DE2754944A1 - Verfahren und reagens zur bestimmung von ascorbinsaeure - Google Patents

Verfahren und reagens zur bestimmung von ascorbinsaeure

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Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, DiPL1-PHYS-DR1TCFiNCKE
Dipl.-Ing. F. A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing.H.Liska
8 MÜNCHEN 86, DEN » Q· Ü62.
POSTFACH 860 820
MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22
HCH
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BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Sandhofer Straße 112-132, 6800 Mannheim
Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure.
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure und ein zur Durchführung des Verfahrens geeignetes Reagens.
Die Bestimmung von Ascorbinsäure ist vor allem in der Lebensmitte Ichemi e von großer Bedeutung. Sie wird zur Beurteilung der Qualität verschiedener Nahrungsmittel benötigt, wie z. B. die von Obstsäften, Frischgemüse, Tiefkühlgemüse und anderen Proben. Oft wird gerade bei Erfrischungsgetränken ein bestimmter Vitamin C-gehalt deklariert, der dann auch gehalten werden muß. Aber auch als Antoxidans und als Schönungsmittel wird Ascorbinsäure zugesetzt und muß dann bestimmt werden. Im klinisch-diagnostischen Bereich ist der Ascorbinsäuregehalt vor allem im Urin von Interesse, wo er zu Störungen in den verschiedenen, auf Red-Ox-Reaktionen beruhenden Schnelldiagnostika Anlaß gibt. Die Ascorbatbestimmung im Serum ist in tropischen Ländern von Interesse, da hier Avitaminosen (Skorbut) oft von den Symptomen anderer Krankheiten so überdeckt sind, daß sie nicht zu diagnostizieren sind. Aufgrund der Bedeutung der Ascorbinsäurebestimmung sind schon verschiedene Verfahren entwickelt und publiziert worden, deren Spezifität aber in der Regel gering ist und die einen zum Teil erheblichen Aufwand erfordern. Eine Zusammenfassung der bekannten Verfahren, ihrer Spezifität und ihrer Praktikabilität findet sich in Handbuch der Lebensmittelchemie, Hrg. J. Schormüller, Bd. II, 2, Springer-Verlag Berlin-Heidelberg, 1967, 764-789.
Die obigen Ausführungen gelten auch für die Dehydroascorbinsäure. Ascorbinsäure wird nämlich durch Luftsauerstoff leicht in Dehydroascorbinsäure überführt. Im Probenmaterial liegt daher häufig eine Mischung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure vor. Da Dehydroascorbinsäure die gleiche Vitaminwirkung besitzt wie Vitamin C, ist es zumeist sinnvoll zu prüfen, wie groß der Dehydroascorbatgehalt der Probe ist.
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Es sind auch bereits Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalzen bekannt geworden. Diese Reaktionen verlaufen entsprechend der Gleichung:
Tetrazoliumsalz + Ascorbat )Formazan + Dehydroascorbat + H
Diese Verfahren, die in alkalischem Milieu durchgeführt werden müssen, werden jedoch durch zahlreiche Substanzen stark gestört und wurden daher auch von den Entwicklern nur zur Bestimmung von Reinsubstanzen bzw. für pharmazeutische Zubereitungen, die keine größeren Mengen an Störsubstanzen enthalten, vorgeschlagen. In eigenen Versuchen konnte die Brauchbarkeit dieser Methoden nicht bestätigt werden.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure zu schaffen, welches die oben angegebenen Nachteile nicht aufweist, spezifischer als die bekannten Verfahren ist und insbesondere nicht die Störungsanfälligkeit gegenüber Fremdsubstanzen aufweist, die bisher bei Verwendung von Tetrazoliumsalzen auftrat. Ein Ziel der Erfindung ist auch die Schaffung eines Verfahrens der vorstehend bezeichneten Art, welches auch auf Dehydroascorbinsaure angewendet werden kann.
Es wurde nunmehr gefunden, und hierauf beruht die Erfindung, daß in schwach saurem pH-Wert mit ganz bestimmten Tetrazoliumsalzen in Gegenwart eines bestimmten Elektronenüberträgers und eines oberflächenaktiven Mittels die Störung durch Fremdsubstanzen praktisch vollständig ausgeschaltet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure mittels Tetrazoliumsalz unter Messung der erhaltenen Färbung ist daher dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlo-
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rid oder Distyryl-nitroblau-tetrazoliumchlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Detergenz bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.
