DE10049732C2 - Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, auf eine Vorrichtung zur Durchführung und auf Anwen­ dungen des Verfahrens.

Ein in den letzten Jahren aufgetretenes Problem mit zunehmender Bedeutung stellt die Belastung der Meere mit toxischen Algen dar, die in erster Linie den anderen Meeresbewohnern, aber auch den Menschen in höchstem Maße gefährlich werden können. Dabei können sich Algentoxine in der Nahrungskette anreichern (z. B. Muscheln) oder auch direkte toxische Auswirkungen zeigen. Insbesondere können die Algentoxine lysierend wirken, das heißt, sie lösen Zellstrukturen des von ihnen angegriffenen Organismus auf und führen zu dessen Zerstörung. Verschiedene Verfahren zum Testen der lytisch wirkenden Substanzen wurden entwickelt. Alle arbeiten mit dem gleichen Grundprinzip durch Lyse von Erythrozyten und anschließende photometrische Messung des freigesetzten Hämoglobins durch Bestrahlung mit Licht einer Wellenlänge von 540 nm (vergleiche beispielsweise Aufsatz I von B. Edvardsen et al. "Hemolytic activity in extracts of Chrysochromulina polylepsis grown at different levels of selenite and phosphate", Toxic Marine Phytoplancton, Elsevier Science Publishing 1990, pp. 284-289 oder Aufsatz II von G. Arzul et al. "A haemolytic test to assay toxins excreted by the marine dinoflagellate Gyrodinium cf. auroleum", Wat. Res. Vol. 28, No. 4, pp. 961-965, 1994). Die in der Literatur beschriebenen Testverfahren werden jedoch in einzelnen und größeren Reaktionsgefäßen durchgeführt und die photo­ metrische Messung erfolgt in einzelnen Küvetten. Ein entsprechend hoher Aufwand an einzusetzender Ausrüstung, zu testender Substanz und auch an Bearbeitungs- und Testzeit ist zur Erzielung aussagekräftiger Testergebnisse erforderlich. Weiterhin umfasst der Präparationsschritt bei den bekannten Verfahren in der Regel eine Extraktion der zu testenden Substanz in einem organischen Lösungsmittel (Methanol und Chloroform).

Aus dem Aufsatz III von V. R. Muzykantov et al. "Hemolytic Complement Activity Assay in Microtitration Plates" (Journal of Applied Biochemistry 7, 223-­ 227 (1985)) ist es bekannt, die Komplement-Aktivität durch Inkubation von Antikörper-beladenen Schafserythrozyten mit Serumkomplement des Meer­ schweinchens zu messen. Beim Nachweis einer Komplement-Bindungsreak­ tion wird ausgenutzt, dass die Komplementfaktoren (Proteine) eines Serums an Antikörper, die sich auf dem Antigen (z. B. Bakterien, Viren) befinden, binden und diese auflösen. Die nicht lysierten Schafserythrozyten werden dann in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte als Streuung bei 630 nm gemessen. Ein ähnliches Verfahren zur Bestimmung der Komplement-Aktivität von Patientenserum ist aus dem Aufsatz IV von H. P. Heinz et al. "Vereinfachter Mikroassay zur Bestimmung der gesamthämolytischen Komplement-Aktivität, CH-50" (Lab. Med. 9: 320-323 (1985)) bekannt. Hierbei wird die Streuung nicht lysierter Erythrozyten bei einer Wellenlänge von 690 nm in einer Mikrotiter­ platte gemessen. Auch in der DE 42 38 497 A1 wird ein Verfahren zum Nachweis einer Komplement-Bindungsreaktion beschrieben, bei dem die photometrische Erfassung der Hämolyse an 40 auf dem Durchmesser einer einzelnen Vertiefung in einer Mikrotiterplatte verteilten Messpunkten bei Wellenlängen zwischen 380 nm und 450 nm erfolgt. Gemessen werden hierbei sowohl die Zellen selbst als auch zellfreie Bereiche.

