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Verfahren und Einrichtung für mikrobiologische Untersuchungen Die
Erfindung betrifft ein Verfahren, mit welchem das Wachstum mikrobiologischer Organismen
festgestellt werden kann, und ferner eine dafür verwendbare Einrichtung. Der Erfindung
liegt der Gedanke zugrunde, ein Verfahren und eine Einrichtung zu schaffen, um durch
Messung von Änderungen in der elektrischen Leitfähigkeit eines Nährmediums, in dem
derartige Organismen gezüchtet werden, die Organismen schnell wahrzunehmen und zu
identifizieren0
Auf vielen Gebieten ist es für die Analyse, Diagnose
und Behandlung äußerst wichtiò, daß das Auftreten, die Identität und das Ausmaß
der Verseuchung durch mikrobiologische Organismen in Proben festestellt werden kann,
die zOBo aus den Gebieten der Biologie, der Medizin, der Ernährungswissenschaft,
der Bodenkunde, der iAbwasser-Kunde uswO stammen, Gutebestimmungen für Lebensmittel,
die Überwachung von Ab wasser-Behandlung, medizinische Diagnose und Behandlung,
die Erzeugung vieler Arten von Pharmazeutika und dergleichen hängen alle ab von
der Identifizierung und quantitativen Bestimmung mikrobiologischer Komponenten,
die in dem zu untersuchenden System vorhanden sind.
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tur derartige Bestimmungen sind bislang längere Züchtungsperioden
der Muster in verschiedenen Nährmitteln oder -lösungen erforderlich gewesen, um
ein ausreichendes Wachstum zu erzielen und die verschiedenen Gruppen von Kolonien,
die sich aus dem ursprünglichen Muster gebildet haben, durch genaue Betrachtung
zählen zu können0 Es muß durchaus damit gerechnet werden, daß Tage vergehen, bis
das Wachstum für eine zuverlässige Zählung und Identifizierung der Mikrobenmuster
ausreicht, In einigen Fällen werden für die Züchtung der Muster eine oder mehrere
Wochen benötigt, um eine zuverlässige Identifizierung und quantitative Analyse zu
ermöglichen.
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Die Langsamkeit der bekannten Verfahren iJ sah kostspielig und erfordert
auch insofern einen beträchtlichen Zeit aufwand, da für die Sichtverfahren ziemlich
große und umfangreiche Züchtungsflächen benötigt werden. Außerdem ist es meistens
erforderlich, eine Reihe von Kulturen in dem Zählapparat zu bearbeiten0 Wichtiger
ist vielleicht jedoch noch für den Fall der medizinischen Diagnose, daß durch der-Artig
lange Wartezeiten der Arzt gezwunden sein kann, eine Behandlung ohne zuverlässige
Betätigung der Identität der störenden Organismen zu beginnen. Es kommt durchaus
vor, daß eine verkehrte Medizin, z.B. ein Antibiotikum, gewählt wird, die bzw. das
sich dann als unwirksam erweist, während der Zustand des Patienten sich weiter verschlechtert.
Meistens dauert es Tage, bis aufgrund der gegenwärtigen Labor-Verfahren eine korrekte
Identifizierung erreicht wird0 Erfindungsgemäß wird eine Einrichtung geschaffen,
in der das Wachstum von Mikroorganismen in einem Nährmedium einige Stunden nach
dem Einbringen der Organismen feststellbar ist0 Außerdem können mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren die Mikroorganismen nach ihrer Art, antibiotischen Empfindlichkeit und
Konzentration in dem anfänglichen Muster identifiziert werden, und zwar wenige Stunden
nach Einleitung des Verfahrens.
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i>ie Mikroorganismen können nacJI der Erfindung nicht nur
wahrgenommen,
identifiziert und charakterisiert werden, sondern dieses Ziel wird unter Verwendung
sehr geringer Mengen von Nährmedium und einer einfach zu betätigenden Einrichtung
erreicht. Gegenüber bekannten Verfahren sind auch die räumlichen Anforderungen zur
Prüfung und Identifizierung vieler verschiedener Proben von Mikroorganismen erheblich
verringert.
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Erfindungsgemäß wird das Wachstum mikrobiologischer Organismen sehr
schnell dadurch bestimmt, daß Änderung in der elektrischen Leitfähigkeit in abgedichteten
Zellen gemessen werden, die ausgewählte Arten von K)hrmedien enthalten, die mit
einer Probe gemmpft worden sind, welche die vermutete, zu untersuchende Mikroben
enthält. Die Messung und Auswahl der Nährmedien ermöglicht, daX Vorhandensein, die
Art, die antibiotische Empfindlichkeit und die Quantität der Bakterien oder anderen
Mikroorganismen u bestimmen, die in irgendeiner ausgewJhlten Probe vorhanden sind0
Mehrere Arten von Züchtungs- und Leitfähigkeitszellen sind vorgesehen, um die Änderung
in der elektrischen Leitfähigkeit zu messen.