Unter den verwendbaren Tetrazoliumsalzen ergibt das 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid, im folgenden als MTT bezeichnet, die besten Ergebnisse und wird daher im Rahmen der Erfindung bevorzugt. Das Tetrazoliumsalz wird vorzugsweise in einer Menge von 0,01 bis 1 mMol/1 Testlösung, besonders bevorzugt von 0,05 bis 0,15 mMol/1 verwendet.
Wie oben erwähnt, ist es wesentlich für das Verfahren der Erfindung, daß bei schwach sauren pH-Werten gearbeitet wird. In diesem pH-Wertbereich findet keine Reaktion mit den meisten Störsubstanzen statt bzw. wird die Reaktion so verlangsamt, daß sie praktisch bedeutungslos wird. Allerdings ist bei diesem sauren pH-Wert auch die Umsetzungsgeschwindigkeit mit der Ascorbinsäure so gering, daß ein praktisches Bestimmungsverfahren hierauf nicht aufgebaut werden könnte. Durch das Phenazinmethosulfat in Kombination mit dem Detergenz wird jedoch spezifisch die Umsetzung der Ascorbinsäure so beschleunigt, daß trotzdem befriedigende Reaktionsgeschwindigkeiten erzielt werden, überraschenderweise wird die Reaktion mit den Störsubstanzen jedoch durch die genannten Zusätze nicht beschleunigt.
Zur Einstellung des schwach sauren pH-Wert-bereichs, vorzugsweise eines pH-Werts zwischen 4,5 und 6,0 und besonders bevorzugt zwischen 4,8 und 5,3, eignen sich verschiedene Puffersysteme. Diejenigen Puffersysteme, die im genannten pH-Bereich puffern, sind dem Fachmann bekannt. Gute Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mit Phosphatpuffer, TRA-Puffer und Phosphat/Citrat-Puffer erzielt und diese Puffer werden daher bevorzugt. Besonders gute Ergebnisse liefert der Phosphat/Citrat-Puffer, da mit diesem Puffer die Proportionalität der Extinktionsänderung durch den gebildeten Farbstoff bei allen Ascorbatmengen am besten erfüllt wird. Die zweckmäßige Pufferkonzentration
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liegt zwischen 0,05 und 1 molar, bevorzugt werden 0,1 bis 0,5 Mol/l.
Das jeweils geeignete Detergenz kann leicht durch einige Versuche festgestellt werden. Die höchsten Reaktionsgeschwindigkeiten wurden mit Benzalkoniumchlorid (Zephirol) erzielt. Bei manchen Proben führte dieses Detergenz jedoch zur Bildung von Niederschlagen, welche die Bestimmung stören können. Als bester Kompromiß zwischen Reaktionsbeschleunigung und Klarhaltung der Probelösungen erwiesen sich die Alkylaryl-polyäthylenglykolester. Andere Beispiele für gut geeignete Detergentien sind Polyoxyäthylensorbitanester, wie Sorbimacrogol-stearat oder Polyäthylenglykollaurylather. Als Gruppe werden daher die nichtionogenen Polyäthylenglykolester und -äther im Rahmen der Erfindung bevorzugt, ganz besonders bevorzugt wird der Octyl-phenol-polyäthylenglykolester (Triton X100).
Für die Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit reichen im allgemeinen Konzentrationen zwischen 0,1 und 1 % des Detergenz aus. Oberhalb von 1 % wurde eine weitere Zunahme der Reaktionsgeschwindigkeit nicht mehr festgestellt. Da im Rahmen der Erfindung das Detergenz jedoch nicht nur als Reaktionsbeschleuniger wirkt, sondern auch die Löslichkeit des gebildete Formazans verbessert, werden Zusätze zwischen 1 und 2 % bevorzugt.
