試験サンプル中
の活性化プロテインCに対する感受性を測定する方法で
あって、(a)カルシウムイオンおよびリン脂質を含有
する試験溶液中で、X因子、活性化IX因子、活性化プ
ロテインCおよびトロンビンを試験サンプルと反応さ
せ、(b)段階(a)の反応で生成した活性化X因子の量
を測定し、そして段階(b)の測定に基づいて、対照と比
較することにより、活性化プロテインCに対する試験サ
ンプルの感受性を評価するという段階から成る方法が提
供される。対照は、活性化プロテインCが存在していな
い状態で、該試験サンプルを活性化IX因子、X因子、
トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と反応さ
せることを伴うのが好ましい。対照はまた、確立された
範囲の血液成分および活性に基づいた歴史的対照といっ
たような既知の知識を基礎としてもよい。
【0021】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインCに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第1および第2試薬成分から成る試験キットで
あって、該第1試薬成分がIXa因子およびX因子、また
該第2試薬成分が活性化プロテインCから成る試験キッ
トが提供される。トロンビン、カルシウムイオンおよび
リン脂質は該第1試薬成分または該第2試薬成分のいず
れかに存在する。
【0022】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインCに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための、第1、第2および第3試薬成分から成る試験キ
ットであって、第1試薬成分がIXa因子、X因子および
カルシウムイオン、第2試薬成分が活性化プロテイン
C、また第3試薬成分がリン脂質から成る試験キットが
提供される。またトロンビンは第1試薬成分または第3
試薬成分に存在する。
【0023】本発明のさらなる他の態様により、活性化
プロテインCに対する試験サンプルの感受性を測定する
ための試験試薬であって、IXa因子、X因子、トロンビ
ン、活性化プロテインC、リン脂質およびカルシウムイ
オンから成る試験試薬が提供される。好ましくは、その
試験試薬は、VIII因子を含まない。
【0024】好ましい態様の詳細な説明 個体のAPC感受性を測定するための確実かつ正確なア
ッセイに対する必要性が長期にわたって容認されてき
た。APC感受性異常を患っている人々は、血栓症や血
栓塞栓性疾患といったような障害を起こしやすい。AP
C感受性異常は、プロテインS欠乏症、APC阻害剤ま
たは補助因子、およびAPC耐性Va因子またはVIIIa
因子の欠乏または過剰により起こり得る。APC感受性
異常は、血液凝固カスケードにおける種々の欠陥により
起こり得るので、改良されるアッセイは、原因とは無関
係にAPC感受性を測定することが可能であるべきであ
る。
【0025】APC感受性のための本発明のアッセイ
は、X因子のXa因子への活性化に基づく。IXa因子お
よびVIIIa因子の存在下、X因子はXa因子へと活性化
される。Xa因子は、Xa因子の色素産生基質を使用する
ことにより検出され得る。Xa因子の存在はまた、プロ
トロンビンのトロンビンへの転化により、もしくは凝固
時間を測定することにより評価することができる。
【0026】本発明のアッセイは、血漿サンプルまたは
分画といったような試験サンプルを、精製IXa因子、X
因子、トロンビン、APC、カルシウムイオンおよびリ
ン脂質を含んでいる溶液に添加することを必要とする。
好ましくは、IXaβ因子として知られている成熟型のI
Xa因子をこのアッセイに使用する。IXa因子、X因
子、トロンビン、APC、カルシウムイオンおよびリン
脂質を「試験試薬」の形に組み合わせることができ、こ
れに試験サンプルを添加して「試験溶液」とする。VII
I因子は試験溶液に添加せず、VIII因子は試験サンプル
中に既存しているものを利用する。一般的に、試験試薬
中のこれらの物質は、2つまたはそれ以上の「試薬成
