DE10049732A1 - Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung, Anordnung zur Durchführung und Anwendung des VerfahrensInfo
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Abstract
Bekannte Testverfahren basieren auf dem Grundprinzip der Lyse (Auflösung der Zellstruktur) von Erythrozyten und anschließenden photometrischen Ermittlung des freigesetzten Hämoglobins durch Absorptionsmessung von Licht einer vorgegebenen Wellenlänge. Die bekannten Verfahren werden jedoch in einzelnen und größeren Reaktionsgefäßen und Küvetten mit Einzelmessungen durchgeführt. Der Aufwand an einzusetzender Ausrüstung, zu testender Substanz und vor allem an Bearbeitungs- und Testzeit zur Erzielung aussagekräftiger Ergebnisse ist sehr hoch. Das erfindungsgemäße Verfahren (ELA) basiert auf dem Lyse-Detektions-Prinzip, führt aber eine hocheffiziente Parallelverarbeitung der zu testenden Substanz (TS, AP) in mul-kleinen Einzelvolumina unterschiedlicher Ausbildungsformen (CV, SV) ein, die matrizenförmig (MPC, MPV) angeordnet sein können. Dadurch ergibt sich ein hoher Probendurchsatz verbunden mit einer entsprechend hohen Verfahrensökonomie und -sicherheit. In Ausführungsformen arbeitet das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Absorptionswellenlänge von 414 nm, wodurch ein gegenüber bekannten Verfahren um ca. das Zehnfache gesteigerte Empfindlichkeit erreicht wird. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich einfach automatisieren und damit kommerziell in Anwendungen sowohl als Test-, als Frühwarn- oder auch als Screeningsystem umsetzen.
Description
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Testen von Substanzen mit
lytischer Wirkung, auf eine Vorrichtung zur Durchführung und auf Anwen
dungen des Verfahrens.
Ein in den letzten Jahren aufgetretenes Problem mit zunehmender Bedeutung
stellt die Belastung der Meere mit toxischen Algen dar, die in erster Linie den
anderen Meeresbewohnern, aber auch den Menschen in höchstem Maße
gefährlich werden können. Dabei können sich Algentoxine in der
Nahrungskette anreichern (z. B. Muscheln) oder auch direkte toxische
Auswirkungen zeigen. Insbesondere können die Algentoxine lysierend wirken,
das heißt, sie lösen Zellstrukturen des von ihnen angegriffenen Organismus
auf und führen zu dessen Zerstörung. Verschiedene Verfahren zum Testen der
lytisch wirkenden Substanzen wurden entwickelt. Alle arbeiten mit dem
gleichen Grundprinzip durch Lyse von Erythrozyten und anschließende
photometrische Messung des freigesetzten Hämoglobins durch Bestrahlung
mit Licht einer Wellenlänge von 540 nm (vergleiche beispielsweise Aufsatz
von B. Edvardsen et al. "Hemolytic activity in extracts of Chrysochromulina
polylepsis grown at different levels of selenite and phosphate", Toxic Marine
Phytoplancton, Elsevier Science Publishing 1990, pp. 284-289 oder Aufsatz
von G. Arzul et al. "A haemolytic test to assay toxins excreted by the marine
dinoflagellate Gyrodinium cf. auroleum", Wat. Res. Vol. 28, No. 4, pp. 961-965,
1994). Die in der Literatur beschriebenen Testverfahren werden jedoch in
einzelnen und größeren Reaktionsgefäßen durchgeführt und die photo
metrische Messung erfolgt in einzelnen Küvetten. Ein entsprechend hoher
Aufwand an einzusetzender Ausrüstung, zu testender Substanz und auch an
Bearbeitungs- und Testzeit ist zur Erzielung aussagekräftiger Testergebnisse
erforderlich. Weiterhin umfasst der Präparationsschritt bei den bekannten
Verfahren in der Regel eine Extraktion der zu testenden Substanz in einem
organischen Lösungsmittel (Methanol und Chloroform).
