SU971120A3 - Способ определени аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ ИЛИ ДЕГИДРОАСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1

Изобретение относитс  к способам определени  аскорбиновой или дегидроаскорбиновой кислоты.

Определение аскорбиновой кислоты имеет большое значение, прежде всегоg

в химии пищевых продуктов, дл  оценки качества различных пищевых продуктов, таких, например, как фруктовые соки, свежие овощи, свежемороженные овощи и другие. Часто дл  прохладительных на- JQ питков требуетс  определенное содержание витамина С, следовательно, оно должно контролироватьс . Аскорбиновую кислоту добавл ют в качестве антиокислител  и осветлител , и поэтому содержание ее|5

также должно определ тьс . При клиникодиагностических исследовани х обнаружение аскорбиновой кислоты в моче обеспечивает быструю диагностику различных заболеваний. Представл ет интерес опре- 20 деление аскорбиновой кислоты в сыворотке дл  тропических стран, так как в услови х этих стран симптомы авитаминозов (цинги) настолько прикрываютс  симтт -мами других болезней, что их нэвозмож- 25

но выделить. Учитыва  ЕЗЖНОСТЬ определени  аскорбиновой кислоты, разработаны различные способы ее определени .

Все сказанное вьпые справедливо и дл  дегидроаскорбиновой кислоты, так как аскорбинова  кислота под действием кислорода воздуха легко переходит в дегидроаскорбиновую кислоту. Поэтому в испытуемых продуктах часто присутствует смесь аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислот. Поскольку дегидроаскорбинова  кислота оказывает такое же действие , как витамин С, то в большинстве случаев целесообразно определ ть содержание в испытуемом образце дегидроаскорбата .

Известны различные способы определени  аскорбиновой или дегидроаскорбинсжой кислоты, например хроматографический способ Г1 .

