DE10049732C2 - Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des VerfahrensInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Testen von Substanzen mit
lytischer Wirkung, auf eine Vorrichtung zur Durchführung und auf Anwen
dungen des Verfahrens.
Ein in den letzten Jahren aufgetretenes Problem mit zunehmender Bedeutung
stellt die Belastung der Meere mit toxischen Algen dar, die in erster Linie den
anderen Meeresbewohnern, aber auch den Menschen in höchstem Maße
gefährlich werden können. Dabei können sich Algentoxine in der
Nahrungskette anreichern (z. B. Muscheln) oder auch direkte toxische
Auswirkungen zeigen. Insbesondere können die Algentoxine lysierend wirken,
das heißt, sie lösen Zellstrukturen des von ihnen angegriffenen Organismus
auf und führen zu dessen Zerstörung. Verschiedene Verfahren zum Testen der
lytisch wirkenden Substanzen wurden entwickelt. Alle arbeiten mit dem
gleichen Grundprinzip durch Lyse von Erythrozyten und anschließende
photometrische Messung des freigesetzten Hämoglobins durch Bestrahlung
mit Licht einer Wellenlänge von 540 nm (vergleiche beispielsweise Aufsatz I
von B. Edvardsen et al. "Hemolytic activity in extracts of Chrysochromulina
polylepsis grown at different levels of selenite and phosphate", Toxic Marine
Phytoplancton, Elsevier Science Publishing 1990, pp. 284-289 oder Aufsatz II
von G. Arzul et al. "A haemolytic test to assay toxins excreted by the marine
dinoflagellate Gyrodinium cf. auroleum", Wat. Res. Vol. 28, No. 4, pp. 961-965,
1994). Die in der Literatur beschriebenen Testverfahren werden jedoch in
einzelnen und größeren Reaktionsgefäßen durchgeführt und die photo
metrische Messung erfolgt in einzelnen Küvetten. Ein entsprechend hoher
Aufwand an einzusetzender Ausrüstung, zu testender Substanz und auch an
Bearbeitungs- und Testzeit ist zur Erzielung aussagekräftiger Testergebnisse
erforderlich. Weiterhin umfasst der Präparationsschritt bei den bekannten
Verfahren in der Regel eine Extraktion der zu testenden Substanz in einem
organischen Lösungsmittel (Methanol und Chloroform).
Aus dem Aufsatz III von V. R. Muzykantov et al. "Hemolytic Complement
Activity Assay in Microtitration Plates" (Journal of Applied Biochemistry 7, 223-
227 (1985)) ist es bekannt, die Komplement-Aktivität durch Inkubation von
Antikörper-beladenen Schafserythrozyten mit Serumkomplement des Meer
schweinchens zu messen. Beim Nachweis einer Komplement-Bindungsreak
tion wird ausgenutzt, dass die Komplementfaktoren (Proteine) eines Serums
an Antikörper, die sich auf dem Antigen (z. B. Bakterien, Viren) befinden,
binden und diese auflösen. Die nicht lysierten Schafserythrozyten werden dann
in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte als Streuung bei 630 nm gemessen.
Ein ähnliches Verfahren zur Bestimmung der Komplement-Aktivität von
Patientenserum ist aus dem Aufsatz IV von H. P. Heinz et al. "Vereinfachter
Mikroassay zur Bestimmung der gesamthämolytischen Komplement-Aktivität,
CH-50" (Lab. Med. 9: 320-323 (1985)) bekannt. Hierbei wird die Streuung nicht
lysierter Erythrozyten bei einer Wellenlänge von 690 nm in einer Mikrotiter
platte gemessen. Auch in der DE 42 38 497 A1 wird ein Verfahren zum
Nachweis einer Komplement-Bindungsreaktion beschrieben, bei dem die
photometrische Erfassung der Hämolyse an 40 auf dem Durchmesser einer
einzelnen Vertiefung in einer Mikrotiterplatte verteilten Messpunkten bei
Wellenlängen zwischen 380 nm und 450 nm erfolgt. Gemessen werden hierbei
sowohl die Zellen selbst als auch zellfreie Bereiche.
