JP4436518B2 - 培養細胞評価方法、培養細胞増殖予測方法及び培養細胞増殖制御方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するための培養細胞評価方法、その評価方法により評価された結果を利用して、その細胞の増殖過程を予測する培養細胞増殖予測方法、及びその予測方法により予測された結果を利用して、その細胞の増殖を制御する培養細胞増殖制御方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の培養細胞評価方法としては、K.Zygourakisらがバイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング誌（Biotechnology and Bioengineering,Vol.38,Pp.459-470(1991)及びBiotechnology and Bioengineering,Vol.38,Pp.471-479(1991)）で報告している接着依存性細胞の接触阻害増殖モデルが知られている。この増殖モデルは、接着依存性細胞の増殖過程を、接触阻害のない状況における対数増殖期（第１ステージ）と、細胞コロニーが形成された後から隣接する細胞コロニー同士が接触しない状況における第２ステージと、細胞コロニー同士が接触した状況における定常期（最終ステージ）の３種に分類している。
【０００３】
さらに、この増殖モデルは、前記第１ステージにおいて、細胞接種時の細胞分散性、接種密度及び増殖幾何学と、増殖速度との関係を示すとともに、その後のステージにおいて、分裂過程（細胞周期）の異なる細胞の増殖を接触阻害の影響に基づいてシミュレートしている。また、実際に、培養ウシ肺動脈血管内皮細胞を用いて、前記増殖モデルの裏付けとなる実験を行った結果が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の増殖モデルでは、培養細胞を培養する際の培養過程の一部である増殖過程のみに着目してモデル化されていたことから、その増殖過程のみを評価するに止まっていた。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、接着依存性細胞の単層培養過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその培養過程全体を容易に把握することができる培養細胞評価方法を提供することにある。それ以外の目的とするところは、接着依存性細胞の増殖過程を的確に予測することができる培養細胞増殖予測方法を提供することにある。それら以外の目的とするところは、接着依存性細胞の増殖を適切に制御することができる培養細胞増殖制御方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の培養細胞評価方法は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するための培養細胞評価方法であって、前記単層培養過程を、前記接着依存性細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでの細胞接着期と、前記接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの誘導期と、前記細胞分裂の開始後から培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの対数増殖期と、前記コンフルエント状態になった後の定常期と、からなる４種のステージに分類するとともに、これら４種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出し、前記接着依存性細胞の単層培養過程を定量評価することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１に記載の発明において、隣接する接着依存性細胞同士が接触しない接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期をモニタリングすることにより、見かけの倍加時間ｔdを決定し、この見かけの倍加時間ｔdを対数増殖期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記細胞接着期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘaとのモニタリング結果を得、それらを下記方程式（１）に代入して接着可能率αと時定数τを決定し、これら接着可能率α及び時定数τを細胞接着期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【０００９】
【数４】
請求項４に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項３に記載の発明において、隣接する接着依存性細胞同士が接触しない接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期をモニタリングすることにより決定された見かけの倍加時間ｔdと、請求項３に記載の接着可能率α及び時定数τを用いて、対数増殖期及び細胞接着期の期間を決定することにより、各接種細胞濃度ＸoにおけるラグタイムｔLを導出するとともに、前記接種細胞濃度ＸoとラグタイムｔLを下記方程式（２）に代入して誘導係数β及び基準誘導時間γを決定し、これら誘導係数β及び基準誘導時間γを誘導期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【００１０】