Врем , необходшйое дл  определени  по данному способу, очень велико (не менее 2 ч), причем при подготовке пробы к хроматографии тер етс  значительное количество аскорбата и поэтому количественное определение с помощью указанного способа практически невозможно. Изв€к;тен также способ, основанный на окислении аскорбиновой кислоты в догидроаскорбиновую и осаждении последней в виде производного гидразина 2 . Данный способ трудоемок и мало специфичен , так как все соединени  с кетонными функциональными грултшми дают такую же реакцию. Наиболее близок к предлагаемому спо соб определени  аскорбиновой или дегидр аскорбиновой кислоты путем обработки исследуемой пробы реагентом, содержащи четвертичную соль тетразоЛа и щелочной буферный раствор, с последующим измеpeiraoM И1 тенсивности окраски образующегос  окрашенного соединени  ГЗ , Недостатком известного способа  вл етс  то, что его провод т в щелочной среде и многочисленные вещества оказы вают мешающее действие. Кроме того, указанный способ длителен . Цепь изобретени  - сокращение длительности определени  и повышение специфи шости . Поставленна  цель достигас тс  тем, что берут две пробы, к первой пробе добавл ют реагент, содержащий фосфатноцитратный буфер, полиэтиленгликолевы и эф1ф октилфенола, этилендиаминтетрауксу ную кислоту, 3-(4,5-диметилтиазолил-2 -2,5-дифенилтетразолбромид, феназинмет сульфат и воду при следующем соотноще нии компонентов, вес,%: Фосфатно-цитратны и 0,5-20 буфер Полиэтиленгликолевый эфир октилфенола 0,1-1,,5 Этилендиаминтетрауксусна  кислота (ЕДТА) О,О045-0,045 3-( 4,5-Диметилтиазолил-2 ) -2,5 -дифенилтетразолбромид (МТТ) О, 0003-0,03 0,ООО25-0,О0 Феназинметосульфат До 100 Вода а к другой параллельной пробе добавл ю указанный реагент, содержащий дополни тельно аскорбатоксидазу в когшчестве 0,0001-0,005 вес.%, вычитают экстин шпо параллельной пробы из экстинкции первой ,пробы и рассчитывают содержани аскорбиновой кислоты, причем в случае определени  дегидроаскорбиновой кислот первую исследуемую пробу предваритель обрабатывают избытком гомоцистеина при рН 7-8 и содержание дегидроаскорбиновой кислоты определ ют по разности ежду общим содержанием аскорбиновой дегидроаскорбиновой кислот и содержанием аскорбиновой кислоты. Предлагаемы способ осуществл ют в слабокислой среде. При таких значени х рН больщинство мещакщих веществ не вступает в реакцию или скорость ее Настолько замедл етс , что практически ею можно пренебречь. В такой кислой среде скорость взаимодействи  реактива с аскорбиновой кислотой мала, поэтому определение аскорбиновой кислоты с ее помощью практически невозможно. Однако добавление феназинметосульфата в комбинации с детергентом ускор ет эту реакцию. Неож1зданно то, что указанные добавки не ускор ют реакцию реактива с мешающими веществами. Дл  установлени  рН, соответствующего слабокислой среде, предпочтительно в интервале между 4,0 и 6,О {особенно методу 4,8 и 5,3) могут использоватьс  различные буферные системы, в частности фосфатно-цитратный буфер, так как в этом случае при всех количествах аскорбата выполн етс  пропорциональность между экстинкцией образующегос  окращенного вещества и концентрацией аскорбата. Предпочтительным детергентом, используемым в предлагаемом способе,  вл етс  полиэтиленгликолевый эфир октилфенола (тритон х 10О). Скорость реакции увеличивает также Феназинметосульфат (ФМС), обеспечива  количественное протекание реакции. При использовании других известных переносчиков электронов такого ускор ющего действи  не наблюдаетс . Концентраци  ФМС 0,01 -1 ммоль/л (предпочтительнее 0,05-0,15 ммоль/л), так как в этом случае не происходит взаимодействи  реактива с соединени ми, содержащими 5 Н-группы, такими как гомоцистеин. Такие соединени  с S Н-группами можно добавл ть, когда имеющийс  в пробе де- гидроаскорбат необходимо одновременно восстанавливать до аскорбата. Если в исследуемой пробе наход тс  ионы двухвалентных металлов, склонных к образованию хелатов, то могут образовьтатьс  хелаты в результате взаимодействи  с получающимс  окрашенным соединением формазина, что может вли ть на результаты измерений. Хот  образование хелатов в значительной степени подавл етс  вследствие применени  цитрат но-фосфатного буфера, однако целесообраз но добавл ть дополнительно к пробе небольшгие количества комплексробразователей , таких как этилендиаминтетрауксус на  кислота с концентрацией 0,0045- 0,045 вес.%. В особых случа х, в частн сти при анализе проб с очень высоким содержанием ионов двухвалентных металлов , целесообразны и добавки в больших количествах, ; При осуществлении предлагаемого i способа используют параллельную пробу, дополнительно содержащую аскорбатоксид зу, котора  избирательно окисл ет содер жащийс  в параллельной пробе аскорбат. По окончании реакции окислени  параллел /ную пробу используют как холостую проб . дл  определени  количества аскорбиновой кислоты, т.