Bezüglich des Zentrifugierens von Mikrotiterplatten ist aus der DE 43 38 731 A1 eine Methode zur Bestimmung von Festphasen-Immun­ gssays bekannt. Hierbei wird eine Mikrotiterplatte mit einem Antigen beschich­ tet und dann eine Serum- oder Plasmaprobe eingetropft, sodass eine Antigen- Antikörper-Bindung erfolgt. Nach einigen Waschschritten werden dann mit Anti-Antikörpern beladene Erythrozyten eingetropft. Anschließend wird die Mikrotiterplatte zentrifugiert, um die Indikatorzellen in Kontakt mit den Antigen- Antikörper-Komplexen zu bringen. Nach weiteren Waschritten werden die immobilisierten Indikatorzellen dann gemessen. Weiterhin wird bei dem aus der DE 39 16 595 A1 bekannten Verfahren zur nicht-radioaktiven Messung der Nukleinsäuresynthese in eukaryontischen Zellen ein Nukleotid, das zuvor nicht-radioaktiv markiert oder mit einem Hapten derivatisiert worden ist, in eine Empfängerzelle über Liposomen eingeschleust. Die Syntheserate wird dann anhand des Einbaus des Nukleotids über dessen Markierung oder Derivatisie­ rung ermittelt. Für erforderliche Wasch- und Fixierungsschritte werden dabei die Suspensionszellen in einer Mikrotiterplatte abzentrifugiert. Die für die Messung benötigten Zellen werden auf diese Weise in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte zurückgehalten.

Durch die genannten Aspekte wird bei dem bekannten Testverfahren von lytisch wirkenden Substanzen gemäß der weiter oben genannten Aufsätze I und II nur eine begrenzte Leistungsfähigkeit erreicht. Ausgehend von dem prinzipiellen Testverfahren, das auf der Lyse einer einen Detektionsstoff enthaltenden Testsuspension durch die präparierte Testsubstanz und der an­ schließenden Detektion des freigegebenen Detektionsstoffes als Maß für die lytische Aktivität der Testsubstanz basiert, ist es daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein weiterentwickeltes Testverfahren anzugeben, das eine deutlich gesteigerte Leistungsfähigkeit aufweist, insbesondere hinsichtlich der Verfahrensökonomie und der Verfahrensempfindlichkeit. Dabei sollen die Verbesserungsschritte ebenso wie bevorzugte Mittel zur Verfahrens­ durchführung einfach und damit effektiv und kostengünstig sein.

Die Lösung für diese Aufgabe stellt das erfindungsgemäße Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung dar mit

• - einem Präparationsschritt, in dem eine Probe der zu testenden Substanz extrahiert wird,
• - einem Lysierungsschritt, in dem die aufbereitete Probe mit einer zellularen Testsuspension, deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
• - einem Zentrifugierungsschritt, in dem die lysierte Testsuspension in den Kegelvolumina separiert und anschließend in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina transferiert wird,
• - einem Detektionsschritt, in dem mit einer auf den verwendeten Detektions­ stoff ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension freigegebene Menge an Detektionsstoff in allen Schalenvolumina parallel erfasst wird und
• - einem Auswertungsschritt, in dem anhand der detektierten Detektionsstoff­ menge der zu testenden Substanz eine lytische Aktivität zugeordnet wird.

Durch die verbesserte Konzeption der Verfahrensschritte "Lysieren", "Zentrifu­ gieren" und "Detektieren" kann bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren eine bedeutende Leistungssteigerung erzielt werden. Durch die Übertragung des bekannten Verfahrensprinzips auf eine Vielzahl von Einzelvolumina wird die Bearbeitung sehr vieler Proben in einer Mehrfachbestimmung möglich. Eine Bewältigung großer Probenzahlen mit einem geringen bzw. überhaupt betreibbaren Aufwand wird so ermöglicht. Außerdem kann in erheblichem Maße Bearbeitungszeit eingespart werden, sodass die relevanten Messergebnisse auch innerhalb eines kurzen Zeitintervalls zur Verfügung stehen. Durch den Einsatz von sehr kleinen, parallel zu nutzenden Einzelvolumina wird darüber hinaus eine bedeutende Einsparung an Test- und Probenmaterial erzielt. Dadurch wird zum einen eine Kostensenkung für das Testverfahren erreicht, zum anderen können nunmehr auch Substanzen getestet werden, die nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen. Weiterhin werden auch zur Erstellung der Testsuspension erforderliche Grund­ substanzen, beispielsweise Blut von Spendertieren, in verminderter Form benötigt.