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Im einzelnen sind abgedichtete, sterile, Nährmedium enthaltende Zellen
vorgesehen, in die die zu untersuchenden Proben z.B. durch Impfung eingebracht werden.
Die geimpften Zellen werden gebrätet und gleichzeitig wird die elektrische beitfähigkeit
der darin enthaltenen Nährmedien überwacht. Änderungen in der Leitfähigkeit werden
aufgezechnet. Durch
Vergleich mit gleichen Zellen, die vorher mit
Kulturen bekannter Mikroorganismen geimpft werden sind und deren Leitfähigkeitsänderung
in Bezug auf die relative Konzentration der ursprufunglichen eingefuhrten Mikroorganismen
bekannt ist, kann die Konzentration der mit der zu untersuchenden Probe eingebrachten
Mikroorganismen berechnet werden, Durch die Impfung einer Reihe von Zellen, die
vorher mit verschiedenen Mischungen von wachstumverhindernden Materialien gefüllt
worden sind, können die Mikroorganismen der zu untersuchenden Probe nach ihrer Art
und antibiotischen Empfindlichkeit identifiziert werden indem in den Zellen eine
fehlende Änderung in der elektrischen Leitfähigkeit, oder bei Wachstum der Organismen
das Ausmaß der Änderung in der Leitfähigkeit festgestellt wird0 Derartige Verfahren
zur Identifizierung und quantitativen Analyse werden nachstehend ausführlich erläutert.
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Die Erfindung ermöglicht demnach, Mikroorganismen innerhalb wesentlich
kürzerer beit zu iden-tifizieren, als mit bekannte ten Verfahren möglich.
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Kit der Erfindun, wird ein Verfahren geschaffen, mit welchem Mikroorganismen
nach ihrer Art und Menge innerhalb weniger Stunden identifiziert werden können,
im Gegensatz zu den Tagen odvr sogar Jochen, die bekannte Verfahren
benötigen.
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Nach der Erfindung werden besondere, neuartige Quellen geschaffen,
welche für die Züchtun von Mikroorganismen benutzt werden und die gleichzeitig mit
Mitteln ausgestattet sind, um änderungen der elektrischen Leitfähigkeit in diesen
Fällen zu beobachten und zu messen, Weitere Vorzüge und Merkmale der Erfindung ergeben
sich aus den Ansprüchen sowie aus der nachfolgenden Beschreibung und den Zeicnnungen,
in denen die Erfindung ausführlich erläutert und dargestellt ist0 Es zeigen : Fig.
1 schaubildlich und teilweise aufgeschnitten eine einzelne erfindungsgemäße Züchtungs-
und Leitfähigkeitszelle Fig. 2 vereinfacht eine Reihe von Zellen nach Fig. 1, die
in einem Brutataarat angeordnet und mit elektrischen Anschlussen zur Übertragung
von Änderungen in der Leitfähigkeit verbunden sind, Figo 3 ein Schaltbild einer
elektrischen Einrichtung zur Wahrnehmung und Aufzeichnung von Änderungen in der
elektrischen Leitfähigkeit der erfindungsgemäßen Zellen Fig. 4 ein Diagramm zur
Veranschaulichung der zeitlichen Änderung der Leitfähigkeit bei Züchtung der Mikroorganismen
Proteus, Aerobacter,
Pseudomonas und Eo Coli in einem 1%igen Pepton-Dextrose-Nährmedium,
Fig. 5 ein Diagramm zur Veranschaulichung der zeitlichen Änderung der Leitfähigkeit
bei Züchtung des Mikroorganismus Prot eus in verschiedenen Nährmedien, t . 6 - 10
schematische Darstellungen der Verteilung von sechzehn verschiedenen Antiseren in
vier Leitfähigkeitszellen zur Identifizierun eines bestimmen Mikroorganismus, 11
eine Ansicht eines senkrechten Schnittes durch eine abgewandelte Form einer Leitfähigkeitezelle
und Fig. 12 eine Draufsicht auf eine abgewandelte Form einer Leiterfähigkeitszelle
bei abgenommenem Oberteil, Fur das Wachstum nehmen alle lebenden Organismen nährstoffe
auf und scheiden Abfallprodukte aus0 dieser Vorgang ist allgemein als metabolischer
Prozeß bekannt. Mikroorganismen unterscheiden sich in dieser Hinsicht nicht von
anderen Formen des Lebens; des Mikroorganismus erreicht ein Wachstum dadurch, daß
eine fest umrissene Art von Nährstoff aufgenommen und eine gleichfalls fest umrissene
Art von Abfallstoffen ausgescheiden wird.