е. экстинкцию холостой пробы вычитают из экстинкции исследуемогс раствора и разность используют дл  расчета количества аскорбиновой кислоты, i Данный вариант осуществлени  способа повышает его специфичность, в особеннос ти в тех случа х, когда в исследуемом растворе присутствуют вещества, которые могут взаимодействовать с солью тетра- зола. При определезгаи дегидроаскорбиновой кислоты ее перевод т в аскорбиновую кислоту и определ ют описанным способом восстанавливают при помощи органического сульфгидрильного соединени 7 предпочтительно гомоцистеина, который беретс  в избытке, в нейтральной или слабощелочной среде, при рН 7-8 (при использовании .гомоцистеина - при рН 7,5. Если затем дл  определени  образующейс  аскорбиновой кислоты устанавливают значение рН, соответствующее слабокислой среде, то взаимодействие реактива с аскорбиновой кислотой протекает без вс ких осложнений т.е. избыток сульфгидрильного соединени  не восстанавливает вновь образующуюс  в ходе реакции дегидроаскорбиновую кислоту , и, таким образом, не происходит искажени  результатов анализа. Способ позвол ет определ ть дегидроаскорбиновую кислоту в присутствии аскорбиновой кислоты. Дл  этого вначале определ ют в пробе содержание аскорбиновой кислоты, а затем во второй пробе восстанавливают дегидроаскорбиновую кислоту и определ ют ее. ГЬ разности полученных результатов можно определить количество в пробе дегидроаскорбиновой кислоты. Реакци  согласно предлагаемому способу протекает примерно ЗО мин, ; Измер ют интенсивность окраски образующегос  окрашенного соединени , например , обычным фотоколориметром при подход щей длине волны, например при 578 нм. Однако дл  определени  интенсивности окраски можно использовать и другие известные методы. Удовлетворительные результаты дает и оценка по сравнению полученной окраски с эталонной, в особенности, когда предлагаемый способ проводитс  с использованием индикаторных полос. А. Определение аскорбиновой кислоты. Готов т раствор следующего состава, /п (%): Nc(HP04 Лимонна  кислота Тритон Х-11 0,45(0.045) 0,041(0,0041) В две кюветы (одна из них содержит робу, втора  - холостую пробу), заливают о 3,00 мл раствора и 0,1 мл исследуеой пробы. Пробу и холостую пробу наревают до 37°С. К холостой пробе доавл ют 0,00033% аскорбатоксидазы 0,О1 мг/Змл) и инкубируют 2 мин. При том аскорбинова  кислота разлагаетс . атем к обеим пробам добавл ют по ,О75 мг ФМС так, чтобы содержание аствора в них составл ло 0,ОО25%. нова инкубируют 5 мин. После этого предел ют экстинкцию холостой пробы Е 1 ) и пробы (Ер). Рассчитывают лЕ о формуле E EP-ELСодержание аскорбиновой кислоты в робе рассчитывают исход  из общей асчетной формулы дл  определени  конентраций EcJVv-fOOO -испытуемый объем, мп; -объем пробы, мл; -молекул рный вес определ емого вещества; -толщина сло , см; -коэффициент экстинкции МТТ-формазона (при 578 нм 16,9), л ммоль .см7. Отсюда дл  L, -аскорбиновой кислоты i,7o-tTfe,.b ; -Гб,9--I-0,0-.100 г I, -аскорбиновой кислоты на л раствора обы). Если предварительно пробу р збавл ют то результат умножают на фактор разбав лени  F . Б. Определение дегидроаскорбиновой кислоты (ДГА). Восстанавливают ДГА до аскорбиновой кислоты в присутствии гомоцистеина (пр рН 7,5). Определ ют сумму аскорбиново кислоты и ДГА и рассчитывают в виде общего содержани  аскорбиновой кислоты После Ъычета определенной в отдельном тесте аскорбиновой кислоты из разницы можно рассчитать количество Д1А. Приготовление растворов: а)буферный раствор (фосфат;ный буфе 0,1 ммоль/л, рН 7,5) 163 мг и 2,00 г раствор ют примерно в 70 йл воды и доливают до 100 б)раствор гомоцистеина. 60 мг гомо шстеина раствор ют в буферном раствор ( а) и доливают до 50 мл. в)раствор пробы с аскорбиновой кислотой + ДГА (не больше 0,6 г/л). Значение рН пробы довод т до 7,5 раствором едкого кали  (2мопь/л) (.,. и разбавл ют водой до пригодной концентра шш. В пробирку внос т пипеткой по 50 мл растворов (а), (б) и (в), смеш1юают ш. и оставл ют на 15 мин при комнатной ; температуре. 0,1 мл инкубированнохх) раствора исследуют на содержание аскор биновой кислоты согласно А. Расчет. 1. Общее количество аскорб шовой кислоты (ДГА + аскорбинова  кислота) г ..... пробЫ «3- -(000 где F - фактор разбавлени  пробы; Y - инкубационный объем, мл V - испытуемый объем, мп,V - объем раствора пробы (в) при инкубировании, мл5 V - объем инкубированного раствор в тесте, .мл; NVQ - молекул рный вес аскорбиновой кислоты, d - толщина сло , см 6 - коэффициент экстинкции МТТформазона (при 578 нм 16,9), ЛММош -cMt т.е. , с. 5-г,1-(1Ь-,ЪдЕ 0,8442-РйЕ Ь,9 0,5-0,1--1НОО 2.Аскорбинова  кислота из расчета пробы (г/л пробы). 3.Дегидроаскорбинова  кислота. САГС( (результат из(1)- редуЛьтат из (2)) 0,9886 (г ДГА/л пробы) MQ174.13 0,9886 176,13 -MGc(cKop6 Исследуют сок черной смородины на содержание в нем аскорбиновой и дегидроаскорбиновой кислоты. 0,1 мл сока исследуют согласно А на содержание аскорбиновой кислоты, при этом д Е равно 0,43 .