DE60304815T2

DE60304815T2 - Zellkulturverfahren

Info

Publication number: DE60304815T2
Application number: DE60304815T
Authority: DE
Inventors: Hikaru Higashimurayama-shi INOUE; Hiroyuki Akishima-shi IRIE; Hiroki Hachioji-shi Hibino; Hideki Hachioji-shi KOYANAGI
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2002-06-17
Filing date: 2003-06-10
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2023-06-11
Also published as: JP2004016107A; CN1592790A; EP1443114A1; DE60304815D1; CN1325657C; AU2003242208A1; EP1443114B1; WO2003106700A1; EP1443114A4; US20050019912A1; JP4067880B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zellkultivierung, welches erlaubt, dass der Wachstumszustand von Transplantationszellen genau bestimmbar ist, ohne dass die Zellen direkt kontaktiert werden.
Stand der Technik
Der Knochen an Stellen von fehlenden Knochen aufgrund der Entfernung von Knochentumoren oder von Traumata wird zur Zeit dadurch ergänzt, dass der fehlende Knochen mit einem Knochenfüller ergänzt wird. Jedoch in Fällen von Osteoporose etc., wo der Knochen allmählich spröde wird, oder in Fällen, wo die Stelle des fehlenden Knochens einen großen Bereich einnimmt, ist es schwierig, dieses Problem mit den beschriebenen Verfahren zu lösen.
Daher wurde es in den letzten Jahren notwendig, ein neues Verfahren anzuwenden, bei dem Knochenmark eines Patienten entnommen wird, mesenchymale Stammzellen aus dem entnommenen Knochenmark künstlich in Osteoplasten differenziert werden und nachdem den Osteoplasten ein passendes Wachstum erlaubt wurde, sie wieder dem Patienten eingesetzt werden. Da in diesem Fall Osteoplasten aus Knochenmark gezüchtet werden, welches von dem Patienten selbst entnommen wurde, und diese nachfolgend in den gleichen Patienten zurückgebracht werden, lässt sich ein Knochenwachstum ohne eine Immunreaktion aktivieren.
Im Fall des künstlichen Züchtens von Osteoplasten auf oben beschriebene Weise ist es notwendig, genau bestimmen zu können, ob die Osteoplasten ein adäquates Wachstum erreicht haben oder nicht. Da die Osteoplasten letztendlich in den Körper des Patienten zurückgebracht werden, ist es wünschenswert, Kontakt mit den Zellen so weit wie möglich zu vermeiden. Da jedoch der Wachstumszustand von Osteoplasten typischerweise nicht visuell erfasst werden kann, muss ihr Wachstumszustand ermittelt werden, indem sie auf irgendeine Weise in Form einer Probe manipuliert werden.
Beschreibung der Erfindung
Unter Berücksichtigung der obigen Umstände ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Zellkultivierung zu schaffen, welches erlaubt, dass der Wachstumszustand von Transplantationszellen genau bestimmbar ist, ohne dass die Zellen direkt kontaktiert werden.
Zur Lösung der obigen Aufgabe schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Zellkultivierung zur Erzeugung von Transplantationszellen nach Anspruch 1. Das Verfahren weist auf: einen Schritt, in welchem Transplantationszellen und Untersuchungszellen unter identischen Bedingungen kultiviert werden; und einen Schritt, in welchem der Wachstumszustand der Transplantationszellen unter Verwendung der Untersuchungszellen bestimmt wird.
Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Zellkultivierung, welches weiterhin den Schritt aufweist, in welchem die Transplantationszellen und die Untersuchungszellen separat in einem Kulturgefäß aufgenommen sind, welches Unterteilungen hat, um eine Mehrzahl von Proben in dem gleichen Gefäß separat aufzunehmen.
Weiterhin schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Zellkultivierung, weiterhin mit einem Schritt, bei dem zu Beginn der Kultivierung die Anzahl von Zellen pro Einheitsvolumen der Transplantationszellen und der Untersuchungszellen größenordnungsmäßig gleich gemacht wird.
Da gemäß der vorliegenden Erfindung Transplantationszellen und Untersuchungszellen in einem isolierten Zustand kultiviert werden, können die Untersuchungszellen problemlos entnommen werden, ohne dass die Transplantationszellen kontaktiert werden, wenn die Untersuchungszellen aus einem Gefäß entnommen werden. Da weiterhin die Transplantationszellen und die Untersuchungszellen in dem gleichen Kulturgefäß aufgenommen sind, können die Transplantationszellen und die Untersuchungszellen konstant in der gleichen Umgebung durch Handhabung des besagten Kulturgefäßes gehalten werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 ist eine Darstellung, um eine einfache Erläuterung einer Zusammenfassung des Zellkultivierungssystems zu geben.