分」として予めパッケージした後、試験サンプルを添加
する直前に混合することができる。試験試薬を製造した
後は、1つのインキュベーション段階を行うだけで、試
験サンプルの評価を行うことができる。
【0027】上記精製血液因子を試験溶液に添加するの
で、凝固カスケード全体によらず、そのアッセイを行う
ことができる。このことは、より簡単かつ確実なアッセ
イを可能とし、またより低濃度の試験サンプルの使用を
可能とする。そのアッセイで使用する試験サンプルの量
を減らすことで、サンプル中のある血液因子が及ぼす阻
害作用が最小となり、もしくは排除される。
【0028】本発明のアッセイに関する他の有利な点
は、クマリンやヘパリンといったような物質を用いる抗
凝固療法によって、その結果が影響を受けないという点
であり、このことから患者のサンプルを試験することが
できる。この有利な点は、血栓塞栓性障害に対する抗凝
固療法を受けている患者を検査する際、またモニターす
る際に重要である。それらのAPC感受性状態に関する
正確な診断とモニタリングには、抗凝固療法がアッセイ
の結果に何ら不適当な影響を及ぼさないということが必
要である。
【0029】本発明のアッセイで使用するAPCの量
は、試験サンプル中に存在するVIIIa因子の約50%に
減らすべきである。APCは、0.05〜5U/mlの範
囲内であるのが好ましく、0.2〜0.4U/mlの範囲内
であるのが最も好ましい。試験サンプル中に存在するV
III因子の量は、本発明のアッセイに関する対照といっ
たような、種々の方法により測定することができる。試
験サンプル中に存在するVIII因子の量は、使用するA
PCの量に影響する。そのアッセイで使用するX因子の
量は、約0.01〜10U/mlであるべきである。
【0030】そのアッセイ中に血餅形成が起こるのを防
ぐため、テトラペプチド(AcOH−Gly−Pro−Arg−
Pro−OH)を試薬に添加することが多い。またポリブ
レンといったようなヘパリン中和剤をそのアッセイに使
用することもできる。
【0031】本発明のアッセイはVIII因子の添加を必
要としない。試験サンプルがVIII因子を正常量の0.3
〜1.5倍含んでいるなら、そのアッセイは試験サンプ
ル中に通常存在するVIII因子に依存することができる
が、このことは本発明のアッセイに関する対照により、
もしくは他の方法により測定することができる。試験サ
ンプル中に存在するVIII因子は、そのアッセイで添加
するトロンビンにより活性化される。さらに、試験サン
プルまたは試験溶液は、正常レベルの少なくとも50%
のプロテインSを含有すべきであるが、このことは機能
的アッセイにより測定することができる。プロテインS
欠乏症であることが知られている、もしくは疑われてい
る場合には、プロテインSを試験溶液に添加することが
できるが、この場合には他の血液因子の評価が望まれ
る。
【0032】好ましい態様において、そのアッセイは、
APCの存在下、またAPCが存在していない状態(対
照)で、試験サンプルをX因子、IXa因子(IXaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオンおよびリン脂質と
反応させることから成る。X因子、IXa因子(IXaβ因
子)、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質および
APCと反応させた試験サンプルを含んでいる試験バイ
アルならば、Xa因子に関して評価できよう。これらの
結果を、APCを添加せずに、IXa因子(IXaβ因子)、
X因子、トロンビン、カルシウムイオン、リン脂質と反
応させた試験サンプルを含んでいる対照バイアルから得
られる結果と比較する。対照において生成したXa因子
の量を、試験において生成したXa因子の量で割ること
に基づく比率が、試験サンプルのAPC感受性を示す。
【0033】APC感受性異常の原因に関係なく、本発
明のアッセイは、APCの作用を評価するのに利用する
ことができる。例えば、本発明のアッセイは、APC耐
性VIIIa因子が存在している場合でも、弱められたAP
