WO2000034777A2 - Verfahren zur bestimmung von biologischen langzeitwirkungen von stoffen - Google Patents

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Jens Zeller
Thomas Zoller
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Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts
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Definitions

  • the invention relates to a method for determining such long-term biological effects of a substance, which depend on the solubility of the substance or on the removal ("leaching") of bioactive components in the body.
  • Substances introduced into the animal or human organism can interact with the organisms and thereby cause reactions. Such reactions can often cause damage to the organism up to its death. If substances are harmful to the organism, one speaks of their toxicity. Toxicity can e.g. also lie in the induction of tumors, especially if the substances act as "depot poisons".
  • substances can also have a slower effect, the measurement of which is considerably more difficult. It has been shown that the solubility of some substances can have an effect on the long-term effect, since solubility and the associated shorter biopersistence lead to a reduced effect on the organism and thus to a smaller reaction.
  • the substance to be examined was administered to animals by inhalation, instillation or implantation and after a waiting period the animal was killed and checked for material residues, e.g. Fiber residues, examined. Alternatively, it was waited until a carcinogenic effect occurred, if one should be investigated for the substance.
  • material residues e.g. Fiber residues
  • Another approach consists in flushing the substance to be examined with various salt solutions and quantifying the substance dissolution by analyzing the constituents in the flushing liquid.
  • a dispersion was used instead of a rinse.
  • the analysis of substance constituents in the suspension or rinsing liquid allows an indirect conclusion to be drawn about the solution of substance constituents, but no direct statement about the reactive substance Potential of remaining, as yet undissolved components.
  • the invention relates to a method for determining long-term biological effects of a substance, which depend on its solubility, with the following steps:
  • the long-term biological effect to be determined is preferably the toxicity of the substance, the toxicity of the substance being based on its ability to initiate the release of oxygen radicals from the cells.
  • the substances to be examined can be, for example, (mineral) fibers, dusts, xenobiotics and other (potential) inhalation agents.
  • the cells used are cells with "respiratory-bursf” activity, such as phagocytes (macrophages, monocytes, granulocytes), lung cells (alveolar epithelial cells) or immortalized cell lines of these or similar cell types or other (tumor) cell lines with "respiratory -bursf 'activity of humans or animals.
  • Chemiluminescence is shown, for example, as the reaction that is caused.
  • the amount of the substances to be examined, which is adapted to generate a sufficiently high chemiluminescence signal for the respective cell number is preferably 100-500 ⁇ g dust per 5 ⁇ 10 5 cells, preferably around 250 ⁇ g dust.
  • the first sample is prepared so that the first predetermined time is such that the substance to be examined is just suspended in the volume of the medium, i.e. more or less immediately after the mixing of the substance and the medium, while the second and each further predetermined time can be such that the substance to be examined is mixed in the volume of the medium for a longer time, so that at least part of the substance changes may be subject.
  • Typical values are in the range from weeks to months, preferably 2-6 weeks for a short-term incubation. For a long-term incubation, periods of more than 6 weeks to several months should be used.
  • the medium which is used to dissolve or mix the substance can preferably correspond to certain body fluids in its ability to disperse substances, for example those from the area of the body which is interesting for the particular question. It is preferably H 2 0, simulated lung fluids, (modified) gamble solutions, physiological salt or saline solutions (e.g. 0.9% NaCI solution), Ringer's solution, Sörensen buffer, veronal buffer or other buffer solutions, such as specified in Documenta Gligy Scientific Tables (6th ed., P. 277) or in the Gibco product catalog (1996-1997, pp. 77-84 and 88). It should be noted that the buffers and solutions themselves can affect the level of chemiluminescence.
  • physiological salt or saline solutions e.g. 0.9% NaCI solution
  • Ringer's solution e.g. 0.9% NaCI solution
  • Sörensen buffer e.g. 0.9% NaCI solution
  • veronal buffer or other buffer solutions such as specified in Documenta Gligy Scientific Tables (6th
  • the method according to the invention is based on the fact that samples of the substance to be examined, which have been incubated for different lengths in order to determine differences in their biological effects depending on their solubility, are added to cell batches, whereupon the cells show a reaction which can be measured. Before the method according to the invention is actually used, it is therefore necessary to determine a reaction of the cells which can be measured and which is correlated with the long-term effect of the substance to be investigated.
  • a certain amount of the substance to be examined e.g. a mineral fiber
  • a suitable medium e.g. mixed with a saline solution to form a suspension or solution.
  • At least two different samples are produced, one of which is used for a longer period of time, e.g. several weeks, to allow a partial solution of the substance in the medium, while the other sample is freshly prepared and used for determination immediately after suspension or mixing. It is also possible to produce several samples which incubate for different lengths of time in order to be able to better track solubility-dependent effects over time. Furthermore, it is possible not to use the first sample immediately after its preparation, but also to incubate it for a predetermined time.
  • the different, at least two samples are then added to a corresponding number of batches of suitable cells.
  • the cells can, for example, in a Suspension in a suitable nutrient medium so that only the two liquids have to be mixed together.
  • the property to be measured is measured, for example chemiluminescence when using mineral fibers. This can be done, for example, with a commercially available luminometer.
  • the difference in chemiluminescence between the freshly incubated sample and the pre-incubated sample (s) is determined by either determining the maximum chemiluminescence (or other size) of the sample, or the integrals of the chemiluminescence over time of these samples and be compared with each other.
  • the ratio of the values determined in this way allows the long-term effect to be estimated with regard to the property which is correlated with the reaction which is brought about. It is not the absolute values of the chemiluminescence that is important, but the ratio of the values determined in order to arrive at an estimate of the (long-term) toxicity.