Durch die genannten Aspekte wird bei dem bekannten Testverfahren daher
nur eine begrenzte Leistungsfähigkeit erreicht. Ausgehend von dem prinzi
piellen Testverfahren, das auf der Lyse einer einen Detektionsstoff
enthaltenden Testsuspension durch die präparierte Testsubstanz und der an
schließenden Detektion des freigegebenen Detektionsstoffes als Maß für die
lytische Aktivität der Testsubstanz, ist es die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, ein weiterentwickeltes Testverfahren anzugeben, dass eine deutlich
gesteigerte Leistungsfähigkeit aufweist, insbesondere hinsichtlich der Verfah
rensökonomie und der Verfahrensempfindlichkeit. Dabei sollen die Verbesse
rungsschritte ebenso wie bevorzugte Mittel zur Verfahrensdurchführung
einfach und damit effektiv und kostengünstig sein.
Die Lösung für diese Aufgabe stellt das erfindungsgemäße Verfahren zum
Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung dar mit
- - einem Präparationsschritt, in dem eine Probe der zu testenden Substanz extrahiert wird,
- - einem Lysierungsschritt, in dem die aufbereitete Probe mit einer zellularen Testsuspension, deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
- - einem Zentrifugierungsschritt, in dem die lysierte Testsuspension in den Kegelvolumina separiert und anschließend in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina transferiert wird,
- - einem Detektionsschritt, in dem mit einer auf den verwendeten Detektions stoff ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension freigegebene Menge an Detektionsstoff in allen Schalenvolumina parallel erfasst wird und
- - einem Auswertungsschritt, in dem anhand der detektierten Detektionsstoff menge der zu testenden Substanz eine lytische Aktivität zugeordnet wird.
Durch die verbesserte Konzeption der Verfahrensschritte "Lysieren", "Zentrifu
gieren" und "Detektieren" kann bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren
eine bedeutende Leistungssteigerung erzielt werden. Durch die Übertragung
des bekannten Verfahrensprinzips auf eine Vielzahl von Einzelvolumina wird
die Bearbeitung sehr vieler Proben in einer Mehrfachbestimmung möglich.
Eine Bewältigung großer Probenzahlen mit einem geringen bzw. überhaupt
betreibbaren Aufwand wird so ermöglicht. Außerdem kann in erheblichem
Maße Bearbeitungszeit eingespart werden, sodass die relevanten
Messergebnisse auch innerhalb eines kurzen Zeitintervalls zur Verfügung
stehen. Durch den Einsatz von sehr kleinen, parallel zu nutzenden
Einzelvolumina wird darüber hinaus eine bedeutende Einsparung an Test- und
Probenmaterial erzielt. Dadurch wird zum einen eine Kostensenkung für das
Testverfahren erreicht, zum anderen können nunmehr auch Substanzen
getestet werden, die nur in geringen Mengen zur Verfügung stehen. Weiterhin
werden auch zur Erstellung der Testsuspension erforderliche
Grundsubstanzen in verminderter Form benötigt.
Bei einer Weiterführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einer
Extraktion der zu testenden Substanz ohne Verwendung eines organischen
Lösungsmittels können zusätzlich Bearbeitungszeit und -material durch die
starke Vereinfachung eingespart werden. Insbesondere kann ein einfaches
Aufschließen durch eine Ultraschallbehandlung (Sonizieren) erfolgen. Dadurch
kann der Umgang mit den zu den gesundheitsschädlichen Chemikalien
zählenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden. Bei dem bekannten
Verfahren werden die Proben durch eine Extraktion in Methanol und
Chloroform aufbereitet. Beide Chemikalien weisen eine große Anzahl
gesundheitsschädlicher Eigenschaften auf. Derartige zusätzliche Bearbei
tungsschritte können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entfallen. Zu
testende Zellen/Organismen, insbesondere unizelluläre Algen, können
beispielsweise in pelletierter Form sofort und direkt verwendet oder in der
Regel auch über einen längeren Zeitraum gelagert werden. Für den Testansatz
werden die Pellets lediglich in einen Testpuffer aufgenommen, sodass eine
definierte Zellzahl pro Volumeneinheit vorliegt, und beispielsweise durch eine
Ultraschallbehandlung (Sonizieren) anstelle einer Lösung in Lösungsmitteln
aufgeschlossen. Trotz der Möglichkeit eines vereinfachten Präparations
schrittes können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch andere Proben,
die auf unterschiedliche Arten - auch unter Beteiligung von organischen
Lösungsmitteln - gewonnen wurden, bearbeitet werden. Ein Abgleich zwischen
unterschiedlichen Proben erfolgt dann durch entsprechende Kontrollen.
