DE2830453A1

DE2830453A1 - Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von isoenzymen

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Publication number: DE2830453A1
Application number: DE19782830453
Authority: DE
Inventors: Karl John Sanford
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1977-07-11
Filing date: 1978-07-11
Publication date: 1979-02-01
Also published as: JPS5434298A; JPS5728271B2; FR2397637A1; GB2000869B; GB2000869A; DE2830453C2; US4250255A; CA1116061A; FR2397637B1

Description

PAT E N TANVZALl¹Ii

J. RBITSTÖTTER

PROF. IiR. DR. niPI,. ING. W. BUNTE (1958-1976)

DR. ING.

W. KINZEBACH

DR. PHII» DIPT.» CITHM.

K. P. HÖLLER

DR. RER. NAT. DIPL. CHEM.

nElTSTÖTTER 8c KINZEBACH POSTFACH 7SO. D-8000 MÜNCHEN 43

TELEFON: (OSS) 37 65 TELEXi G21G208 ISAR D

BAUEReTBASSE 22, 80OO MUNCIIIiN

München, H. Juli 1978 M/19 141 814 770

EASTMAN KODAK COMPANY 343 State Street

Rochester, New York 14650 USA

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Isoenzymen

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POSTANSCHRIFT! POSTFACH 780, D-8000 MÖNCHEN 48

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivi-

I tat von Isoenzymen.

; Isoenzyme sind enzymatisch aktive Proteine, die dieselbe Reaktion katalysieren und in derselben Spezies auftreten, die sich jedoch hinsichtlich bestimmter physikalisch-chemischer Eigenschäften unterscheiden. So ist beispielsweise die Lactatdehydro- ! genäse (L-LactatrNAD-Oxidoreductase, EC 1.1.1.27; LDH) ein tetrameres Enzym, das ein Molekulargewicht in der Größenordnung von 140 000, abhängig von der jeweiligen Quelle, aufweist. Das Enzym ist durch zwei Strukturgene kodiert, die zu zwei Untereinheiten (H und M) führen, welche unter Bildung des aktiven tetrameren LDH-Enzyms sich vereinigen. Die Permutationen von H und M-Untereinheiten im aktiven Enzym führen zu fünf Isoenzymen, nämlich H^, HgM, H₂M₂, HM₃ und M^. Derzeit beruht die Nomenklatur für die LDH-Isoenzyme auf deren relativer Wanderung in einem elektrischen Feld, d.h. bei der Elektrophorese. Die Reihenfolge zunehmender Wanderungsgeschwindigkeit nach der Anode; ist: H₄>H₃M>H₂M₂>HM₃>M₄, und sie werden als LD₁, LD₂, LD₃, LD₄ bzw. LD₅ bezeichnet.

Seit einigen Jahren konzentriert sich die Aufmerksamkeit auf den diagnostischen Wert von Isoenzymen. Es wurde festgestellt, daß Bestimmungen der Serumspiegel der Isoenzyme von Cholinesterase, Amylase, Kreatinkinase, Lactatdehydrogenase, alkali- · scher Phosphatase und Hexosaminidase von klinischer Bedeutung sind.So sind beispielsweise die relativen Mengen dieser LDH-Iso- ^: enzyme im Serum eines Patienten zusätzlich zur Gesamt-LDH-Aktivität von diagnostischer Bedeutung. Diese Bedeutung rührt daher,1 daß LD-, und LD₂ Isoenzyme in Herz, Nieren und Erythrocyten, j LD₄ und LDg Isoenzyme in der Skelettmuskulatur und in der Leber, sowie LD₃ Isoenzyme in der Milz, den Lungen, der Bauchspeichel-

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drüse, der Schilddrüse, in den Nebennierendrüsen und in den Lymphknoten in relativ großer Menge vorliegen. Eine Nekrose der Zellen in geschädigten Organen führt zur Freisetzung ihrer entsprechenden Enzyme in den Blutkreislauf. So kann der Nachweis und die mengenmäßige Erfassung der LDH-Isoenzyme wertvolle Informationen hinsichtlich der Lage von geschädigtem Gewebe geben, beispielsweise beim Myocardinfarkt, bei Leberschädigungen, und dergleichen.

Im allgemeinen wurden die Isoenzymspiegel bisher auf dreierlei Weise bestimmt. Es sind dies physikalisch-chemische, elektrophoretische und immunochemische Methoden. Da eine große Zahl der Veröffentlichungen in der Literatur Forschungsarbeiten mit LDH-Isoenzymen beschreiben, konzentriert sich die nachfolgende Erörterung auf LDH, obgleich sie auch für andere Isoenzyme gültig ist.

Wrobleroski et al, Annotations of the New York Academy of Science, Band 94, Seite 912 (1961) beschreibt die thermische ; Denaturierung als Methode zur Bestimmung von LDH-Isoenzymen. Hierbei macht man von der unterschiedlichen Hitzestabilität der Isoenzyme Gebrauch. Emerson et al, Journal of Clinical Pathology, Band 18, Seite 803 (1965) beschreibt die selektive Inhibierung von LDH-Isoenzymen mit Reagenzien wie Harnstoff und Oxalat. Warburton et al, Enzymologie, Band 26, Seite 125 (1963) und Warburton et al, Nature, Band 198, Seite 386 (1963) beschreiben die Verwendung organischer Lösungsmittel, um LDH-Isoenzyme auszufällen. Die US-Patentschriften 3 388 044 und 3 326 777, sowie Bishop et al, Proceedings of the National Academy of Science, Band 69, Seite 1761 (1972) beschreiben die Verwendung von Pyruvat und Lactat, um LDH-Isoenzyme unterschiedlich zu inhibieren. Cawley et al, American Journal of Clinical Pathology, | Band 45, Seite 737 (1966) beschreibt elektrophoretische Arbeits-j weisen zur Auftrennung von LDH-Isoenzymen. Nisselbauiu et al , Ϊ

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Journal of Biological Chemistry, Band 236, Seite 401 (1961) beschreibt eine Methode zur Inhibierung von LDH-Isoenzymen unter Verwendung von Antiseren bei Enzymen des menschlichen Herzens und der Leber. Die US-Patentschrift 3 994 783 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Serumspiegels von Kreatin-Phosphokinase-MB-Isoenzym (CPK-MB), bei dem die CPK vor und nach der MB-Aktivierung mit 1,4-Dimercapto-2₃3-dihydroxybutan oder 2-Mercaptoäthanol ermittelt wird. Die britische Patentschrift 1 481 463 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung spezifischer Isoenzyme, beispielsweise CPK und LDH, unter Einsatz eines Ionenaustauschermittels.

Die vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen sind ganz allgemein mit verschiedenen Nachteilen behaftet. Den physikalisch-chemischen Arbeitsweisen fehlt es an ausreichender Spezifitä.t. So : unterscheiden sie beispielsweise nicht ausreichend zwischen LDH- ^! Isoenzymen des Herzens, d.h. LD, und LD«, und Isoenzymen des , Muskels, d.h. LD, und LD₅. Darüber hinaus sind die Arbeitsweisen zeitraubend und umständlich. Dennoch ist diese Art von Isoenzymbestimmung im allgemeinen noch immer schneller als eine elektrophoretische Arbeitsweise.

Auch elektrophoretische Methoden sind mit dem Nachteil behaftet, daß sie zeitraubend und aufwendig sind. Man muß nicht nur die Elektrophorese durchführen, es ist auch erforderlich (1) die Reagenzien für die LDH-Reaktion herzustellen. Da derartige Reagenzien im allgemeinen instabil sind, müssen sie für jeden Ansatz frisch hergestellt werden. Schließlich muß man (2) die Elektrophoreseplatten nach der Behandlung mit Reagenzlösung inkubieren, (3) eine Fixierwäsche auf die Proben aufbringen und (4) eine dehsitometrische Ablesung vornehmen. Die ganze Operation benötigt mindestens mehrere Stunden und erfordert die überwachung durch einen Fachmann. Darüber hinaus muß die Färbungsprozedur vorsichtig gesteuert werden, um ein zu schwaches

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. oder zu starkes Anfärben zu vermeiden, was zu irrtümlichen Ergebnissen führen würde.