Die Beschleunigung der Reaktion wird außerdem durch das Phenazinmethosulfat (PMS) bewirkt, welches die Reaktionsgeschwindigkeit vervielfacht und vor allem einen quantitativen Umsatz bewirkt. Mit anderen, bekannten Elektronenüberträgern wurde diese Beschleunigungswirkung nicht festgestellt. Die Konzentrationen können zwischen 0,01 und 1 inMol/1 liegen, in Ausnahmefällen auch darüber und darunter. Als besonders geeignet erwies sich eine Konzentration zwischen 0,05 und 0,15 mMol/1, da hierbei noch keine Reaktion mit SH-gruppenhaltigen Verbindungen, wie Homocystein, eintritt. Derartige SH-gruppenhaltige Verbindungen können zugesetzt werden, wenn vorhandenes Dehy-
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droascorbat gleichzeitig zu Ascorbat oxidiert werden soll. Hierauf wird weiter unten noch eingegangen.
Wenn die zu untersuchende Probe zur Chelatbildung neigende, zweiwertige Metallionen enthält, so können Chelate mit dem gebildeten Formazanfarbstoff entstehen, welche die Meßwerte beeinflussen können. Die Chelatbildung wird zwar durch den bevorzugt verwendeten Citrat/Phosphat-Puffer weitgehend ausgeschaltet. Es erwies sich jedoch als zweckmäßig, außerdem noch kleine Mengen von Sequestrierungsmitteln, wie Äthylendiamintetraessigsäure u.a., zuzusetzen. Geeignete Mengen liegen im allgemeinen zwischen 0,1 und 5 mMol/1. Für besondere Zwecke, insbesondere bei der Analyse von Proben mit sehr hohem Gehalt an zweiwertigen Metallionen, können jedoch auch größere Zusätze zweckmäßig sein.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Parallelprobe mitgeführt, welche das gleiche Reagens enthält wie der Bestimmungsansatz, zusätzlich jedoch noch Ascorbatoxidase enthält. Die Ascorbatoxidase oxidiert spezifisch das in dem Parallelansatz enthaltene Ascorbat. Nach Ablaufen dieser Oxidationsreaktion wird diese Parallelprobe dann als Leerwert für die eigentliche Ascorbinsäurebestimmung verwendet. Dies heißt, daß die Extinktion des Leerwerts von der Extinktion der eigentlichen Meßreaktionslösung subtrahiert wird und die Differenz der Berechnung der Ascorbinsäuremenge zugrunde gelegt wird.
Diese bevorzugte Ausführungsform der Erfindung steigert die Spezifität der Methode noch weiter, insbesondere dann, wenn in der Probelösung noch andere Substanzen vorhanden sind, bei denen eine Reaktion mit dem Tetrazoliumsalz nicht auszuschließen ist. Die Ascorbatoxidase wird zweckmäßig in Mengen zwischen 1 und 50 ü/ml Testlösung eingesetzt. Für Reihenanalysen bestimmter, weitgehend gleich zusammengesetzter Proben, insbesondere von Nahrungsmitteln, läßt sich leicht durch weni-
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ge Vorversuche feststellen, welche Ascorbatoxidasemenge in der Regel ausreicht, um vorhandenes Ascorbat quantitativ zu oxidieren.
Wie bereits erwähnt läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung der Dehydroascorbinsäure einsetzen. Zu diesem Zweck wird die Dehydroascorbinsäure zuerst in Ascorbin säure überführt und diese dann in der oben beschriebenen Weise bestimmt. Die Reduktion erfolgt zweckmäßig mit einer organischen Sulfhydrylverbindung. Bevorzugt wird Homocystein. Das Reduktionsmittel wird dabei im Überschuß verwendet und die Reduktion in neutralem oder schwach alkalischem Medium durchgeführt. Wird eine Sulfhydrylverbindung verwendet, so erweist sich eine Reduktion bei pH-Werten zwischen 7 und 8 als vorteilhaft. Bei dem bevorzugten Homocystein werden bei pH-Werten um etwa 7,5 beste Ergebnisse erzielt. Wenn anschließend für die Bestimmung der gebildeten Ascorbinsäure der schwach saure pH-Wert eingestellt wird, läuft die Umsetzung mit der Ascorbinsäure glatt ab, ohne daß die überschüssige Sulfhydrylverbindung im Laufe der Reaktion neu gebildete Dehydroascorbinsäure wieder zurückreduziert und damit das Ergebnis verfälscht.