Im Gegensatz zu den aus den weiter oben zitierten Aufsätzen III und IV bekannten Verfahren, bei denen die Zielstellung in der Messung der Komplementaktivität liegt, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Zielstellung der Messung von durch Fremdsubstanz induzierter Lyse verfolgt. Das dafür verwendete, völlig andere Messprinzip besteht in der Messung der Absorption des abzentrifugierten, zellfreien Überstandes in den schalenförmi­ gen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte bei einer geeigneten Wellenlänge. Weiterhin wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Gegensatz zu dem bereits oben erwähnten, aus der DE 42 38 497 bekannten Verfahren, bei dem zur photometrischen Erfassung der Hämolyse vierzig verschiedene Mess­ punkte in einer einzelnen Vertiefung der Mikrotiterplatte angefahren werden, nicht die Vertiefungen punktweise abgetastet, sondern mit einem Lichtstrahl mit einer bezüglich des Absorptionsmaximums festgelegten Wellenlänge zur Messung der Absorption in der homogenen Lösung ohne zelluläre Bestandteile bestrahlt. Es ergibt sich somit ein Messwert pro Vertiefung. Weiterhin dient der Zentrifugierungsschritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dem effektiven Abtrennen von zellulären Bestandteilen (hier Erythrozyten), die für die Mes­ sung selbst nicht benötigt werden und das Messergebnis sogar stören. Von Interesse ist nur der durch die Lyse freigesetzte Zellinhalt, der als Bestandteil einer homogenen Lösung photometrisch gemessen wird. Bei den aus der DE 43 38 731 A1 und der DE 39 16 595 A1 bekannten Verfahren werden dagegen die Zellen selbst gemessen, nachdem sie zuvor durch per Zentrifugie­ rungsschritt indirekt oder direkt immobilisiert wurden. Somit hat der Zentrifugierungsschritt dort eine grundsätzlich andere Funktion als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Bei einer Weiterführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer Extraktion der zu testenden Substanz ohne Verwendung eines organischen Lösungsmittels können zusätzlich Bearbeitungszeit und -material durch die starke Vereinfachung eingespart werden. Insbesondere kann ein einfaches Aufschließen durch eine Ultraschallbehandlung (Sonizieren) erfolgen. Dadurch kann der Umgang mit den zu den gesundheits- und umweltschädlichen Chemikalien zählenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden. Bei dem bekannten Verfahren werden die Proben durch eine Extraktion in Methanol und Chloroform aufbereitet. Beide Chemikalien weisen eine große Anzahl gesundheitsschädlicher Eigenschaften auf. Derartige zusätzliche Bearbeitungsschritte können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen. Zu testende Zellen/Organismen, insbesondere unizelluläre Algen, können beispielsweise in pelletierter Form sofort und direkt verwendet oder in der Regel auch über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Für den Testansatz werden die Pellets lediglich in einen Testpuffer aufgenommen, sodass eine definierte Zellzahl pro Volumeneinheit vorliegt, und beispielsweise durch eine Ultraschallbehandlung (Sonizieren) anstelle einer Lösung in Lösungsmitteln aufgeschlossen. Trotz der Möglichkeit eines vereinfachten Präparations­ schrittes können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Proben, die auf unterschiedliche Arten - auch unter Beteiligung von organischen Lösungsmitteln - gewonnen wurden, bearbeitet werden. Ein Abgleich zwischen unterschiedlichen Proben erfolgt dann durch entsprechende Kontrollen.