  • a particularly interesting group of substances for using the method of the present invention are the mineral fibers, in particular also the respirable mineral fibers.
  • the application of the method according to the invention to such fibers is described below by way of example, the size used to measure the reaction of the cells being the bioluminescence emitted by certain cells suitable for this purpose.
  • the synthetic mineral fibers that can be quickly checked for their toxicological long-term risk with the method according to the invention are produced in large quantities worldwide for the purpose of insulation, thermal insulation etc. and have largely replaced natural mineral fibers such as asbestos. It was found, that adverse health effects cannot be ruled out even with these artificial fibers, which may depend on their size, respirability, respiratory ability and biopersistence in the lung tissue. With regard to the removal of fibers from the lungs, various mechanisms are discussed, including breaking up the fibers and dissolving them. The method according to the invention thus provides a useful means of making it possible to draw conclusions about the fact that fibers can be eliminated from the body and thus indirectly about their toxicity through the effect of fiber mixtures or suspensions.
  • chemiluminescence As already shown above, certain cell types, e.g. in macrophages, after contact with fibers to release oxygen radicals, the direct measurement of which is, however, difficult. When free radicals are released, however, these cells show the phenomenon of chemiluminescence, which can easily be quantified using suitable measuring devices. The formation of chemiluminescence is therefore a suitable, measurable reaction to the action of the mineral fibers. The chemiluminescence determination enables an assessment of the solubility or biodurability of the investigated substances. Chemiluminescence can possibly be enhanced by substances such as luminol or lucigenin.
  • an immortalized tumor cell line which, after treatment, for example with calcitriol, differentiates and merges into a cell line which is macrophage-like Has properties.
  • HL-60 cells HL-60-M cells
  • quartz quartz
  • FIG. 1 shows in diagram form the chemiluminescence of cells after contact with various mineral fibers over time.
  • FIG. 2 shows, as a bar graph, summarized from several experiments, the greatest peaks in chemiluminescence for the different materials from FIG. 1 and the corresponding integrals under the curves shown in FIG. 1.
  • Quartz This dust had characteristics that are described in Stöber and Arnold, 1960, Betr. Silicosis Research [Sonderbd. Fundamentals of Silicosis Research] 4: 73-85.
  • the quartz samples were kindly provided by Dr. E. Schiller, Heusenstamm provided as a sample.
  • Glass wool, code A This mineral fiber has the following proportions of dimensions: diameter (D) ⁇ 1 ⁇ m: 84%; Length (L) ⁇ 5 ⁇ m: 13.5%, 5-15 ⁇ m: 43.5%, 15-30 ⁇ m: 19%, 30-50 ⁇ m: 10.5%,> 50 ⁇ m: 13.5%.
  • This fiber can e.g. from Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Germany.
  • Stone wool, code G This mineral fiber has the following proportions: D ⁇ 1 ⁇ m: 8.3%; L ⁇ 5 ⁇ m: 14.3%, 5-15 ⁇ m: 51, 7%, 15-30 ⁇ m: 21, 6%, 30-50 ⁇ m: 8.6%,> 50 ⁇ m: 3.8%.
  • This fiber too can e.g. from Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Germany.
  • Crocidolite fiber This mineral fiber has the following proportions: D ⁇ 1 ⁇ m: 97.3%; L ⁇ 5 ⁇ m: 45.3%, 5-15 ⁇ m: 40.7%, 15-30 ⁇ m: 6.3%, 30-50 ⁇ m: 4%,> 50 ⁇ m: 3.7%.
  • This fiber too can e.g. from Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Germany.
  • Erionite fiber This mineral fiber has the following proportions: D ⁇ 1 ⁇ m: 89.2%, ⁇ 2 ⁇ m: 99%, ⁇ 3 ⁇ m: 100%; L ⁇ 5 ⁇ m: 63.7%, 5-15 ⁇ m: 30.4%,> 15 ⁇ m: 4.9%.
  • This fiber too can e.g. from Grünzweig + Hartma ⁇ n AG, Ludwigshafen, Germany.
  • Rock wool MMVF21 This fiber has an average diameter of 0.9 ⁇ m and an average length of 44 ⁇ m. A further characterization of the properties can be found in Bellmann et al., Environ. Health Perspect. 102 (Suppl. 5), 185-189 (1994). This fiber can e.g. from the German Rockwool Mineralwoll-GmbH, Gladbeck, Germany.
  • This fiber can also be obtained, for example, from Deutsche Rockwool Mineralwoll-GmbH, Gladbeck, Germany.
  • the human, promyelocytic cell line HL-60 was kept under 5% carbon dioxide in RPMI-1640 medium (cf. Zoller et al., Toxicology Letters 87, 131-138 (1996)).
  • the cells were usually passaged twice a week at a concentration of 250,000 cells / ml.
  • To differentiate the cells to HL-60-M they were cultured for 96 h at a density of 300,000 cells / ml in phenol red-free medium with the addition of 10E-7 M 1, 25-dihydroxyvitamin D3 (VD3).
  • VD3 was diluted in ethanol; the final concentration of ethanol was 1%.
  • the mineral fibers (dusts) (250 ⁇ g / ml) were suspended or mixed in physiological saline or Sörensen phosphate buffer. One sample was used immediately after its preparation, while at least one other sample was preincubated for 3-6 weeks, usually four weeks, before the samples were added to the preparations
  • the suspensions of fibers were each added to the same batches of HL-60-M cells and subjected to the measurement in a Berthold LB9505C luminometer (Berthold, Germany) immediately after mixing. 500,000 cells in 1 ml Dulbecco's medium without phenol red with luminol (Sigma) (20 ⁇ M) for 250 ⁇ g dust or mineral fiber were used. The measurement was carried out at 37 ° C., continued for at least 1 h and with new ones in each case Approaches repeated at least three times.