Diese Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens läßt sich auch zur Bestimmung von Dehydroascorbinsäure neben Ascorbinsäure einsetzen. Hierzu ist es lediglich notwendig, in einer Probe in der vorstehend beschriebenen Weise Ascorbinsäure zu bestimmen und in einer zweiten Probe zuerst die Dehydroascorbinsäure, wie oben angegeben, zu reduzieren und danach die Bestimmung durchzuführen. Aus der Differenz der beiden Werte ergibt sich dann die Dehydroascorbinsäuremenge.
Unter den bevorzugten Bedingungen läuft das Verfahren der Erfindung in etwa 30 Minuten quantitativ ab, d. h. die Reaktion kommt nach ungefähr einer halben Stunde zum Stillstand. Die
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Messung kann beispielsweise in einem handelsüblichen Photometer bei einer für die Bestimmung des gebildeten Farbstoffs geeigneten Wellenlänge, wie 578 nm durchgeführt werden. Es lassen sich jedoch auch die anderen bekannten Methoden zur Bestimmung der Stärke einer entwickelten Färbung einsetzen. Auch die Auswertung durch Farbvergleich führt zu befriedigenden Ergebnissen, insbesondere wenn das erfindungsgemäße Verfahren auf einem Teststreifen durchgeführt wird.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure mit einem Gehalt an Tetrazoliumsalz und Puffer, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Tetrazoliumsalz eine Verbindung aus der Gruppe 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliumblau-, Tetrazoliumblauchlorid oder Distyrylnitroblau-tetrazoliumchlorid und außerdem Phenazinmethosulfat, Detergenz und schwach saure Puffersubstanz sowie gegebenenfalls ein Sequestrierungsmittel für zweiwertige Metallionen oder/und Ascorbat oder/und eine Sulfhydrylverbindung enthält.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Reagens als Puffersubtanz Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,5 bis 6. Die bevorzugte Tetrazoliumsalzverbindung ist MTT.
Ein bevorzugtes Reagens der oben genannten Art enthält
0,01 bis 1 mMol/1 Tetrazoliumsalz,
0,01 bis 1 mMol/1 PMS,
0,1 bis 2 % V/V Detergenz,
0,1 bis 1 Mol/l Puffersubstanz,
1 bis 50 U/ml Ascorbatoxidase und
0,1 bis 10 mMol/1 Sequestrierungsmittel, jeweils bezogen auf die Konzentration in der fertigen Testlösung. Das erfindungsgemäße Reagens kann in trockener oder flüssiger Form, als Konzentrat oder gebrauchsfertige Lösung
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vorliegen. Sämtliche Bestandteile, ausgenommen die Ascorbinoxidase, können vorgemischt vorliegen.
Ein besonders bevorzugtes Reagens der obigen Art enthält
0,05 bis 0,15 mMol/1 MTT,
0,05 bis 0,15 mMol/1 PMS,
O,5 bis 1,5 % V/V Octylphenol-polyäthylenglykolester, 0,5 bis 5 mMol EDTA,
0,1 bis 0,4 mMol/1 Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,8 bis 5,3
1 bis 10 U/ml Ascorbatoxidase.
Die Erfindung schafft eine einfache und spezifische Methode zur Bestimmung von Ascorbinsäure (Vitamin C) und Dehydroascorbinsäure, die gegenüber bekannten Verfahren wesentlich spezifischer und weniger störungsanfällig ist und mit einfachen Mitteln durchgeführt werden kann. Die Erfindung schafft auch zur Durchführung des Verfahrens geeignete P.eagentien, die auch in Form eines Teststreifens angewendet werden können. Bei derartigen Teststreifen wird ein entsprechendes, vorzugsweise blattförmiges Trägermaterial, beispielsweise saugfähiges Papier, wie Filterpapier oder Kunststoffolie, mit dem Reagens imprägniert und dann entweder in die zu untersuchende Probe eingebracht oder diese Probe aufgetropft. Die Auswertung kann dann durch Farbvergleich erfolgen. Herstellung und Aufbau von Teststreifen sind dem Fachmann bekannt und bedürfen hier keiner näheren Beschreibung.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter. Beispiel 1
Phosphat/Citrat-puffer, oberflächenaktives Mittel, Sequestrierungsmittel, Tetrazoliumsalz, PMS sowie Wasser und Probe wurden in die Küvette eines handelsüblichen Photometers einge-
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bracht, die Reaktion ablaufen gelassen und die Extinktionsdifferenz gegen Luft oder Wasser gemessen. In einer parallelen Leerwertprobe wurde außerdem Ascorbatoxidase eingesetzt. Die gleiche Ascorbatoxidasemenge wurde der Meßwertprobe nach Beendigung der Reaktion zugesetzt, um durch die Ascorbatoxidase selbst etwa hervorgerufene Extinktionsdifferenzen auszugleichen.