【数５】
但し、Ｘo *＝１．０細胞／ｃｍ2とする。
【００１１】
請求項５に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の発明において、種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期又は定常期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘatとのモニタリング結果を得、それらを下記数式（３）に代入して前記培養時間ｔにおける増殖度Ｙ（ｔ）を決定し、この増殖度Ｙ（ｔ）を対数増殖期又は定常期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【００１２】
【数６】
請求項６に記載の発明の培養細胞増殖予測方法は、請求項１から請求項５のいずれかに記載のパラメータを用いて、接着依存性細胞の増殖過程を予測するものである。
【００１３】
請求項７に記載の発明の培養細胞増殖制御方法は、請求項６に記載の培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、接着依存性細胞の増殖制御を行うものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（第１実施形態）
以下、この発明の第１実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
【００１５】
本実施形態の培養細胞評価方法は、接着依存性細胞（以下、細胞と記載する）を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するためのものである。
【００１６】
前記細胞は、培養容器の底面に直接又は細胞外マトリックスを介して接着することができるとともに、その容器の底面上で単層培養することができる性質を有する細胞である。前記培養容器としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、テフロン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。また、前記細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【００１７】
このような細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が使用される。さらに、この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞（Embryonic Stem Cells）を使用することもできる。
【００１８】
或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インターロイキン、インスリン様成長因子、グルコシルセラミダーゼ、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモーターを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。このとき、遺伝子治療等による病気の治療を行うことができる形質転換細胞や、特定の外来遺伝子を発現させることができる研究目的の形質転換細胞の培養過程を評価することができる。
【００１９】
また、前記外来遺伝子として、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を用いることによって、内在的な遺伝子の機能を破壊したり、プロモーター機能を調査したりすることができる治療又は研究目的の形質転換細胞の培養過程を評価することもできる。
【００２０】
図１に模式的に示されるように、上記細胞の単層培養過程は、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４からなる４種のステージに分類される。
【００２１】
細胞接着期１１は、細胞を必要に応じて血清又は増殖因子が添加された所定の培養液とともに培養容器内に接種してから、その容器底面に接着するまでの期間である。このステージは、前記細胞が培養容器の底面に接着するための細胞接着期間として位置付けられる。
【００２２】
このステージの細胞の中には、接種するための細胞懸濁液を調製する際のダメージによって生存不能となる細胞が見られ、この生存不能細胞とそれ以外の生存細胞とが混在している。前記ダメージとしては、例えば、採取された組織から細胞を単離するための単離操作や、培養容器の底面から細胞を剥離させるための剥離操作を行うための酵素（プロテイナーゼ等）処理によるダメージや、凍結保存された細胞を培養温度に戻すための温度変化ダメージ等が挙げられる。そして、前記生存不能細胞は培養容器の底面に接着せずに死滅し、生存細胞は所定時間経過後に培養容器の底面に接着して生存する。
【００２３】
誘導期１２は、前記細胞接着期１１の終了後から、培養容器底面に接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの期間である。このステージは、前記生存細胞が新しい環境に順応するための細胞順応期間と位置付けることができ、所定のラグタイムｔLの後にそれらの細胞は正常な細胞分裂を開始する。なお、前記ラグタイムｔLは誘導期１２全体の期間を表す。
【００２４】