  • FIG. 1 shows typical results of the chemiluminescence measurements of the various mineral fibers used, in each case pre-incubated and not pre-incubated. After an initial "peak" of chemiluminescence of about 5-10 minutes, the chemiluminescence decreased over 30-60 minutes and finally subsided after this time. In all experiments, the cells stimulated with quartz showed the highest chemiluminescence values. As shown in FIG. 1a, the maximum value for quartz was 6.5x10 6 cpm (counts per minute). In contrast, the maximum value for Code A and G fibers was 2 ⁇ 10 6 cpm (FIG. 1a). The corresponding maximum value of these fibers after a four-week preincubation in physiological saline solution fell below 0.5 x10 6 cpm.
  • MMVF21 and HT-N fibers show an increased chemiluminescence after pre-incubation compared to non-pre-incubated fibers.
  • the differences were significantly less pronounced for erionite and crocidolite (Fig. 1c), with a tendency towards higher values for pre-incubated fibers.
  • Figure 2 summarizes the above results summarizing multiple reproductions in bar graphs.
  • 2a shows the respective maximum values of chemiluminescence
  • 2b shows the integrals over the time of chemiluminescence.
  • the fluctuation ranges for the bars correspond to the standard deviation (SD).
  • SD standard deviation
  • the bars marked with an asterisk differ significantly according to the Student's t test with p ⁇ 0.05 from the corresponding results obtained without preincubation.
  • chemiluminescence is correlated with the amount of photons formed by reactive oxygen intermediates, their determination enables a conclusion to be drawn about the risk of toxicity over a longer period of time. It is shown that the long-term toxicity of glass wool and rock wool is likely to be lower since the fibers lose their ability to induce oxygen radicals. Since the random examination of samples has shown that fiber morphology and number of fibers have not visibly changed within the incubation period, it must be assumed that conversions on the surface of the individual fibers, e.g. Gel layer formation or leaching are responsible for this decrease in chemiluminescence.
  • the increase in chemiluminescence indicates an even greater potential for inducing oxygen radicals over time, so that these fibers are to be regarded as more critical with regard to long-term exposure in the organism.
  • the method according to the invention provides a means of preventing the long-term exposure to substances (dusts, fibers, xenobiotics, other inhalants). ions, noxae) on organisms in vitro.
  • substances dusts, fibers, xenobiotics, other inhalants.
  • ions, noxae on organisms in vitro.
  • the process can be carried out easily and quickly and leads to meaningful results that can be transferred to the in vivo situation. It is inexpensive and saves time-consuming and ethically questionable animal experiments.
  • immortalized cell lines as shown in the example, no animals are required for the production of cells.
  • the process could be used by producers of chemical substances in order to be able to estimate various long-term effects in the development of new substances.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten bereit: A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volumen eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe; B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zu Bildung zumindest einer zweiten Probe; C) Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Hervorrufen von mit der biologischen Wirkung korrellierten, meßtechnisch erfassbaren Reaktionen der Zellen; D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen; E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwirkung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes. Das Verfahren ermöglicht die Abschätzung der Langzeitauswirkung von Stoffen auf Organismen durch In-vitro-Versuche.

Description

Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen von Stoffen und Kit zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von solchen biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von der Löslichkeit des Stoffes oder vom Herauslösen ("Auslaugen") bioaktiver Komponenten im Körper abhängen.
In den tierischen oder menschlichen Organismus eingebrachte Stoffe können in Wechselwirkung mit den Organismen treten und dadurch Reaktionen hervorrufen. Solche Reaktionen können oftmals eine Schädigung des Organismus bis hin zu seinem Tod verursachen. Wenn Stoffe für den Organismus schädlich sind, spricht man von ihrer Toxizität. Eine Toxizität kann z.B. auch in der Induzierung von Tumoren liegen, vor allem, wenn die Stoffe als "Depotgifte" fungieren.
Gerade bei neuartigen Stoffen, die in die Umgebung von Mensch und Tier eingeführt werden sollen, ist es wichtig, zu prüfen, ob diese Stoffe in den Organismus gelangen können, z.B. durch Aufnahme über die Haut, oral, oder inhalativ, und ob die Stoffe eine toxische Wirkung haben.
Neben einer sofort einsetzenden toxischen Wirkung von Stoffen, die sich leicht nachweisen läßt, können Stoffe auch eine langsamere Wirkung haben, deren Messung erheblich schwieriger ist. Es hat sich gezeigt, daß die Löslichkeit einiger Stoffe einen Einfluß auf die Langzeitwirkung haben kann, da eine Löslichkeit und damit verbundene kürzere Biopersistenz zu einer verringerten Einwirkung auf den Organismus und damit zu einer kleineren Reaktion führen.