Analog zu dem bekannten Verfahren gibt es eine Fortführung des erfindungs
gemäßen Verfahrens zum Testen hämolytischer Substanzen mit einer Erythro
zyten-Suspension als Testsuspension und einer photometrischen Detektion
von lytisch freigesetztem Hämoglobin als Detektionsstoff durch Messung der
Absorption bei einer Wellenlänge von 414 nm ("Erythrozytenlysistest" ELA). Als
weiterer relevanter Unterschied zu dem bekannten Verfahren - neben der
Parallelisierung des Verfahrens - ist hier jedoch die Verwendung einer anderen
Wellenlänge zu nennen. Die Verwendung von 540 nm bei den bekannten
Tests ist bislang eine etablierte Größe, die nicht weiter hinterfragt oder
abgewandelt wird. Für die Mess- und Gerätefachleute ist eine Einstellung der
verwendeten Wellenlänge auf den Wert von 540 nm selbstverständlich. Eine
Analyse des Absorptionsspektrums von Blut ergibt jedoch ein bedeutend
größeres Absorptionsmaximum bei der im erfindungsgemäßen Verfahren
eingesetzten Wellenlänge von 414 nm. Zur Fehlerkompensation wird als
Referenzwellenlänge parallel die Absorption bei 620 nm gemessen. Hämo
globin absorbiert bei dieser Wellenlänge nicht, es werden aber Unregel
mäßigkeiten der verwendeten Mikrotiterplatten erfasst und subtrahiert, die
ansonsten zu Verfälschungen in den Messergebnissen führen können. Durch
die Messung der Hämolyse bei einer Wellenlänge von 414 nm wird das
Testverfahren ca. um Faktor 10 empfindlicher. Dadurch können beispielsweise
ichthyotoxische Substanzen einer Alge getestet, deren Produktion im Verlauf
des Zellzyklus' (Ruhephase - Synthese - Ruhephase - Zellteilung - Ruhe
phase . . .) deutliche Unterschiede zeigt. Mit dem bekannten Verfahren mit
seiner geringen Sensitivität bei der bislang eingesetzten Wellenlänge von 540
nm können diese zeitlichen Produktionsunterschiede nicht detektiert werden.
Im Zusammenhang mit den kürzeren Lichtwegen durch die Testsuspension in
einer Mikrotiterplatte (ca. 3-5 mm bei einem 200 µl Volumen gegenüber einer
Küvette mit ungefähr 1 cm Durchlauflänge) ergeben sich bei einer gegebenen
Wellenlänge entsprechend geringere Absorptionswerte. Bei einer Verwendung
von 414 nm als Wellenlänge wird diese Verringerung aber aufgrund der hier
maximal auftretenden Absorption kompensiert. Bei einer Wellenlänge von 540
nm sind die Werte wesentlich schlechter reproduzierbar.
Bei einer anderen Verfahrensfortführung kann auch ein Verfahren zum Testen
potenziell cytolytischer Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als
Testsuspension und einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem
Fluoreszenzfarbstoff als Detektionsstoff durch Messung der Fluoreszenz
emission vorgesehen sein. Hierbei handelt es sich um eine weitere
Optimierung des erfindungsgemäßen Verfahrens, durch die es noch sensitiver
und vielseitiger wird. Es werden die Erythrozyten durch Liposomen (künstliche
Membranvesikel) ersetzt, sodass hier von einem "Liposomlysistest" (LLA)
gesprochen werden kann. Auf diese Weise können Tierversuche eingespart
werden. Eine Gewinnung von tierischem oder sogar menschlichem Blut ist
nicht mehr erforderlich. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die Zusam
mensetzung der Membran so zu konzipieren, dass die Lyse besonders schnell
eintritt. Weiterhin lassen sich Liposomen entweder mit Fluoreszenzfarbstoffen
füllen, sodass man bei Lyse eine Zunahme der Fluoreszenzemission photo
metrisch messen kann, oder es werden die Membranen der Liposomen mit
Fluoreszenzfarbstoffen markiert, sodass bei Lyse eine Abnahme der
Fluoreszenzemission zu detektieren ist. Gegenüber den Absorptionsmessun
gen von Hämoglobin sind die Fluoreszenzmessungen sehr viel sensitiver.