Analog zu dem bekannten Verfahren gibt es eine Fortführung des erfindungs­ gemäßen Verfahrens zum Testen hämolytischer Substanzen mit einer Erythro­ zyten-Suspension als Testsuspension und einer photometrischen Detektion von lytisch freigesetztem Hämoglobin als Detektionsstoff durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 414 nm ("Erythrozytenlysistest" ELA). Als weiterer relevanter Unterschied zu dem bekannten Verfahren - neben der Parallelisierung des Verfahrens - ist hier jedoch die Verwendung einer anderen Wellenlänge zu nennen. Die Verwendung von 540 nm bei den bekannten Tests ist bislang eine etablierte Größe, die nicht weiter hinterfragt oder abgewandelt wird. Für die Mess- und Gerätefachleute ist eine Einstellung der verwendeten Wellenlänge auf den Wert von 540 nm selbstverständlich. Eine Analyse des Absorptionsspektrums von Blut ergibt jedoch ein bedeutend größeres Absorptionsmaximum bei der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Wellenlänge von 414 nm. Zur Fehlerkompensation wird als Referenzwellenlänge parallel die Absorption bei 620 nm gemessen. Hämo­ globin absorbiert bei dieser Wellenlänge nicht, es werden aber Unregel­ mäßigkeiten der verwendeten Mikrotiterplatten erfasst und subtrahiert, die ansonsten zu Verfälschungen in den Messergebnissen führen können. Durch die Messung der Hämolyse bei einer Wellenlänge von 414 nm wird das Testverfahren ca. um Faktor 10 empfindlicher. Dadurch kann beispielsweise die Produktion ichthyotoxischer Substanzen einer Alge im Verlauf ihres Zellzyklus' (Ruhephase - Synthese - Ruhephase - Zellteilung - Ruhe­ phase. . .) getestet werden. Mit dem bekannten Verfahren mit seiner geringen Sensitivität bei der bislang eingesetzten Wellenlänge von 540 nm können diese zeitlichen Produktionsunterschiede nicht detektiert werden. Im Zusammenhang mit den kürzeren Lichtwegen durch die Testsuspension in einer Mikrotiterplatte (ca. 3-5 mm bei einem 200 µl Volumen gegenüber einer Küvette mit ungefähr 1 cm Durchlauflänge) ergeben sich bei einer gegebenen Wellenlänge entsprechend geringere Absorptionswerte. Bei einer Verwendung von 414 nm als Wellenlänge wird diese Verringerung aber aufgrund der hier maximal auftretenden Absorption kompensiert. Bei einer Wellenlänge von 540 nm sind die Werte wesentlich schlechter reproduzierbar.

Bei einer anderen Verfahrensfortführung kann auch ein Verfahren zum Testen potenziell zytolytischer Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als Testsuspension und einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem Fluoreszenzfarbstoff als Detektionsstoff durch Messung der Fluoreszenz­ emission vorgesehen sein. Hierbei handelt es sich um eine weitere Optimierung des erfindungsgemäßen Verfahrens, durch die es noch sensitiver und vielseitiger wird. Es werden die Erythrozyten durch Liposomen (künstliche Membranvesikel) ersetzt, sodass hier von einem "Liposomlysistest" (LLA) gesprochen werden kann. Auf diese Weise können Tierversuche eingespart werden. Eine Gewinnung von tierischem oder sogar menschlichem Blut ist nicht mehr erforderlich. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die Zusam­ mensetzung der Membran so zu konzipieren, dass die Lyse besonders schnell eintritt. Weiterhin lassen sich Liposomen entweder mit Fluoreszenzfarbstoffen füllen, sodass man bei Lyse eine Zunahme der Fluoreszenzemission photo­ metrisch messen kann, oder es werden die Membranen der Liposomen mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert, sodass bei Lyse eine Abnahme der Fluoreszenzemission zu detektieren ist. Gegenüber den Absorptionsmessun­ gen von Hämoglobin sind die Fluoreszenzmessungen sehr viel sensitiver.

Die Einzelvolumina können in unterschiedlicher Form passend ausgestaltet sein. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um eine größere Anzahl von Reagenzröhrchen - mit spitzem und flachem Boden - handeln, die in einem Ständer nebeneinander angeordnet sind und eine gute Einsatzmöglichkeit für Pipettierroboter bieten. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah­ rens kann jedoch vorteilhaft eine bevorzugte Anordnung mit einer Mikrotiter­ platte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina und einer Mikrotiterplatte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Schalenvolumina, die jeweils über eine Mehrkanalpipette mit der zu testenden Substanz beladen werden, vorgesehen sein.