что соответствует содержанию 0,121 г/л или 0,О121%. Дл  определени  содержани  в нем депщроаскорбиновой кислоты 0,5 мл сока обрабатывают согласно Б гомоцистеином. О,1 мл полученного при этом инкубированного раствора исследуют согласно А на сумму аскорбата и дегидроаскорбата. Е при этом равно 0,38. Отсюда по указанной в Б формуле рассчитьгеают сумму аскорбата и дегидроаскорбата, равную 0,329 г/л или 0,0329%. Содержание дегидроаскорбата составл ет 0,329-0,121 0,208 г/л или 0,0208%. Проведена сери  опытов определени  аскорбиновой или дегидродскорбшювой кислоты . Пример. Фосфатно.4штратный буфер, поверхностно-активное вещество, комплексообразователь, соль тетразола, ФМС, а также воду и исследуемую пробу, ввод т в кювету обычного фотокалориметра. После осуществлени  реакции измер ют разность эксткнкшш по сравнению с воздухом шш водой. В параллельную холостую пробу ввод т, кроме того, аскорбатоксидазу (ААО). Такое же количество А АО ввод т в исследуемую пробу после окончани  реакции, чтобы скомпенсировать разницу в экстинкции, обусловленную самой ААО. Подробности проведени  спрсоба, при .мен емые реактивы и их количества приведены в табл. 1. Реактивом приведенного выше состава можно определ ть от 5 до 25О мг аскорбата в исследуемой жидкости. При более высоких концентраци х пробу необходимо соответствующим образом раз- бавить, при меньших концентраци х брать большее количество пробы. Количество воды при этом соответствующим образом должно быть уменьшено. При проведениивсех последующих определений используют составы реагент аналогично примеру 1 {табл. 2). П р и м е р 2. Определение аскорбата в апельсиновом соке, ОД мл апельсинового сока ввод т в кювету в качестве пробы аналогично при меру 1, В результате обнаруживают концентрашпо витамина С 305 мг/л, что соответствует декларации (ЗОО мг/л). После анализа количество аскорбиновой кислоты, введенной в пробу, полностью ощюдел етс  (lOO%). Окраска с течени времени не измен етс . Небольшое пому 1нение апельсинового сока не оказывает вли ни  на результаты анализа. Пример 3. 2,0 лимонного напит ка раствор ют в 2О мл воды и 0,1 мл полученного раствора ввод т в кнвету по примеру 1. Наход т 96 мг витаМгаш С на 1ОО г сухого вещества. Изменени  окраски с течением времени не наблюда етс . Определ ют 99,2% аскорбиновой кислоты, добавленной в пробу перед разбавлением . Небольшое помутнение раст вора не оказывает вли ни  на результаты анализа. П р и м е р 4. Определение аскорбат в плодах шиповника. 5 мл концентрата шиповника раствор ют в 10О мл воды. ОД мл полученного раствора после центрифугировани  ввод т в кювету по примеру 1.. Наход т 177О мг витамина С в расчете на 1 л концентрата. Небольшое изменение окрас во времени, наблюдавшеес  в пробе и в холостой пробе, учитывают с помошью экстрапол шш. Аскорбиновой кислоты, добавленной к пробе перед разбавлением, обнаруживают 10О%. Легкое окрашивание разбавленного экстракта не оказывает вли ни  на результаты анализа. П р и м е р 5. Определение аскорбат в соке черной смородины. 1 мл сока черной смородины разбавл  ют водой до Ю мл и О,1 мл полученног раствора ввод т в кювету по примеру 1. Наход т ЗОБ мг/л витамина С. Обнаруж вают 100% аскорбиновой кислоты, добавленной перед разбавлением. Изменени  окраски с течением времени не наблюдаетс  Чтобы проверить, не оказывает ли мешающего вли ни  неразбавленный сильно окрашенный сок, дл  снижени  в нем содержани  аскорбата его выдержи- вают в открытой посуде в течение 4 недель в холодильнике. Затем 0,1 мл не: разбавленного сока ввод т в кювету. На ход т еше 93 мг/л витамина С. Интенси на  окраска исходной пробы не оказывает мешающего вли ни . Изменени  окраски с течением времени не наблюдаетс . Добавленна  в пробу аскорбинова  кислота полностью определ етс . Примере. Определение аскорбата в пиве. Чтобы обеспечить прозрачность и возможность консервировани  в пиво можно добавить аскорбиновую кислоту, хот  дл  баварского пивоварени  эта операшга не приемлема. Ни в светлом или темном бочковом пиве, ни в пиве в банках при проведении анализа по способу, описанному Б примере 1, аскс иновой кислоты нет. Моиающего вли ни  не обнаруживйают. Добавленное в пробу количество аскорбиновой кислоты полностью обнаруживают. П р и м е р 7. Осфеделение аскорбата 3 шпинате. Бланшированный свежемороженный шпинат после оттаивани  тщательно перемешивают , 50 г его обрабатывают известным способом, но вместо НРО,используют метафосфорную кислоту. Ввод т 0,2 мл экстракта, рН которого равен 5. При проведении способа аналогично примеру 1 наход т 22 мг аскорбата в расчете на 1ОО г свежемороженного шпината при содержании в нем 8% сухой массы. Это соответствует 275 мг аскорбата в расчете на 1ОО г сухой массы. Из добавленного к шпинату перед экстрагированием количества аскорбиновой кислоты обнаруживают 99,8%. Изменени  окраски с течением времени не наблюдают. П р и м е р 8. Определение аскорбата в картофеле. 