C感受性を検出することができる。そのような場合、V
IIIa因子はAPCにより分解され得ないが、それでもな
おVIIIa因子は、X因子をXa因子に転化するという、
その正常機能を行うことができる。このアッセイはま
た、APCの天然阻害剤が関係する先天性異常を検出す
るのにも適当である。
【0034】本発明のアッセイの利用は、予めパッケー
ジされた試験キットと試薬成分により容易とすることが
できる。その因子と他の物質は、分解度に応じて保存す
るのが好ましい。例えば、多成分から成るアッセイ用の
試験キットは、簡用性を確実にし、貯蔵期間を最大にす
るために開発された。
【0035】これらの試験キットは、2つまたは3つの
試薬成分から成るのが好ましい。3つの試薬成分から成
る試験キットが好ましいが、これはそのようなキットで
は、APCを分けて保存するので、容易に利用できるか
らである。試験キットに関する製剤例を以下に示す。
【0036】本発明のアッセイは、本発明の試薬を製造
するための第1試薬成分Aと第2試薬成分Bを含む試験
キットを用いると行いやすい。試薬成分Aは、IXa因子
およびX因子並びにカルシウムイオンを含み、また試薬
成分Bは、トロンビン、リン脂質およびAPCを含む。
【0037】また本発明の試薬を製造するための試薬成
分Cと試薬成分Dから成る試験キットを使用することも
できる。試薬成分Cは、IXa因子およびX因子、カルシ
ウムイオン並びにトロンビンを含み、また試薬成分D
は、リン脂質およびAPCを含む。
【0038】本発明のアッセイはまた、3成分から成る
試験キットを使用することもできる。個体成分としてA
PCを含み、3成分から成る試験キットが好ましいが、
これはそのキットが試験サンプルや対照サンプルを評価
するのに容易に適合させることができるからである。A
PCがそのバイアル自体に含まれているので、APC
(試薬成分)を同体積の緩衝剤に置き換えることにより、
対照を簡単に行うことができる。
【0039】ある3成分から成る試験キットは、本発明
の試薬を製造するための第1試薬成分E、第2試薬成分
Fおよび第3試薬成分Gから成る。試薬成分Eは、IXa
因子およびX因子並びにカルシウムイオンを含む。試薬
成分Fは、トロンビンおよびリン脂質を含む。試薬成分
Gは、APCを含む。
【0040】3成分から成る最も好ましいキットでは、
リン脂質もまた他の全ての物質から分けられている。こ
の分離はさらに、試薬成分の安定性を高める。3成分か
ら成る好ましいキットは、本発明の試薬を製造するため
の第1試薬成分H、第2試薬成分Iおよび第3試薬成分
Jから成る。試薬成分Hは、IXa因子およびX因子、カ
ルシウムイオン並びにトロンビンを含む。試薬成分I
は、リン脂質を含む。試薬成分Jは、APCを含む。
【0041】試薬にはIXaβ因子を使用するのが好まし
いが、これは確実に安定な試薬とするからである。IXa
β因子は、セライト〈商標〉[ジョン−マンビラ社(Jo
hn−Manville Corp.)]を使用する標準的な技術によ
りヒトの血漿から得られる。さらなる凝固因子であるX
Ia因子およびXIIa因子が存在するということはまた、I
Xa因子の活性を維持するのにも有用となり得る。
【0042】本発明の試薬は、IXaβ因子を0.05〜
5U/mlの範囲内で、X因子を0.01〜10U/mlの
範囲内で、トロンビンを0.01〜2.0U/mlの濃度範
囲内で、リン脂質を0.01〜100nmol/mlの範囲内
で、カルシウムイオンを1〜50μmol/mlの範囲内
で、またAPCを0.05〜5U/mlの範囲内で含有す
るのが好ましい。
【0043】ヒトの血液凝固因子、トロンビンおよび活
性化プロテインCを使用するのが好ましい。これらの成
分を感染物質不活化処置しておくことがさらに好まし
い。
【0044】以下の実施例には、種々の試験サンプルで
のAPC感受性測定から得られた結果が含まれる。
【0045】
【実施例】
〈実施例 1〉 3成分から成る試験キットを用いてのA
PC感受性アッセイ 以下の試験キットを使用した。 試薬成分H(100μl) : IXaβ因子、X因子、カ
ルシウムイオン、トロンビンおよびアルブミン 試薬成分I(100μl) : リン脂質およびアルブミ