Mikrotiterplatten sind beispielsweise aus dem weiter oben zitierten Stand der Technik bekannt und werden an vielen Stellen in humanbiologischen Laboratorien bereits eingesetzt. Auf dem Gebiet der marinen Toxikologie sind sie jedoch nicht verbreitet, da hier in der Regel Einzeluntersuchungen vorgenommen werden, die nicht automatisiert sind. Bestätigungen von Einzelergebnissen werden hier in der Regel durch einfache Wiederholung von Einzelmessungen erzielt. Der Einsatz von Mikrotiterplatten bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren erlaubt jedoch eine hohe Probendurchsatz­ rate und gewährleistet die oben genannten Vorteile. Beispielsweise können bei einer 96well-Mikrotiterplatte, die eine Matrizenanordnung von 8 parallelen Volumina in 12 Spalten aufweist, 32 Proben in einer 3fach-Bestimmung getestet werden. Eine weitere Miniaturisierung der Einzelvolumina zu Erreichung größerer Matrizen ist möglich. Mikrotiterplatten sind einfach herstellbare und preiswerte Massenteile, deren Vorteil in der unterschiedlichen Formgebung der Einzelvolumina liegt. Mikrotiterplatten mit konischen Vertie­ fungen eignen sich besonders für den Zentrifugierungsschritt des erfindungs­ gemäßen Verfahrens. Während des Zentrifugierens setzen sich unzerstörte Zellen und Zellreste in der kegeligen Spitze ab, sodass die lysierte Testsuspension ohne störende Rückstände im oberen Teil der Kegelvolumina einfach abgezogen werden kann. Dabei ist - genau wie beim Befüllen der Einzelvolumina - eine Mehrfachpipette sehr hilfreich, mit der beispielsweise jeweils eine ganze Spalte von Vertiefungen gleichzeitig bearbeitet werden kann. Bei dem photometrischen Detektionsschritt ist dann eine Überführung in flache Vertiefungen sinnvoll, da so eine einfache und homogene Durch­ strahlung gewährleistet ist. Beide Vertiefungsformen können auf Mikrotiter­ platten gleicher Anzahl von Einzelvolumina realisiert sein, sodass jeder Vertiefung auf der einen Platte eine Vertiefung auf der anderen Platte entspricht.

Weiterhin kann durch den Einsatz von Mikrotiterplatten das Testverfahren auch problemlos automatisiert und damit kommerzialisiert werden, sodass es den Laborrahmen mit seinen relativ umständlichen und aufwändigen Einzel­ messungen verlassen kann und eine bedeutend breitere Anwendungspalette findet, auch bei dem ungeschulten Anwender. Unabhängig von dem Einsatz von Mikrotiterplatten kann eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung als Frühwarnsystem für das Auftreten ichthyotoxischer Algen vorgesehen sein. Beispielsweise töten ichthyotoxische Algen Fische, indem sie ihr empfindliches Kiemenepithel lysieren. Die Fische verbluten dadurch. Das erfindungsgemäße Testverfahren in der Ausführung als ELA oder LLA) auf Mikrotiterplatten ermöglicht ein äußerst schnelles und sensitives Testen von Umweltproben auf gefährliche Algenspezies und andere toxische Substanzen. Daraus ergibt sich die vorteilhafte Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens als Frühwarnsystem.

Eine andere bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Ausführung als ELA oder LLA kann in einer Anwendung als Screening­ system für potenziell zytolytische Substanzen bestehen. Ein Bedürfnis für eine solche Anwendung kann einerseits die Suche nach eben solchermaßen wirkenden Substanzen sein. Hierbei kann es sich beispielsweise um bestimmte künstliche Design-Antibiotika, aber auch um natürliche Antibiotika handeln. Beispielsweise hat Mycosubtilin eine hohe Affinität zu Cholesterin. Bei der Lyse von Erythrozyten tritt bei Anwesenheit dieses Stoffes dann eine dotier- und auswertbare Lysehemmung durch freies oder liposomgebundenes Cholesterin auf (vgl. Aufsatz V: F. Besson et al. "Action of microsubtilin on erythrocytes and artificial membranes", Microbios. 59 (1989) pp 137-143). Andererseits kann aber auch der Umstand gegeben sein, dass man bestimmte medizinisch- pharmazeutische Produkte oder Lebensmittel auf Kontaminationen hin untersuchen möchte, beispielsweise auf hämolytische Bakterien (vgl. beispielsweise Aufsatz VI: H. C. Wong et al. "Incidence of highly genetically diversified Vibrio paraphaemolyticus in seafood imported from Asian countries", Int. J. Food Micobiol. 52 (3) 1999, pp 181-188.