Bezüglich des Zentrifugierens von Mikrotiterplatten ist aus der
DE 43 38 731 A1 eine Methode zur Bestimmung von Festphasen-Immun
gssays bekannt. Hierbei wird eine Mikrotiterplatte mit einem Antigen beschich
tet und dann eine Serum- oder Plasmaprobe eingetropft, sodass eine Antigen-
Antikörper-Bindung erfolgt. Nach einigen Waschschritten werden dann mit
Anti-Antikörpern beladene Erythrozyten eingetropft. Anschließend wird die
Mikrotiterplatte zentrifugiert, um die Indikatorzellen in Kontakt mit den Antigen-
Antikörper-Komplexen zu bringen. Nach weiteren Waschritten werden die
immobilisierten Indikatorzellen dann gemessen. Weiterhin wird bei dem aus
der DE 39 16 595 A1 bekannten Verfahren zur nicht-radioaktiven Messung der
Nukleinsäuresynthese in eukaryontischen Zellen ein Nukleotid, das zuvor
nicht-radioaktiv markiert oder mit einem Hapten derivatisiert worden ist, in eine
Empfängerzelle über Liposomen eingeschleust. Die Syntheserate wird dann
anhand des Einbaus des Nukleotids über dessen Markierung oder Derivatisie
rung ermittelt. Für erforderliche Wasch- und Fixierungsschritte werden dabei
die Suspensionszellen in einer Mikrotiterplatte abzentrifugiert. Die für die
Messung benötigten Zellen werden auf diese Weise in den Vertiefungen der
Mikrotiterplatte zurückgehalten.
Durch die genannten Aspekte wird bei dem bekannten Testverfahren von
lytisch wirkenden Substanzen gemäß der weiter oben genannten Aufsätze I
und II nur eine begrenzte Leistungsfähigkeit erreicht. Ausgehend von dem
prinzipiellen Testverfahren, das auf der Lyse einer einen Detektionsstoff
enthaltenden Testsuspension durch die präparierte Testsubstanz und der an
schließenden Detektion des freigegebenen Detektionsstoffes als Maß für die
lytische Aktivität der Testsubstanz basiert, ist es daher die Aufgabe der
vorliegenden Erfindung, ein weiterentwickeltes Testverfahren anzugeben, das
eine deutlich gesteigerte Leistungsfähigkeit aufweist, insbesondere hinsichtlich
der Verfahrensökonomie und der Verfahrensempfindlichkeit. Dabei sollen die
Verbesserungsschritte ebenso wie bevorzugte Mittel zur Verfahrens
durchführung einfach und damit effektiv und kostengünstig sein.
Die Lösung für diese Aufgabe stellt das erfindungsgemäße Verfahren zum
Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung dar mit
- - einem Präparationsschritt, in dem eine Probe der zu testenden Substanz extrahiert wird,
- - einem Lysierungsschritt, in dem die aufbereitete Probe mit einer zellularen Testsuspension, deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
- - einem Zentrifugierungsschritt, in dem die lysierte Testsuspension in den Kegelvolumina separiert und anschließend in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina transferiert wird,
- - einem Detektionsschritt, in dem mit einer auf den verwendeten Detektions stoff ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension freigegebene Menge an Detektionsstoff in allen Schalenvolumina parallel erfasst wird und
- - einem Auswertungsschritt, in dem anhand der detektierten Detektionsstoff menge der zu testenden Substanz eine lytische Aktivität zugeordnet wird.
Durch die verbesserte Konzeption der Verfahrensschritte "Lysieren", "Zentrifu
gieren" und "Detektieren" kann bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren
eine bedeutende Leistungssteigerung erzielt werden. Durch die Übertragung
des bekannten Verfahrensprinzips auf eine Vielzahl von Einzelvolumina wird
die Bearbeitung sehr vieler Proben in einer Mehrfachbestimmung möglich.