2 ist ein Flussdiagramm zur Erläuterung des Kultivierungsschritts, der in einem Kultivierungscenter 2 durchgeführt wird.
3 ist eine schematische Darstellung eines Kulturgefässes, wie es in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben wird.
Beste Art zur Durchführung der Erfindung
Nachfolgend erfolgt eine Erläuterung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung.
Zu Beginn erfolgt unter Bezugnahme auf 1 eine kurze Erläuterung einer Zusammenfassung des Zellkultivierungssystems, bei welchem das Zellkultivierungsverfahren gemäß der vorliegenden Ausführungsform angewendet wird.
In 1 wird Knochenmark, welches in einer Klinik 1 einem Patienten entnommen wurde, in einem bestimmten Transportgefäß aufgenommen und in ein Kultivierungs-Center 2 gebracht, um die Knochenkultur zu bilden. Weiterhin kann das Transportgefäß bei einer Temperatur von ungefähr 37°C, einer Temperatur von 4°C oder bei Gefriertemperatur gehalten werden.
Im Kultivierungs-Center 2 erfolgt eine Primärkultivierung, in der mesenchymale Stammzellen, welche in dem erhaltenen Knochenmark enthalten sind, kultiviert werden, eine sekundäre Kultivierung, in welcher eine Knochenkultur gebildet wird, indem die kultivierten mesenchymalen Zellen einem Nährmaterial hinzugefügt werden, welches als Gerüst bezeichnet wird, und Untersuchungen etc. zur Ermittlung, ob Bakterien und Pilze in dem Knochenmark, der Kulturflüssigkeit etc. enthalten sind, durchgeführt, letztendlich gefolgt durch Aufnahme der ausgebildeten Knochenkultur in einem bestimmten Transportgefäß und dem Transport zur Klinik 1. Weiterhin kann das Transportgefäß bei einer Temperatur von ungefähr 37°C, einer Temperatur von 4°C oder bei Gefriertemperatur gehalten werden.
Das in der Sekundärkultur verwendete Gerüst wird von einem Gerüstliefercenter 3 geliefert.
Nachfolgend erfolgt unter Bezugnahme auf 2 eine kurze Erläuterung des Kultivierungsschritts, der in dem Kultivierungs-Center 2 durchgeführt wird.
Zunächst wird Knochenmark, welches in der Klinik 1 einem Patienten entnommen wurde, dem Kultivierungs-Center 2 geliefert, wobei es in einem bestimmten Transportgefäß aufgenommen ist.
Im Kultivierungs-Center 2 wird ein Teil der Knochenmarkzellen, welche sich in dem Transportgefäß befinden, entnommen und untersucht, um zu bestimmen, ob Bakterien, Pilze oder dergleichen in dem entnommenen Knochenmark enthalten sind oder nicht (Schritt SP1).
Wenn keine Anormalitäten in den Untersuchungsergebnissen gefunden werden, wird das Knochenmark einem Kultivierungsschritt übertragen, um mesenchymale Stammzellen wachsen zu lassen, welche in der Knochenmarkflüssigkeit enthalten sind (Schritt SP2). Weiterhin wird der Kulturschritt zum Wachsenlassen der mesenchymalen Stammzellen als primäre Kultivierung bezeichnet. Bei dieser primären Kultivierung lässt man mesenchymale Stammzellen durch Hinzufügen von Knochenmark, welches im Schritt SP1 ähnlich untersucht worden ist, zu einem Medium wachsen, welches untersuchtes Serum enthält, von dem bestätigt wurde, dass es frei von Pilzen, Bakterien, Endotoxinen etc. ist (menschliches Serum oder Rinderserum wird in diesem Medium verwendet).
Wenn die mesenchymalen Stammzellen auf eine adäquate Menge herangewachsen sind, welche zur Bildung eines gezüchteten Knochens notwendig ist, werden sie als nächstes untersucht, um zu bestimmen, ob sie Pilze, Bakterien etc. enthalten oder nicht (Schritt SP3) und wenn es als Ergebnis dieser Untersuchung keine Probleme gibt, werden sie einer Sekundärkultivierung übertragen, um einen Zuchtknochen zu bilden (Schritt SP4).