■ Bei der Bestimmung von Isoenzymen hat sich die Immunochemie als eine vielversprechende, möglicherweise anwendbare Technik angeboten. So führt beispielsweise die Verwendung von LDH-Isoenzymen

: als Antigene zur Produktion von Antiseren, bei denen es sich , um relativ spezifische Diskriminatoren unter den Isoenzymen handelt. Jedoch wird die Produktion aktiver Antikörper nur dann hervorgerufen, wenn man als Antigen das native LDH-Enzym einsetzt. Wenn LD, das Antigen ist, werden Antiseren für LD-^ produziert, die auf LD₄<LD₃<C LD₂ einen inhibierenden Effekt ausüben. Wenn man dagegen LD₅ als Antigen einsetzt, werden Antiseren produziert, die für LD,- spezifisch sind und die auf LD₂<C LD^^-1C LD4 einen inhibierenden Effekt ausüben. Darüber hinaus gibt es Anzeichen, daß nicht-neutralisierende Antikörper gebildet werden, wodurch die Isoenzyme vor einer Inaktivierung . durch Antikörper geschützt werden. Schileßlich ist die Produk-

■ tion von Antiseren zeitraubend. Deren Reinigung ist darüber hinaus schwierig.

Der vorstehende Stand der Technik zeigt deutlich, daß mit Recht stets nach besseren Möglichkeiten zur Bestimmung von Isoenzymen

gesucht wird.

Bekannt ist, daß oberflächenaktive Mittel in weitem Umfang zur Reinigung und Charakterisierung von Proteinen eingesetzt werden. Dies erfolgt aufgrund ihrer Lösungs- und Dissozierungseigenschaften. So wurde beispielsweise festgestellt, daß nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen von Rohm und Haas Co.) zur Extraktion von Enzymen aus Zellen brauchbar sind. Marganen et al, Biochimica et Biophysica Acta, \ Band 371, Seiten 442 bis 450 (1974) beschreibt die Verwendung des kationischen oberflächenaktiven Mittels Cetyltrimethyl- ^:

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ammoniumbromid bei der Polyacryl amid-Gelelektrophorese hydrophiler Proteine zur Bestimmung des Molekulargewichts. Jones et al, Journal of Biochemistry, Band 135, Seiten 231 bis 236 (1973) .beschreibt .die Wechselwirkung zwischen Ribonuclease A und den beiden oberflächenaktiven Mitteln Natrium-n-dodecylsulfat und n-Dodecyltrimethylammoniumbromid.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß Amphiphile spezifisch oder unterschiedlich die Aktivität von Isoenzymen beeinflussen können. Hierdurch wird ein Weg zur Unterscheidung der in einer Probe anwesenden Isoenzyme eröffnet.

Der hier verwendete Begriff "Amphiphil" betrifft eine ionische Verbindung, die einen hydrophilen und einen hydrophoben Teil aufweist, beispielsweise ein oberflächenaktives Mittel.

Bisher ist im Stand, der Technik weder beschrieben noch nahegelegt, daß Amphiphile, beispielsweise oberflächenaktive Mittel, zur Unterscheidung von Isoenzymen eingesetzt werden können. Es stellt einen unerwarteten Befund dar, daß Amphiphile die Aktivität von Isoenzymen unterschiedlich beeinflussen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms ^: in einer Probe besteht darin, daß man in einer ersten Bestimmung die Gesamtenzymaktivität in der Probe ermittelt, in Gegenwart einer i vorgegebenen Konzentration eines Amphiphils, das spezifisch.-■ das Isoenzym inhibiert, eine zweite Bestimmung durchführt und j aus der Differenz der beiden Bestimmungen die Aktivität des in der Probe vorliegenden Isoenzyms ermittelt. In einer bevorzugten Ausführungsform inhibiert eine vorgegebene Konzentration; an Amphi.ph.il spezifisch die Aktivität aller anwesenden -Iso- j enzyme mit Ausnahme des besonderen, zu bestimmenden Isoenzyms. ' Auf diese Weise kann die Aktivität des gewünschten Isoenzyms direkt durch einen Bestimmungsvorgang ermittelt werden.

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In weiterer Ausgestaltung der Erfindung wird auch ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von mehr als einem Isoenzym in einer Probe geschaffen, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Wirkung verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils, das die Aktivität eines jeden Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, ; auf jedes Isoenzym mengenmäßig erfaßt, in Gegenwart ver- ; schiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines ! einzelnen Amphiphils so viele Bestimmungen durchführt, wie Isoenzyme vorliegen und aus den erhaltenen Werten die jeweiligen Aktivitäten berechnet. Letzteres erfolgt dadurch, daß man aus der Anzahl der einzelnen Bestimmungen eine Anzahl von Gleichungen bildet, die eine der Anzahl an Gleichungen entsprechende Anzahl an Unbekannten, entsprechend der Anzahl an Isoenzymen, deren Aktivität bestimmt werden soll, enthalten. Diese Gleichungen werden gelöst, wodurch man die Aktivität eines jeden Isoenzyms in der Probe erhält.

Jedes Amphiphil, das zur Unterscheidung des jeweiligen Isoenzyms : geeignet ist, d.h. das die Aktivität des Isoenzyms unterschied- ; lieh beeinflußt, kann im erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren j gebraucht werden. Zu geeigneten Amphiphilen gehören beispiels- \ '■ weise Heparin und ionische oberflächenaktive Mittel. Zu Beispielen für ionische oberflächenaktive Mittel, die zur Durchführung der Erfindung brauchbar sind, gehören Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumbromid, N-Äthylpyridiniumbromid, Tetrapropylammoniumbromid, Nonatrimethylammoniumbromid, Dodecylaminhydrochlorid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Tri- : octylpropylammoniumbromid, Cetylpyridiniumbromid , Natriumdodecyldiphenylätherdisulfön at, Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat, Natriumisopropylnaphthalinsu!fonat, Natriumsulfosuccinat-dial kyl,-ester, Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat, Natrium-N-methyl- j _; N-oleoyl taurat, Natriumoctyl phenol poly(äthenoxy)sul fonat, Natriumalkylsulfonat, Octylphenolpoly(l-oxapropen)oxaäthencarbonsäure-^; Natriumsalz, Dodecansäure-Natriumsalz, Perfluoroctylcarbonsäure j

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Pe rfTuorheptylcarbonsäure ₅ Dehydrocholsäure-Natriumsalz, Natriumstearat, Natriumbutylsulfat, Natriumoctylsul fat, Natriumdecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natriumtetradecylsulfat, Cy_g-Fluoralkylphosphat, das Laurinsäurederivat eines Imidazo!alkylhaiogenidsalzes, das ölsäurederivat eines Imidazole!kylhalogenidsalzes , Tetra decyltrimethylammoniumbromid, C₇_g-Dimethylsulfat-quaternäres Amin, perfluorierte aromatische quaternare Amine, und dergleichen.'

Es liegt auf der Hand, daß das jeweils eingesetzte Amphiphil und dessen Konzentration vom jeweils zu bestimmenden Isoenzym abhängen. Nicht jedes Amphiphil besitzt Unterscheidungswirkung hinsichtlich der Aktivität von Isoenzymen in einem jeden Isoenzymsystem. So wurde beispielsweise festgestellt, daß es sich beim Hexadecyltrimethylammoniumbromid und beim Natriumdecylsulfat um Substanzen handelt, die ausgezeichnete Diskriminatoren. für LDH-Isoenzyme darstellen. Jedoch erscheint es, daß dieselben zwei Amphiphile hinsichtlich der Aktivitäten der Isoenzyme von Kreatinin-Phosphokinase (CBK) keinen diskriminatorischen Effekt : aufweisen, zumindest dann nicht, wenn sie anhand einer UbIichen · Bestimmungsmethode unter Verwendung gekuppelter Reaktionen und einer Bestimmungslösung, die Hexokinase und Glucose-6-phosphat- j Dehydrogenase enthält, untersucht werden, ^;

Wenn man feststellen will, ob ein Amphiphil die Aktivität eines | Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, läßt sich der nachfolgende ■

Test ohne Schwierigkeiten durchführen. Man stellt für jedes ; Amphiphil eine Reihe von Lösungen her, die einen weiten Konzentrationsbereich überdecken. Im allgemeinen reicht ein Konzentrationsbereich von ungefähr 0,01 bis ungefähr 100 mM ■ aus. Man bestimmt die Aktivität eines jeden Isoenzyms in Gegen- !

wart des Amphiphils und vergleicht mit seiner Aktivität in j einem Puffer (ohne Amphiphil) und zwar bei jeder Konzentration | des Amphiphils in der Reihe. Die Bestimmung der Konzentration j

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an Amphiphil, bei der eine maximale Diskriminierung auftritt, wird durch eine graphische Darstellung der relativen Aktivität gegen die Konzentration erleichtert.