対数増殖期１３は、前記誘導期１２の終了後（細胞分裂開始後）から、培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの期間である。前記コンフルエント状態は、培養容器底面の大半が細胞によって単層に覆われている状態である。このコンフルエント状態としては、好ましくは培養容器底面の８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％が細胞によって占有されている状態である。このステージは、各生存細胞が盛んに細胞分裂を行う細胞分裂期間として位置付けられる。
【００２５】
この細胞の培養容器底面上での単層培養過程は、図２に模式的に示されるように、培養容器の底面２１全体を、縦横に等間隔に延びる多数の２次元グリッド２２で仕切ることによってモデル化される。さらに、前記グリッド２２によってほぼ正方形状に仕切られた各グリッドスクエア２３（以下、スクエア２３と記載する）は、１つの細胞２４の接着面の面積Ａc（ｃｍ2）とほぼ同じ大きさに形成されている。すなわち、接種細胞濃度Ｘo（細胞／ｃｍ2又はcells／ｃｍ2；以下、接種濃度Ｘoと記載する）が充分に小さいとき、各細胞２４は互いに隣接することなく分散した位置に接着する。このとき、前記各細胞（親細胞）２４は、培養容器の底面２１上で１つのスクエア２３を占有する。
【００２６】
次に、前記親細胞２４が細胞分裂する際には、その親細胞２４が占有するスクエア２３に隣接する８つのスクエア２３のいずれか１つを、親細胞２４から分裂した２点鎖線で示される娘細胞２４ａが占有する。この娘細胞２４ａは、親細胞２４の横方向に隣接して位置する４つのスクエア２３ａに対しては、それぞれ６分の１の確率で配置され、親細胞２４の斜め方向に隣接して位置する４つのスクエア２３ｂに対しては、それぞれ１２分の１の確率で配置される。続いて、前記親細胞２４又は娘細胞２４ａが細胞分裂を行い、それらの細胞２４，２４ａに隣接するスクエア２３を占有する。
【００２７】
このような細胞増殖過程を経て、前記親細胞２４に隣接する８つのスクエア２３が全て占有されたとき、前記親細胞２４は、その周囲に隣接する娘細胞２４ａによる接触阻害によって細胞分裂を停止する。さらに、前記親細胞２４に隣接して生成された娘細胞２４ａの周囲のスクエア２３が全て占有されたときにも、同様にその娘細胞２４ａは細胞分裂を停止する。これらの過程を経て、前記親細胞２４の周囲には、多数の娘細胞２４ａがコロニー様に密集した図示しない細胞コロニーが形成される。
【００２８】
一方、前記親細胞２４から離間した位置に接着した別の親細胞２４の周囲にも同様に細胞コロニーが形成される。そして、これらの細胞コロニーの端縁同士が接触したところで、その端縁におけるコロニーの伸展が停止され、細胞２４によって占有されていないスクエア２３を覆うように細胞コロニーが伸展する。最後に、ほとんど全ての細胞コロニー同士が接触したところで、細胞２４は培養容器の底面２１上でコンフルエント状態になる。
【００２９】
定常期１４は、前記細胞２４が培養容器の底面２１上でコンフルエント状態になった後の期間である。このステージは、細胞分裂が停止された細胞静止期間として位置付けられる。このステージの細胞２４は、ほとんど全ての隣接する細胞２４同士が接触した状態にあり、培養容器の底面２１上に娘細胞２４ａが接着するためのスクエア２３がなく、接触阻害状態となって細胞分裂がほとんど起こらない。
【００３０】
これら４種のステージに分類される細胞の単層培養過程は、培養容器の底面に接着している生存細胞の数又はその状態をモニタリングすることによって評価される。前記モニタリング方法としては、例えば、培養容器の底面に接着している細胞をプロテイナーゼ等の酵素を用いて容器底面から剥離させ、その剥離された細胞数を血球計算器（血球計算盤）又は細胞数測定装置（コールターカウンター）を用いて計測することによって行われる。或いは、顕微鏡下で接着細胞数を目視によって数えたり、写真撮影又はＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを利用した画像解析手段を用いて計測することによってモニタリングされる。また、例えばホルマザン量に対する特定波長での吸光度測定等の比色定量法を用いて測定することによってモニタリングしてもよい。
【００３１】
上記のモデルにおいて、対数増殖期１３を定量評価するためのパラメータとしては、細胞の見かけの倍加時間ｔd（時間）、平均の比増殖速度μave、又は１細胞の倍加時間ｔd1（時間）が挙げられる。
【００３２】
前記見かけの倍加時間ｔdは、培養容器内に接種された細胞集団をモニタリングすることによって得られるパラメータである。この見かけの倍加時間ｔdは、隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、対数増殖期１３における接着細胞濃度Ｘa（細胞／ｃｍ2又はcells／ｃｍ2；以下、接着濃度Ｘaと記載する）を経時的にモニタリングすることによって平均の比増殖速度μaveを測定し、その測定結果から算出される。さらに、これらのパラメータをより実践的に利用できるようにするために、隣接する細胞同士が接触しない種々の接種濃度Ｘoで細胞を培養したときの結果の平均値を算出するとよい。
【００３３】