Eine Bewältigung großer Probenzahlen mit einem geringen bzw. überhaupt
betreibbaren Aufwand wird so ermöglicht. Außerdem kann in erheblichem
Maße Bearbeitungszeit eingespart werden, sodass die relevanten
Messergebnisse auch innerhalb eines kurzen Zeitintervalls zur Verfügung
stehen. Durch den Einsatz von sehr kleinen, parallel zu nutzenden
Einzelvolumina wird darüber hinaus eine bedeutende Einsparung an Test- und
Probenmaterial erzielt. Dadurch wird zum einen eine Kostensenkung für das
Testverfahren erreicht, zum anderen können nunmehr auch Substanzen
getestet werden, die nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen. Weiterhin
werden auch zur Erstellung der Testsuspension erforderliche Grund
substanzen, beispielsweise Blut von Spendertieren, in verminderter Form
benötigt.
Im Gegensatz zu den aus den weiter oben zitierten Aufsätzen III und IV
bekannten Verfahren, bei denen die Zielstellung in der Messung der
Komplementaktivität liegt, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die
Zielstellung der Messung von durch Fremdsubstanz induzierter Lyse verfolgt.
Das dafür verwendete, völlig andere Messprinzip besteht in der Messung der
Absorption des abzentrifugierten, zellfreien Überstandes in den schalenförmi
gen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte bei einer geeigneten Wellenlänge.
Weiterhin wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im Gegensatz zu dem
bereits oben erwähnten, aus der DE 42 38 497 bekannten Verfahren, bei dem
zur photometrischen Erfassung der Hämolyse vierzig verschiedene Mess
punkte in einer einzelnen Vertiefung der Mikrotiterplatte angefahren werden,
nicht die Vertiefungen punktweise abgetastet, sondern mit einem Lichtstrahl
mit einer bezüglich des Absorptionsmaximums festgelegten Wellenlänge zur
Messung der Absorption in der homogenen Lösung ohne zelluläre Bestandteile
bestrahlt. Es ergibt sich somit ein Messwert pro Vertiefung. Weiterhin dient der
Zentrifugierungsschritt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dem effektiven
Abtrennen von zellulären Bestandteilen (hier Erythrozyten), die für die Mes
sung selbst nicht benötigt werden und das Messergebnis sogar stören. Von
Interesse ist nur der durch die Lyse freigesetzte Zellinhalt, der als Bestandteil
einer homogenen Lösung photometrisch gemessen wird. Bei den aus der
DE 43 38 731 A1 und der DE 39 16 595 A1 bekannten Verfahren werden
dagegen die Zellen selbst gemessen, nachdem sie zuvor durch per Zentrifugie
rungsschritt indirekt oder direkt immobilisiert wurden. Somit hat der
Zentrifugierungsschritt dort eine grundsätzlich andere Funktion als bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren.
Bei einer Weiterführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer
Extraktion der zu testenden Substanz ohne Verwendung eines organischen
Lösungsmittels können zusätzlich Bearbeitungszeit und -material durch die
starke Vereinfachung eingespart werden. Insbesondere kann ein einfaches
Aufschließen durch eine Ultraschallbehandlung (Sonizieren) erfolgen. Dadurch
kann der Umgang mit den zu den gesundheits- und umweltschädlichen
Chemikalien zählenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden. Bei
dem bekannten Verfahren werden die Proben durch eine Extraktion in
Methanol und Chloroform aufbereitet. Beide Chemikalien weisen eine große
Anzahl gesundheitsschädlicher Eigenschaften auf. Derartige zusätzliche
Bearbeitungsschritte können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen.
Zu testende Zellen/Organismen, insbesondere unizelluläre Algen, können
beispielsweise in pelletierter Form sofort und direkt verwendet oder in der
Regel auch über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Für den Testansatz
werden die Pellets lediglich in einen Testpuffer aufgenommen, sodass eine
definierte Zellzahl pro Volumeneinheit vorliegt, und beispielsweise durch eine
Ultraschallbehandlung (Sonizieren) anstelle einer Lösung in Lösungsmitteln
aufgeschlossen. Trotz der Möglichkeit eines vereinfachten Präparations
schrittes können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Proben,
die auf unterschiedliche Arten - auch unter Beteiligung von organischen
Lösungsmitteln - gewonnen wurden, bearbeitet werden. Ein Abgleich zwischen
unterschiedlichen Proben erfolgt dann durch entsprechende Kontrollen.