50 г картофел  моют, измельчают и обрабатывают таким же образом, как и шпинат в примере 7. рН.экстракта устанавливают равньгм 5 и объем его довод т до 1ОО мл. После центрифугировани  50О мл ввод т в кювету. Обнаруживают 18,9 мг аскорбата в расчете на 1 кг картофел . эта величина составл ет примерно -150 мг/кг. В данном случае используют старый картофель, сильно высохший и частично проросший. В этих . услови х содержание витамина С в нем сильно снижаетс  или даже полностью исчезает. Дл  проверки к картофелю перед экстрагированием добавл ют 75 мг аскориновой кислоты, после чего определ ют ее в количестве 97%. Изменени  окраски с течением времеи не наблюдают.. П р и м е р 9. Определение аскорбата сыворотке. Содержание аскорбиновой кислоты в сыворотке должно иаход11тьс  в пределах между 2 и 15 мг/лна 1 мл сыворотки, Из которой с помощью трихлоруксусной кислоты удал ют белок и испош зуют в качестве пробы. В шести различных сыворотках обнаруживают от -1,5 до 2,64мг/л аскорбата. Изменени  окраски с течением времени не наблюдают. При добавке в пробу 17,2 мг аскорбата на 1 л сыворот ки вновь обнаруживают практически 1ОО% Пример 10. Опредепеш: е аскорбата в моче. аскорбата в моче может Содержание достигать значительных количеств. При нормальном питании в мочу попадает от 10 до 100 мг/л. При приеме доз, больше 100 мг 60-8О% прин того количеств обнаруживают в моче. Поэтому при потреблении аскорбиновой кислоты в количест вах, во много раз превышающих нормальное , следует ожидать и большее, чем 1ОО мг/л, содержание ее в моче. В свежей моче при объеме пробы О,1 мл обнаруживают 257 мг/л аскорбата. При этом вновь обнаруживают 98,3% добавленной перед анализом аскорбиновой кислоты. Изменени  окраски с течением времени и других мешающих вли ний не наблюдаю Прим ер 11. Большие количества витамина С в моче, найденные в примере Ю, могут частично или полностью подавл ть образование окрашенных соедине1-щй на обычных индикаторных полоска на глюкозу, кровь или билирубин и т.д., основанное на окислении различных лейкоокрашенных соединений, и, таким бобра- зом, приводить к искажению результатов, что молсет быть установлено с помощью индикаторной бумаги. Круглый фильтр из испытуемой бумаги-тщательно промывают раствором О,2 моль, /О, 1 моль лимоннокислого буфера с рН 5, отсасываю на вакуумном фильтре и сушат в вакууме при комнатной температуре. Затем на фильтр, лежащ:ий в чашке Петри, наливают смесь, соответствующую по сославу холостой пробе примера 1, но не содержащую пробы и аскорбатоксидазы, после чего его снова сушат в вакууме лри комнатной температуре в тегиноте. На подготовленны таким образом фильтр нанос т по калле растворы, содержащие 2; 5; 10; 25 и 50м аскорбата/100 мл. В течение 1 мин на бумаге образуютс  сине-фиолетовые п тна , интенсивность окраски которых возрастает с увеличением концентрации аскор бата. При накапывании воды наблюдают только легкое желтое окрашивание. Пример 12. Определение дегидроскорбиновой кислоты. Исследуемый материал экстрагируют в случае необходимости разбавл ют так, тобы содержание дегидроаскорбата сосавл ло 75-1500 мг/л (0,005-0,10%). л  раствора устанавливают показатель Н, равный 7,5. К двум част м этого аствора добавл ют две части К-фосфатноо буфера (рН 7,5, О,1 ммоль/л, 1%, иапазон 0,1-2%). 0,1 мл приготовленноо таким образом раствора исследуют через 15 мин аналогично примеру 1 на аскорбат и определ ют сумму аскорбата дегидроаскорбата. Принима  коэффициент разбавлени  F равным 2,5, можно определить после вычитани  полученного ранее содержани  аскорбата содержание в пробе дегидроаскорбата. Спуст  2 ч после введени  О, 5 г аскорбиновой кислоты у человека берут на анализ мочу, которую дел т на 3 порции: первую (l) используют неизменной, вторую (2) дополн ют О,О05% гомоцистеина и третью (3) - 0,01% дегидроаскорбиновой кислоты. Исследуют их по описанному в А способу на содержание аскорбиновой кислоты (способ I). Дл  сравнени используют известные способы: окисление аскорбиновой кислоты и осаждение в виде производного гидразина (способ П) и восстановление дихлорфенолиндофенолом (реактив Тиллманна) в качестве титриметри- ческого метода (способ 111). Результаты представлены в табл. 3. I В каждой порции должно быть одинаковое количество аскорбиновой кислоты, и только предлагаемый способ (способ I) .дает одинаковые значени . Способ П частично вы вл ет добавленную дегидроаскорбиновую кислоту (отклонение в порци х 1 и 2 вызвано неточностью способа). Способ иг зачастую дает сильное искажение вследствие введени  гомо1шстеина, которыйг включаетс  в качестве восстановител . Однако дегидроаскорбинова  кислота также вызывает значительное увеличение значени , Предлагаемый способ определени  аскорбиновой кислоты (витамина С) и дегидроаскорбиновой кислоты прост и по сравнению с известными способами значительно более специфичен, более устойчив к мешающему вли нию других веществ и менее длителен.