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Die Nährstoffe sind gewöhnlich ziemlich komplexe organische j4olekule,
wie Proteine, Kohlenwasserstoffe, Aminosäuren, Fette und dergleichen0 Die Abfallstoffe
sind jedoch beträchtlich einfachere Molekule, von denen eine große Anzahl mobile
lonenarten bildet, Diese ionisierten Abfallstoffe ändern die elektrische Leitfähigkeit
der Medien, in die hinein sie abgeweben werden0 Daher ändert sich die elektrische
Leitfähigkeit der Nährmedien mit dem darin stattfindenden Wachstum der Mikroorganismen
und der darauf beruhenden Abgaben von ionisierten Abfallstoffen in das Medium, Der
Uberschuß an ionisierten Abfallstoffen ist natürlich unmittel-bar abhängig von dem
Ausmaß des Wachstums und der damit zusammenhängenden metabolischen Aktivität der
Organismen0 Für irgendeine gegebene Art führt ein größeres oder schnelleres Wachstum
zu einer größeren oder schnelleren Zunahme in den ionisierten Abfallstoffen und
damit zu einer größeren oder schnelleren Änderung in der elektrischen Leitfähigkeit
der Medien, Der Anteil der ionisierten Abfallstoffe und ihre relativen Unterschiede
in der elektrischen Mobilität sind auch kennzeichnend für irgendeine besondere Art
von Organismus0 Zwei verschiedene Organismen, die gleiche Wachstumsraten haben,
geben an die Trägermedien verschiedene Nettomengen an ionisierten Teilchen ab die
unterschiedliche Mobilitätseigen schaften haben. Daher ändert irgendein wachsender
Mikroorganismus
die elektrische Leitfähigkeit des Mediums, in
welchem der Organismus wächst, gemäß seiner Wachstumsrate und der Ionenmischungscharakteristik
der Abfallstoffe dieser betreffende Organisumsart.
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Für Zwecke der Erfindung werden Standard-Nährmedien modifiziert, um
die Leitfähigkeitsänderungen auf Höchstwerte zu bringen. Dabei mussen zwei Faktoren
beachtet werden, nämlich die Salzkonzentration und die Pufferkapazität. Die Salzkonzentration
wird so niedrig wie möglich eingestellt, soll jedoch noch ein utes Wachstum der
Ilikroorganismen ermöglichen0 Eine niedrige Salzkonzentration sorgt für eine geringe
Leitfähigkeit des Nährmediums und damit für eine größere antsilsmäßige Änderung
der Lösungsleitfähigkeit bei dem Wachstum der Organismen. Eine niedrige Pufferkapazität
ermöglicht große pH-Änderungen in dem Medium während des Wachstums und gringt die
Leitfähigkeitsänderungen, welche die pH-Änderungen begleiten, auf einen Höchstwert,
Erfindungsgemäß werden diese Zusammenhänge ausgenutzt, um besondere Mikroorganismen
zu identifizieren und ihr nuantitatives Auftreten in irgendeiner mit den Organismen
verseuchten Quelle zu bestimmen. Im einzelnen werden vorbereitete Leitfähigkeitszellen,
die Nährmedium enthalten, mit Mikroorganismen geimpft und die Änderung in der Leitfähigkeit
dieser Zellen aufgezeichnet. Die Leitfähigkeitsänderung wird
mit
nicht verseuchten Bezugszellen verglichen, die die gleichen Nährmedien enthalten,
und dient zur Bestimmung der Art der Mikroorganismen und dem Gehalt der Ausgangsproben
an diesen Organismen. Die Änderung in der Leitfähig keit der Zelle ist derart, daß
der Mikroorganismus innerhalb einer Zeit von mehreren Stunden festgestellt und identifiziert
werden kann0 Nachfolgend wird die Erfindung ausführlich erläutert, Fig. 1 zeit eine
Leitfähigkeitszelle 10, die allgemein würfelförmig gebaut ist0 Die Zelle 10 ist
innen hohl und hat mit einem Boden 12 zusammenhängende Seitenwände 11. Ein Deckel
13 ist auf dej Grundteil durch geeigneten Klebstoff befestigt. Falls die Zelle aus