So hat sich beispielsweise gezeigt, daß das krebserzeugende Potential inhalierbarer Fasern von ihrer Geometrie, d.h. dem Verhältnis von Faserlänge zu Durchmesser, und von ihren chemisch-physikalischen Eigenschaften abhängen, wobei die Biopersistenz in der Lunge maßgeblich von den chemisch-physikalischen Parametern abhängt. Je schneller nämlich eine inhalierte Faser in der Lunge durch Auflösung oder Abtransport eliminiert wird, umso geringer ist ihr langzeit- toxikologisches Risiko. Die Auflösung und der Abtransport hängen wiederum auch von der Löslichkeit der Faser ab. Es konnte hierbei gezeigt werden, daß die eigentliche Reaktion von Zellen, wie z.B. Phagozyten, auf die Exposition mit bestimmten Fasern in einer Erhöhung der Abgabe von Sauerstoffradikalverbindungen (reactive oxygen species, ROS) besteht. Diese Sauerstoffradikalverbindungen scheinen dann durch die von ihnen hervorgerufenen Zerstörungen an zellulären Strukturen die eigentlich Verantwortlichen für die Toxizität der Fasern zu sein. Eine schnellere Entfernung der fraglichen Stoffe aus dem Organismus verringert also das Risiko einer Radikal-bedingten Schädigung des Organismus.
Es kann daher von großer Wichtigkeit für die Bewertung der Langzeiteffekte eines Stoffes sein, seine Biopersistenz im Organismus festzustellen.
Im Stand der Technik sind bislang verschiedene Ansätze zu einer solchen Bestimmung vorgenommen worden.
Im Tierversuch wurde Tieren der zu untersuchende Stoff durch Inhalation, In- stillation oder Implantation verabreicht und nach einer Wartezeit das Tier getötet und auf Stoffrückstände, z.B. Faserrückstände, untersucht. Alternativ wurde gewartet, bis ein karzinogener Effekt auftrat, sofern ein solcher bei dem Stoff untersucht werden sollte. Tierversuche sind jedoch ethisch bedenklich, langwierig und zudem mit hohen Kosten verbunden.
Ein weiterer Ansatz besteht in der Durchspülung des zu untersuchenden Stoffes mit verschiedenen Salzlösungen und einer Quantifizierung der Stoffauflösung durch Analyse der Bestandteile in der Spülflüssigkeit. Alternativ wurde mit einer Dispersion statt einer Spülung gearbeitet. Die Analyse von Stoffbestandteilen in der Suspensions- bzw. Spülflüssigkeit erlaubt zwar einen indirekten Rückschluß auf die Lösung von Stoffbestandteilen, aber keine direkte Aussage über das reaktive Potential verbliebener, noch nicht gelöster Bestandteile.
Es besteht daher weiterhin ein Bedarf an einem Verfahren, durch eine zuverlässige und einfache Bestimmung der biologischen Wirkung eines Stoffes Hinweise auf seine Löslichkeit und ggf. Biopersistenz zu erhalten. Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein solches Verfahren bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 1. Weiterhin stellt die Erfindung ein Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem unabhängigen Patentanspruch 15 bereit. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen und Aspekte ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen, der Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten:
A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volumen eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe;
B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zur Bildung zumindest einer zweiten Probe;
C) Getrenntes Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Hervorrufen von mit der biologischen Wirkung korrelierten, meßtechnisch erfassbaren Reaktionen der Zellen;
D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen;
E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwirkung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes. Vorzugsweise ist die zu bestimmende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes, wobei die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruhen kann, eine Initiation einer Sauerstoffradikalfreisetzung aus den Zellen zu bewirken. Die zu untersuchenden Stoffe können beispielsweise (Mineral) fasern, Stäube, Xenobiotika und weitere (potentielle) Inhalationsnoxen sein.
Die verwendeten Zellen sind Zellen mit "respiratory-bursf'-Aktivität, wie z.B. Phago- zyten (Makrophagen, Monozyten, Granulozyten), Lungenzellen (Alveolare- pithelzellen) oder immortalisierte Zellinien dieser oder ähnlicher Zelltypen oder andere (Tumor)-zellinien mit "respiratory-bursf'-Aktivität von Mensch oder Tier. Es zeigt sich beispielsweise als hervorgerufene Reaktion eine Chemilumineszenz. Die zur Erzeugung eines ausreichend hohen Chemilumineszenzsignals der jeweiligen Zellzahl angepaßte Menge der zu untersuchenden Stoffe beträgt vorzugsweise 100-500 μg Staub pro 5 x 105 Zellen, vorzugsweise um 250 μg Staub. Versuchsansätze mit Zellzahlen im Bereich > 5 x 105 Zellen/ml bis < 5 x 106 Zellen/ml und Staubmengen im Bereich von 25 μg/ml bis 500 μg/ml haben sich bewährt.
Vorzugsweise wird die erste Probe so angesetzt, daß die erste vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium gerade suspendiert ist, d.h. mehr oder minder unmittelbar nach dem Mischen von Stoff und Medium, während die zweite und jede weitere vorbestimmte Zeit so bemessen sein kann, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium für eine längere Zeit gemischt wird, so daß zumindest ein Teil des Stoffes Veränderungen unterworfen sein kann. Typische Werte liegen hierbei im Bereich von Wochen bis Monaten, vorzugsweise 2-6 Wochen für eine Kurzzeitinkubation. Für eine Langzeitinkubation sind Zeiträume von mehr als 6 Wochen bis mehrere Monate anzusetzen.