前記１細胞の倍加時間ｔd1は、培養容器内に接種された１つの細胞をモニタリングすることによって得られるパラメータである。この１細胞の倍加時間ｔd1は、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、対数増殖期１３における生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いて経時的にモニタリングし、１回の細胞分裂に要する時間を測定することによって決定される。さらにこのとき、複数回の細胞分裂についてモニタリングして得られた倍加時間ｔd1の平均値を算出することによって決定するのが好ましく、複数の細胞についてそれぞれ決定された倍加時間ｔd1の平均値を算出することによって決定するのがより好ましい。
【００３４】
細胞接着期１１を定量評価するためのパラメータとしては、接着可能率α及び時定数τ（時間）が挙げられる。前記時定数τは、培養容器の底面を構成する素材と細胞との相性（接着難易性）を示すパラメータである。
【００３５】
これら接着可能率αと時定数τは、種々の接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、接種開始後からの培養時間ｔ（時間）に対する接着濃度Ｘaを経時的にモニタリングすることによって決定される。すなわち、図３に示されるように、前記モニタリング結果を用いて、培養時間ｔに対して、各接種濃度Ｘoにおける接着濃度Ｘaの割合である接着細胞割合（Ｘa／Ｘo）をグラフ上にプロットすることによって、下記方程式（１）に示されるような指数関数的な対応関係が得られる。そして、これらの結果を非線形最小二乗法を用いて演算処理することにより、接着可能率αと時定数τが決定される。
【００３６】
【数７】
なお、前記接着可能率αは通常０〜１．０の間の値をとり、時定数τは通常正の値をとる。
【００３７】
誘導期１２を定量評価するためのパラメータとしては、誘導係数β（時間）及び基準誘導時間γ（時間）が挙げられる。また、ラグタイムｔL（時間）をパラメータとしてもよい。なお、前記基準誘導時間γは、接種濃度Ｘoを１．０細胞／ｃｍ2としたときのラグタイムｔLを示し、通常は正の値をとる。
【００３８】
前記ラグタイムｔLは、前記パラメータとしての接着可能率α及び時定数τ、並びに見かけの倍加時間ｔd又は１細胞の倍加時間ｔd1を上記モデルに適用し、図４に示されるように、種々の接種濃度Ｘoでの培養過程に対して非線形最小二乗法によるフィッティングを行った後、最も計算線が実測値に一致したときのラグタイムｔL値を算出することによって決定される。
【００３９】
さらに、図５に示されるように、前記種々の接種濃度Ｘoに対してラグタイムｔLを片対数グラフ上にプロットすることによって、下記方程式（２）に示されるような直線的（対数関数的）な対応関係が得られる。そして、これらの結果を最小二乗法を用いて演算処理することにより、誘導係数β及び基準誘導時間γが決定される。
【００４０】
【数８】
但し、Ｘo *＝１．０細胞／ｃｍ2とする。また、前記誘導係数βは通常負の値をとる。
【００４１】
一方、前記ラグタイムｔLは、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、誘導期１２における生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いて経時的にモニタリングし、培養容器の底面に接着してから最初の細胞分裂を開始するまでの時間を測定することによって決定することもできる。さらにこのとき、複数の細胞についてそれぞれ決定されたラグタイムｔLの平均値を算出することによって決定するのが好ましい。
【００４２】
また、対数増殖期１３又は定常期１４を評価するためのパラメータとしては、例えば、所定の培養時間ｔにおける増殖度Ｙ（ｔ）が挙げられる。この増殖度Ｙ（ｔ）は、ある接種濃度Ｘoで細胞を培養する際に、対数増殖期１３又は定常期１４の所定の培養時間ｔにおける接着濃度Ｘatを計測し、その接着濃度Ｘatに対する前記接種濃度Ｘoの割合としての接着率（Ｘat／Ｘo）を算出することによって決定される。すなわち、この増殖度Ｙ（ｔ）は、前記接種濃度Ｘoと、前記培養時間ｔにおける接着濃度Ｘatとを、下記数式（３）に代入することによって算出される。
【００４３】
【数９】
また、便宜上、前記所定の培養時間ｔを、例えば、９６時間、１４４時間又は１９２時間に固定し、種々の接種濃度Ｘoで細胞を単層培養したときの各接着濃度Ｘatを計測して、各接種濃度Ｘoにおける増殖度Ｙ（ｔ）を算出し、図６に示されるような計算線を作製してもよい。なお、前記計算線は、培養時間ｔが９６時間のときは一点鎖線で示され、ｔが１４４時間のときは実線で示され、ｔが１９２時間のときは点線で示されている。このとき、図６に示される計算線から、前記各培養時間ｔにおいて増殖度Ｙ（ｔ）を最も高くすることができる接種濃度Ｘoを容易に求めることができることから、細胞を最も効率的に増殖させるための条件を容易に推定することができる。さらに、図６に示される計算線を改良し、接種濃度Ｘoをｘ軸、増殖度Ｙ（ｔ）をｙ軸、培養時間ｔをｚ軸にとった３次元グラフを作製することによって、細胞を最も効率的に増殖させるための条件としての接種濃度Ｘo及び培養時間ｔを容易に推定することも可能である。
【００４４】
また、この増殖度Ｙ（ｔ）は、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、細胞接着期１１から対数増殖期１３を通して生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いてモニタリングし、所定の培養時間ｔにおいて、その親細胞に由来する娘細胞（通常は親細胞の周囲に隣接して接着している）の細胞数を計測することによって決定することもできる。さらにこのとき、複数の親細胞についてそれぞれ決定された増殖度Ｙ（ｔ）の平均値を算出することによって決定するのがより好ましい。