In der Sekundärkultivierung werden die mesenchymalen Stammzellen, welche durch die Primärkultivierung herangewachsen sind, an ein Nährmaterial angeheftet, welches als Gerüst bezeichnet wird, wobei sie in Osteoplasten differenziert werden, um Knochengewebe (Zuchtknochen) zu bilden.
Dieses Gerüst ist ein Nährmaterial bestehend aus porösem Kalziumsphosphat in Form von β-TCP. Durch Anheften mesenchymaler Stammzellen an dieses Gerüst wird eine Differenzie rung mesenchymaler Stammzellen in Osteoplasten gefördert, was zu der Ausbildung von Knochengewebe führt. Weiterhin kann zu diesem Zeitpunkt ein Wachstumsförderer etc. hinzugefügt werden, um die Differenzierung in Osteoplasten weiter zu beschleunigen. Weiterhin kann ein Gerüst wie ein poröses Hydroxyapatit anstelle des genannten β-TCP verwendet werden.
Der auf diese Weise gebildete Zuchtknochen wird dann einem Schritt übertragen, in welchem Untersuchungen vor dem Transport durchgeführt werden, beispielsweise Untersuchungen, um zu bestimmen, ob der Zuchtknochen Viren, Mycoplasma, Pilze oder Bakterien etc. enthält oder nicht (Schritt SP5) und wenn es keine Anormalitäten gibt, wird der Zuchtknochen in ein bestimmtes Transportgefäß gebracht und in die Klinik 1 transportiert.
In der Klinik, welche den Zuchtknochen empfangen hat, erfolgt eine chirurgische Transplantation, um den Zuchtknochen zu einem bestimmten Operationsdatum in einen Patienten zu transplantieren.
Nachfolgend wird die oben erwähnte Sekundärkultivierung genauer beschrieben.
Zuerst werden bei der Sekundärkultivierung durch die Primärkultivierung herangezogene mesenchymale Stammzellen an ein Transplantationsgerüst und an ein Untersuchungsgerüst geheftet. In der folgenden Erläuterung werden an das Transplantations angeheftete Zellen als Transplantationszellen 200 bezeichnet, wohingegen an das Untersuchungsgerüst angeheftete Zellen als Untersuchungszellen 300 bezeichnet werden. Diese Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 werden unter identischen Bedingungen kultiviert. Gerüste gleicher Größe und Form werden als Transplantationsgerüst und Untersuchungsgerüst verwendet, an welche die Transplantationszellen 200 bzw. Untersuchungszellen 300 angeheftet werden, um die Zellen unter identischen Bedingungen zu züchten und die Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 werden in dem gleichen Thermo-Hygrostat unter Verwendung eines Mediums der gleichen Losnummer kultiviert. Weiterhin werden die Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 bevorzugt so eingestellt, dass die Anzahl von Zellen pro Einheitsvolumen größenordnungsmäßig gleich sind. Besonders bevorzugt werden die Transplantationszellen 200 und die Untersuchungszellen 300 auf 10⁶ bis 10⁷ Zellen/cm³ eingestellt.
Nachfolgend werden diese Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 jeweils in einem Kulturgefäß 100 gemäß 3 zusammen mit dem Transplantationsgerüst und dem Untersuchungsgerüst aufgenommen. Wie in 3 gezeigt, ist das Kulturgefäß 100 so aufgebaut, dass es Unterteilungen hat, um zu ermöglichen, dass eine Mehrzahl von Proben separat innerhalb des gleichen Gefäßes aufgenommen werden kann. Genauer gesagt, Proben werden in einer Mehrzahl von Löchern (Vertiefungen) aufgenommen, welche durch die Unterteilungen gebildet werden und die Transplantationsproben (welche Transplantationszellen 200 und das Transplantationsgerüst enthalten) und die Untersuchungsproben (welche die Untersuchungszellen 300 und das Untersuchungsgerüst enthalten) werden separat in diesen Löchern 101 aufgenommen. Zusätzlich ist dieses Kulturgefäß 100 bevorzugt so gestaltet, dass es in der Lage ist, ungefähr 3–50 Transplantationsproben und Untersuchungsproben aufzunehmen.