Das Medium, das zum Lösen bzw. Mischen des Stoffes verwendet wird, kann vorzugsweise in seiner Fähigkeit zur Dispension von Stoffen bestimmten Körperflüssigkeiten entsprechen, beispielsweise solchen aus dem Bereich des Körpers, der für die jeweilige Fragestellung interessant ist. Vorzugsweise handelt es sich um H20, simulierte Lungenflüssigkeiten, (modifizierte) Gamble-Lösungen, physiologische Salz- oder Kochsalzlösungen (z.B. 0,9% NaCI-Lösung), Ringerlösung, Sörensen-Puffer, Veronal-Puffer oder andere Pufferlösungen, wie z.B. angegeben in Documenta Gligy Wissenschaftliche Tabellen (6. Aufl., S. 277) oder in Gibco Produktkatalog (1996-1997, S. 77-84 u. 88). Es ist zu berücksichtigen, daß die Puffer und Lösungen selbst das Ausmaß der Chemilumineszenz beeinflussen können.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß Proben des zu untersuchenden Stoffes, die unterschiedlich lange inkubiert wurden, um Unterschiede in ihrer biologischen Wirkung in Abhängigkeit von ihrer Löslichkeit festzustellen, zu Zellansätzen gegeben werden, woraufhin die Zellen eine Reaktion zeigen, die meßtechnisch erfassbar ist. Es ist daher vor konkreter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendig, eine meßtechnisch erfassbare Reaktion der Zellen zu bestimmen, die mit der zu untersuchenden Langzeitwirkung des untersuchten Stoffes korrelliert ist.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine bestimmte Menge des zu untersuchenden Stoffes, z.B. eine Mineralfaser, mit einem geeigneten Medium, z.B. einer Salzlösung gemischt, um eine Suspension oder Lösung zu bilden. Hierbei werden zumindest zwei verschiedene Proben hergestellt, von denen die eine für einen längeren Zeitraum, z.B. mehrere Wochen, inkubiert wird, um eine (Teillösung des Stoffes in dem Medium zu ermöglichen, während die andere Probe frisch hergestellt wird und unmittelbar nach der Suspension oder Durchmischung zur Bestimmung verwendet wird. Es ist auch möglich, mehrere Proben herzustellen, die unterschiedlich lange inkubiert werden, um von der Löslichkeit abhängige Effekte über die Zeit besser verfolgen zu können. Weiterhin ist es möglich, die erste Probe nicht unmittelbar nach ihrem Ansatz zu verwenden, sondern ebenfalls für eine vorbestimmte Zeit zu inkubieren.
Die verschiedenen, zumindest zwei Proben werden dann zu einer entsprechenden Zahl von Ansätzen geeigneter Zelle gegeben. Die Zellen können z.B. in einer Suspension in einem geeigneten Nährmedium vorliegen, so daß lediglich die beiden Flüssigkeiten miteinander vermischt werden müssen.
Unmittelbar nach Zugabe einer Probe des gemischten oder gelösten Stoffes zu dem Zellansatz wird die zu messende Eigenschaft gemessen, bei Verwendung von Mineralfasern beispielsweise die Chemilumineszenz. Dies kann beispielsweise mit einem handelsüblichen Luminometer geschehen. Der Unterschied in der Chemilumineszenz zwischen der kurz inkubierten, frischen Probe und der bzw. den vor- inkubierten Proben wird bestimmt, indem entweder die Höchstwerte an Chemilumineszenz (oder einer anderen Größe) der Proben, oder die Integrale der Chemilumineszenz über die Zeit dieser Proben bestimmt und miteinander verglichen werden. Das Verhältnis der so bestimmten Werte erlaubt eine Abschätzung der Langzeitwirkung bezüglich der Eigenschaft, die mit der hervorgerufenen Reaktion korrelliert ist. Es kommt dabei nicht auf die Absolutwerte der erreichten Chemilumineszenz an, sondern auf das Verhältnis der ermittelten Werte, um zu einer Abschätzung der (Langzeit) Toxizität zu kommen.
Eine besonders interessante Gruppe von Stoffen zur Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind die Mineralfasern, insbesondere auch die lungengängigen Mineralfasern. Im folgenden wird beispielhaft die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf solche Fasern beschrieben, wobei die zur Messung der Reaktion der Zellen verwendete Größe die von bestimmten, zu diesem Zweck geeigneten Zellen abgestrahlte Biolumineszenz ist.
Es versteht sich jedoch, daß auch andere Stoffgruppen von der Erfindung mit- umfasst sein sollen und andere Reaktionen der Zellen denkbar sind, solange diese meßtechnisch erfasst werden können.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren schnell auf ihr toxikologisches Langzeitrisiko überprüfbaren künstlichen Mineralfasern werden weltweit in großen Mengen zum Zwecke der Isolierung, Wärmedämmung etc. produziert und haben hier natürliche Mineralfasern, wie z.B. Asbest, weitestgehend ersetzt. Es zeigte sich, daß adverse gesundheitliche Effekt auch bei diesen künstlichen Fasern nicht ausgeschlossen werden können, welche möglicherweise von ihrer Größe, Respirierbarkeit, Lungengängigkeit und Biopersistenz im Lungengewebe abhängen. Bezüglich der Beseitigung der Fasern aus der Lunge werden verschiedene Mechanismen diskutiert, zu denen Aufbrechen der Fasern und Auflösen gehören. Somit stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein nützliches Mittel zur Verfügung, um über die Auswirkung von Fasermischungen bzw. Suspensionen wiederum einen Rückschluß auf die Eliminierbarkeit der Fasern aus dem Körper und damit indirekt auf deren Toxizität zu ermöglichen.
Zur Anwendung des Verfahrens war es allerdings notwendig, eine geeignete Reaktion von Zellen zu identifizieren, die eine solche Abschätzung ermöglichten.