ン 試薬成分J (50μl) : 活性化プロテインC(AP
C)(2U/ml) 各々の試薬成分の成分物質は、米国特許出願第07/8
19,456号および同第07/905,541号により
調製することができる。これらの成分物質を調製する方
法は、他にも広く知られている。またこれらの成分物質
は、市販されているものもある。例えば、成分Hと成分
Iは、イムノクロム[(IMMUNOCHROM)〈商
標〉 F VIII:C,イムノ社(IMMUNO AG)]と
いう商品名で市販されている。
【0046】試薬成分を血漿サンプル50μlと混合
(1:20で希釈)して、37℃で5分間インキュベート
する。次いで、色素産生基質の希釈溶液200μl[イ
ムノクロム〈商標〉 F VIII:C,イムノ社の取扱説
明書より、CH3OCO−D−CHA−GLY−ARG
−pNA−AcOH(4mmol/l)]を用いて、生成したX
a因子を測定する。この溶液はまた、トロンビンを阻害
するためのα−NAPAPと、X因子のさらなる活性化
を停止するためのEDTAを含む。5分間インキュベー
ションした後、酢酸(水溶液,50%v/v)100μl
を用いて反応を停止し、終点法評価を行った。試験中に
生成したXa因子の量を示すために、吸光度を405nm
で測定した。対照実験では、血漿サンプルを試薬成分H
および試薬成分I並びに緩衝剤50μlのみと共にイン
キュベートする。対照は添加APCを欠いている。2つ
のアッセイ混合物(APCを含むものと含まないもの)に
関する吸光度の比率を計算する。
【0047】〈実施例 2〉 サンプル試験 実施例Iで使用した3成分から成る試験キット用いて、
以下の試験サンプルを試験した。 (1) クエン酸を添加した正常血漿(C−npl)(サンプ
ルナンバー:18) − 凍結乾燥した標準血漿 100% [イムノ社,ウイ
ーン] − 凍結した正常対照血漿 [ジョージ・キング(Georg
e King),米国] − 健康な有志者の凍結した血漿サンプル (VIII因子の正常レベルの40〜120%) (2) ヘパリン処理した正常血漿(H−npl) − ヘパリン対照血漿 [イムノ社,ウイーン] (3) プロテインSの正常含量を有するAPC耐性血漿 − 「コーテスト(COATEST) APC耐性キッ
ト」 [クロモゲニックス(Chromogenix),スェーデン]から
得られる 対照血漿レベル 2(Copl 2) (4) 患者の血漿(P)、これらの患者には血栓発現傾向
があるが、プロテインCおよびプロテインSの正常レベ
ルを有する。
【0048】
【表1】
【0049】上記実験に基づくと、正常なAPC感受性
を有する血漿に対する比率範囲は、1.65〜2.05で
ある(平均 ± 標準偏差(SD))。この範囲より値が小
さい場合は、APC感受性が弱められていることを示
す。この範囲より値が大きい場合は、APC感受性が強
められていることを示す。
【0050】本発明の好ましい態様について説明した
が、本明細書中に記載した説明および実施例は説明とし
て掲げたものであって、本発明を制限するものではな
い。本発明の範囲と精神を逸脱することなく、種々に変
更したり、改正したりすることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハルトムート・ラング オーストリア、アー−2560グリレンベル ク、シュタインホーフシュトラーセ15番 (72)発明者 ベルタ・モリッツ オーストリア、アー−1030ヴィーン、ベア トリクスガッセ20番

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 試験サンプル中の活性化プロテインCに
    対する感受性を測定する方法であって、(a) カルシ
    ウムイオンおよびリン脂質を含有する試験溶液中で、X
    因子、活性化IX因子、活性化プロテインCおよびトロ
    ンビンを該試験サンプルと反応させ、(b) 段階(a)
    の反応で生成した活性化X因子の量を測定し、(c)
    段階(b)の測定に基づいて、対照と比較することによ
    り、活性化プロテインCに対する試験サンプルの感受性