Das Kulturgefäß 100, in welchem die Transplantationszellen 200 (Transplantationsprobe) und die Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) aufgenommen sind, wird dann in einer Atmosphäre angeordnet, in welcher die Sekundärkultivierung durchzuführen ist, d.h. unter Bedingungen, welche zur Durchführung der Sekundärkultivierung geeignet sind. Beispielsweise wird das Kulturgefäß 100 in einer Atmosphäre angeordnet, in der die Temperatur bei 37 ± 0,5°C gehalten ist und die Kohlendioxidkonzentration auf 5 Volumenprozent gehalten ist. Im Ergebnis haften sich die mesenchymalen Stammzellen an die Gerüst-Phagocyten β-TCP und Differenzieren in Osteoplasten und Knochengewebe bildet sich in ungefähr 10 Tagen bis 2 Wochen nach Beginn der Sekundärkultivierung.
Nachfolgend werden Untersuchungszellen 300, welche in dem Kulturgefäß 100 enthalten sind (Untersuchungsprobe) entnommen, wenn ungefähr 2–30 Tage, bevorzugt 10 Tage, nach Beginn der Sekundärkultivierung vergangen sind. Der Wachstumszustand der Osteoplasten in diesen Untersuchungszellen 300 wird dann untersucht, um die Ausbildung von Knochengewebe zu bestätigen, was dann verwendet wird, die Ausbildung von Knochengewebe in den Transplantationszellen 200 zu ermitteln.
Beispielsweise sind die folgenden Bestimmungstechniken Beispiele von Techniken, mit denen die Ausbildung von Knochengeweben von Untersuchungszellen 300 während der oben erwähnten Sekundärkultivierung bestätigbar ist.
(1) Bestimmung basierend auf dem Aktivitätsgrad alkalischer Phosphatase.
Untersuchungszellen werden zerkleinert und der Aktivitätsgrad der alkalischen Phosphatase in den zerkleinerten Untersuchungszellen 300 wird gemessen. Da diese alkalische Phosphatase ein Bestandteil ist, der den Aktivitätsgrad der Osteoplasten angibt, macht die Messung des Aktivitätsgrades dieser alkalischen Phosphatase es möglich, den Wachstumszustand von Osteoplasten bei der Sekundärkultivierung zu bestimmen, so dass eine Bestätigung hinsichtlich der Ausbildung von Knochengewebe ermöglicht ist.
(2) Bestimmung unter Verwendung der Mikroskopie
(a) Bestimmung durch Bildverarbeitung unter Verwendung von Bildern, welche mit einem Konfokalmikroskop erhalten werden.
Bilder der Oberfläche des Untersuchungsgerüsts werden mit einem konfokalen Mikroskop erhalten und die Osteoplasten werden durch Bildverarbeitung entnommen. Der Wachstumszustand der Osteoplasten wird dann durch Untersuchen bestimmt, ob die Anzahl von entnommenen Zellen eine bestimmte Anzahl übersteigt oder nicht, um die Ausbildung von Knochengewebe zu bestätigen.
(b) Bestimmung unter Verwendung eines konfokalen Kugelstifttyp-Mikroskops.
Für den Fall, dass das verwendete Gerüst in seiner Mitte eine zylindrische Öffnung hat, wird ein konfokales Kugelschreibertyp-Mikroskop in die zylindrische Öffnung des Gerüsts eingeführt. Die Ausbildung von Knochengewebe wird dann durch Bestätigung des Vorhandenseins von Osteoplasten an der Oberfläche der Öffnung (im Inneren des Gerüsts) bestätigt.
(c) Bestimmung durch Fluoreszenzfärbung.
Nachdem Untersuchungszellen 200 zerkleinert wurden und die in den zerkleinerten Untersuchungszellen 300 enthaltenen Osteoplasten fluoreszenzgefärbt wurden, wird die sich ergebende Fluoreszenz gemessen. Das Ergebnis der Messung, nämlich der Wachstumszustand der Osteoplasten, entsprechend der Anzahl von fluoreszierend gefärbten Zellen, wird dann ermittelt, um die Ausbildung von Knochengewebe zu bestätigen. Die genannte Messung der Fluoreszenz kann durch Zählen der fluoreszierend gefärbten Osteoplasten unter Verwendung eines Mikroskops durchgeführt werden.
Wenn die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen in Osteoplasten und das Wachstum der Osteoplasten durch diese Bestimmungstechniken in den Untersuchungszellen 300 bestimmbar ist, wird beurteilt, dass die Ausbildung von Knochengewebe ausreichend fortgeschritten ist. Transplantationszellen 200 werden dann aus dem Kulturgefäß 100 entnommen und die Sekundärkultivierung wird abgeschlossen. Diese Transplantationszellen 200 werden dann in dem folgenden Schritt in Form eines Untersuchungsschritts gemäß 2 übertragen.