Wie bereits oben dargestellt, kommt es bei bestimmten Zelltypen, z.B. bei Makro- phagen, nach Kontakt mit Fasern zu einer Sauerstoffradikalfreisetzung, deren direkte Messung jedoch schwierig ist. Diese Zellen zeigen jedoch bei Radikalfreisetzung das Phänomen der Chemilumineszenz, welches sich auf einfache Weise mittels geeigneter Meßgeräte quantitativ erfassen lässt. Mithin ist die Ausbildung einer Chemilumineszenz eine geeignete, meßtechnisch erfassbare Reaktion auf die Einwirkung durch die Mineralfasern. Die Chemilumineszenz-Bestimmung ermöglicht hier eine Einschätzung der Löslichkeit bzw. Biodurabilität der untersuchten Stoffe. Die Chemilumineszenz kann ggf. durch Stoffe, wie Luminol oder Lucige- nin, verstärkt werden.
Es sind jedoch auch andere Meßgrößen vorstellbar, die sich bei Einwirkung von Stoffen auf Zellen verändern, wie z.B. der pH. Auch solche Größen können zur Feststellung einer Reaktion auf einen bestimmten Stoff im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Für die vorliegende Anwendung hat es sich als praktisch erwiesen, eine immortalisierte Tumorzelllinie einzusetzen, die sich nach Behandlung, beispielsweise mit Calcitriol, differenziert und in eine Zellinie übergeht, die makrophagenähnliche Eigenschaften hat. Beispielsweise zeigte es sich, daß nach Exposition differenzierter Zellen vom Typ HL-60 (HL-60-M-Zellen) mit Quarz diese ein nahezu identisches Chemilumineszenzprofil zeigten wie Rinderalveolarmakrophagen. Durch Verwendung dieser immortallisierten Zellinie oder anderer, ähnlicher Zellinien ist eine einfache und schnell reproduzierbare, standardisierbare Methodik entwickelbar, die für die Gewinnung von Makrophagen keine Tiere benötigt.
Im folgenden wird die Erfindung im Detail erläutert, wobei auf die Figuren Bezug genommen wird, in denen folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 zeigt in Diagrammform die hervorgerufene Chemilumineszenz von Zellen nach Kontakt mit verschiedenen Mineralfasern im zeitlichen Verlauf.
Fig. 2 zeigt als Balkendiagramm zusammengefaßt aus mehreren Experimenten die jeweils größten Ausschläge ("Peaks") an Chemilumineszenz bei den verschiedenen Materialien aus Fig. 1 und die entsprechenden Integrale unter den in Fig. 1 dargestellten Kurven.
Die Erfindung wird weiter anhand des nachfolgenden Beispiels beschrieben.
Beispiel
Im folgenden soll die vorliegende Erfindung an einem Beispiel erläutert werden. Dieses ist auf die Bestimmung der Langzeittoxizität/Kanzerogenität von mineralischen Fasern gerichtet, wobei als zelluläre Reaktion die Chemilumineszenz bestimmt wird. Es versteht sich jedoch, daß dieses Beispiel nicht als limitierend zu verstehen ist und andere Stoffe, Langzeitwirkungen und meßtechnisch erfassbare Reaktionen ebenfalls von der Erfindung umfasst sind.
Mineralfasern
Es wurden beispielhaft folgende Stäube und Mineralfasern untersucht: Quarz: Dieser Staub wies Charakteristika auf, die in Stöber und Arnold, 1960, Betr. Silikose-Forschung [Sonderbd. Grundlagen Silikose-Forschung] 4: 73-85 beschrieben sind. Die Quarzproben wurden freundlicherweise von Dr. E. Schiller, Heusenstamm als Muster zur Verfügung gestellt.
Glaswolle, Code A: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: Durchmesser (D) < 1 μm: 84%; Länge (L) < 5 μm: 13,5 %, 5-15 μm: 43,5 %, 15-30 μm:19 %, 30-50 μm: 10,5 %, > 50 μm: 13,5 %. Diese Faser kann z.B. von der Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.
Steinwolle, Code G: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 μm: 8,3 %; L < 5 μm: 14,3 %, 5-15 μm: 51 ,7 %, 15-30 μm: 21 ,6 %, 30-50 μm: 8,6 %, > 50 μm: 3,8 %. Auch diese Faser kann z.B. von der Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.
Krokydolith-Faser: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 μm: 97,3%; L < 5 μm: 45,3 %, 5-15 μm: 40,7 %, 15-30 μm: 6,3 %, 30-50 μm: 4 %, > 50 μm: 3,7 %. Auch diese Faser kann z.B. von der Grünzweig + Hartmann AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.
Erionit-Faser: Diese Mineralfaser weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 1 μm: 89,2%, < 2 μm: 99 %, < 3 μm: 100 % ; L < 5 μm: 63,7 %, 5-15 μm: 30,4 %, > 15 μm: 4,9 %. Auch diese Faser kann z.B. von der Grünzweig + Hartmaπn AG, Ludwigshafen, Deutschland, bezogen werden.
Steinwolle MMVF21 : Diese Faser hat einen mittleren Durchmesser von 0,9 μm und eine mittlere Länge von 44 μm. Eine weitere Charakterisierung der Eigenschaften findet sich in Bellmann et al., Environ. Health Perspect. 102 (Suppl. 5), 185-189 (1994). Diese Faser kann z.B. von der Deutsche Rockwool Mineralwoll-GmbH, Gladbeck, Deutschland, bezogen werden.
HT-N: Diese Faser gehört zur HT-Gruppe, die eine höhere Löslichkeit bei pH = 4,5 aufweist. Sie weist folgende Dimensionsanteile auf: D < 5 μm: 40,73 %, 0,5-1 ,0 μm: 28,81 %, 1-1 ,5 μm: 16,56 %, 1 ,5-2 μm: 8,94 %, > 2 μm: 4,97 %; L < 5 μm: 12,25 %, 5-10 μm: 21 ,19 %, 10-15 μm: 16,56 %, 15-20 μm: 12,91 %, > 20 μm: 37,09 %. Auch diese Faser kann z.B. von der Deutsche Rockwool Mineralwoll-GmbH, Gladbeck, Deutschland, bezogen werden.