    を評価するという段階から成る方法。
  2. 【請求項2】 該対照が、カルシウムイオンおよびリン
    脂質の存在下、活性化プロテインCを添加せずに、該試
    験サンプルをX因子、活性化IX因子およびトロンビン
    と反応させることにより製造した対照溶液から成り、ま
    たそれによって生成した活性化X因子の量を測定する、
    請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 該IXa因子がIXaβ因子である、請求項
    1に記載の方法。
  4. 【請求項4】 色素産生基質を添加することにより該測
    定段階を行う、請求項1に記載の方法。
  5. 【請求項5】 X因子の濃度が0.01〜10U/ml、
    また活性化プロテインCの濃度が0.05〜5U/mlで
    ある、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項6】 IXa因子の濃度が0.05〜5U/ml、
    またトロンビンの濃度が0.01〜2.0U/mlである、
    請求項5に記載の方法。
  7. 【請求項7】 リン脂質の濃度が0.01〜100nmol
    /ml、またカルシウムイオンの濃度が1〜50μmol/m
    lである、請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項8】 該試験サンプルが該試験溶液の10%v
    /v未満である、請求項1に記載の方法。
  9. 【請求項9】 該試験サンプルが該試験溶液の2%v/
    v未満である、請求項9に記載の方法。
  10. 【請求項10】 該試験サンプルが該試験溶液の0.8
    〜1.6%v/vである、請求項9に記載の方法。
  11. 【請求項11】 第1および第2試薬成分から成る、活
    性化プロテインCに対する試験サンプルの感受性を測定
    するための試験キットであって、該第1試薬成分がIXa
    因子およびX因子、また該第2試薬成分が活性化プロテ
    インCから成る試験キット。
  12. 【請求項12】 該第1試薬成分がさらにカルシウムイ
    オン、また該第2試薬成分がさらにトロンビンおよびリ
    ン脂質を含有する、請求項11に記載の試験キット。
  13. 【請求項13】 該第1試薬成分がさらにカルシウムイ
    オンおよびトロンビン、また該第2試薬成分がさらにリ
    ン脂質を含有する、請求項11に記載の試験キット。
  14. 【請求項14】 第1、第2および第3試薬成分から成
    る、活性化プロテインCに対する試験サンプルの感受性
    を測定するための試験キットであって、該第1試薬成分
    がIXa因子、X因子およびカルシウムイオン、該第2試
    薬成分が活性化プロテインC、また該第3試薬成分がリ
    ン脂質から成る試験キット。
  15. 【請求項15】 該第1試薬成分がさらにトロンビンを
    含有する、請求項14に記載の試験キット。
  16. 【請求項16】 該第3試薬成分がさらにトロンビンを
    含有する、請求項14に記載の試験キット。
  17. 【請求項17】 活性化プロテインCに対する試験サン
    プルの感受性を測定するための試験試薬であって、IXa
    因子、X因子、トロンビン、活性化プロテインC、リン
    脂質およびカルシウムイオンから成る試験試薬。
  18. 【請求項18】 VIII因子を含まない、請求項17に
    記載の試験試薬。
  19. 【請求項19】 IXa因子の濃度が0.05〜5U/m
    l、X因子の濃度が0.01〜10U/ml、トロンビンの
    濃度が0.01〜2.0U/ml、活性化プロテインCの濃
    度が0.05〜5U/ml、リン脂質の濃度が0.01〜1
    00nmol/ml、またカルシウムイオンの濃度が1〜50
    μmol/mlである、請求項18に記載の試験試薬。
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