【００４５】
本実施形態の培養細胞増殖予測方法は、上記培養細胞評価方法によって評価された結果を用いて、細胞の増殖過程を予測するものである。この増殖予測方法としては、例えば、上記パラメータを用いて、図４に示されるようなグラフ上に、培養時間ｔに対する接着濃度Ｘaの関係を示す計算線を作製し、その計算線に基づいて同一株の細胞の増殖過程を予測することができる。このとき、前記細胞を接種濃度Ｘoにて培養容器内に接種してから、その細胞が細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４に到達するまでの培養時間ｔをそれぞれ的確に予測することができる。また、接種濃度Ｘoと現在の接着濃度Ｘaとから、その細胞のステージを予測することができるうえ、その後の培養過程の進行を的確に予測することができる。
【００４６】
本実施形態の培養細胞増殖制御方法は、上記培養細胞増殖予測方法によって予測された結果を用いて、細胞の増殖を制御するものである。この増殖制御方法としては、例えば、培地交換時期の制御、培地種類の切替え時期の制御、培養温度の制御等の培養操作の制御が挙げられる。
【００４７】
培地交換時期の制御は、生存細胞数（接着濃度Ｘa）と培地成分の消費速度との間に存在する関係を求め、その関係を用いて、全ての生存細胞に対して、培地成分の不足による増殖抑制を起こさせずに、培地成分が最も有効に消費される交換時期を予測し、その予測に基づいて培地交換を実行するものである。また、培地中に含有されている各成分の残量を、それらの成分の含量を測定するための測定機器等を用いて経時的にモニタリングすることによって最適な培地交換時期を予測し、その予測に基づいて培地交換を実行してもよい。
【００４８】
培地種類の切替え時期の制御は、例えば、増殖因子や血清を大量に必要とする対数増殖期１３において、増殖因子濃度又は血清濃度を高めた培地に切替えることにより、対数増殖期１３の進行をより一層促進させるものである。或いは、培地中の成分のうち、特定のステージにおいて特に消費速度が速い物質の濃度を高めた培地を、そのステージになったところで切替えることにより、単層培養過程を迅速かつ円滑に進行させるように制御してもよい。一方、外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、その遺伝子の発現を調節するための遺伝子発現調節因子を含有する培地に切替えることによって、その遺伝子の発現を制御してもよい。
【００４９】
培養温度の制御は、例えば、所望とする培養時間ｔに細胞を所望のステージに移行させるために、培養温度を低下させることによって行われる。すなわち、この培養温度の制御は、通常３７℃で培養される細胞の単層培養過程におけるステージの進行を遅延させ、所望とする培養時間ｔに所望のステージに移行させるために、遅延の程度に応じて培養温度を低下させることによって達成される。この培養温度としては、好ましくは０℃以上３７℃未満、より好ましくは２５℃以上３７℃未満、さらに好ましくは３０℃以上３７℃未満である。この培養温度が０℃未満の場合には、培地が凍結したりする不具合が生じるおそれがある。
【００５０】
また、熱ショックタンパク質のプロモーターとともに細胞内に導入された外来遺伝子を有する形質転換細胞に対しては、前記外来遺伝子の転写を促進させることができることから、培養温度を４２〜４７℃の温度に急激に上昇させるのが好ましい。さらに、前記形質転換細胞の死を抑制するために、培地全体が前記温度になった直後に通常の培養温度に戻すのがより好ましい。
【００５１】
一方、上記培養細胞評価方法を利用して、例えば細胞年齢の推定を行うことができ、その細胞の残りの分裂回数の予測等を行うことができる。前記細胞年齢は、その細胞に分化してから後、その分化状態を維持しながら細胞分裂を行った分裂回数で表され、通常は有限である。この細胞年齢の推定は、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞について培養細胞評価方法による評価を行った結果としてのパラメータを用いて、その細胞の細胞年齢を推定するものである。
【００５２】
この細胞年齢の推定方法としては、例えば、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞をそれぞれ上記培養細胞評価方法に従って評価し、それによって得られた結果としての各パラメータをグラフ上にプロットして検量線を作製する。そして、細胞年齢未知の同一株の細胞を上記と同じ方法にて評価し、各パラメータを前記検量線上で比較することによって、その細胞の細胞年齢が推定される。
【００５３】
また、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞について、前記評価結果としての複数のパラメータ間の関係を求め、必要であればその関係を示すグラフを作製し、その関係から細胞年齢未知の同一株の細胞の細胞年齢を推定することもできる。この細胞年齢の推定に用いられる複数のパラメータとしては、例えば、見かけの倍加時間ｔdと接着可能率α、見かけの倍加時間ｔdと時定数τが挙げられる。また、細胞の培養容器底面上での接着面積Ａc又は細胞の大きさと、細胞年齢との関係を求め、その関係を用いて細胞年齢の推定を行うこともできる。
【００５４】