Wie gesagt, ist es bevorzugt, Amphiphile zu wählen, die ein Isoenzym selektiv inhibieren» Jedoch ist dies zur Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht erforderlich. Es ist nur erforderlich, Amphiphile zu wählen, die zu einer Unterscheidung zwischen den Isoenzymen führen, indem sie die Aktivität der Isoenzyme unterschiedlich beeinflussen. Man stelle sich beispielsweise eine Situation vor, in der die Bestimmung der Isoenzyme Ι_χ, I und I , die in einer Probe vorliegen, gewünscht wird. Aus Bestimmungen mit reinem I , I und I wurde festgestellt,

χ y ζ

daß bei Bestimmung in Gegenwart von 1,0 mM eines Amphiphils A, die Aktivität von I um 50 %, die Aktivität von I_y um 75 % inhibiert wird und die Aktivität von I unverändert bleibt. Man führt eine Gesamtbestimmung in Gegenwart von 1,0 mM Amphiphil A, durch, was zu einer Aktivität von 650 Einheiten U pro Liter führen soll. Auf der Grundlage dieser Information läßt sich die folgende Gleichung schreiben:

0,5 χ + 0,25 y + ζ = 650 (1)

worin x, y und ζ für die in der Probe festgestellten Aktivitäten der Isoenzyme I , I und I stehen.

Aus Bestimmungen mit reinem I , I und I wurde festgestellt, daß bei der Bestimmung in Gegenwart von 0,5 mM Amphiphil A2 die Aktivität von I um 25 % ansteigt, die Aktivität von I um 25 % inhibiert wird und die Aktivität von I vollständig in- j hibiert wird. Man führt eine Gesamtbestimmung in Gegenwart von ί 0,5 mM A₂ durch, was zu einer Aktivität von 500 Einheiten U pro Liter führen soll. Aus dieser Information läßt sich die nachfolgende Gleichung schreiben:

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1,25 χ + 0,75 y = 500 (2)

Dann führt man eine Gesamtbestimmung ohne Anwesenheit eines Amphiphils durch, wobei eine Aktivität von 1000 Einheiten U pro Liter gefunden wird. Daraufhin läßt sich die nachfolgende Gleichung schreiben:

χ + y + ζ = 1000 (3)

Die drei vorstehenden Gleichungen können nunmehr gleichzeitig gelöst werden, um die Aktivität eines jeden einzelnen Isoenzyms zu ermitteln. Bei der vorstehend dargelegten hypothetischen Situation wurden die Aktivitäten der Isoenzyme als I_v = 200 Einheiten U pro Liter, I = 333 Einheiten U pro Liter und I = Einheiten U pro Liter, bestimmt. Für den Fachmann liegt es auf ι der Hand, daß jede Gruppe von Isoenzymen auf vergleichbare Weise wie bei der zuvor beschriebenen hypothetischen Situation, die zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienen soll, bestimmt werden kann. Bei der Durchführung einer derartigen Bestimmung versteht es sich, daß für jedes in der Probe vorhandene Isoenzym eine Bestimmung durchgeführt werden muß, wenn man getrennte Aktivitäten jedes einzelnen Isoenzyms erhalten will. Es versteht sich ferner, daß man anstelle von zwei verschiedenen Amphiphilen dasselbe Amphiphil bei zwei verschiedenen: Konzentrationen verwenden kann, und daß an die Stelle einer Bestimmung mit einem vorliegenden Amphiphil eine Bestimmung in Abwesenheit eines Amphiphils treten kann. So soll hier der Begriff "verschiedene Amphiphile" auch den Fall umfassen, daß einmal verschiedene Konzentrationen desselben Amphiphils vorliegen, oder auch der Fall, daß einmal kein Amphiphil vorliegt.

Im allgemeinen kann man irgendeine übliche Bestimmungsmethode zur Bestimmung der Aktivität des interessierenden Isoenzyms beim

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erfindungsgemäßen Verfahren anwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Isoenzymen ist brauchbar bei üblichen flüssigen Bestimmungen. Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß sämtliche Reagenzien in trockener oder lyophi1isierter Form eingesetzt und unmittelbar vor der Verwendung mit Wasser rekonstituiert werden können. Somit umfaßt die Erfindung auch den Einsatz lyophilisierter Reagenzien.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders brauchbar, wenn die Analytbestimmung in einem Mehrschichtelement des in der US-Patentschrift 3 992 158 beschriebenen Typs durchgeführt wird. Elemente dieses Typs enthalten im allgemeinen:

(1) eine Ausbreit- oder Verteilungsschicht,

(2) eine Reagensschicht, die unter den Einsatzbedingungen mit der Ausbreit- oder Verteilungsschicht in fluidem Kontakt steht, und ^:

(3) gewünschtenfal Is einem Schichtträger.

Bevorzugte Elemente dieser Art umfassen eine nicht-faserige Ausbreit- oder Verteilungsschicht. ^!

Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens brauchbaren Mehrschichtelemente können auch eine Aufzeichnungsschicht umfassen, d.h. eine Schicht, die unter der Ausbreit- oder Verteilungsschicht und unter der Reagensschicht angeordnet ^ ist und die keine wechselwirkenden Materialien enthält und lediglich zur Aufnahme der in den darüber liegenden Schichten gebildeten Farbstoffe dient. Derartige Schichten umfassen im allgemeinen eine Matrix, die für den Farbstoff permeabel ist und, gewünschtenfalls, andere Zusätze, wie Beizen, oberflächenaktive .Mittel , und dergleichen, die zu einer Verstärkung der Wirkungen in den Schichten führen können. Deren Anordnung in

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^analytischen Elementen ist ausführlicher in der belgischen Patentschrift 831 660 beschrieben.

j Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Anwen- ! dung und der erzielbaren Vorteile des erfindungsgemäßen Verfah- ; rens.

^; Beispiele 1 bis 9 erläutern die unterschiedlichen Einwirkungen bestimmter Amphiphile auf die Aktivitäten der LDH-Isoenzyme.

Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die nachfolgenden Ausführungen auf sämtliche Beispiele 1 bis 9:

1. Die Amphiphile werden entweder aus Äthanol-Wasser-oder Äthanol-Acetonlösungen umkristallisiert und vor ihrer Verwendung gründlich im Vakuum getrocknet. !

. 2. Zur Herstellung der Puffer und sämtlicher anderer Puffer- ; enthaltender Lösungen verwendet man destilliertes Wasser, das durch eine Ionenaustauschersäule gegeben wurde.

3. In den Beispielen werden Rinderherz-LDH (Sigma Chemical Co.,; Typ III), Kaninchenmuskel-LDH (Sigma Chemical Co., Typ V) und Schweine-LDH, LD₁₅ LD₂, LD₃, LD₄ und LD₅ in Form von Ammoniumsulfatsuspensionen verwendet.

4. Beim eingesetzten NADH handelt es sich um das aus Hefe isolierte Di η atriumsalz der Reinheitsstufe III. Der Cofaktor wird unter wasserfreien Bedingungen als Pulver bei Raumtemperatur gelagert und vor Licht geschützt.

. ■ ■ ■ ■ ί

■ . 5. Bestimmung der LDH-Aktivitat i

Die Bestimmung der LDH-Aktivität in Abwesenheit und in | Gegenwart eines oberflächenaktiven Mittels wird wie folgt ;

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ι durchgeführt. Man stellt täglich frisch Vorratslösungen von j NADH (1,8 raM) und Pyruvat (9,8 mM) in 30 mM Natriumphosphat-

j puffer mit pH 7,4 her. Die Enzymlösungen werden täglich frisch hergestellt, indem man mit einer Hamilton-Injektionsspritze aus den Enzymvorratslösungen 5 pl entnimmt und mit 30 mM

■ Phosphatpuffer auf 5 ml verdünnt. Die erhaltene Lösung enthält angenähert 5 Einheiten/ml. Man führt die Enzymbestimmung

durch, indem man 2,7 ml Puffer oder Puffer-oberflächenaktives Mittel-Lösung in eine 10 ml Quartzküvette pipettiert und anschließend jeweils 100 jul der NADH-Vorratslösungen und der Pyruvat-Vorratslösungen zugibt. Man gibt die Küvette in einen thermostatisierten Zeil enhalter, setzt in einen Cary 118-Spektrophotometer ein und läßt 1 Minute bei 25⁰C äquilibrieren. Zur äquilibrierten Lösung gibt man 100 ml Enzymlösung zu und schüttelt die Küvette schnell, während das Oberteil der Küvette mit einem kleinen Stück Parafilnr^ bedeckt ist und setzt sie dann wieder in den Spektrophotometer ein. Man mißt die Absorptionsabnahme bei 340 nm als Funktion der Zeit. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bestimmt, indem man die Neigung der anfänglichen Absorptionsabnahme, d.h. innerhalb der ersten 50 Sekunden der Reaktion, mißt.