einem thermoplastischen Material hergestellt ist, kann er Deckel 13 auf dem Bodenteil
durch Anwendung von sitze abgedichtet befestigt ein, Der deckel 13 ist it einer
Mittelöffnung 14 versehen, die ihrerseits mit eine Stopfen 16 aus einem gummiartigen
oder ähnlich elas-tischen Material verschlossen ist0 In der Unteren Hälfte der Zelle
10 sind fest zwei Elektroden 17 abgedichtet angeordnet0 Diese Elektroden 17 liegen
auf gegenüberliegenden Seiten der Z-elle 10 und sind ferner mit elektrischen Kontakten
18 versehen, die an den Elektroden befestigt sind Die Kontakte 18 gehen gut abgedichtet
durch die Seitenwand
11 der Zelle 10 hindurch und springen an
der Außensei-tz in der dargestellten Weise vor, Die Elektroden 17 sind vorzugsweise
aus einem chemisch inerten, metallisch leitenden Material, wie rostfreiem Stahl,
hergestellt0 Die Zelle 10 einschlieílich des Bodens 12, den Wänden 11 und dem Deckel
13, wird vorzugsweise aus einem inerten, sterilisierbaren Kunststoff, wie Polyäthylen,
Polystyrol, Polypropylen oder dergleichen, hergestellt. Der Grundteil kann in der
Weise hergestellt sein, daß er mit den abgedichtet angeordneten Elektroden Geformt
wird0 Der Deckel 13 kann, wie oben beschrieben, darauf abgedichtet befestigt werden0
Die Zelle wird vor der Verwendung sterilisiert, und der Innenraum wird etwa zur
Hälfte mit einem sterilen Nänrmedium 19 gefüllt. Die Selle wird dann mit dem Stopfen
16 abgedichtet versonlossen und ist danach zur Verwendung bereito Falls die Zelle
10 in großen Mengen hergestellt wird, kann das in einer fortlaufenden Reihe von
Schritten unter sterilen Bedingungen geschehen, wobei die Zellen hergestellt, mit
ausgewählten Nährmedien gefüllt, mit Stopfen versehen und in sterilen Packungen
eingesiegelt werden0 Der Benutzer braucht nur die mit den gewünschten Nährstoffen
gefüllten Zellen zu wählen, um seine Untersuchungen auszuführen0
Eine
oder mehrere Zellen mit ausgewählten Nährmedien darin werden dadurch beimpft, daß
die Probe mittels einer Spritze durch den Stopfen 13 in das Nährmedium 19 eingebracht
wird.
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Die Beimpfte Zelle wird rlann in einen Brutschrank 21 gesetzt, zusammen
mit irgendwelchen anderen benötigten Zellen 10. Von eilen Zellen 10 sind die Kontakte
18 in elektrische Verbinder 22 eingesetzt, die im Brutschrank 21 vorgesehen sind0
Mehradrige Kabel 23 schließen die Verbindungsstücke23 und damit die darin eingestöpselten
ellen 10 an einen Prüf- und Untersuchungsschaltkreis 24, siehe Fig. 3, an.
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Die Untersuchungsschaltung 24 weist eine nach dem Nullverfahren arbeitende
'Jtrombrückenschaltung 26 auf, die einer Wheatstonschen Brücke entspricht, wobei
ein Arm der Brücke die beimpfte Zelle 10 und ein zweiter Arm eine Bezugszelle 10'
enthält, die mit der Zelle 10 im Bau und Inhalt an Nährmedium identisch ist, jedoch
nicht mit den unbekannten Mikroorganismen beimpft wird0 Ein dritter Arm der Brücke
enthält einen festen Widerstand 27, der irgendeinen entsprechenden Wert hat, z.B.
10 000 Ohm0 Der vierte Arm des Brückenkreises 26 enthält einen Dekaden-Präzis ionswiderstandskast
en Der gesamte Brückenkreis 26 ist an die Ausgangsanschlüsse 31 einer Schaltungsvorrichtung
29 angeschlossen, die einen Wechselstromsignalgenerator zur Speisung des Brückenkreises
26
und einen Synchrondetektor enthält. Die Null-Anschlüsse des
Brückenkreises 26 sind an die Signaleingänge 32 des Synchrindetektors 29 angeschlossen.