Analog zu dem bekannten Verfahren gibt es eine Fortführung des erfindungs
gemäßen Verfahrens zum Testen hämolytischer Substanzen mit einer Erythro
zyten-Suspension als Testsuspension und einer photometrischen Detektion
von lytisch freigesetztem Hämoglobin als Detektionsstoff durch Messung der
Absorption bei einer Wellenlänge von 414 nm ("Erythrozytenlysistest" ELA). Als
weiterer relevanter Unterschied zu dem bekannten Verfahren - neben der
Parallelisierung des Verfahrens - ist hier jedoch die Verwendung einer anderen
Wellenlänge zu nennen. Die Verwendung von 540 nm bei den bekannten
Tests ist bislang eine etablierte Größe, die nicht weiter hinterfragt oder
abgewandelt wird. Für die Mess- und Gerätefachleute ist eine Einstellung der
verwendeten Wellenlänge auf den Wert von 540 nm selbstverständlich. Eine
Analyse des Absorptionsspektrums von Blut ergibt jedoch ein bedeutend
größeres Absorptionsmaximum bei der im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzten Wellenlänge von 414 nm. Zur Fehlerkompensation wird als
Referenzwellenlänge parallel die Absorption bei 620 nm gemessen. Hämo
globin absorbiert bei dieser Wellenlänge nicht, es werden aber Unregel
mäßigkeiten der verwendeten Mikrotiterplatten erfasst und subtrahiert, die
ansonsten zu Verfälschungen in den Messergebnissen führen können. Durch
die Messung der Hämolyse bei einer Wellenlänge von 414 nm wird das
Testverfahren ca. um Faktor 10 empfindlicher. Dadurch kann beispielsweise
die Produktion ichthyotoxischer Substanzen einer Alge im Verlauf ihres
Zellzyklus' (Ruhephase - Synthese - Ruhephase - Zellteilung - Ruhe
phase. . .) getestet werden. Mit dem bekannten Verfahren mit seiner geringen
Sensitivität bei der bislang eingesetzten Wellenlänge von 540 nm können
diese zeitlichen Produktionsunterschiede nicht detektiert werden. Im
Zusammenhang mit den kürzeren Lichtwegen durch die Testsuspension in
einer Mikrotiterplatte (ca. 3-5 mm bei einem 200 µl Volumen gegenüber einer
Küvette mit ungefähr 1 cm Durchlauflänge) ergeben sich bei einer gegebenen
Wellenlänge entsprechend geringere Absorptionswerte. Bei einer Verwendung
von 414 nm als Wellenlänge wird diese Verringerung aber aufgrund der hier
maximal auftretenden Absorption kompensiert. Bei einer Wellenlänge von 540 nm
sind die Werte wesentlich schlechter reproduzierbar.
Bei einer anderen Verfahrensfortführung kann auch ein Verfahren zum Testen
potenziell zytolytischer Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als
Testsuspension und einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem
Fluoreszenzfarbstoff als Detektionsstoff durch Messung der Fluoreszenz
emission vorgesehen sein. Hierbei handelt es sich um eine weitere
Optimierung des erfindungsgemäßen Verfahrens, durch die es noch sensitiver
und vielseitiger wird. Es werden die Erythrozyten durch Liposomen (künstliche
Membranvesikel) ersetzt, sodass hier von einem "Liposomlysistest" (LLA)
gesprochen werden kann. Auf diese Weise können Tierversuche eingespart
werden. Eine Gewinnung von tierischem oder sogar menschlichem Blut ist
nicht mehr erforderlich. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die Zusam
mensetzung der Membran so zu konzipieren, dass die Lyse besonders schnell
eintritt. Weiterhin lassen sich Liposomen entweder mit Fluoreszenzfarbstoffen
füllen, sodass man bei Lyse eine Zunahme der Fluoreszenzemission photo
metrisch messen kann, oder es werden die Membranen der Liposomen mit
Fluoreszenzfarbstoffen markiert, sodass bei Lyse eine Abnahme der
Fluoreszenzemission zu detektieren ist. Gegenüber den Absorptionsmessun
gen von Hämoglobin sind die Fluoreszenzmessungen sehr viel sensitiver.