Herstellung der Zellansätze
Die humane, promyelozytäre Zellinie HL-60 wurde unter 5 % Kohlendioxid in RPMI-1640 Medium gehalten (vgl. Zoller et al., Toxicology Letters 87, 131-138 (1996)). Üblicherweise wurden die Zellen zweimal pro Woche mit einer Konzentration von 250000 Zellen/ml passagiert. Zur Differenzierung der Zellen zu HL-60-M wurden diese für 96 h in einer Dichte von 300.000 Zellen/ml in phenolrotfreiem Medium unter Zusatz von 10E-7 M 1 ,25-DihydroxyvitaminD3 (VD3) kultiviert. VD3 wurde hierbei in Ethanol verdünnt; die Endkonzentration an Ethanol betrug 1 %.
Herstellung der Proben
Die Mineralfaser(stäube) (250 μg/ml) wurden in physiologischer Kochsalzlösung oder Sörensen-Phosphatpuffer suspendiert bzw. gemischt. Eine Probe wurde unmittelbar nach ihrem Ansatz verwendet, während zumindest eine andere Probe für 3-6 Wochen, üblicherweise für vier Wochen, präinkubiert wurde, bevor die Proben zu den Ansätzen gegeben wurden
Durchführung der Messung
Die Suspensionen von Fasern wurden jeweils zu gleichen Ansätzen von HL-60-M Zellen gegeben und unmittelbar nach Durchmischung der Messung in einem Berthold LB9505C Luminometer (Fa. Berthold, Deutschland) unterworfen. Hierbei wurden 500000 Zellen in 1 ml Dulbecco's Medium ohne Phenolrot mit Luminol (Sigma) (20 μM) für 250 μg Staub oder Mineralfaser verwendet. Die Messung wurde bei 37°C durchgeführt, für mind. 1 h fortgesetzt und mit jeweils neuen Ansätzen mind. dreimal wiederholt.
Ergebnisse
Fig. 1 zeigt typische Ergebnisse der Chemilumineszenz-Messungen der verschiedenen eingesetzten Mineralfasern, jeweils vorinkubiert und nicht vorinkubiert. Nach einem Anfangs-"Peak" der Chemilumineszenz von etwa 5-10 Minuten erniedrigte sich diese über 30-60 Minuten, um schließlich nach dieser Zeit abzuklingen. In allen Versuchen zeigten die mit Quartz stimulierten Zellen die höchsten Chemilumineszenz-Werte. Wie in Fig. 1a gezeigt, ergab sich hier bei Quarz ein Höchstwert von 6,5x106 cpm (counts per minute). Demgegenüber betrug der Höchstwert bei Code A und G Fasern 2x106 cpm (Fig. 1a). Der entsprechende Höchstwert dieser Fasern nach einer vierwöchigen Vorinkubation in physiologischer Kochsalzlösung fiel unter 0,5 x106 cpm. Wie in Fig. 1 b dargestellt, zeigen demgegenüber MMVF21 und HT-N Fasern eine erhöhte Chemilumineszenz nach Vorinkubation gegenüber nicht vorinkubierten Fasern. Bei Erionit und Krokydolith (Fig. 1c) waren die Unterschiede deutlich weniger ausgeprägt, mit einer Tendenz zu höheren Werten bei vorinkubierten Fasern.
Fig. 2 faßt die obigen Ergebnisse unter Zusammenfassung mehrfacher Reproduktionen in Balkendiagrammen zusammen. Hierbei zeigt Fig. 2a die jeweiligen Höchstwerte der Chemilumineszenz; Fig. 2b zeigt die Integrale über die Zeit der Chemilumineszenz. Neben den Unterschieden zu Quarz als stärkstem Induktor sind auch hier die oben dargestellten Unterschiede zwischen den einzelnen Faser-Typen deutlich erkennbar. Die Schwankungsbreiten bei den Balken entsprechen der Standardabweichung (Standard deviation, SD). Die mit einem Stern gekennzeichneten Balken unterscheiden sich signifikant gemäß dem Student t-Test mit p < 0,05 von den entsprechenden Ergebnissen, die ohne Vorinkubation erhalten wurden.
Da die Löslichkeit von Mineralfasern vom pH der Lösung abhängt und die Lösung der Fasern im Zeitverlauf während der Präinkubation den pH beeinflussen könnte, wurden bei einigen der Fasern die pH-Werte der Proben nach der Präinkubation bestimmt. Es ergaben sich folgenden Werte nach 4 Wochen Inkubation in ungepuf- ferter Kochsalzlösung:
Glaswolle (Code A): Erhöhung von 7,2 auf 9,7 Steinwolle (Code G): Erhöhung von 7,2 auf 9,3 MMVF21 : Erniedrigung von 7,2 auf 5,5 HT-N: Erniedrigung von 7,2 auf 6,3
Um auszuschliessen, daß die Erniedrigung der Chemilumineszenz bei präinkubier- ten Glas- und Steinwollefasern auf die pH-Änderungen zurückzuführen ist, wurden entsprechende Proben in einem gepufferten System, nämlich in Sörensen Puffer mit pH 5,0 und 7,4, angesetzt. Es zeigte sich, daß die zuvor festgestellte Tendenz einer Absenkung der Chemilumineszenz nach Präinkubation auch in diesem gepufferten System vorhanden war.