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Für die Erfindung verwendbare Geräte, die als Signalquelle und Synchrondetektor
dienen, sind im Handel erhältlich. Ein brauchbares Gerät ist zOBo der "Lock-In Amplifier",
Model J3-4, der Princeton Applied Research, IncO din derartiges Gerat liefert ein
Wechselstromsignal, das an o£ie Signalquellenanschlüsse 31 den Brückenschaltung
26 angelegt wird, und ermöglicht eine Anzeige der Amplitude des Wechselstromsignales,
das über den Null-Anschlussen des Bruckenkreises erzeugt wird0 Bei Benutzung wird
die Leitfähigkeit oder einfacher ihr invers es, der Widerstand, der beimpften Zelle
10 in der folgenden Weise gemessen: Die Zelle 10 und die Bezugszelle 10' werden
in den Brutschrank 21 gesetzt, wobei ihre Kontakte 18 in die Verbindungsteile 22
eingeführt werden. Die ausgewählten Zellen werden dann elektrisch in den Bruckenkreis
26 durch Wahl mittels nicht dargestellter Drehschalter eingeschaltet. Sodann wird
das Wechselstromsignal vom Generator 29 auf die Zellen gegeben und der Dekaden-Kasten
28 ingestellt, bis die Ablesung am Synchrondetektor 29 t\ll zeigt, und der Bruckenkreis
26 dann ausgeglichen ist. Das Widerstandsverhältnis der beimpften Zelle 10 zur Bezugszelle
10' entspri
dem Verhältnis des festen Widerstandes 27 zum Widerstand
des Dekaden-Kastens 28.
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Aufgrund dieser Schaltung kann der Widerstand und damit die Leitfähigkeit
der Zelle 1C mit einer Genauigkeit von etwa 1 : 10 000 oder 1 : 1 000 000 festgestellt
werden. Diese Empfindlichkeit ist gut ausreichend, um schnell das Wachstum der Mikroorganismen
in den bekannten Nährmedien festzustellen.
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Nachdem die Leitfähigkeit der beimpften Zelle 10 festgestellt worden
ist, werden andere Brutzellen 10 in gleicher eise gemessen und die Ergebnisse aufgezeichnet0
Die Leitfähigkeit der beimpften Zellen wird damit über irgendeine gewünschte Zeitspanne
hinweg überwacht. Ein Diagramm der zeitlichen Änderung der Leitfähigkeit ergibt
eine Kurve, die kennzeichnend für eine besondere Art von Mikroorganismus in dem
oder den betreffenden Medien ist0 Aus den Daten, die von den zeitlichen Wachstum
und der Leitfähigkeit abhängen, können die Identität und Menge irgendeines Mikroorganismus
innerhalb sehr weniger Stunden leicht ermittelt werden.
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In wig. 4 sind Kurven, die den Widerstand in Abhängigkeit von der
Zeit zeigen, für eine Anzahl verschiedener Mikroorganismen
dargestellt,
doe in gleichen Nährmedien Bereichtet worden sind0 In, einzelnen sind die Arten
Pseudomonas, E. Coli, Proteus und Aerobacter alle in einem Nährmedium gezüchtet
worden, das 1% Pepton und 1% Dextrose enthält und unter dem Namen "Difco" bekannt
ist. Während 300 Minuten nach der Zellbeimpfung wurden die da gestellten Kurven
durch den Detektorkreis 24 aufgenommen und die dargestellten Widerstandsänderungen
aufgezeichnet.
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Für Pseudomonas blieb der Zellwiderstand praktisch unverändert: der
Anfangswiderstand betrug etwa 10 300 Ohm und Ohm nahm geringfugig auf etwa 10 050/
nach einer Brutzeit von 300 Minuten abO Dagegen zeigte die mit Proteus geimpfte
Zelle einen anfä.nglichen widerstand von etwa 10 300 Ohm, der auf einen Schlußwiderstand
von etwa 9000 Ohm nach 300 inuten abnahm.
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Die Aerobacter enthaltende Zelle hatte einen Anfangswiderstand von
etwa 10 300 Ohm und nach etwa 300 minuten Brutzeit einen Widerstand von etwa 8550
Ohm.
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Verschiedene Arten zeigen demnach verschiedene Leitfähigkeitskurven
bei Züchtung in gleichen Nährmedien und gleichen Leitfähigkeitszellen. Wie außerdem
Fig. 5 zeigt, liefert eine bestimmte Mikroorganismenart verschiedene Leitfähigkeitsänderungen
bei Zuchtung in verschiedenen Medien. Diese
Erscheinung kann auch
benutzt werden, um eine bestimmte unbekannte Art von Mikroorganismus zu charakterisieren0
Zur Aufzeichnung der Kurven nach Fig. 5 wurden Mikroorganismen der Art Proteus in
verschiedenen Nährmedien gezüchtet, die jeweils in Zellen 10 eingeschlossen waren.