Die Einzelvolumina können in unterschiedlicher Form passend ausgestaltet
sein. Hierbei kann es sich beispielsweise auch um eine größere Anzahl von
Reagenzröhrchen - mit spitzem und flachem Boden - handeln, die in einem
Ständer nebeneinander angeordnet sind und eine gute Einsatzmöglichkeit für
Pipettierroboter bieten. Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfah
rens kann jedoch vorteilhaft eine bevorzugte Anordnung mit einer Mikrotiter
platte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina und einer
Mikrotiterplatte als Matrixanordnung einer Vielzahl von Schalenvolumina, die
jeweils über eine Mehrkanalpipette mit der zu testenden Substanz beladen
werden, vorgesehen sein.
Mikrotiterplatten sind an sich bekannt und werden an vielen Stellen in
humanbiologischen Laboratorien bereits eingesetzt. Auf dem Gebiet der
marinen Toxikologie sind sie jedoch nicht verbreitet, da hier in der Regel
Einzeluntersuchungen vorgenommen werden, die nicht automatisiert sind.
Bestätigungen von Einzelergebnissen werden hier in der Regel durch einfache
Wiederholung von Einzelmessungen erzielt. Der Einsatz von Mikrotiterplatten
bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren erlaubt jedoch eine hohe
Probendurchsatzrate und gewährleistet die oben genannten Vorteile. Beispiels
weise können bei einer 96well-Mikrotiterplatte, die eine Matrizenanordnung
von 8 parallelen Volumina in 12 Spalten aufweist, 32 Proben in einer 3fach-
Bestimmung getestet werden. Eine weitere Miniaturisierung der Einzelvolumina
zu Erreichung größerer Matrizen ist möglich. Mikrotiterplatten sind einfach
herstellbare und preiswerte Massenteile, deren Vorteil in der unterschiedlichen
Formgebung der Einzelvolumina liegt. Mikrotiterplatten mit konischen Vertie
fungen eignen sich besonders für den Zentrifugierungsschritt des erfindungs
gemäßen Verfahrens. Während des Zentrifugierens setzen sich unzerstörte
Zellen und Zellreste in der kegeligen Spitze ab, sodass die lysierte
Testsuspension ohne störende Rückstände im oberen Teil der Kegelvolumina
einfach abgezogen werden kann. Dabei ist - genau wie beim Befüllen der
Einzelvolumina - eine Mehrfachpipette sehr hilfreich, mit der beispielsweise
jeweils eine ganze Spalte von Vertiefungen gleichzeitig bearbeitet werden
kann. Bei dem photometrischen Detektionsschritt ist dann eine Überführung in
flache Vertiefungen sinnvoll, da so eine einfache und homogene Durch
strahlung gewährleistet ist. Beide Vertiefungsformen können auf Mikrotiter
platten gleicher Anzahl von Einzelvolumina realisiert sein, sodass jeder
Vertiefung auf der einen Platte eine Vertiefung auf der anderen Platte
entspricht.
Weiterhin kann durch den Einsatz von Mikrotiterplatten das Testverfahren auch
problemlos automatisiert und damit kommerzialisiert werden, sodass es den
Laborrahmen mit seinen relativ umständlichen und aufwendigen Einzel
messungen verlassen kann und eine bedeutend breitere Anwendungspalette
findet, auch bei dem ungeschulten Anwender. Unabhängig von dem Einsatz
von Mikrotiterplatten kann eine bevorzugte Anwendung des Verfahrens zum
Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung als Frühwarnsystem für das
Auftreten ichthyotoxischer Algen vorgesehen sein. Beispielsweise töten
ichthyotoxische Algen Fische, indem sie ihr empfindliches Kiemenepithel
lysieren. Die Fische verbluten dadurch. Das erfindungsgemäße Testverfahren
in der Ausführung als ELA oder LLA) auf Mikrotiterplatten ermöglicht ein
äußerst schnelles und sensitives Testen von Umweltproben auf gefährliche
Algenspezies und andere toxische Substanzen. Daraus ergibt sich die
vorteilhafte Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens als
Frühwarnsystem.