Die Einzelheiten des Verfahrens, die verwendeten Reagentien und ihre Mengen ergeben sich aus der nachstehenden Tabelle.
TABELLE
Leerwert
(ml)		 Probe
(ml)		 Konzentration im Test
Na2HPO4 0,4 Mol/l/
Citronensäure O,2
Mol/l, pH 5 + 3 %
Triton X1OO +
2 mMol/1 ETDA		 1,5 1,5 Na2HPO4 0,2 Mol/l Citronen
säure 0,2 Mol/l, Triton X100
1,5 % EDTA/1 mMol/1
Wasser
Probe		 1,0
0,1		 1,0
0,1		 1-50/UMol/l =0,176 - 8,8 mg/
1 Ascorbat
AAO 5OO U/ml 0,02 ....... 3,3 U/ml Testlösung
2 min inkubieren, mMol/1 dann ,2 0, 2 0 ,1 mMol/1
MTT 1, 5 mMol/1 ,2 0, 2 0 ,1 mMol/1
PMS 1, 5
0
0
inkubieren, bis die Reaktion zum Stillstand gekommen ist (ca. 30 min)
AAO 500 U/l
0,02
3,3 U/l
Die oben angegebene Zusammensetzung eignet sich zur Bestimmung von 5 bis 250 mg Ascorbat pro Liter Probeflüssigkeit. Bei höheren Konzentrationen ist die Probe entsprechend zu verdünnen.
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Bei geringeren Konzentrationen kann die Probemenge erhöht werden. Der Wassergehalt wird dann entsprechend erniedrigt.
Beispiel 2
Ascorbatbestiiranung in Orangensaft.
Von einem käuflichen Orangensaft wurde 0,1 ml direkt als Probe wie in Beispiel 1 beschrieben, eingesetzt. Es fanden sich 305 mg Vitamin C/l. Das entspricht der Deklaration von 4 Pfund reifen Orangen (= 300 mg/1). Zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100 % wiedergefunden. Schleichreaktionen traten nicht auf und die geringe Trübung des Orangensafts blieb ohne Einfluß auf die Bestimmung.
Beispiel 3
2,0 g eines Citronenteegetränks (Nestea) wurden in 20 ml H2O gelöst und 0,1 ml dieser Lösung in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Gefunden wurden 96 mg Vitamin C/100 g Trockenmasse. Schleichreaktionen wurden nicht festgestellt. Der Probe vor dem Auflösen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 99,2 % wiedergefunden. Die geringe Trübung der Lösung war ohne Einfluß auf den Test.
Beispiel 4
Bestimmung in Hagebutten.
5 ml Hagebuttenkonzentrat wurden in 100 ml H-O gelöst. Davon wurden nach dem Zentrifugieren 0,1 ml in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 1770 mg Vitamin C/l Konzentrat. Ein leichter Schleich trat in Probe und Leerwert auf. Er wurde durch Extrapolation beücksichtigt. Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 1OO,9 % wieder-
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gefunden. Die leichte Färbung des so verdünnten Extrakts stör te die Bestimmung nicht.
Beispiel 5
Bestimmung in Johannisbeersaft.
1 ml schwarzer Johannisbeersaft wurde mit Wasser auf 10 ml verdünnt und davon O,1 ml in den Test nach Beispiel 1 eingesetzt. Es fanden sich 3O5 mg Vitamin C/l. Vor dem Verdünnen zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 100 % wiedergefunden. Schleichreaktionen konnten nicht beobachtet werden. Um zu prüfen, ob der unverdünnte, stark gefärbte Saft zu Störungen Anlaß gab, wurde er 4 Wochen offen im Kühlschrank gelagert, um den Ascorbatgehalt zu senken. Dann wurde 0,1 ml Saft unverdünnt in den Test eingesetzt. Es fanden sich noch 93 mg Vitamin C/l. Die starke Probenfärbung störte nicht. Auch Schleichreaktionen traten nicht auf. Zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig wiedergefunden.