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Wenn in einem zitronensauren Medium mit Pufer und Salz bei Verdünnung
auf 20% eines Standard-Koser-Mediums gebrütet wurde, zeigte die Zelle nacn 30 Minuten
einen Widerstand von 10 300 Ohm. Nacn 450 Minuten Brütung zeigte der schließliche
Widerstand der Zelle nur eine unbedeutende Änderung auf 10 330 Ohm. Andererseits
wurde in einem Harnstoff-Nährmedium gebrütet, mit 20 g/l Harnstoff, 1,82 g/l saures
Kaliumphosphat, 1,9 g/l Dinatriumphosphat, 0,02 g/l Hefeextrakt und 0,002 g/l Phenol-Rot.
Es wurde dreißig Minuten in einer gleichen Zelle Bebrütet, die anfangs einen Widerstand
von 10 300 Ohm zeigte, der nach 375 Minuten auf 8610 Ohm fiel.
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Bei Züchtung in einem Standard-Methylrot-Voges-Proskauer-Medium erzeugte
Proteus nach dreißig Minuten einen Widerstand von 10 300 Ohm, der nach 450 Minuten
auf 9990 Ohm fiel, Bei Züchtung in einem Lactose-Nährmedium (1% Lactose, 1?'o Difco-Pepton)
erzeugte Proteus einen Widerstand von 10 300 Ohm nach dreißig Minuten und 9920 Ohm
nach 450 Minuten.
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Ein Vergleich einer Gruppe von Widerstandskurven, die mit einer unbekannten
Art von Mikroorganismen aufgenommen worden ist, die in einer Reihe von Nährmedien
gezüchtet worden sind, mit Kurven für eine bekannte Art in identischen Nährmedien
ermöglicht demnach die Feststellung, unn welche Art es sich handelt, da die Reihen
von Widerstandskurven kennzeichnend für die betreffenden Arten sind, Als Beispiel
für die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Zellen wurden Leitfähigkeitszellen
mit E; Coli geimpft, und zwar wurden 350, 3500 und 35 000 Bakterien B. Coli in Leitfähigkeitszellen
eingebracht0 Dabei traten kennzeichnende änderungen in der Leitfähigkeit bei der
geringsten Kon zentration in 340 Minuten, bei der Konzentration von 3500 in 240
minuten und bei der höchsten Konzentration in 175 Minuten auf.
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Diese Ergebnisse zeigen, dalj etwa 65 - 100 Minuten erforderlich sind,
um ein Zehnfaches Anwachsen in der Anzahl der B-akterien zu erzeugen, Das entspricht
einer Generationszeit von etwa zwanzig bis dreißig minuten in Ubereinstimmung mit
anderen Messungen der Generationszeit für Bakterien E0 Coli, Diese Ergebnisse zeigen
auch, daß Bakterien in weniger als 600 Minuten festgestellt werden können0 Daher
würde es bei Blutkulturen und ulturen von Rückenhamrkslüssigkeit weniger als zehn
Stunden dauern, um durch Leitfähit;rkeitsmessung
das wachstum von
Mikroorganismen festzustellen0 Demgegenüber benötigen bekannte Verfahren fünf bis
fünf zehn Tage.
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Für einen wirksamen Einsatz der Erfindung zu klinischen Arbeiten ist
eine große Anzanl von Zellen erforderlich, die viele verschiedene Züchtungsmedien
enthaltene Weiter ist für einen wirksamen Einsatz erforderlich, daß in einem kontinuierlichen
Zyklus der Zell-Beimpfung, Brütung und Leitfähigkeitsmessung gearbeitet wird0 Zu
diesem Zweck können die Bruteinrichtungen Gruppen von übereinander gestapelten Zellen
enthalten, Ferner können die Zellen 10 auf Trägern zu etwa 50 Zellen nebeneinander
angeordnet werden, wobei jede in der Halterung stehende Zelle in einen Anschluß
eingestöpselt ist, der in einem zentralen Kern angeordnet ist0 Die Bruteinrichtung
kann nach dem Typ "Faule Susanne" gebaut sein, so daß sechs oder acht Halterungen
mit jeweils etwa fünfzig Zellen auf jedem Niveau in die Anschlüsse eingestöpselt
werden können.