Andererseits, für den Fall, dass das Wachstum der Osteoplasten in den Untersuchungszellen 200 nicht adäquat ist, wird damit fortgefahren, die verbleibenden Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 im Kulturgefäß 100, in welchem die Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) enthalten sind, welche zur Bestimmung der Sekundärkultur verwendet werden, weiter zu kultivieren. Eine der Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) wird wieder aus dem Kulturgefäß 100 nach dem Verstreichen einiger Tage, bevorzugt ungefähr 3–7 Tage unter Berücksichtigung der Ausbildung von Knochengewebe entnommen und der Wachstumszustand der Osteoplasten in den entnommenen Untersuchungszellen 300 wird bestimmt.
Wenn das Wachstum von Osteoplasten bestätigt wird und die Ausbildung von Knochengewebe im Ergebnis adäquat ist, werden Untersuchungszellen 200 dem Untersuchungsschritt übertragen, hingegen, wenn die Ausbildung von Knochengewebe nicht adäquat ist, mit der Sekundärkultivierung fortgefahren wird.
Wie oben erläutert, kann bei dem Kultivierungsverfahren, wie es in der vorliegenden Ausführungsform beschrieben wird, durch Kultivierung von Transplantationszellen 200 und Untersuchungszellen 300 unter identischen Bedingungen der Zellwachstumszustand der Untersuchungszellen 300 als nahezu identisch zu dem Zellwachstumszustand der Transplantationszellen 200 betrachtet werden. Im Ergebnis kann durch Bestätigung des Zellwachstumszustands der Untersuchungszellen 300 der Zellwachstumszustand der Transplantationszellen 200 bestimmt werden, ohne dass die Transplantationszellen 200 direkt kontaktiert werden.
Da zusätzlich die Transplantationszellen 200 (Transplantationsprobe) und die Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) jeweils entsprechend und separat im Kulturgefäß 100 aufgenommen und kultiviert werden, welches die Unterteilungen zum separaten Aufnehmen einer Mehrzahl von Proben in einem einzelnen Gefäß hat, kann jede Probe vor einer Kontaktierung geschützt werden. Im Ergebnis können Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) problemlos aus dem Kulturgefäß 100 entnommen werden, ohne dass Transplantationszellen 200 kontaktiert werden, selbst wenn sie aus dem Kulturgefäß 100 entnommen werden. Im Ergebnis kann eine Verunreinigung der Transplantationszellen 200 durch Pilze und Bakterien verhindert werden, wenn Untersuchungszellen 300 (Untersuchungsprobe) aus dem Kulturgefäß 100 entnommen werden. Zusätzlich können durch Anordnen des Kulturgefäßes 100, welches sowohl Transplantationszellen 200 als auch Untersuchungszellen 300 enthält, in einer Atmosphäre, welche für die Sekundärkultivierung geeignet ist, zu Beginn der Sekundäraktiverung die Transplantationszellen 200 und die Untersuchungszellen 300 problemlos unter identischen Bedingungen kultiviert werden.
Weiterhin kann, obgleich in der voranstehenden Ausführungsform der Fall beschrieben wurde, dass mesenchymale Stammzellen aus Knochenmarkflüssigkeit primärkultiviert werden, die mesenchymalen Stammzellen während der Sekundärkultivierung in Osteoplasten differenziert werden und dann diese Osteoplasten gezüchtet werden, plazentares Blut oder peripheres Blut etc. anstelle von Knochenmarkflüssigkeit entnommen werden und dann kann basierend auf dieser Probe die Primärkultivierung durchgeführt werden. Alternativ kann Knochenmarkflüssigkeit oder plazentales Blut etc. direkt auf ein Gerüst für die Primärkultivierung geimpft werden und dann können die mesenchymalen Stammzellen auf dem Gerüst gezüchtet und nachfolgend differenziert werden.
Zusätzlich können die kultivierten Zellen auch somatische Stammzellen, ES-Zellen, knochenzugehörige Zellen oder Chondrocyten etc. zusätzlich zu den mesenchymalen Stammzellen sein. Weiterhin können die Zellen autologe Zellen oder heterologe Zellen sein. Zusätzlich können die Stammzellen direkt ohne Differenzierung transplantiert werden.
Zusätzlich können geeignete Wachstumsförderer während der Kultivierung hinzugefügt werden; Beispiele hiervon umfassen BMP, FGF, TGF-β, VEGF, IGF, PDGF und HGF.