Beispiel 6
Bestimmung in Bier.
Bier, das außerhalb Bayerns gebraut ist, darf zu Schönungszwecken und zur Haltbarmachung Ascorbinsäure enthalten. Dagegen ist der Zusatz nach dem bayerischen Reinheitsgebot verboten. Weder in hellem oder dunklem Faßbier noch in Dosenbier wurde bei der Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 Ascorbinsäure gefunden. Störungen konnten nicht festgestellt werden und zugesetzte Ascorbinsäure wurde vollständig wiedergefunden.
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Beispiel 7
Bestimmung in Spinat.
Blanchierter, tiefgefrorener Spinat wurde aufgetaut und gründlich gemischt. 50 g davon wurden nach dem Verfahren von Marchesini et al (J. Food Science 39 (1974), 568 bis 571) auf gearbeitet, nur daß anstelle von HPO., Phosphorsäure eingesetzt wurde. Bei einem Einsatz von 0,2 ml des auf pH 5 gestellten Extrakts wurden bei der Durchführung des Verfahrens von Beispiel 1 22 mg Ascorbat/100 g tiefgefrorenen Spinat gefunden. Bei einem Trockengewicht von 8 % entspricht das 275 mg Ascorbat/100 g Trockenmasse und somit den Befunden für blanchierten Spinat verschiedener Sorten. Vor der Extraktion zugesetzte Ascorbinsäure wurde zu 98,8 % wiedergefunden. Schleichreaktionen konnten nicht beobachtet werden.
Beispiel 8
Bestimmung in Kartoffeln.
50 g Kartoffeln wurden gewaschen, zerkleinert und in gleicher Weise wie der Spinat in Beispiel 7 aufgearbeitet. Der Extrakt wurde auf pH 5 gestellt und auf 100 ml aufgefüllt. Nach dem Zentrifugieren wurden 500 ml in den Test eingesetzt. Es fanden sich 18,9 mg Ascorbat/kg Kartoffeln. Normal sind ca. 150 mg/kg. Es handelte sich jedoch um alte Ware, die schon sehr ausgetrocknet und teilweise gekeimt war. Unter diesen Bedingungen sinkt der Vitamin C-gehalt stark ab und kann sogar völlig verschwinden. Zur Prüfung wurde den Kartoffeln vor der Extraktion 75 mg Ascorbinsäure zugesetzt und das Extraktionsverfahren durchgeführt. Es fanden sich 97 % dieses inneren Standards wieder. Schleichreaktionen traten nicht auf.
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Beispiel 9
Bestimmung in Serum.
Der Gehalt von Ascorbinsäure im Serum soll zwischen 2 und 15 mg/1 betragen. Daher wurde 1 ml mit Trichloressigsäure enteiweißtes Probenmaterial in den Test eingesetzt. In 6 verschiedenen Seren fanden sich 1,5 bis 2,64 mg Ascorbat/1. Schleichreaktionen traten nicht auf. Die Wiederfindung zugesetzter Ascorbinsäure betrug praktisch 100 % bei Zugabe von 17,2 mg Ascorbat/1 Serum.
Beispiel 10
Bestimmung in Urin.
Der Gehalt an Ascorbat im Harn kann erhebliche Werte erreichen. Bei normaler Ernährung beträgt die Ausscheidung im Urin 10 bis 100 mg/1. Bei Einnahme höherer Dosen als 100 mg werden 60 bis 8O % der eingenommenen Menge im Urin wiedergefunden, so daß bei der heute vielfach üblichen Einnahme größerer Ascorbinsäuremengen im Harn auch größere Werte als 100 mg/1 zu erwarten sind. In einem frischen Urin wurden beim Einsatz von 0,1 ml 257 mg Ascorbat/1 bei einer Wiederfindung von 98,3 % gefunden, ohne daß Schleichreaktionen oder andere Störungen beobachtet wurden.