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Die Charakterisierung und Identifizierung eines zu untersuchenden
Mikroorganismus kann auch erfordern, daii nicht nur das Wachstum in verschiedenen
Nährmedien in der oben beschriebenen Weise untersucht wird, sondern auch, ob bestimmte
Antiseren das Wachstum des betreffenden Mikroorganismus verhindern oder unterstützen4
Im
einzelnen werden kleine Nengen eines spezifischen ntiserums einem kräftigen Nährmedium
zugesetzt 5 das bei einer großen Anzahl verschiedener Mikroorganismus-Arten ein
gutes Wachstum gewährleistet0 Ein solches Medium ist eine Tryptic-Soja-Brühe. Z-ellen
mit diesem Nährmedium wird eine große Anzanl von Antiseren zugesetzt, von denen
jedes das Wachstum nur einer bestimmten Mikroorganismus-Art verhindert, gegen die
das Antiserum gerichtet ist. mit ergibt sich ein sehr wirkungsvolles Werkzeug zur
Unterscheidung und Identifizierung eines unbekannten Mikroorganismus.
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Z.B. kann mit sechzehn spezifischen Antiseren gearbeitet werden, von
denen jedes gegen eine besondere Mikroorganismus-Art gerichtet ist, zOSO Aerobacter,
Proteus uswO, und von denen wenigstens eines spezifisch gegen den zu untersuchenden
Organismus wirkt, Es ist dann möglich, diesen Organismus zu charakterisieren, indem
aie Antiseren nur vier Leitfähigkeitszellen entsprechend dem Schema zugesetzt werden,
das in den Fig. 6 - 10 dargestellt ist.
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In Fig. 6 sind die Antiseren mit 0 - 15 benummertO Einer ersten Zelle,
die Nährmedium enthält, werden kleine Mengen der Antiseren 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 und
7, siehe Fig. 7, zugesetzt, Einer zweiten Zelle werden Antiseren 0, 1, 4, 5, 8,
9, 12 und 13, siehe Fig. 8, zugesetzt Einer dritten Zelle werden die Antiseren G,
1, 2, 3, 8, 3, 10 und 11, siehe Fig. 9,
und einer vierten zelle
die Antiseren 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14, siehe Fig. 10, zugesetzt.
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Alle vier Zellen werden dann mit dem unbekannten Mikroorganismus beimpft
und danach gebrütet und in der vorbeschriebenen Weise gemessen. Falls in der Zelle
Nr. 1 ein Wachstum auftritt, wie durch eine Änderung der Leitfähigkeit mit der Zeit
angezeigt wird, viird der ürgailismus nicht durch die ontiseren 0, 1, 2, , 4, 5,
6 und 7 gestört. Falls Wachstum in er alle NrO 2 auftritt, wird durch die Antiseren
0, 1, 2, 3, 8, 9, 10 oder 11 ein Wachstum des Organismus nicht verhindert usw.
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Dem in einer Zelle eintretenden Wachstum wird die Ziff. 1 und einem
nicht eintretenden Wachstum die Ziff. O zugeordnet.
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Das Ergebnis aus llen vier Zellen kann daher in einer dharakterisitischen
binären Zahl zusammengefaßt werden, wobei 1111 ein Wachstum in allen vier Zellen,
1010 ein Wachstum in den Zellen 1 und 3 und Nicht eintreten des Wachstums in den
Zellen 2 und 4, 1110 ein Wachstum in den Zellen 1, 2 und 3, aber nicht in der Zelle
4, usw., bedeuten, Eine Prüfung zeigt, daß die Zahl, welche Wachstum oder Nichteintreten
des Wachstums fur die Gruppe von Zellen anzeigt, eine binäre Zahl ist, deren Wert
der Zahl entspricht9 die einem bestimmten Antiserum zugeordnet ist. Z.B. bedeutet
die binärzahl 1111 in Dezimalchreibweise 15, und 0101 in
Binärschreibweise
entspricht 5 in Dezimalschreibweise.
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Diese Antiserum-Zahlen entsprechen der Organismus-Art, jeweils besonders
durch das betreffende Cnti-erum im Wachstum gehindert wird. Bei Anwendung dieses
Verfahrens können zOBo 64 Antiseren durch Benutzung von sechs Zellen geprüft werden,
uswO Die Fig. 11 und 12 zeigen eine weitere Ausführungsform einer Leitfähigkeitszelle
nacn der Erfindun;0 Diese Zellen sind mit gedruckten ßchaltteilen versehen und können
in großen Mengen mit großer Geschwindigkeit und sehr niedrigen Kosten hergestellt
werden Trotz ihres äußerst einfachen Baus können derartige Zellen zur ermittlung
von Leitfähigkeitsdaten in derselben Weise wie die Zellen 10 verwendet werden0 Die
mit gedruckten Schaltungsteilen versehenen Zellen, siehe Fig, 11 und 12, weisen
eine dünne Kunsts-toff-Grundt?la-tte oder -folie 41 aus Mylar oder Polyester auf,
auf die elektrisch leitende Abschnitte 42 eines Metalls, z.B. Aluminium, aufgedruckt
sind. Jeder leitende Abschnitt 42 ist mit einem Leitungsstück 43 aus dem gleichen
Metall versehen, das ebenfalls auf die Kunststoff-Grundplatte 41 aufgedruckt ist.