6. Amphiphil-Vorratslösung

Man stellt Lösungen des Amphiphils her, indem man eine gegebene Menge an Amphiphil auswiegt, beispielsweise 100 mg, ■ und eine Vorratslösung in 30 mM Natriumphosphatpuffer in einem 100 ml Meßkolben herstellt. Lösungen mit einer geringeren Konzentration an Amphiphil werden hergestellt, indem man mit der Vorratslösung entsprechende Verdünnungen durchführt.

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Beispiel

■■ Wechselwirkung des Amphiphils mit LDH-Isoenzymen

'; Die LDH-Enzymbestimmung (Pyruvat + NADH —>) wird durch Abnahme der NADH-Absorption bei 340 nm als Funktion der Zeit durchge-

! führt. In Gegenwart eines Amphiphils tritt eine hoch spezifische Inaktivierung der LDH-Isoenzyme auf, wie dies in den Figuren la und Ib dargestellt ist. In Figur la ist das Aktivitätsprofil von LDg (Kaninchenmuskel) in Gegenwart von 8,65 mM Natriumdecyl-

I sulfat (DSS) und 1 mM Cetylpyridiniumbromid (CP) erläutert. ^: Es ist deutlich zu ersehen, daß das anionische Detergens zu einer schnellen Inaktivierung des LDg-Isoenzyms führt, wogegen

¹ in Gegenwart eines kationischen Detergens beinahe kein Aktivi- .

! tätsverlust beobachtet wird. Die gegenteilige Beobachtung macht ■ ί man bei LO, (Rinderherz), wie dies in Figur Ib erläutert ist. ; : Dies bedeutet, daß in Gegenwart von CP (Ib) eine vollständige _; . Inaktivierung des LD, erfolgt, wogegen im anionischen Detergens ·

j beinahe kein Aktivitätsverlust des LD^ beobachtet wird. Darüber j hinaus ist die spezifische Inaktivierung von LD^ und LDg durch

j die kationischen bzw. anionischen Detergenzien schnell. Das ! heißt die vollständige Inaktivierung erfolgt innerhalb der .

ι !

: Ansprechzeit des Instruments (ungefähr 5 Sekunden). ^!

ι t

] I

Beispiel

Wechselwirkung zwischen kationischem Amphiphil und LDH-Isoenzymen

Es wurde eine Anzahl kationischer Amphiphile hinsichtlich ihrer spezifischen Inaktivierung von LD₁ in Gegenwart von Lüg untersucht. Diese Verbindungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

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co co cn

TABELLE 1

Einfluß kationischer Amphiphile auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Amphi phil

N-Kthylpyridiniumbromid Tetrapropylammoniumbromid N on atrimethylammoniumbromid

Dodecylamin^#HCl DodecyltrimethyIammoniumbromid Trioctylpropylammoniumbrom id Hexadecylpyridiniumbromid Hexadecyltrimethylammoniumbromi d

Di methyldioctadecylammoniumbromid Didodecyldimethylammoniumbromi d

* nicht löslich in wäßrigem Puffer

für eine 50 ?4-ige Inaktivierung des angegebenen Isoenzyms benötigte Amphi phi I konzentrat!on

keine
keine

(LD₅
(LDj

(LD₅)
(LD?)

LD.

Wirkung Wirkung

0,15 mM 0,35 mM

6,5 mM

(LD

(LD₁)

LD₁)

10
12

1,6 2,2

mM

mM mM

0,07 mM 0,4 mM

0,9 mM mM

CX) CJ O

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Beispiel 3

Wirkung von Cetylpyridiniuinbromid (CP) auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Die Wirkung von CP auf die LDH-Isoenzyme LD₁, LD₂, LD₃, LD. und LD₅ ist in Figur 2 erläutert. Die vollständige Inaktivierung aller Isoenzyme mit Ausnahme von LDc erfolgt angenähert bei derselben Amphiphi!konzentration, u.h. bei 0,1 mM. Bei diesem Amphiphilspiegel verbleibt jedoch eine 100 $-ige LDg-Aktivitat, bezogen auf eine Pufferkontrolle. Mit zunehmender Amphiphilkonzentration geht jedoch die LB^-Aktivität allmählich verloren. Das Verhalten von LD-^ und LDg über einen weiteren Bereich der Konzentration des oberflächenaktiven Mittels ist in Figur 3 dargestellt. Es lassen sich mehrere Beobachtungen machen. (1) Bei höheren Konzentrationen an CP₅ d.h. 1 mM, wird die LDg-Aktivität wesentlich vermindert. {2) LDg aus zwei verschiedenen Spezies, d.h. Kaninchenmuskel und Schweinemuskel, ergibt eine unterschiedliche Stabilität gegenüber der CP-Inaktivierung, wobei das Enzym des Schweinemuskels stabiler als das Enzym des Kaninchenmuskels ist. (3) Nach vollständiger Inaktivierung des LDg (Kaninchenmuskel) führen weitere Zunahmen der CP-Konzentration dazu, daß der InaktiVierungseffekt auf das LDg verringert wird. Dieser Effekt bei steigender CP-Konzentration wird bei LDj nicht beobachtet.

Beispiel 4

Einfluß von Hexadecyltrimethylammoniumbromid auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Die Wirkung des Hexadecyltrimethylammoniumbromids (CTAB) auf die fünf LDH-Isoenzyme ist in Figur 4 dargestellt. Die allgemeine Charakteristik der Isoenzym-Oetergens-Wechselwirkung

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entspricht der mit CP. Jedoch erfolgt die Inaktivierung von LD₁, LDg» LDg und LD. bei einer höheren Konzentration an oberflächenaktivem Mittel_s und die LDg-Inaktivierung erfolgt in geringerem Ausmaß.

Das Verhalten von LD, und LD₅ (aus Kaninchen- und Schweinemuskel) über einen breiten Konzentrationsbereich an CTAB ist in Figur 5 dargestellt. Es lassen sich mehrere Beobachtungen machen. (1) Ungleich dem CP zeigen das LDg aus Kaninchen- und aus Schweinequellen in Gegenwart von CTAB beinahe identische Inaktivierungsprofile. (2) Selbst bei 10 mM Lösungen an oberflächenaktivem Mittel geht nicht mehr als 30 % der LDg-Kontroilaktivität in den CTAB-Lösungen verloren. (3) LD₁ spricht offensichtlich weniger auf eine Inaktivierung bei hohen Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel an, d.h. bei ungefähr 10 mM.

Beispiel

Verwendung von CTAB zur Bestimmung von LDg-Isoenzym in Lösung

Eine Lösung, die alle fünf LDH-Isoenzyme enthält, wird bei unterschiedlichen Konzentrationen an LD₅ mit einer 0,275 mM CTAB-Lösung in 30 mM Phosphatpuffer mit pH 7,4, untersucht. Die Prozedur umfaßt eine Bestimmung des LD₅ in Puffer, des LD₅ in CTAB-Lösung und dann des LDg in Gegenwart der anderen vier LDH-Isoenzyme in CTAB-Lösung. Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt. Man erhält für alle drei Lösungstypen eine lineare Aktivitäts-LDg-Konzentrationskurve, d.h. LDg-Puffer, LD₅-CTAB, LD₅ + andere Isoenzyme - CTAB. Da die Aktivität von LD₅ in CTAB angenähert ■ 90 bis 95 % des Pufferwerts ausmacht, kann man die etwas erniedrigten Werte für LD₅*-CTAB und LD₅, LD₄, LD₃, LD₂, LD₁-CTAB korrigieren.