Die Einzelvolumina können in unterschiedlicher Form passend ausgestaltet
sein. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um eine größere Anzahl von
Reagenzröhrchen - mit spitzem und flachem Boden - handeln, die in einem
Ständer nebeneinander angeordnet sind und eine gute Einsatzmöglichkeit für
Pipettierroboter bieten. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah
rens kann jedoch vorteilhaft eine bevorzugte Anordnung mit einer Mikrotiter
platte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina und einer
Mikrotiterplatte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Schalenvolumina, die
jeweils über eine Mehrkanalpipette mit der zu testenden Substanz beladen
werden, vorgesehen sein.
Mikrotiterplatten sind beispielsweise aus dem weiter oben zitierten Stand der
Technik bekannt und werden an vielen Stellen in humanbiologischen
Laboratorien bereits eingesetzt. Auf dem Gebiet der marinen Toxikologie sind
sie jedoch nicht verbreitet, da hier in der Regel Einzeluntersuchungen
vorgenommen werden, die nicht automatisiert sind. Bestätigungen von
Einzelergebnissen werden hier in der Regel durch einfache Wiederholung von
Einzelmessungen erzielt. Der Einsatz von Mikrotiterplatten bei dem
erfindungsgemäßen Testverfahren erlaubt jedoch eine hohe Probendurchsatz
rate und gewährleistet die oben genannten Vorteile. Beispielsweise können bei
einer 96well-Mikrotiterplatte, die eine Matrizenanordnung von 8 parallelen
Volumina in 12 Spalten aufweist, 32 Proben in einer 3fach-Bestimmung
getestet werden. Eine weitere Miniaturisierung der Einzelvolumina zu
Erreichung größerer Matrizen ist möglich. Mikrotiterplatten sind einfach
herstellbare und preiswerte Massenteile, deren Vorteil in der unterschiedlichen
Formgebung der Einzelvolumina liegt. Mikrotiterplatten mit konischen Vertie
fungen eignen sich besonders für den Zentrifugierungsschritt des erfindungs
gemäßen Verfahrens. Während des Zentrifugierens setzen sich unzerstörte
Zellen und Zellreste in der kegeligen Spitze ab, sodass die lysierte
Testsuspension ohne störende Rückstände im oberen Teil der Kegelvolumina
einfach abgezogen werden kann. Dabei ist - genau wie beim Befüllen der
Einzelvolumina - eine Mehrfachpipette sehr hilfreich, mit der beispielsweise
jeweils eine ganze Spalte von Vertiefungen gleichzeitig bearbeitet werden
kann. Bei dem photometrischen Detektionsschritt ist dann eine Überführung in
flache Vertiefungen sinnvoll, da so eine einfache und homogene Durch
strahlung gewährleistet ist. Beide Vertiefungsformen können auf Mikrotiter
platten gleicher Anzahl von Einzelvolumina realisiert sein, sodass jeder
Vertiefung auf der einen Platte eine Vertiefung auf der anderen Platte
entspricht.
Weiterhin kann durch den Einsatz von Mikrotiterplatten das Testverfahren auch
problemlos automatisiert und damit kommerzialisiert werden, sodass es den
Laborrahmen mit seinen relativ umständlichen und aufwändigen Einzel
messungen verlassen kann und eine bedeutend breitere Anwendungspalette
findet, auch bei dem ungeschulten Anwender. Unabhängig von dem Einsatz
von Mikrotiterplatten kann eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens zum
Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung als Frühwarnsystem für das
Auftreten ichthyotoxischer Algen vorgesehen sein. Beispielsweise töten
ichthyotoxische Algen Fische, indem sie ihr empfindliches Kiemenepithel
lysieren. Die Fische verbluten dadurch. Das erfindungsgemäße Testverfahren
in der Ausführung als ELA oder LLA) auf Mikrotiterplatten ermöglicht ein
äußerst schnelles und sensitives Testen von Umweltproben auf gefährliche
Algenspezies und andere toxische Substanzen. Daraus ergibt sich die
vorteilhafte Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens als
Frühwarnsystem.