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Jedes Leitungsstück 43 erstreckt sich bis zur Kante der Grundplatte
41 und ist dort in Verbindung mit elektrischen Anschlußstiften 44, die an der Kante
der Grundplatte 41 befestigt sind0
Eine Abstandplatte 46 aus Kunststoff,
o3o aus dem gleichen Material die die Platte 41, ist auf diese aufgesetzt0 Die Abstandplatte
46 ist Illit Aussc ni-tten versehen, welche den Metallabschnitten 42 entsprechen,
so daß jeder Abschnitt 42 nach oben frei liegt, jedoch von seinen Nachbarabschnitten
isoliert ist0 Die Abschnitte 42 werden mit Nähmedium 47 in einem halbfesten Zustand
beschichtet. Die Nährstoffbeschichtung ist im Volumen ausreichend, um die gesamte
Zelle zu füllen, die von dem Metallgrundabschnitt 42 und der Abstandsplatte 46 begrenzt
wird0 Jede Zelle kann mit dem denselben oder mit anderen Nährmedien gefullt werden,
ge nach zrfordernisQ Daher können spezifische Inhibitoren, Wachstumfaktoren oder
Antibiotika in irgendeiner gewünschten Anordnung in dem Zellmedium mit untergebracht
werden0 Die Zellen werden niit einer Deckplatte oder -folie 48 aus den gleichen
Kunststoffmaterial verschlossen. Die Deckplatte 48 ist an ihrer gesamten Unterfläche
mit einem elektrisch leitenden Material 49, zOBo Aluminium bedruckt, das eine gemeinsame
Elektrode für alle Zellen auf der Platte 41 bildet. Ein geeigneter, nicht dargestellter
elektrischer Anschlußstift ist für die obere Elektrode 49 an einer Kante der Platte
48 vorgesehen.
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Die Plattenzellen sind alle unter aseptischen Bedingungen hergestellt
und werden bis zu ihrer Verwendung abgedichtet gehalten.
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Zur Benutzung wird die Deckschicht 48 unter aseptischen Bedingungen
abgezogen. Ein dunner Film 51 einer den vermuteten Mikroorganismus enthaltendene
Flüssigkeit wird dann auf die Oberseite alle freiliegenden Nähmedien 47 der gesamten
Platte aufgesprüht oder aufgerollt.
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Nachdem die den zu untersuchenden Mikroorganismus enthaltende Flüssigkeit
von den Nährmedien aufgenommen worden ist, ird die obere Platte oder -folie 4a wieder
uf der den platte 41 angeordnet. Derart werden Miniatur-Leitfähigkeitszellen gebildet,
die jeweils aus Boden-Folie 41, Elektrode 42, Nährmedium 47, verseuchter Flüssigkeit
51, oberer Elektrode 49 und oberer Folie 48 bestehen.
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Die Anschlußstifte 44 und der obere Anschlußstift für die gemeinsame
Elektrode werden dann an den vorbeschriebenen Leitfähigkeitsmeßkreis angeschlossen,
während die gesamte Folienanordnung in einem Brüter auf konstanter Temperatur gehalten
wird. Sodann werden in der vorbeschriebenen Weise Leitfähigkeitsmessungen ausgeführt.
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Z.B. können die mit gedruckten Schaltungsteilen ausgefuhrten Zellen
eine 0,125 mm dicke Bodenfolie 41 aufweisen, wobei
die Abstandsfolie
und das Nährmedium in den Zellen etwa 0,2 mm dick ist0 Das Volumen des Nährmediums
in jeder Zelle beträgt etwa 0,2 mlO Eine Folie dieser Art von etwa 21,5 cm Breite
und 23 cm Länge enthalt etwa 50 Zellen0 Jede Zelle nimmt etwa 0,05 ml der aie Mikroorganismen
enthaltenden Flüssigkeit auf.
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- PATENTANSPRÜCHE -