Zusätzlich kann anstelle von β-TCP während der Sekundärkultivierung folgendes verwendet werden: Genauer gesagt, jegliches Material kann verwendet werden, vorausgesetzt, es hat Affinität für Körpergewebe und Material, welches vom Körper absorbiert werden kann, ist sogar noch besser. Zusätzlich kann das Material auch porös sein. Beispiele poröser Materialien umfassen poröse Keramiken mit Biokompatibilität, Collagen, Polylaktosesäure oder poröse Metalle und es gibt keine Einschränkungen hinsichtlich solcher poröser Materialien, vorausgesetzt, sie haben eine große Porenanzahl. Zusätzlich können Keramiken auf Kalziumphosphatbasis wie Apatit und β-Trikalziumphosphat (β-TCP), Collagen oder Polylaktosesäure etc. als poröse Materialien verwendet werden. Zusätzlich können Keramiken auf Kalziumphosphatbasis mit Collagen kombiniert werden oder Keramiken auf Kalziumphosphatbasis können mit polylaktoser Säure kombiniert werden. β-Trikalziumphosphat, Collagen und Polylaktosesäure haben die Eigenschaft, biologisch abbaubar und vom Körper absorbierbar zu sein, wohingegen Apatit die Eigenschaft einer hohen Festigkeit hat. Weiterhin versteht es sich, dass ein Fachmann auf diesem Gebiet in der Lage ist, einen geeigneten Typ an porösem Material entsprechend der Transplantationsstelle etc. geeignet auswählen und verwenden zu können.
Obgleich oben eine detaillierte Beschreibung einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung erfolgte, sind konkrete Ausgestaltungen nicht auf diese Ausführungsform beschränkt, sondern es können andere Ausgestaltungen etc. ebenfalls in einem Umfang enthalten sein, der von dem Inhalt der Erfindung nicht abweicht.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben erläutert, kann bei dem Verfahren zur Zellkultivierung der vorliegenden Erfindung, da der Wachstumszustand von Transplantationszellen gemäß dem Wachstumszustand von Untersuchungszellen bestimmt werden kann, indem Transplantationszellen und Untersuchungszellen unter identischen Bedingungen kultiviert werden, der Wachstumszustand von Transplantationszellen genau bestimmt werden, ohne dass ein wie auch immer gearteter Kontakt mit den Transplantationszellen erfolgt. Folglich kann eine Verunreinigung der Transplantationszellen durch Pilze oder Bakterien etc. vermieden werden, wenn der Wachstumszustand bestimmt wird.
Da zusätzlich bei dem Kultivierungsverfahren der vorliegenden Erfindung Transplantationszellen und Untersuchungszellen separat in einem Kulturgefäß aufgenommen sind und kultiviert werden, welches in der Lage ist, eine Mehrzahl von Proben jeweils separat aufzunehmen, kann ein Kontakt zwischen den jeweiligen Zellen verhindert werden und die Zellen können problemlos auch bei einer Entfernung der Untersuchungszellen entfernt werden.
Weiterhin können durch Aufnahme der Transplantationszellen und Untersuchungszellen in dem gleichen Kulturgefäß und durch Anordnen des Kulturgefäßes zu Beginn der Sekundärkultivierung in einer Atmosphäre, welche für die Sekundärkultivierung geeignet ist, die Transplantationszellen und die Untersuchungszellen problemlos unter identischen Bedingungen kultiviert werden. Folglich ist der Arbeitsaufwand für Arbeitspersonen, welche mit der Sekundärkultivierung befasst sind, erheblich verringert.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Transplantationszellen, aufweisend die Schritte: Unterteilen einer Gruppe von Zellen in Transplantationszellen und Untersuchungszellen; getrenntes Kultivieren der Transplantationszellen und der Untersuchungszellen unter identischen Bedingungen und in einem isolierten Zustand; und Bestimmen des Wachstumszustandes der Transplantationszellen unter Verwendung der Untersuchungszellen.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin mit dem Schritt: separates Aufnehmen der Transplantationszellen und der Untersuchungszellen in einem Kulturgefäß, welches zur Aufnahme einer Mehrzahl von Proben in einem einzigen Gefäß Unterteilungen hat.
Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin mit dem Schritt: größenordnungsmäßiges Gleichmachen der Anzahl von Zellen pro Einheitsvolumen der Transplantationszellen und der Untersuchungszellen zu Beginn der Kultivierung.