Eine andere bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in
der Ausführung als ELA oder LLA kann in einer Anwendung als Screening
system für potenziell zytolytische Substanzen bestehen. Ein Bedürfnis für eine
solche Anwendung kann einerseits die Suche nach eben solchermaßen
wirkenden Substanzen sein. Hierbei kann es sich beispielsweise um bestimmte
künstliche Design-Antibiotika, aber auch um natürliche Antibiotika handeln.
Beispielsweise hat Mycosubtilin eine hohe Affinität zu Cholesterin. Bei der Lyse
von Erythrozyten tritt bei Anwesenheit dieses Stoffes dann eine dotier- und
auswertbare Lysehemmung durch freies oder liposomgebundenes Cholesterin
auf (vgl. Aufsatz V: F. Besson et al. "Action of microsubtilin on erythrocytes
and artificial membranes", Microbios. 59 (1989) pp 137-143). Andererseits
kann aber auch der Umstand gegeben sein, dass man bestimmte medizinisch-
pharmazeutische Produkte oder Lebensmittel auf Kontaminationen hin
untersuchen möchte, beispielsweise auf hämolytische Bakterien (vgl.
beispielsweise Aufsatz VI: H. C. Wong et al. "Incidence of highly genetically
diversified Vibrio paraphaemolyticus in seafood imported from Asian
countries", Int. J. Food Micobiol. 52 (3) 1999, pp 181-188.
Eine Ausbildungsform der Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der
Figur dargestellten schematischen und um einige relevante Vorrichtungs
gegenstände erweiterten Ablaufdiagrammes näher erläutert. Bei dem gewähl
ten Ausführungsbeispiel handelt es sich um die Bestimmung von Algentoxinen
mit dem ELA (Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest).
In einem Präparationsschritt ELA I werden für die Bestimmung der
Algentoxine die Algenproben AP zunächst durch Zentrifugieren pelletiert. Die
entstandenen Pellets PE können entweder bei -20°C gelagert oder direkt
verwendet werden. Für den Test werden die Pellets PE in einem Testpuffer
TP aufgelöst und aufgenommen, sodass eine pro Volumeneinheit definierte
Zellzahl vorliegt, und durch eine Ultraschallbehandlung US aufgeschlossen.
Für die Extraktion der Toxine sind also im gewählten Ausführungsbeispiel
keine organischen Lösungsmittel erforderlich.
An dieser Stelle sei auch etwas zu der Erythrozytengewinnung, -aufbereitung
und -lagerung angemerkt. Das Blut wird einem geeigneten Spender entnom
men. Hierbei kann es sich um Fische, Säuger, aber auch um Menschen
handeln, da nur sehr geringe Blutmengen benötigt werden (z. B. ca. 100 µl
Karpfen-Vollblut für eine Mikrotiterplatte; bei Säuger-Erythrozyten benötigt man
aufgrund ihrer geringeren Größe ca. die dreifache Menge). Das entnommene
Blut wird zunächst mit einem geeigneten Nährmedium und Heparin
gewaschen und kann in diesem Nährmedium in Zellkulturflaschen bis zu 3
Monaten im Kühlschrank gelagert werden. Für den Einsatz im ELA werden die
Erythrozyten mit einem Testpuffer, der identisch ist mit dem Testpuffer TP für
die Algenaufbereitung, gewaschen und eine geeignete Zellzahl eingestellt.