さらに、この細胞年齢の推定結果を上記培養細胞増殖予測方法に反映させて、細胞の増殖過程を予測することによって、細胞年齢を加味したより的確な予測（例えばその細胞が目的とするステージに到達するまでの培養時間ｔの予測）を行うことができる。さらには、その予測結果を利用して、前記細胞の増殖をより適切に制御することもできる。また、例えば、老化した生物個体から採取した細胞年齢の高い老化細胞に対しては、その細胞が目的とするステージまで培養過程を進めることができるか否かを予測することができ、そのステージまで培養過程を進めることができないと予測された場合には、その細胞を培養すること自体に意味がないことをあらかじめ判断することができて大変便利である。
【００５５】
上記第１実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ この培養細胞評価方法は、細胞の単層培養過程を、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４の４種のステージに分類するとともに、これら４種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出して定量評価するものである。このため、前記パラメータを用いて細胞の単層培養過程をステージ毎に部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を単層培養過程全体に適用することによって、その培養過程全体を容易に把握することができる。
【００５６】
一方、R.-C.Ruaanらはバイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング誌（Biotechnology and Bioengineering,Vol.41,Pp.380-389(1993)）で、本実施形態における細胞接着期１１と誘導期１２とを合わせた期間に相当する期間であるラグタイムを定義して評価した論文を報告している。この論文は、本実施形態における細胞接着期１１と誘導期１２との両ステージを区別することなく同一視して評価している。しかしながら、本実施形態において前記両ステージが明らかに異なる性質のステージであることが確認されていることから、前記報告にあるラグタイムの評価自体がその細胞の培養過程を的確に表現するには不足したものであると言える。
【００５７】
・ 見かけの倍加時間ｔd、平均の比増殖速度μave又は１細胞の倍加時間ｔd1を、対数増殖期１３におけるパラメータとすることによって、対数増殖期１３を容易に定量評価することができる。接着可能率α及び時定数τを細胞接着期１１におけるパラメータとすることによって、細胞接着期１１を容易に定量評価することができる。誘導係数β及び基準誘導時間γを誘導期１２におけるパラメータとすることによって、誘導期１２を容易に定量評価することができる。増殖度Ｙ（ｔ）を対数増殖期１３又は定常期１４におけるパラメータとすることによって、それらのステージを容易に定量評価することができる。
【００５８】
・ この培養細胞増殖予測方法は、上記パラメータを用いて細胞の増殖過程を定量的に予測するものであることから、その細胞の増殖過程をより的確かつ詳細に予測することができる。また、この培養細胞増殖制御方法は、前記培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、細胞の増殖制御を定量的に行うものであることから、その細胞の増殖制御をより適切に行うことができる。さらに、培養細胞評価方法を細胞年齢の推定に利用し、その推定結果を加味することによって、より一層的確な増殖予測を行うことができるうえ、より一層適切な増殖制御を行うことができる。
（第２実施形態）
この発明の第２実施形態を上記第１実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００５９】
本実施形態の組織培養評価方法は、細胞から構成される組織を培養容器内で３次元培養して組織形成させる際に、その細胞固有の組織形成過程を評価するためのものである。前記細胞は上記第１実施形態と同じ種類の細胞が使用される。
【００６０】
前記組織形成過程は、単層培養過程と３次元培養過程とから構成される。前記単層培養過程は、上記第１実施形態の単層培養過程と同様に、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４の４種のステージから構成される。また、前記３次元培養過程は、細胞を培養容器内で３次元培養する過程であり、３次元培養期から構成される。
【００６１】
前記３次元培養としては、多層化培養又は３次元空間培養が挙げられる。前記多層化培養は、培養容器の底面上で細胞が複数の層状構造を形成するように培養することであり、通常は上層ほど細胞分化が進行した細胞によって構成される。すなわち、この多層化培養は、生体内で多層化されて存在する皮膚等の組織を培養容器内で再構築するための培養である。
【００６２】
一方、前記３次元空間培養は、培養容器内に１枚又は複数枚のスポンジシートを積層し、それら各スポンジシート表面又はスポンジシート内部のスポンジ表面上に細胞を単層で培養するものである。前記スポンジシートとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、テフロン等からなる合成樹脂シート、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン等からなる生体高分子シート、又はポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体等からなる生分解性高分子シートが好適に使用される。さらに、このスポンジシートの培養面には、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等の細胞外マトリックスがコーティングされているのが好ましい。