Eine andere bevorzugte Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in
der Ausführung als ELA oder LLA kann in einer Anwendung als Screening
system für potenziell cytolytische Substanzen bestehen. Ein Bedürfnis für eine
solche Anwendung kann einerseits die Suche nach eben solchermaßen
wirkenden Substanzen sein. Hierbei kann es sich beispielsweise um bestimmte
künstliche Design-Antibiotika, aber auch um natürliche Antibiotika handeln.
Beispielsweise hat Mycosubtilin eine hohe Affinität zu Cholesterin. Bei der Lyse
von Erythrozyten tritt bei Anwesenheit dieses Stoffes dann eine dotier- und
auswertbare Lysehemmung durch freies oder liposomgebundenes Cholesterin
auf (vgl. F. Besson et al. "Action of microsubtilin on erythrocytes and artificial
membranes", Microbios. 59 (1989) pp 137-143). Andererseits kann aber auch
der Umstand gegeben sein, dass man bestimmte medizinisch-pharma
zeutische Produkte oder Lebensmittel auf Kontaminationen hin untersuchen
möchte, beispielsweise auf hämolytische Bakterien (vgl. beispielsweise H. C.
Wong et al. "Incidence of highly genetically diversified Vibrio paraphaemo
lyticus in seafood imported from Asian countries", Int. J. Food Micobiol. 52 (3)
1999, pp 181-188.
Eine Ausbildungsform der Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der
Figur dargestellten schematischen und um einige relevante Vorrichtungs
gegenstände erweiterten Ablaufdiagrammes näher erläutert. Bei dem gewähl
ten Ausführungsbeispiel handelt es sich um die Bestimmung von Algentoxinen
mit dem ELA (Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest).
In einem Präparationsschritt ELA I werden für die Bestimmung der
Algentoxine die Algenproben AP zunächst durch Zentrifugieren pelletiert. Die
entstandenen Pellets PE können entweder bei -20°C gelagert oder direkt
verwendet werden. Für den Test werden die Pellets PE in einem Testpuffer
TP aufgelöst und aufgenommen, sodass eine pro Volumeneinheit definierte
Zellzahl vorliegt, und durch eine Ultraschallbehandlung US aufgeschlossen.
Für die Extraktion der Toxine sind also im gewählten Ausführungsbeispiel
keine organischen Lösungsmittel erforderlich.
An dieser Stelle sei auch etwas zu der Erythrozytengewinnung, -aufbereitung
und -lagerung angemerkt. Das Blut wird einem geeigneten Spender entnom
men. Hierbei kann es sich um Fische, Säuger, aber auch um Menschen
handeln, da nur sehr geringe Blutmengen benötigt werden (z. B. ca. 100 µl
Karpfen-Vollblut für eine Mikrotiterplatte; bei Säuger-Erythrozyten benötigt man
aufgrund ihrer geringeren Größe ca. die dreifache Menge). Das entnommene
Blut wird zunächst mit einem geeigneten Nährmedium und Heparin
gewaschen und kann in diesem Nährmedium in Zellkulturflaschen bis zu 3
Monaten im Kühlschrank gelagert werden. Für den Einsatz im ELA werden die
Erythrocyten mit einem Testpuffer, der identisch ist mit dem Testpuffer TP für
die Algenaufbereitung, gewaschen und eine geeignete Zellzahl eingestellt.
In einem Lysierungsschritt ELA II werden Mikrotiterplatten MPC, im
gewählten Ausführungsbeispiel handelt es sich 96-well-Platten (12 Spalten × 8
Reihen) mit kleinen Kegelvolumina CV (in der Figur nur schematisch
angedeutet), mithilfe einer achtkanaligen Mehrkanalpipette MP mit einer
Erythrozyten-Suspension Es als Testsuspension TL befüllt. Anschließend wird
die Testsubstanz TS, im gewählten Ausführungsbeispiel Algenextrakte AP,
zugegeben und bei einer geeigneten Temperatur IT inkubiert. In der Literatur
werden als lnkubationstemperaturen IT 30°C und 37°C angegeben, 15°C sind
jedoch auch möglich und energiesparend. Auch eine Inkubationstemperatur IT
von 4°C ist möglich, wenn die Reaktionen langsamer ablaufen sollen. Über die
Inkubationstemperatur IT ist also die Sensitivität des erfindungsgemäßen
Testverfahrens ELA steuerbar. Während der Inkubationszeit werden die
Erythrozyten in der Erythrozyten-Suspension ES von den toxischen Algen in
der Testsubstanz TS entsprechend ihrer Toxizität angegriffen und lysiert.