In einem Lysierungsschritt ELA II werden Mikrotiterplatten MPC, im
gewählten Ausführungsbeispiel handelt es sich 96-well-Platten (12 Spalten × 8
Reihen) mit kleinen Kegelvolumina CV (in der Figur nur schematisch
angedeutet), mithilfe einer achtkanaligen Mehrkanalpipette MP mit einer
Erythrozyten-Suspension Es als Testsuspension TL befüllt. Anschließend wird
die Testsubstanz TS, im gewählten Ausführungsbeispiel Algenextrakte AP,
zugegeben und bei einer geeigneten Temperatur IT inkubiert. fn der Literatur
werden als Inkubationstemperaturen IT 30°C und 37°C angegeben, 15°C sind
jedoch auch möglich und energiesparend. Auch eine Inkubationstemperatur IT
von 4°C ist möglich, wenn die Reaktionen langsamer ablaufen sollen. Über die
Inkubationstemperatur IT ist also die Sensitivität des erfindungsgemäßen
Testverfahrens ELA steuerbar. Während der Inkubationszeit werden die
Erythrozyten in der Erythrozyten-Suspension Es von den toxischen Algen in
der Testsubstanz TS entsprechend ihrer Toxizität angegriffen und lysiert.
Dabei wird Hämoglobin als enthaltener Detektionsstoff DS freigegeben.
In einem Zentrifugierungsschritt ELA III wird die Mikrotiterplatte MPC in einer
Zentrifuge ZE mit einem speziellen Rotor für Mikrotiterplatten zentrifugiert,
wobei sich noch nicht lysierte Zellen und Zelltrümmer in den kegelförmigen
Spitzen der einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte MPC sammeln. Die
flüssigen Überstände der von der Algenprobe AP lysierten Testsuspension TL
werden mit der Mehrkanalpipette MP in eine andere Mikrotiterplatte MPS mit
Schalenvolumina SV, das heißt mit flachem Boden, transferiert.
Anschließend werden in einem Detektionsschritt ELA IV die lysierten
Überstände in den Mikrotiterplatten MPS mit flachem Boden in einem Plate-
Reader-Photometer PRP photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 414 nm
auf ihr Absorptionsvermögen hin detektiert (Referenzwellenlänge λ = 620 nm).
Dabei werden alle Vertiefungen in der Mikrotiterplatte MPS zeitsparend
gleichzeitig detektiert. Bei Photometern mit einer geringeren Detektions
parallelität kann auch jeweils eine größere Teilmenge der Vertiefungen
detektiert werden. Der Detektionsprozess kann automatisch ablaufen.
In einem abschließenden Kalkulationsschritt ELA V werden für eine
Kalkulation der lytischen Aktivität LA der zu untersuchenden Testsubstanz TS
üblicherweise die LC50-Werte als Konzentration, bei der 50% der Erythrozyten
in der Erythrozyten-Suspension ES lysiert werden, bestimmt. Die Verwendung
eines externen Standards, beispielsweise "Saponin" oder eine andere hämo
lytische Substanz, erlaubt eine Berechnung von Äquivalentdosen, die einen
Vergleich von Daten verschiedener Tests ermöglichen.
Zur Erleichterung der Verfahrensdurchführung und für eine weitere
Verbesserung der Verfahrensökonomie können "ELA-Kits" vorbereitet werden,
die beispielsweise folgende Komponenten enthalten können (Analoges gilt für
"LLA-Kits"):
- - Mikrotiterplatten mit konischen und flachen Vertiefungen
- - bereits mit Testsuspension beschickte Mikrotiterplatten mit konischen Vertiefungen
- - externe Standardsubstanzen (z. B.: Saponin)
- - ELA-Puffer
- - Protokollvorschläge für Probenpräparation o. ä.