Beispiel 11
So hohe Vitamin C-gehalte im Urin, wie sie in Beispiel 10 gefunden wurden, können die Farbstoffbildung üblicher Teststreifen für Glucose, Blut oder Bilirubin usw., die auf Oxidation verschiedener Leucofarbstoffe beruhen, ganz oder teilweise unterdrücken und zu falschen Resultaten führen. Ob diese Gefahr besteht, kann durch einen Teststreifen festgestellt wer-
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den. Ein Rundfilter aus Testpapier wurde hierzu gründlich mit 0,2 Mol Na2HPO4/O,1 MOl/1 Citronensaurepuffer von pH gewaschen, abgesaugt und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde das Leerwertgemisch von Beispiel 1, jedoch ohne Probe und Ascorbatoxidase, über das in einer Petrischale liegende Filter gegossen und erneut unter Vakuum und Lichtabschluß bei Raumtemperatur getrocknet. Auf das so vorbereitete Filter wurde je ein Tropfen von Lösungen, enthaltend 2, 5, 10, 25 und 50 mg Ascorbat/100 ml, aufgetropft. Innerhalb einer Minute bildeten sich blauviolette Flecken, deren Farbintensität mit steigender Ascorbatmenge zunahm. Wasser ergab lediglich eine leichte Gelbfärbung.
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Claims (14)

  1. Patentansprüche
    Verfahren zur Bestimmung von Ascorbinsäure oder Dehydroascorbinsäure mit Tetrazoniumsalz und Auswertung der erhaltenen Färbung, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid, Nitrotetrazoliuitiblau, Tetrazoliumblau-chlorid, oder Distyryl-nitroblau-tetrazoliumchlorid zusammen mit Phenazinmethosulfat und einem Detergenz bei schwach saurem pH-Wert durchgeführt wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Phosphat/Citrat-puffer eingestellt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Alkylaryl-polyäthylenglykolester als Detergenz verwendet wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein pH-Wert zwischen 4,5 und 6 eingestellt wird.
  5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Sequestrierungsmittel zugesetzt wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß einem Leerwertansatz mit Probelösung Ascorbatoxidase zugesetzt und die Leerwertextinktion nach Beendigung der Oxidationsreaktion von der Extinktion der eigentlichen Bestimmungsreaktion substrahiert wird.
  7. 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung von Dehydroascor-
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    ORIGINAL INSPECTED
    27549U
    -Ht-
    bat der Probelösung überschüssige Sulfhydrylverbindung bei einem pH-Wert zwischen 7 und 8 zugesetzt und nach Beendigung der Oxidation auf pH 4,8 bis 5,3 gebracht und die Ascorbinsäure bestimmt wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfhydrylverbindung Homocystein verwendet wird.
  9. 9. Reagens zur Bestimmung von Ascorbinsäure und Dehydroascorbinsäure mit einem Gehalt an Tetrazoliumsalz und Puffer, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Verbindung aus der Gruppe 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazöliumbromid, Nitrotetrazoliumblau, Tetrazoliumblau-chlorid oder Distyrylnitroblau-tetrazoliumchlorid und außerdem Phenazinmethosulfat, Detergenz, schwach saure Puffersubstanz und gegebenenfalls eine Sulfhydrylverbindung oder/und Ascorbatoxidase oder/und ein Sequestrierungsmittel enthält.
  10. 10. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Puffersubstanz aus Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,5 bis 6, besteht.
  11. 11. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es 3-(4,5-Dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid enthält.
  12. 12. Reagens nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es als Detergenz einen Alkylarylpolyäthylenglykol-ester enthält.
  13. 13. Reagens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es
    0,01 bis 1 mMol pro Liter 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid,
    0,01 bis 1 mMol pro Liter Phenazinmethosulfat,
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    275A9A4
    - yt -
    0,1 bis 1 Mol pro Liter Puffersubstanz, 0,1 bis 2 Gew.-% Detergenz,
    1 bis 50 U pro ml Ascorbatoxidase,
    0,1 bis 10 mMol pro Liter Sequestrierungsmittel, bezogen auf die fertige Testlösung, enthält.
  14. 14. Reagens nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß es aus
    0,05 bis 0,15 mMol pro ml 3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid,
    0,05 bis 0,15 mMol pro Liter Phenazinmethosulfat, 0,5 bis 1,5 % Octylphenyl-polyäthylenoxidäther, 0,5 bis 5 mMol pro Liter Äthylendiamin-tetraessigsäure, 0,1 bis O,4 mMol pro Liter Phosphat/Citrat-puffer, pH 4,8 bis
    1 bis 10 U pro ml Ascorbatoxidase,
    jeweils bezogen auf fertige Testlösung, besteht oder diese enthält.
    909824/0348
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