Dabei wird Hämoglobin als enthaltener Detektionsstoff DS freigegeben.
In einem Zentrifugierungsschritt ELA III wird die Mikrotiterplatte MPC in einer
Zentrifuge ZE mit einem speziellen Rotor für Mikrotiterplatten zentrifugiert,
wobei sich noch nicht lysierte Zellen und Zelltrümmer in den kegelförmigen
Spitzen der einzelnen Vertiefungen der Mikrotiterplatte MPC sammeln. Die
flüssigen Überstände der von der Algenprobe AP lysierten Testsuspension TL
werden mit der Mehrkanalpipette MP in eine andere Mikrotiterplatte MPS mit
Schalenvolumina SV, das heißt mit flachem Boden, transferiert.
Anschließend werden in einem Detektionsschritt ELA IV die lysierten
Überstände in den Mikrotiterplatten MPS mit flachem Boden in einem Plate-
Reader-Photometer PRP photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 414 nm
auf ihr Absorptionsvermögen hin detektiert (Referenzwellenlänge λ = 620 nm).
Dabei werden alle Vertiefungen in der Mikrotiterplatte MPS zeitsparend
gleichzeitig detektiert. Bei Photometern mit einer geringeren Detektions
parallelität kann auch jeweils eine größere Teilmenge der Vertiefungen
detektiert werden. Der Detektionsprozess kann automatisch ablaufen.
In einem abschließenden Kalkulationsschritt ELA V werden für eine
Kalkulation der lytischen Aktivität LA der zu untersuchenden Testsubstanz TS
üblicherweise die LC50-Werte als Konzentration, bei der 50% der Erythrozyten
in der Erythrozyten-Suspension ES lysiert werden, bestimmt. Die Verwendung
eines externen Standards, beispielsweise "Saponin" oder eine andere hämo
lytische Substanz, erlaubt eine Berechnung von Äquivalentdosen, die einen
Vergleich von Daten verschiedener Tests ermöglichen.
Zur Erleichterung der Verfahrensdurchführung und für eine weitere
Verbesserung der Verfahrensökonomie können "ELA-Kits" vorbereitet werden,
die beispielsweise folgende Komponenten enthalten können (Analoges gilt für
"LLA-Kits"):
- - Mikrotiterplatten mit konischen und flachen Vertiefungen
- - bereits mit Testsuspension beschickte Mikrotiterplatten mit konischen Vertiefungen
- - externe Standardsubstanzen (z. B.: Saponin)
- - ELA-Puffer
- - Protokollvorschläge für Probenpräparation o. ä.