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Beispiel

' Verwendung von CP zur Bestimmung von LP^-Isoenzym in Lösung

Man führt eine Bestimmung ähnlich der des Beispiels 5 mit CP als Amphiphil durch. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt. j Im Falle von CP führt die Bestimmung zu einem angenähert ; 30 %-igen Verlust an LDg-Aktivitat; folglich ist zu erwarten, daß die LDg-Aktivität in den LD₅-CP und LD₅, LD₄, LD₃, LD₂, y LDi-CP-Lösungen bezogen auf die Pufferwerte herabgesetzt ist. ^! Diese Verminderung der LDr-Aktivität wird in der Tat beobachtet

Man erhält jedoch eine lineare Aktivitäts-LDg-Konzentrations- '. kurve, anhand derer die LDr-Bestimmung durchgeführt werden kann

Beispiel

Einfluß anionischer Amphiphile auf die Aktivität von LDH-Isoenzymen

Es wurde ein Anzahl anionischer Amphiphile hinsichtlich ihrer spezifischen Inaktivierung von LD₁- in Gegenwart von LD₁ unter-

ι sucht. Diese Verbindungen sind in Tabelle 2 aufgeführt. <

TABELLE 2 '

Auf spezifische Wechselwirkung mit LDH- |

Isoenzymen untersuchte anionische Amphiphile j

Amphiphi1 Wechselwirkung

1) Butylsulfat

2) Octylsulfat

3) Dehydrocholsäure

4) Laurinsäure

5) Lithiumstearat

6) Natriumdecylsulfat

7) Natriumdodecylsulfat

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kein	Ei	nfl	uß
kein	Ei	nfl	uß
kein	Ei	nfl	uß
kein	Ei	nfl	uß
kein	Ei	nfl	uß
spez	ifi	sch
spez	ifi	sch

Von den untersuchten anionischen Amphiphilen ergeben das
Natriumdecylsulfat (DSS) und das Natriumdodecylsulfat (SDS)
brauchbare, positive Ergebnisse.

Beispiel 8

[ Einfluß von Natriumdecylsuifat und Natriumdodecylsulfat auf die

I Aktivität der LDH-Isoenzyme

¹ Die Wechselwirkung von Natriumdecylsulfat (DSS) mit den

i .

• fünf LDH-Isoenzymen ist in Figur 8 erläutert. Man beobachtet
¹ eine klar gegliederte Sequenz bei der Inaktivierung der Isoenzyme. Bei einer DSS-Konzentration von 7 mM wird die gesamte

■ LD₅ und LD₄~Akti vi tat zerstör⁴", wobei rund 30 % LD₃, 60 % LD₂

'· und 65 % LD^-Akti vität, bezogen auf die Pufferaktivitäten, ver-

: bleiben. Oberhalb einer Konzentration von 9 mM an Amphiphil

zeigt nur noch das LD, eine Aktivität. Daher kann eine Bestim- .

\ mung, die zu Informationen über die LD₁ und LDp-Spiegel führt, j

; unter Verwendung von DSS als Reagens durchgeführt werden.
i

I Die Wechselwirkung der LDH-Isoenzyme mit SDS ist in Figur 9

j dargestellt. Im Vergleich mit den Wirkungen des DSS handelt es i

! sich beim SDS um einen wirksameren Inaktivator, d.h. die In- ^!

ι aktivierung sämtlicher Isoenzyme erfolgt bei einer niedrigeren ;

1 !

^! Amphiphilkonzentration, und das SDS-System ermöglicht offensichtlich eine spezifischere Bestimmung des Isoenzyms LD₁, d.h. ; bei 3,5 mM SDS ist die LDg-Aktivität Null, wogegen die LDj-Aktivität 78 % der Aktivität der Pufferkontrolle ausmacht. Von : Interesse ist die Feststellung, daß bei 1,5 mM SDS die LD₄ und j LD₅-Aktivitäten Null betragen, wogegen 50 % LD₃₅ 65 % LD₂ und ]

• 95 % LD^-Aktivitäten verbleiben. Somit ist es durch geeignete j ; Wahl der SDS-Konzentration möglich, die LD₁ oder LD₁, LD₂ und ·. j LD,-Aktivitäten in Gegenwart der anderen LDH-Isoenzyme zu be- I : stimmen.

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Beispiel

Verwendung von DSS zur Bestimmung des LD-.-lsoenzyms in Lösung

Man untersucht eine Lösung» die alle fünf LDH-Isoenzyme enthält, bei wechselnden Konzentrationen von LD, mit 9 mM DSS-Lösung in
30 mM Phosphatpuffer von pH 7,4. Das Versuchsprotokoll entspricht den in den Beispielen 5 und 6 angegebenen Beschreibungen. Die
Ergebnisse sind in Figur 10 dargestellt. Es können verschiedene
Beobachtungen gemacht werden. (1) Das Aktivitäts-LD,-Konzentra- , tionsprofil ist linear. (2) In Gegenwart anderer Enzyme stellt
man ein leichtes Ansteigen von LD, in Detergenslösung im Ve*—
gleich zu LD-, alleine in Detergenslösung, fest. Diese gesteige»— te Aktivität beruht vermutlich auf einer Lüo-Aktivität. (3) Wie erwartet, ist die LDj-Aktivitat in der Amphiphillösung geringer als die LD-,-Kontroll aktivität im Puffer und zwar aufgrund einer LD-,-Inaktivierung durch das Amphiphil. (4) Es läßt sich feststellen, daß eine genaue Arbeitsweise zur Bestimmung der LD-,- '' Aktivität in Gegenwart der anderen vier LDH-Isoenzyme geschaf- : fen ist.

Beispiel 10

Untersuchung von Amphiphilen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zwischen LD ₁ und LD ₅ zu unterscheiden :

Man stellt eine Reihe von Lösungen her, die Konzentrationsbe- '■ reiche eines jeden zu untersuchenden Amphiphils überstreichen. · Man bestimmt die Aktivitäten von LD-j/und von LD,- in Gegenwart · verschiedener Konzentrationen eines jeden Amphiphils und ver- | gleicht mit den Enzymaktivitäten im Puffer (relative Aktivität).!

In Tabelle 3 sind die Ergebnisse aufgeführt. Sie zeigen die j Brauchbarkeit der untersuchten Amphiphile zur selektiven Inhi- ! bierung von LD^ und LDg. j

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Die Enzymaktivität in Gegenwart und Abwesenheit von Amphiphil wird nach dem folgenden Arbeitsverfahren gemessen: Man stellt täglich Vorratslösungen aus NADH (4 mM) und Pyruvat (40 mM) in 30 mM Natriumphosphatpuffer von pH 7,4 her. Ebenfalls täglich werden Enzymlösungen hergestellt, indem man mit einer Hamilton-Injektionsspritze 5 ul aus den Enzymvorratslösungen entnimmt und mit 30 mM Natriumphosphatpuffer auf 5 ml verdünnt (die erhaltene Lösung enthält angenähert 5 Einheiten U an Enzym/ml).' Die Enzymbestimmung wird durchgeführt, indem man 2,7 ml Puffer oder Puffer-oberflächenaktives Mittel-Lösung in eine Quartzküvette mit 10 mm optischer Weglänge einpipettiert und jeweils 100 pl an NADH und Pyruvatvorratslösungen zusetzt. Man gibt die Küvette in einen thermostatisierten Zellenhalter in einem Cary 118-Spektrophotometer und läßt 1 Minute lang bei 25⁰C äqui1ibrieren. Unter gutem Mischen gibt man Enzymlösung zu. Die Absorptionsabnahme bei 340 nm wird als Funktion der Zeit gemessen. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bestimmt, indem man die Steigung der anfänglichen Absorptionsabnahme, d.h. innerhalb der ersten 50 Sekunden in der Reaktion, mißt.

TABELLE 3

Amphiphile, die hinsichtlich ihrer LDH-Isoenzym-Inhibierungsspezifität untersucht wurden

Amphi phi 1 Wirksamkeit

1. Natriu,m-n-decyl diphenyl äther- ++ disulfonat (Dowfax® 3B2)

2. Natriumisopropylnaphthalinsulfonat +

'(S)
^ O₁S)

N atriumsulfosuccin atdialkylester (Aerosol® 196)

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M/19

Amphiphi Ί

4. Natrium-N-methyl -N-oleoyl taurat

9.
10.