Eine Ausbildungsform der Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der Figur dargestellten schematischen und um einige relevante Vorrichtungs­ gegenstände erweiterten Ablaufdiagrammes näher erläutert. Bei dem gewähl­ ten Ausführungsbeispiel handelt es sich um die Bestimmung von Algentoxinen mit dem ELA (Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest).

In einem Präparationsschritt ELA I werden für die Bestimmung der Algentoxine die Algenproben AP zunächst durch Zentrifugieren pelletiert. Die entstandenen Pellets PE können entweder bei -20°C gelagert oder direkt verwendet werden. Für den Test werden die Pellets PE in einem Testpuffer TP aufgelöst und aufgenommen, sodass eine pro Volumeneinheit definierte Zellzahl vorliegt, und durch eine Ultraschallbehandlung US aufgeschlossen. Für die Extraktion der Toxine sind also im gewählten Ausführungsbeispiel keine organischen Lösungsmittel erforderlich.

An dieser Stelle sei auch etwas zu der Erythrozytengewinnung, -aufbereitung und -lagerung angemerkt. Das Blut wird einem geeigneten Spender entnom­ men. Hierbei kann es sich um Fische, Säuger, aber auch um Menschen handeln, da nur sehr geringe Blutmengen benötigt werden (z. B. ca. 100 µl Karpfen-Vollblut für eine Mikrotiterplatte; bei Säuger-Erythrozyten benötigt man aufgrund ihrer geringeren Größe ca. die dreifache Menge). Das entnommene Blut wird zunächst mit einem geeigneten Nährmedium und Heparin gewaschen und kann in diesem Nährmedium in Zellkulturflaschen bis zu 3 Monaten im Kühlschrank gelagert werden. Für den Einsatz im ELA werden die Erythrozyten mit einem Testpuffer, der identisch ist mit dem Testpuffer TP für die Algenaufbereitung, gewaschen und eine geeignete Zellzahl eingestellt.

In einem Lysierungsschritt ELA II werden Mikrotiterplatten MPC, im gewählten Ausführungsbeispiel handelt es sich 96-well-Platten (12 Spalten × 8 Reihen) mit kleinen Kegelvolumina CV (in der Figur nur schematisch angedeutet), mithilfe einer achtkanaligen Mehrkanalpipette MP mit einer Erythrozyten-Suspension Es als Testsuspension TL befüllt. Anschließend wird die Testsubstanz TS, im gewählten Ausführungsbeispiel Algenextrakte AP, zugegeben und bei einer geeigneten Temperatur IT inkubiert. fn der Literatur werden als Inkubationstemperaturen IT 30°C und 37°C angegeben, 15°C sind jedoch auch möglich und energiesparend. Auch eine Inkubationstemperatur IT von 4°C ist möglich, wenn die Reaktionen langsamer ablaufen sollen. Über die Inkubationstemperatur IT ist also die Sensitivität des erfindungsgemäßen Testverfahrens ELA steuerbar. Während der Inkubationszeit werden die Erythrozyten in der Erythrozyten-Suspension Es von den toxischen Algen in der Testsubstanz TS entsprechend ihrer Toxizität angegriffen und lysiert. Dabei wird Hämoglobin als enthaltener Detektionsstoff DS freigegeben.

In einem Zentrifugierungsschritt ELA III wird die Mikrotiterplatte MPC in einer Zentrifuge ZE mit einem speziellen Rotor für Mikrotiterplatten zentrifugiert, wobei sich noch nicht lysierte Zellen und Zelltrümmer in den kegelförmigen Spitzen der einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte MPC sammeln. Die flüssigen Überstände der von der Algenprobe AP lysierten Testsuspension TL werden mit der Mehrkanalpipette MP in eine andere Mikrotiterplatte MPS mit Schalenvolumina SV, das heißt mit flachem Boden, transferiert.

Anschließend werden in einem Detektionsschritt ELA IV die lysierten Überstände in den Mikrotiterplatten MPS mit flachem Boden in einem Plate- Reader-Photometer PRP photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 414 nm auf ihr Absorptionsvermögen hin detektiert (Referenzwellenlänge λ = 620 nm). Dabei werden alle Vertiefungen in der Mikrotiterplatte MPS zeitsparend gleichzeitig detektiert. Bei Photometern mit einer geringeren Detektions­ parallelität kann auch jeweils eine größere Teilmenge der Vertiefungen detektiert werden. Der Detektionsprozess kann automatisch ablaufen.