【００６３】
多層化培養における３次元培養期は、培養容器の底面上で単層でコンフルエント状態になった細胞の多層化が開始されてから後の期間である。このステージの細胞は、例えば、細胞の分化誘導因子を含有する多層化培養用の培地中で培養されることによって、親細胞の下に娘細胞が配置されるように細胞分裂が進行する。さらに、前記親細胞は、通常それ以降の細胞分裂が抑制されて分化誘導される。前記分化誘導因子としては、例えばカルシウムイオンが挙げられ、ヒト角化細胞の培養においては、通常、単層培養用の培地には０．１ｍＭのカルシウムイオンが含有され、多層化培養用の培地には１．２ｍＭのカルシウムイオンが含有される。
【００６４】
或いは、熱ショックタンパク質のプロモーターとともに分化誘導能を有する外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、前記外来遺伝子の転写を促進させることによって分化誘導を行うことができる。このとき、３次元培養期の開始に際して、培養温度を４２〜４７℃の温度に急激に上昇させるのが好ましい。さらに、前記形質転換細胞の死を抑制するために、培地全体が前記温度になった直後に通常の培養温度に戻すのがより好ましい。
【００６５】
一方、前記３次元空間培養は、培養容器の底面上に単層でコンフルエント状態になった細胞の上面にスポンジシートを被覆した後、そのシートの上面に細胞を接種して単層培養するという操作を行い、さらに必要に応じてこれらの操作を反復することによって行われる。また、複数のスポンジシート上で同時に細胞を単層培養してもよい。従って、この３次元空間培養における３次元培養期は、最下層に位置するスポンジシート上に細胞を接種してから後の期間である。また、この３次元培養期は、各スポンジシート毎に、上記第１実施形態の単層培養過程の場合と同じ４種のステージ（細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４）が存在している。そして、この３次元空間培養における３次元培養期を定量評価するためのパラメータとしては、各スポンジシート毎に適用される上記第１実施形態と同様のパラメータが好適に使用される。
【００６６】
また、前記３次元培養としては、多層化培養と３次元空間培養とを組み合わせた３次元空間多層化培養であってもよい。この３次元空間多層化培養は、前記３次元空間培養において、培養容器の底面及び各スポンジシートから選ばれる少なくとも１種の培養面上に、多層化された細胞を培養するものである。また、前記多層化された細胞の代わりに細胞塊を培養してもよい。この３次元空間多層化培養における３次元培養期は、前記多層化培養における３次元培養期と、３次元空間培養における３次元培養期とを適宜組み合わせることによって定量評価され、それらのパラメータを好適に使用することができる。
【００６７】
この３次元培養期をモニタリングする際には、例えば、培養容器内の組織をそのまま採取して組織切片を作製した後、その組織切片を顕微鏡下で観察することによって行われる。或いは、顕微鏡の焦点深度を変化させて、培養容器内の組織の各層における生存細胞数を目視によって計測したり、写真撮影又はＣＣＤカメラを利用した画像解析手段を用いて計測することによってモニタリングすることもできる。また、培養容器内の組織を核磁気共鳴装置（ＭＲＩ）等の画像解析手段を用いて観察し、様々な方向（特に鉛直方向及び水平方向）から見たときの画像を画像処理装置によって処理することによってモニタリングすることも可能である。また、細胞の特定の分化状態にのみ発現される分化発現マーカーを検出することによってモニタリングすることもできる。
【００６８】
本実施形態の培養細胞増殖予測方法は、上記組織培養評価方法によって評価された結果を用いて、細胞の組織形成過程を予測するものである。この培養細胞増殖予測方法は、単層培養過程予測方法と、３次元培養過程予測方法とから構成される。
【００６９】
前記単層培養過程予測方法は、上記第１実施形態の培養細胞増殖予測方法と同様である。一方、前記３次元培養過程予測方法としては、前記多層化培養における組織形成過程を予測するための多層化培養過程予測方法、前記３次元空間培養における組織形成過程を予測するための３次元空間培養過程予測方法、又は前記３次元空間多層化培養における組織形成過程を予測するための３次元空間多層化培養過程予測方法が挙げられる。
【００７０】
前記多層化培養過程予測方法は、例えば、多層化培養における３次元培養期を定量評価するためのパラメータを用いて、図７（ａ）に示されるようなグラフ上に、培養時間ｔと層数との関係を示す計算線を作製し、その計算線に基づいて同一株の細胞の組織形成過程を予測することによって行われる。このとき、多層化培養において所望とする層数に到達するまでの培養時間ｔを的確に予測することができる。また、接種濃度Ｘoから、所定の培養時間ｔにおける層数を予測することができるうえ、その後の組織形成過程の進行を的確に予測することができる。
【００７１】
前記３次元空間培養過程予測方法は、各スポンジシート毎に前記単層培養過程予測方法を適用して、同一株の細胞に対してその組織形成過程を予測するものである。このとき、上記第１実施形態の培養細胞増殖予測方法と同様に、各層毎に接種濃度Ｘoと、その層における現在の接着濃度Ｘaとから、その層の細胞が細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４に到達するまでの培養時間ｔをそれぞれ的確に予測することができる。また、各層における接種濃度Ｘoと現在の接着濃度Ｘaとから、その層における細胞のステージを予測することができるうえ、その層におけるその後の組織形成過程を的確に予測することができる。