■ 11. - 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18.

: 19.

'. 20,

(Igepon®) Di ηatrium-N-octadecylsulfosuccinamat (Aerosol® 18)

Natriumoctylphenolpoly(äthenoxy)sulfonat (Triton^ X-200, zur Entfernung von Alkoholen gereinigt) Alkylsulfonat (Monflor®31) Octylphenol poly(1-oxapropen)oxaäthan-

(R) carbonsäure-Natriumsalz (Akypo OP-115,

Natriumsalz) Natriumdodecanoat

C-, _D-Perfluoralkyl carbonsäure (Zonyf^ FSA)

Natriumdehydrochol at

Natriumstearat *Natriumbutylsulfat ♦Natriumoctylsulfat *Natriumdecylsul fat ♦Natriumdodecyl sulfat *Natriumtetradecylsulfat Heparin Cy_g-Perfluoralkylphosphat (Zonyl® FSP)

Olsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes (Amine^ 0) Wirksamkeit

++ 0

O O O

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M/19 ι 814

Amphiphil

Wirksamkeit

21.

22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29.

30. ' 31,

Laurinsäurederivat eines Imdiazolalkylhalogenidsalzes (Amine C)

Nonatrimethylammoniumbromi d *Dodecyltrimethylammoni umbromid *Tetradecyltrimethylammoni umbromi d *Hexadecyltrimethylammoniumbromid *Hexadecylpyridiniumbromid *Dodecylaminhydrochlorid

Trioctylpropylammoniumbromid

N-ß-Hydroxyäthyl-N,N-dimethyl-N-3-palmitamidopropylammoniumchlο rid

Tetrapropylammoniumbromid

C₇_g-Perfluordimethylsul fat-quaternäres Ami η (Zonyl® FSC)

Die oberflächenaktiven Mittel werden mindestens einmal ' umkristallisiert, bevor die Wechselwirkung mit LDH bestimmt! wird.

Spezifische Inhibierung von LDg bezogen auf LD,. ■

⁺ Teilweise selektive Inhibierung von LDj- bezogen auf LD₁. 0 Keine selektive Inhibierung von LD₁ oder LD₅. - Teilweise selektive Inhibierung von LD₁ bezogen auf LDg. -- Spezifische Inhibierung von LDi bezogen auf LD₁-. I

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Aufschlüsselung der Warenzeichen

1. Dowfax^ - The Dow Chemical Company

2» Aerosol^ - American Cyanamid Company

3.. Igepon^ - GAF Corporation

4. Triton^ - Rohm & Haas Company

5. Monflor^ - Imperial Chemical Industries

6. Akypo^ - Chem-Y Corp. (Holland.)

7. Zonyl^-' - E. I. du Pont de Nemours & Co.

(R)

8. Amine'^ - Ciba-Geigy Chemical Corporation

Es wurden auch mehrere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zusammen mit LDH untersucht, und man stellt fest, daß bei Lösungen bis zu 2 % Gewicht/Volumen keine selektive Inaktivierung der Isoenzyme erfolgte.

Beispiel 11

Einfluß von N-ß-Hydroxyäthyl -N ,N-dimethyl-N-3-palmitamidopropyl -■ ammoniumchlorid aufidie Aktivität von LDH-Isoenzymen

Ungleich anderen untersuchten kationischen Amphiphilen, die üblicherweise zu einer vollständigen Inaktivierung von LD-^- LD^ führen, wobei nixr LDg-Akti vität übrig bleibt, führt das ; N-ß-Hydroxyäthyl-N,N-dimethyl-N-3-palmitamidopropylammoniumchlorid hauptsächlich zu einer Inaktivierung von LD^-LDg, wo- ^: bei die LDg-Aktivität in hohem Umfang erhalten bleibt (90 %) und die LD^-Akti vi t_sät ungefähr noch 60 % ausmacht, wie dies in Figur 11 dargestellt ist. Somit ist eine Bestimmung von LD₅ oder LDo möglich, ufid in Verbindung mit einer LDg-Bestimmung läßt sich gleichzeitig das LD₄ bestimmen.

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Beispiel 12 Einfluß von Heparin auf die Aktivität der LOH-Xsoenzyme

Mit Heparin, einem sulfatierten MucopoTysaccharid erhält man ein unerwartetes Ergebnis. Heparin beeinflußt die LDH-Aktivität auf eine Weise, die der entgegengesetzt ist, welche auf der Grundlage der mit anderen Sulfat-Einheit-enthaltenden Polyanionen durchgeführten Untersuchung vorherzusagen ist. LD, wird stärker inaktiviert als LDg, wie dies der Figur 12 zu entnehmen ist.

Die nachfolgenden Beispiele 13 bis 17 erläutern die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf menschliche LDH-Isoenzyme. Für die Beispiele 13 bis 17 gilt das nachfolgend Gesagte:

7. Herstellung von Humanenzym-enthaltendem Serum

Man erhöht den pH von vereinigtem Humanserum, das bis kurz vor der Anwendung in gefrorenem Zustand gehalten wird, auf einen Wert von 11,5, bis die gesamte LDH-Aktivitat zerstört ist. Dann stellt man den pH auf 7,4 ein und bestimmt wiederum die LDH-Aktivität des Serums, um sicherzustellen, daß kein LDH reaktiviert worden ist. Anschließend gibt man ein spezifisches menschliches LDH-Isoenzym zu {erhalten aus Leberhomogenisat oder roten Blutzellen), um eine Enzymkonzentration von ungefähr 100 Einheiten/1 zu erhalten. Die verschnittenen (spiked) Serumproben werden zwischen dem Gebrauch gekühlt und, falls erforderlich, wieder verschnitten (respiked). Man stellt jede Woche frisches Serum her.

8. Die angewendete Bestimmungsmethode ist die gleiche wie vor- \ stehend für die Beispiele 1 bis 12 beschrieben, mit der Aus- ! nähme, daß die Testproben aus 25 bis 30 pl Serum anstelle von; 100 ul wäßriger Enzymlösung bestehen. !

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Beispiel 13_ Einfluß von CTAB auf die Aktivität von humanen LDH-Isoenzymen

Man verwendet die zuvor beschriebene Bestimmungsmethode, wobei man wechselnde Konzentrationen von CTAB als Amphiphil und 25 jul. Serumproben einsetzt, um die unterschiedliche Inaktivierung von Humanserum-LDH-Isoenzymen zu zeigen. Wie in Figur 13 gezeigt, wird die Probe, welche die Isoenzyme LDi_s LDp und LDg enthält, vollständig inaktiviert_s während die Probe, welche LD,- enthält, mindestens 60 % ihrer Aktivität in einem Bereich von oberflächenaktiven Mitteln von 0,002 bis 0,004 M beibehält (diese Proben enthalten kein LD^).

Beispiel 14_

Einfluß hoher Proteinkonzentrationen auf die Bestimmung von humanen LDH-Isoenzymen

Gibt man große Mengen an Protein (8 bis 16 %) zu der Amphiphil-Bestimmungslösung , bleibt die erforderliche Menge an Amphiphil normal (ungefähr 3,0 mM). Darüber hinaus wird in Gegenwart eineH hohen Proteinkonzentration die relative Aktivität des Isoenzyms (in diesem Fall LD₅) stark erhöht (>100 %), während LD_1-3 ^! völlig desaktiviert bleiben. Vergleiche Figur 14.

Beispiel

Einfluß des pH auf die Unterscheidung zwischen humanen LD^ und LD/j-Isoenzymen

Wenn man die Lösungsbestimmung, die routinemäßig bei pH 7,4 durchgeführt wird, unter Verwendung von CTAB bei diesem pH

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, 814 770

durchführt, so ergibt sich eine nicht adäquate Unterscheidung zwischen LDg und LD^ (vgl. Figur 15). Es wurde jedoch erfindungsgemäß festgestellt, daß eine Amphiphil-Bestimmungslösung mit einem höheren pH zu einer ausgezeichneten Differenzierung zwischen den Isoenzymen führt.

Man führt eine Versuchsreihe mit 30 jbil Serumproben durch, die sowohl LDg und LD. enthalten, wobei man eine Amphiphi 1 -Besti'mmungslösung einsetzt, die 3 mM CTAB in 14 % Protein enthält. Man variiert den pH des Reagens von 7,3 bis 8,3. Figur 15 zeigt, daß der optimale pH zur Unterscheidung zwischen LDg und LD-7,75 bis 7,85 beträgt. LD₁- wird auf über 100 % aktiviert, während das LD. vollständig inaktiviert wird.