Da die Chemilumineszenz mit der Menge der durch reaktive Sauerstoffzwischenstufen gebildeten Photonen korreliert ist, ermöglicht deren Bestimmung einen Rückschluß auf das Toxizitätsrisiko über einen längeren Zeitraum. Es zeigt sich, daß bei Glaswolle und Steinwolle die Langzeittoxizität geringer sein dürfte, da die Fasern ihre Fähigkeit zur Sauerstoffradikalinduktion verlieren. Da die stichprobenartige Untersuchung von Proben gezeigt hat, daß sich Fasermorphologie und Faserzahl innerhalb des Inkubationszeitraums nicht sichtbar geändert haben, muß vermutet werden, daß Umwandlungen an der Oberfläche der einzelnen Fasern, z.B. Gel-Schicht-Bildung oder Auslaugung für diese Abnahme der Chemilumineszenz verantwortlich sind. Bei den Fasern MMVF21 und HT-N deutet die Zunahme der Chemilumineszenz auf ein sich über die Zeit sogar noch erhöhendes Potential zur Sauerstoffradikalinduktion hin, so daß diese Fasern als kritischer bezüglich einer Langzeitexposition im Organismus anzusehen sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt erstmalig ein Mittel zur Verfügung, die Langzeit-Einwirkung von Stoffen (Stäuben, Fasern, Xenobiotika, andere Inhala- tionen, Noxen) auf Organismen in vitro zu untersuchen. Das Verfahren ist einfach und schnell durchführbar und führt zu aussagekräftigen Ergebnissen, die auf die in-vivo Situation zu übertragen sind. Es ist preisgünstig und spart aufwendige und ethisch bedenkliche Tierversuche ein. Bei Verwendung immortalisierter Zellinien, wie im Beispiel angegeben, werden keine Tiere für die Gewinnung von Zellen benötigt. Das Verfahren könnte von Produzenten chemischer Stoffe eingesetzt werden, um verschiedene Langzeitwirkungen bei der Entwicklung neuer Stoffe abschätzen zu können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von biologischen Langzeitwirkungen eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängen, mit folgenden Schritten:
A) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit einem Volumen eines Mediums für eine erste vorbestimmte Zeit zur Bildung einer ersten Probe,
B) Mischen einer vorbestimmten Menge des Stoffes mit zumindest einem zweiten Volumen des Mediums für zumindest eine zweite vorbestimmte Zeit zur Bildung zumindest einer zweiten Probe;
C) Getrenntes Zugeben der Proben zu Ansätzen geeigneter Zellen zum Hervorrufen von mit der biologischen Wirkung korrelierten, meßtechnisch erfassbaren Reaktionen der Zellen;
D) Messen der hervorgerufenen Reaktionen der Zellen;
E) Vergleichen der Reaktionen zur Abschätzung der biologischen Langzeitwirkung in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Stoffes.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruht, eine Initiation einer Sauerstoffradikalfreisetzung aus den Zellen zu bewirken.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff ein lungengängiger Staub ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff (Mineral)fasem, Stäube, Xenobiotika und weitere (potentielle) Inhalationsnoxen umfasst.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen von Zellen mit "respiratory bursf'-Aktivität entstammen.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor Verwendung bereits über "respiratory bursf'-Aktivität verfügen oder zur Erlangung dieser Eigenschaft ausdifferenziert werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Phagozyten sind oder einer immortalisierten Tumorzellinie entstammen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die hervorgerufene Reaktion eine Chemilumineszenz der Zellen ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Chemilumineszenz mit Luminol oder Lucigenin verstärkt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung der Chemilumineszenz mit einem Biolumineszenzanalysator oder mittels Elektronenspinresonanz-Spektrometrie erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die erste vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium gerade suspendiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zumindest zweite vorbestimmte Zeit so bemessen ist, daß der zu untersuchende Stoff in dem Volumen des Medium für eine längere Zeit gemischt wird, so daß zumindest ein Teil des Stoffes Veränderungen unterworfen sein kann.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium in seiner Fähigkeit zur Dispension des Stoffes einer Körperflüssigkeit entspricht.
15. Kit zur Bestimmung einer biologischen Langzeitwirkung eines Stoffes, die von seiner Löslichkeit abhängt, aufweisend Zellen, die bei Exposition mit dem Stoff eine meßtechnisch erfassbare Reaktion zeigen, welche mit der biologischen Langzeitwirkung des Stoffes korreliert ist, und ein Medium zum Suspendieren und/oder Lösen des Stoffes
16. Kit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die zu bestimmende biologische Langzeitwirkung die Toxizität des Stoffes ist.
17. Kit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Toxizität des Stoffes auf seinem Vermögen beruht, eine Initiation einer Sauerstoffradikalfreisetzung aus den Zellen zu bewirken.
18. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff ein lungengängiger Staub ist.
19. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Stoff (Mineral)fasern, Stäube, Xenobiotika und weitere (potentielle) Inhalationsnoxen umfasst.
20. Kit nach einem der Ansprüche 15 bsi 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen über "respiratory-bursf'-Aktivität verfügen, insbesondere einer immortalisierten Zellinie entstammen oder Phagozyten sind.
21. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen vor Verwendung ausdifferenziert sind.
22. Kit nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Makropha- gen sind.
23. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion eine Chemilumineszenz der Zellen ist.
24. Kit nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Kit weiterhin Luminol oder Lucigenin zur Verstärkung der Chemilumineszenz umfasst.
25. Kit nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium in seiner Fähigkeit zur Dispension des Stoffes einer Körperflüssigkeit nahekommt oder entspricht.
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