I Präparationsschritt
II Lysierungsschritt
III Zentrifugierungsschritt
IV Detektionsschritt
V Kalkulationsschritt
AP Algenprobe
CV Kegelvolumen
DS Detektionsstoff
ELA Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest
ES Erythrozyten-Suspension
IT Inkubationstemperatur
LA lytische Aktivität
LLA Liposomlysistest
MP Mehrkanalpipette
MPC Mikrotiterplatte mit konischen Vertiefungen
MPS Mikrotiterplatte mit flachen Vertiefungen
PE Pellets
PRP Plate-Reader-Photometer
SV Schalenvolumen
TL Testsuspension
TP Testpuffer
TS Testsubstanz
US Ultraschallbehandlung
ZE Zentrifuge
λ Wellenlänge
II Lysierungsschritt
III Zentrifugierungsschritt
IV Detektionsschritt
V Kalkulationsschritt
AP Algenprobe
CV Kegelvolumen
DS Detektionsstoff
ELA Erythrocyte Lysis Assay - Erythrozytenlysistest
ES Erythrozyten-Suspension
IT Inkubationstemperatur
LA lytische Aktivität
LLA Liposomlysistest
MP Mehrkanalpipette
MPC Mikrotiterplatte mit konischen Vertiefungen
MPS Mikrotiterplatte mit flachen Vertiefungen
PE Pellets
PRP Plate-Reader-Photometer
SV Schalenvolumen
TL Testsuspension
TP Testpuffer
TS Testsubstanz
US Ultraschallbehandlung
ZE Zentrifuge
λ Wellenlänge
Claims (7)
1. Verfahren zum Testen von Substanzen mit lytischer Wirkung mit
einem Präparationsschritt (ELA I), in dem eine Probe (AP) der zu testenden Substanz (TS) extrahiert wird,
einem Lysierungsschritt (ELA II), in dem die aufbereitete Probe (AP) mit einer zellularen Testsuspension (TL), deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff (DS) aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina (CV) parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
einem Zentrifugierungsschritt (ELA III), in dem die lysierte Testsuspension (TL) in den Kegelvolumina (CV) separiert und in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina (SV) transferiert wird,
einem Detektionsschritt (ELA IV), in dem mit einer auf den verwendeten Detektionsstoff (DS) ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension (TL) freigegebene Menge an Detektions stoff (DS) in allen Schalenvolumina (SV) parallel erfasst wird und
einem Auswertungsschritt (ELA V), in dem anhand der detektierten Detektionsstoffmenge der zu testenden Substanz (TS) eine lytische Aktivität (LA) zugeordnet wird.
einem Präparationsschritt (ELA I), in dem eine Probe (AP) der zu testenden Substanz (TS) extrahiert wird,
einem Lysierungsschritt (ELA II), in dem die aufbereitete Probe (AP) mit einer zellularen Testsuspension (TL), deren Zellen oder Liposomen einen Detektionsstoff (DS) aufweisen, in einer Vielzahl von µl-kleinen Kegelvolumina (CV) parallel in Kontakt gebracht und inkubiert wird,
einem Zentrifugierungsschritt (ELA III), in dem die lysierte Testsuspension (TL) in den Kegelvolumina (CV) separiert und in eine Vielzahl von µl-kleinen Schalenvolumina (SV) transferiert wird,
einem Detektionsschritt (ELA IV), in dem mit einer auf den verwendeten Detektionsstoff (DS) ansprechenden Detektionsmethode die in der lysierten und separierten Testsuspension (TL) freigegebene Menge an Detektions stoff (DS) in allen Schalenvolumina (SV) parallel erfasst wird und
einem Auswertungsschritt (ELA V), in dem anhand der detektierten Detektionsstoffmenge der zu testenden Substanz (TS) eine lytische Aktivität (LA) zugeordnet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 mit einem vereinfachten Präparationsschritt
(ELA I) mit einer Extraktion der zu testenden Substanz (TS) ohne Verwendung
organischer Lösungsmittel, insbesondere durch Sonizieren.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen hämolytischer Substanzen
mit einer Erythrozyten-Suspension (ES) als Testsuspension (TL) und einer
photometrischen Detektion von lytisch freigesetztem Hämoglobin als
Detektionsstoff (DS) durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von
414 nm.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zum Testen potenziell cytolytischer
Substanzen mit einer Liposomen-Suspension als Testsuspension (TL) und
einer photometrischen Detektion von lytisch beeinflusstem Fluoreszenz
farbstoff als Detektionsstoff (DS) durch Messung der Fluoreszenzemission.
5. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zum Testen von Substanzen
mit lytischer Wirkung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer
Mikrotiterplatte (MPC) als Matrixanordnung einer Vielzahl von Kegelvolumina
(CV) und einer Mikrotiterplatte (MPS) als Matrixanordnung einer Vielzahl von
Schalenvolumina (SV), die jeweils über eine Mehrkanalpipette (MP) mit der zu
testenden Substanz (TS) beladen werden.
6. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer
Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Frühwarn
system für das Auftreten ichthyotoxischer Algen.
7. Anwendung des Verfahrens zum Testen von Substanzen mit lytischer
Wirkung nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 4 als Screening
system für potenziell cytolytische Substanzen.
Priority Applications (3)
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ID=7659015
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