Beispiel

Einfluß der CTAB-Konzentration auf die Unterscheidung humaner LDH-Isoenzyme

Man verwendet eine optimierte Bestimmungsmethode, d.h. eine Amphiphil-Bestimmungslösung mit pH 7,8, die 14 % Protein enthält, um den Einfluß variierender Konzentrationen an CTAB auf die Isoenzyme zu ermitteln. Es wird festgestellt, daß eine Lösung mit einem Gehalt an 2,5 mM CTAB die Isoenzyme LD₄ und LD₅ vollständig aktiv läßt, während die Isoenzyme LD^ und LD^ vollständig inaktiviert werden.

Beispiel 17

Einfluß von DSS auf die Aktivität von humanen LDH-Isoenzymen j

Man verwendet das zuvor beschriebene, optimierte Bestimmungsverfahren unter Einsatz von 0,1 M Natriumdecylsulfat (DSS) als j

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Amphiphil. Diese Lösung führt zu einer vollständigen Desaktivierung von LD_{2 3 4} und 5' ^{wobei das LD}i vollständig aktiv bleibt. Diese, unter Verwendung von Humanseren erhaltenen Ergebnisse stehen in guter Obereinstimmung mit den Ergebnissen, in denen Ammoniumsulfatsuspensionen von tierischem LDH eingesetzt wurden.

Die Beispiele 18 bis 21 erläutern die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung der Isoenzyme von Malat-Dehydrogenase (MDH). Malat-Dehydrogenase (L-Malat:NAD⁺ Oxidoreductase, EC 1.1.1.37, MDH) ein Bestandteil des Zitronensäure-; zyklus, findet sich in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen. Obgleich es hinsichtlich der Anzahl an MDH-Isoenzymen beträchtliche Meinungsverschiedenheiten gibt, haben kürzliche Untersuchungen gezeigt, daß bei Säugern zwei unterschiedliche Isoenzyme vorliegen, von denen das eine in den Mitochondrien (mMDH) und das andere im Cytoplasma (cMDH) lokalisiert sind.

Falls nicht anders angegeben,, geltend die nachfolgenden Ausführungen für die Beispiele 18 bis 21.

1. Man verwendet Schweine-cMDH und mMDH als Ammoniumsulfat- '. suspensionen. Normalerweise verdünnt man 5 jjI der Enzymvorratslösungen mit 30 mM Phosphatpuffer von pH 7,4 vor der Verwendung auf 10 ml. Die erhaltenen Enzymlösungen werden i in Eiswasser gelagert. Falls nicht anders angegeben, werden = 100 ij1 aliquote Anteile für die Bestimmung entnommen.

2. Untersuchung auf MDH -.."'"

Die Bestimmung beruht auf der Umwandlung der Oxalessigsäure ^!

in Gegenwart von NADH und MDH in Malat.

H⁺ + OAA + NADH Malat + NAD⁺ i

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Man führt die Bestimmung in 30 mM Phosphatpuffer bei Umgebungstemperatur mit und ohne entsprechende Konzentrationen an oberflächenaktivem Mittel durch. Der Gehalt beträgt 0,17 mM Oxalessigsäure (OAA) und 0,13 mM NADH. Man verfolgt die Reaktion, indem man die Absorptionsabnahme bei 340 nm unter Verwendung eines Beckman 25-Spektrophotometers oder eines Cary 118-Spektrophotometers beobachtet. Die OAA-Lösungen werden über Eis gelagert, um eine Hydrolyse zu Brenztraubensäure zu vermeiden.

Beispiel 18 Einfluß von CTAB auf die Aktivität der MDH-Isoenzyme

Unter Anwendung der zuvor beschriebenen Bestimmungsmethode werden verschiedene Konzentrationen an CTAB (in Figur 16 dargestellt) als kationisches Amphiphil zugesetzt und die anfänglichen Reaktionsgeschwindigkeiten gemessen. Wie in Figur 16 dargestellt, erhält man eine gute Auftrennung der zwei Isoenzyme. cMDH wird bei 0,3 mM CTAB im wesentlichen vollständig inaktiviert, während das mMDH bezogen auf eine Pufferkontrolle zu 100 % aktiv bleibt.

Mit zunehmender Konzentration an Amphiphil ( > 3,5 mM) sinkt

die Auflösung, da die Inaktivierung des mMDH einsetzt und cMDH

offensichtlich gegenüber einer weiteren Inaktivierung resistent i st.

Beispiel 19 Einfluß von DSS auf die Aktivität von MDH-Isoenzymen

Man befolgt dieselbe Arbeitsweise wie in Beispiel 18 mit der

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: Ausnahme, daß man das anionische Amphiphil Natriumdecylsul fat j (DSS) einsetzt. Es erfolgt eine deutlich bevorzugte Inaktivierung ! von mMDH, bezogen auf cMDH, wie dies in Figur 17 dargestellt ist

Beispiel 20 Verbesserte Unterscheidung zwischen MDH-Isoenzymen !

Man befolgt dieselbe Arbeitsweise wie in Beispiel 18 beschrie- : ben mit der Ausnahme, daß die Geschwindigkeitsmessungen nicht am Anfang, sondern nach 2 Minuten durchgeführt werden. Wie in Figur 18 erläutert, erhält man eine bessere Auftrennung der beiden MDH-Isoenzyme. Man stellt fest, daß durch Erhöhung der Einwirkungszeit von CTÄB auf das Enzym eine wirksamere Inaktivierung von ¹CMDH erfolgt, ohne daß ein Einfluß auf das mMDH ausgeübt wird.

Beispiel 21 !

Einfluß von Amphiphiien auf MDH-Isoenzyme, die zu vereinigtem Humanserum zugesetzt wurden ^[

Zur Bestimmung des Einflusses von Serumproteinen auf die Wechselwirkung von Amphiphilen mit MDH-Isoenzymen, gibt man vereinigtes Humanserum durch eine 1,5 Meter-AMP-Sepharose -Säule, um verbliebenes MDH zu entfernen. Das erhaltene Serum wird mit ; Schweine-cMDH oder mMDH verschnitten. Die Bestimmungsmethode ist mit der zuvor unter Verwendung von CTAB als Amphiphil be- _; schriebenen Methode identisch mit der Ausnahme, daß die Größe der Enzymprobe auf 20 ul verringert wurde, um eine gegenseitige Beeinflussung zwischen Protein und oberflächenaktivem Mittel zu mindern. j Figur 19 zeigt das nach 2 Minuten erhaltene Aktivitätsprofil. | Nach 3 Minuten erhält man eine verbesserte Auflösung, wie dies · in Figur 20 dargestellt ist. i

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Die Beispiele 22 bis 24 erläutern die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung von Isoenzymen der alkalischen Phosphatase, der Aspartat-Aminotransferase (SGOT) und der Kreatinin-Phosphokinase.

Beispiel 22

Einfluß von Amphiphilen auf Isoenzyme der alkalischen Phosphatase

Man untersucht den Einfluß von Amphiphilen auf die Isoenzyme der alkalischen Phosphatase unter Verwendung von alkalischer Phosphatase des Darms (Quelle: Hühner) und von alkalischer Phosphatase aus der Leber (Quelle: Rinder). Man führt die Bestimmung der alkalischen Phosphataseaktivität durch, indem man 30 mM Glycinpuffer bei pH 8,5 mit 1 mM p-Nitrophenylphosphat als Substrat einsetzt. Figur 21 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat. Figur 22 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung der Isoenzyme der alkalischen Phosphatase in Gegenwart von Cetylpyridiniumbromid mit und ohne Natriumchlorid. Es ist zu bemerken, daß die Anwesenheit von 0,2 M Natriumchlorid die Unterscheidung zwischen den Isoenzymen signifikant akzentuiert.

Beispiel 23

Einfluß von Amphiphilen auf Isoenzyme der Aspartat-Aminotransferase i

Es wurde gezeigt, daß Aspartat-Aminotransferase (L-Aspartat; 2-Oxoglutarat-Aminotransferase EC 2.6.1.1) mindestens zwei ver- \ schiedene Isoenzymformen aufweist. Ein Enzym wird aus dem Cytoplasma, das andere aus den Mitochondrien isoliert. Die in

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i M/19 141 ■ 814 770

diesem Beispiel eingesetzten Isoenzyme von SGOT sind in einer lyophi1isierten Humanserum-Matrix enthalten und werden bei 4⁰C gelagert und zur Verwendung mit entionisiertem Wasser rekonstituiert.