I Präparationsschritt
II Lysierungsschritt
III Zentrifugierungsschritt
IV Detektionsschritt
V Kalkulationsschritt
AP Algenprobe
CV Kegelvolumen
DS Detektionsstoff
ELA Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest
ES Erythrozyten-Suspension
IT Inkubationstemperatur
LA lytische Aktivität
LLA Liposomlysistest
MP Mehrkanalpipette
MPC Mikrotiterplatte mit konischen Vertiefungen
MPS Mikrotiterplatte mit flachen Vertiefungen
PE Pellets
PRP Plate-Reader-Photometer
SV Schalenvolumen
TL Testsuspension
TP Testpuffer
TS Testsubstanz
US Ultraschallbehandlung
ZE Zentrifuge
λ Wellenlänge
II Lysierungsschritt
III Zentrifugierungsschritt
IV Detektionsschritt
V Kalkulationsschritt
AP Algenprobe
CV Kegelvolumen
DS Detektionsstoff
ELA Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest
ES Erythrozyten-Suspension
IT Inkubationstemperatur
LA lytische Aktivität
LLA Liposomlysistest
MP Mehrkanalpipette
MPC Mikrotiterplatte mit konischen Vertiefungen
MPS Mikrotiterplatte mit flachen Vertiefungen
PE Pellets
PRP Plate-Reader-Photometer
SV Schalenvolumen
TL Testsuspension
TP Testpuffer
TS Testsubstanz
US Ultraschallbehandlung
ZE Zentrifuge
λ Wellenlänge
Claims (7)
1. Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung mit
einem Präparationsschritt (ELA I), in dem eine Probe (AP) der zu testenden Substanz (TS) extrahiert wird,
einem Lysierungsschritt (ELA II), in dem die aufbereitete Probe (AP) mit einer zellularen Testsuspension (TL), deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff (DS) aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina (CV) parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
einem Zentrifugierungsschritt (ELA III), in dem die lysierte Testsuspension (TL) in den Kegelvolumina (CV) separiert und in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina (SV) transferiert wird,
einem Detektionsschritt (ELA IV), in dem mit einer auf den verwendeten Detektionsstoff (DS) ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension (TL) freigegebene Menge an Detektions stoff (DS) in allen Schalenvolumina (SV) parallel erfasst wird und
einem Auswertungsschritt (ELA V), in dem anhand der detektierten Detektionsstoffmenge der zu testenden Substanz (TS) eine lytische Aktivität (LA) zugeordnet wird.
einem Präparationsschritt (ELA I), in dem eine Probe (AP) der zu testenden Substanz (TS) extrahiert wird,
einem Lysierungsschritt (ELA II), in dem die aufbereitete Probe (AP) mit einer zellularen Testsuspension (TL), deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff (DS) aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina (CV) parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
einem Zentrifugierungsschritt (ELA III), in dem die lysierte Testsuspension (TL) in den Kegelvolumina (CV) separiert und in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina (SV) transferiert wird,
einem Detektionsschritt (ELA IV), in dem mit einer auf den verwendeten Detektionsstoff (DS) ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension (TL) freigegebene Menge an Detektions stoff (DS) in allen Schalenvolumina (SV) parallel erfasst wird und
einem Auswertungsschritt (ELA V), in dem anhand der detektierten Detektionsstoffmenge der zu testenden Substanz (TS) eine lytische Aktivität (LA) zugeordnet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 mit einem vereinfachten Präparationsschritt
(ELA I) mit einer Extraktion der zu testenden Substanz (TS) ohne Verwendung
organischer Lösungsmittel, insbesondere durch Sonizieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen hämolytischer Substanzen
mit einer Erythrozyten-Suspension (Es) als Testsuspension (TL) und einer
photometrischen Detektion von lytisch freigesetztem Hämoglobin als
Detektionsstoff (DS) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von
414 nm.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen potenziell zytolytischer
Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als Testsuspension (TL) und
einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem Fluoreszenz
farbstoff als Detektionsstoff (DS) durch Messung der Fluoreszenzemission.
5. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zum Testen von Substanzen
mit lytischer Wirkung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Zentrifuge
(ZE) und einem Photometer (PRP) sowie mit einer Mikrotiterplatte (MPC) als
Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina (CV) und einer
Mikrotiterplatte (MPS) als Matrixanordnung einer Vielzahl von Schalenvolumina
(SV), die jeweils über eine Mehrkanalpipette (MP) mit der zu testenden
Substanz (TS) beladen werden.
6. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer
Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Frühwarn
system für das Auftreten ichthyotoxischer Algen.
7. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer
Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Screening
system für potenziell zytolytische Substanzen.
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