In einem abschließenden Kalkulationsschritt ELA V werden für eine Kalkulation der lytischen Aktivität LA der zu untersuchenden Testsubstanz TS üblicherweise die LC50-Werte als Konzentration, bei der 50% der Erythrozyten in der Erythrozyten-Suspension ES lysiert werden, bestimmt. Die Verwendung eines externen Standards, beispielsweise "Saponin" oder eine andere hämo­ lytische Substanz, erlaubt eine Berechnung von Äquivalentdosen, die einen Vergleich von Daten verschiedener Tests ermöglichen.

Zur Erleichterung der Verfahrensdurchführung und für eine weitere Verbesserung der Verfahrensökonomie können "ELA-Kits" vorbereitet werden, die beispielsweise folgende Komponenten enthalten können (Analoges gilt für "LLA-Kits"):

• - Mikrotiterplatten mit konischen und flachen Vertiefungen
• - bereits mit Testsuspension beschickte Mikrotiterplatten mit konischen Vertiefungen
• - externe Standardsubstanzen (z. B.: Saponin)
• - ELA-Puffer
• - Protokollvorschläge für Probenpräparation o. ä.

Bezugszeichenliste

I Präparationsschritt
II Lysierungsschritt
III Zentrifugierungsschritt
IV Detektionsschritt
V Kalkulationsschritt
AP Algenprobe
CV Kegelvolumen
DS Detektionsstoff
ELA Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest
ES Erythrozyten-Suspension
IT Inkubationstemperatur
LA lytische Aktivität
LLA Liposomlysistest
MP Mehrkanalpipette
MPC Mikrotiterplatte mit konischen Vertiefungen
MPS Mikrotiterplatte mit flachen Vertiefungen
PE Pellets
PRP Plate-Reader-Photometer
SV Schalenvolumen
TL Testsuspension
TP Testpuffer
TS Testsubstanz
US Ultraschallbehandlung
ZE Zentrifuge
λ Wellenlänge

Claims (7)

1. Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung mit
einem Präparationsschritt (ELA I), in dem eine Probe (AP) der zu testenden Substanz (TS) extrahiert wird,
einem Lysierungsschritt (ELA II), in dem die aufbereitete Probe (AP) mit einer zellularen Testsuspension (TL), deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff (DS) aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina (CV) parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
einem Zentrifugierungsschritt (ELA III), in dem die lysierte Testsuspension (TL) in den Kegelvolumina (CV) separiert und in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina (SV) transferiert wird,
einem Detektionsschritt (ELA IV), in dem mit einer auf den verwendeten Detektionsstoff (DS) ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension (TL) freigegebene Menge an Detektions­ stoff (DS) in allen Schalenvolumina (SV) parallel erfasst wird und
einem Auswertungsschritt (ELA V), in dem anhand der detektierten Detektionsstoffmenge der zu testenden Substanz (TS) eine lytische Aktivität (LA) zugeordnet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1 mit einem vereinfachten Präparationsschritt (ELA I) mit einer Extraktion der zu testenden Substanz (TS) ohne Verwendung organischer Lösungsmittel, insbesondere durch Sonizieren.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen hämolytischer Substanzen mit einer Erythrozyten-Suspension (Es) als Testsuspension (TL) und einer photometrischen Detektion von lytisch freigesetztem Hämoglobin als Detektionsstoff (DS) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 414 nm.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen potenziell zytolytischer Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als Testsuspension (TL) und einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem Fluoreszenz­ farbstoff als Detektionsstoff (DS) durch Messung der Fluoreszenzemission.

5. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Zentrifuge (ZE) und einem Photometer (PRP) sowie mit einer Mikrotiterplatte (MPC) als Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina (CV) und einer Mikrotiterplatte (MPS) als Matrixanordnung einer Vielzahl von Schalenvolumina (SV), die jeweils über eine Mehrkanalpipette (MP) mit der zu testenden Substanz (TS) beladen werden.

6. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Frühwarn­ system für das Auftreten ichthyotoxischer Algen.

7. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Screening­ system für potenziell zytolytische Substanzen.