Bei der Bestimmungsmethode des SGOT handelt es sich um die von Henry et al, American Journal of Clinical Pathology, Band 34, Seite 381 (1960) und von Rodgerson et al, Clinical Chemistry, Band 20, Seite 43 (1974) beschriebene Methode. Die Bestimmungslösung enthält 90 mM Phosphatpuffer mit pH 7,4, 0,18 mM NADH, 6 mM 2-Oxoglutarat, 125 mM Aspartat und 4 Einheiten MDH. Die Bestimmung wird bei 3O⁰C an einem Bec:kman~25-Spektro,photom:eter durchgeführt. Man überwacht die Absorptionsabnahme bei 340 nm. Man stellt Lösungen von oberflächenaktivem Mittel in 90 mM Phosphatpuffer her und verwendet sie anstelle des Bestimmungs- ^; puffers, um die Wirkung auf die Isoenzyme zu bestimmen.

Figur 23 zeigt die Ergebnisse der Untersuchung auf SGOT-Isoenzyme ^: in Gegenwart von Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB), = Figur 24 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von SGOT-Isoenzymen in Gegenwart von Natriumdecylsulfat (DSS). Es wurde auch Cetylpyridiniumbromid verwendet, diese Verbindung ergibt je- : doch offensichtlich keine Unterscheidung zwischen diesen Isoenzymen .

B e i s ρ i e 1

Verwendung von Amphiphilen zur Beeinflussung der Aktivität von Isoenzymen bei einer Bestimmung unter Verwendung eines Mehrschichtenelements

Man stellt nach dem nachfolgenden Schema analytische Elemente her, die sämtliche erforderlichen Reagenzien zur mengenmäßigen Erfassung spezifischer Isoenzyme enthalten-

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M/19 141
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Schicht 2

Ausbreit-Reagens schicht

Avicel^w-Ausbreitschicht,
enthaltend Pyruvat und oberflächenaktives Mittel

Schicht 1

Reagensschicht

Agarose-Schicht, enthaltend Tris-Puffer + NADH

////Träger///////

//////Lexan^-Träger////////

Man verwendet Natriumdecylsulfat, um bei einer Bestimmung unter Verwendung eines Mehrschichtenelements zwischen LD, und LDg-Isoenzymen zu unterscheiden. Die Teststreifen werden wie folgt beschichtet:

Man beschichtet einen Lexan^w-Träger, der mit einer Polycarbonat-Unterschicht versehen ist, mit einer Reagensschicht. Die Reagensschicht enthält Agarose (2,7 g/m²) und NADH (0,12 g/m²) in 0,1 M Tris-Puffer von pH 7,4. Dann beschichtet man mit einer Ausbreit-Reagensschicht, die Avicel^ (43 g/m )₅ Natriumpyruvat

2 2

(0,5 g/m ), Polyvinylpyrrolidon (PVP) (2,15 g/m ) in Isopropylalkohol und Natriumdecylsulfat (DSS) (0,54 g/m ) enthält.

Es werden Vergleichsstreifen wie zuvor beschrieben überzogen mit der Ausnahme, daß der Ausbreit-Reagensschicht kein Natriumdecylsulfat zugesetzt wird.

Die Streifen werden nach der folgenden Arbeitsweise bewertet:

Man stellt zwei wäßrige Lösungen von gereinigten Schweine-LDH-Isoenzymen her, von denen die eine LD^ und die andere LD₅ enthält. Diese Lösungen werden in 0,01 M Tris-Puffer von pH 7,4

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zu angenähert 90 mU/ml hergestellt. Von jeder Lösung tüpfelt man Probenanteile (10 jjI ) und eine Pufferkontroll e (0,01 M Tris) auf die Streifen, die dann in einer POS-Einheit auf abnehmende Fluoreszenz des NADH in Abhängigkeit von der Zeit bei 340 nm gemessen werden.

Die Vergleichsstreifen ohne oberflächenaktives Mittel zeigen die in Tabelle 4 dargestellten Aktivitäten für LD-, und LDg- Dagegen ergibt der Untersuchungsstreifen, der das oberflächenaktive Mittel DSS enthält, eine Aktivität für LD^, jedoch keine Aktivität für LD,.. Mit anderen Worten erfolgt in Gegenwart ^: eines anionischen Amphiphils eine vollständige Inhibierung der

Aktivität von LD₁-.

	TABELLE 4	vität
	Isoenzymakti	^LD5
Streifen	LD₁	13 0
KontrolTe DSS	11 15

Für den Fachmann liegt es auf der Hand, daß bei der erfindungsgemäßen Bestimmung der Isoenzyme man jederzeit gewünschtenfalls anstelle der Verwendung eines zweiten Amphiphils auch dasselbe Amphiphil bei einer zweiten, vorgegebenen Konzentration einsetzen kann, um ein äquivalentes Ergebnis zu erhalten.

2 l/V.

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Isoenzyms in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) in einer ersten Bestimmung

die Gesamtenzymaktivität in der Probe ermittelt und

b) in Gegenwart einer vorgegebenen Konzentration eines Amphiphils, das spezifisch das Isoenzym inhibiert, eine zweite Bestimmung durchführt und

c) aus der Differenz der beiden Bestimmungen die Aktivität des in der Probe vorliegenden Isoenzyms ermittelt.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Aktivität eines Isoenzyms von Lactatdehydrogenase (LDH) bestimmt.

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines LDH-Isoenzyms nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Natriumdecylsulfat oder Natriumdodecylsulfat als Amphiphil verwen- ^! det und das Isoenzym LD, bestimmt.

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines LDH-Isoenzyms nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Cetylpyridiniumbromid oder Hexadecyltrimethylammoniumbromid als Amphiphil verwendet und das Isoenzym LDg bestimmt.

Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines LDH-Isoenzyms nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Heparin, Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat, Natriumisopropyl- j naphtha!insulfonat, Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat, j Natriumoctylphenolpoly(äthenoxy)sulfonat, Alkylsulfonat, j

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Perfluoralkylcarbonsäure, Natriumoctylsulfat, Natriumdecylsulfat, Natriumdodecylsulfat, Natriumtetradecylsulfat, das ölsäurederivat eines Imidazolalkylhaiogenidsalzes, das Laurinsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes, N on atrimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecy1 trimethyI ammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumbromid, Dodecylaminhydrochlorid und Perf1uordimethylsulfat-quaternäres Ämin₃ als Amphiphil verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Isoenzym Malatdehydrogenase (MDH), alkalische Phosphatase und Aspartat-Aminotransferase, bestimmt.

7. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von mehr als einem Isoenzym in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß man

die Wirkung verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils, das die Aktivi-i tat eines jeden Isoenzyms unterschiedlich beeinflußt, auf jedes Isoenzym mengenmäßig erfaßt,

in Gegenwart verschiedener Amphiphile oder verschiedener Konzentrationen eines einzelnen Amphiphils so viele Bestimmungen durchführt, wie Isoenzyme vorliegen, und

aus den erhaltenen Werten die jeweiligen Aktivitäten berechnet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isoenzyme von LDH, MDH, alkalischer Phosphatase und Aminotransferase bestimmt.

9. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ',

man die Isoenzyme von LDH bestimmt. i

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10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man Heparin, Natrium-n-decyldiphenylätherdisulfonat, Natriumisopropylnaphthalinsu!fonat, Dinatrium-N-octadecylsulfosuccinamat, Natriumoctylphenol poly(äthenoxy)sulfonat, Alkyl sulfonat, Perfluoralkylcarbonsäure, Natriumoctylsulfat, Natriumdecylsulfat, Natriumdodecylsulfat_s Natriumtetradecyl■ sulfat, das ülsäurederivat eines Imidazolalkylhalogenidsalzes, das Laurinsäurederivat eines Imidazolalkylhaiogenidsalzes, Nonatrimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumbromid, Tetradecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecyltrimethylammoniumbromid, Hexadecylpyridiniumbromid , Dodecyl aminhydrochlorid und Perf1uordimethylsulfat-quaternäres Amin, als Amphiphil verwendet.

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