Лимонна  кислота 4% рН 5

Тритон X 100 + 3% ЕДТА.0,09%

Вода Проба

ААО О, О 5%

МТТ 0,062% ФМС О,О375% АЛО О, 05% После введени  ААО инкубируют 2 мин. После введени  ФМС инкубируют до прекращени 

1,5Nct HPO 3, 6%

Лимонна  кислота 2%

Тритон X 10О 1,5%

ЕДТА 0,045%

1.0 0.1

0,176-8,8 мг/л аскорбата (О,ОООО176-О , 00088%)

Испытуемый раствор 0,000333%

О, 00414%

0,2

0,О25% 0.2 О,О2

0,ОООЗЗЗ% реакции (около ЗО мин).

но-цитратны и

X 100

атоксидаза

Таблица2

О, 5

2.4

20 1.0

0.1

1.5

О, 045

0.0045 О, О1 О,002

О.ОО01 0,О05 О,ОО9

О.ОООЗ О.ОЗ О.ОО25

О. 00025 0,0005 до 10О до 1ОО до 100

971120

15

О, 133(О,О133) 0,130(0,0130) 0,134 (О,О134) 0,140 {0„0140) 0,155 (0,0155) 0,255(0,0255) ОД44(0„0144) 0,201(0,0201) 0,162(0,0162)

Claims (3)

1.Sc-hormueeer jgra.j. Handbocti der fiebensmiiteefhemie. 6d, ft.a ... Sprinqer- Ver6c cr, eergin -HeicaeCberc , ч9&1,5лбД-7б5.

2.Там же, с, 765-769.

3.Там же, с. 765-789 (прототип).