【００７２】
前記３次元空間多層化培養過程予測方法は、細胞が単層培養されている培養容器底面又はスポンジシートに対しては前記単層培養過程予測方法を適用し、多層化培養されている培養容器底面又はスポンジシートに対しては、単層培養過程予測方法と多層化培養過程予測方法を適用するものである。そして、この３次元空間多層化培養予測方法は、同一株の細胞に対してその組織形成過程を予測することができる。
【００７３】
本実施形態の培養細胞増殖制御方法は、上記培養細胞増殖予測方法によって予測された結果を用いて、細胞の組織形成過程を制御するものである。この培養細胞増殖制御方法としては、例えば、培地交換時期の制御、培地種類の切替え時期の制御、培養温度の制御等の培養操作の制御が挙げられる。前記培地交換時期の制御及び培養温度の制御は、上記第１実施形態の場合と同様である。
【００７４】
前記培地種類の切替え時期の制御としては、例えば、単層培養過程から３次元培養（多層化培養）過程に移行させる際に、分化誘導因子を含有する培地に切替えるための制御が挙げられる。また、単層培養又は３次元空間培養過程において、増殖因子や血清を大量に必要とする対数増殖期１３に、増殖因子濃度又は血清濃度を高めた培地に切替えることにより、対数増殖期１３の進行をより一層促進させることができる。或いは、培地中の成分のうち、特定のステージにおいて特に消費速度が速い物質の濃度を高めた培地を、そのステージになったところで切替えることにより、組織形成過程を迅速かつ円滑に進行させるように制御してもよい。一方、外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、その遺伝子の発現を調節するための遺伝子発現調節因子を含有する培地に切替えることによって、その遺伝子の発現を制御してもよい。
【００７５】
一方、上記組織培養評価方法を利用して、例えば細胞年齢の推定を行うことができ、その細胞の残りの分裂回数を予測して組織形成過程の予測等に役立てることができる。この細胞年齢の推定方法は、前記単層培養過程における培養細胞評価方法で得られたパラメータを用いて、上記第１実施形態の場合と同様に行うのが好ましく、この場合にはモニタリングが容易であることから、より容易かつ的確に細胞年齢の推定を行うことができる。また、３次元培養における組織培養過程を評価した結果得られるパラメータを用いて細胞年齢の推定を行ってもよく、前記単層培養過程のパラメータと組織培養過程のパラメータとを組み合わせて細胞年齢の推定を行ってもよい。
【００７６】
さらに、この細胞年齢の推定結果を上記培養細胞増殖予測方法に反映させて、細胞の組織形成過程を予測することによって、細胞年齢を加味したより的確な予測を行うことができるうえ、その予測結果を利用して前記細胞の組織形成過程をより適切に制御することもできる。また、例えば、老化した生物個体から採取した細胞年齢の高い老化細胞に対しては、その細胞を用いて目的とする組織形成を最終段階まで進行させることができるか否かを予測することができて大変便利である。
【００７７】
上記第２実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ この組織培養評価方法は、細胞の組織培養過程を、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３、定常期１４及び３次元培養期の５種のステージに分類するとともに、これら５種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出して定量評価するものである。このため、前記パラメータを用いて細胞の組織形成過程をステージ毎に部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を組織培養過程全体に適用することによって、その組織形成過程全体を容易に把握することができる。
【００７８】
・ この培養細胞増殖予測方法は、上記パラメータを用いて細胞の組織形成過程を定量的に予測するものであることから、その細胞の組織形成過程をより的確かつ詳細に予測することができる。また、この培養細胞増殖制御方法は、前記培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、細胞の組織形成過程を定量的に制御するものであることから、その細胞の組織形成過程の制御をより適切に行うことができる。さらに、組織培養評価方法を細胞年齢の推定に利用し、その推定結果を加味することによって、より一層的確な組織形成過程の予測を行うことができるうえ、より一層適切な組織形成過程の制御を行うことができる。
【００７９】
【実施例】
以下、上記各実施形態を具体化した実施例について説明する。
＜ヒト角化細胞の培養細胞評価（単層培養）＞
（ヒト角化細胞の調製）
皮膚潰瘍患者（成人男性）の正常皮膚組織を採取した後、トリプシンを用いてヒト角化細胞（keratinocytes）を単離した。
【００８０】
（ヒト角化細胞の単層培養条件）
培養容器：Ｔ−フラスコ（Nuncoln Delta Flask,Nunk Co.,NY,USA；底面積２５ｃｍ2）
培地：無血清培地 Keratinocytes−ＳＦＭ(Life Technology Co.,MD,USA）
培養液量：約１０ｍｌ（前記Ｔ−フラスコに４ｍｍ深さ）
培養液交換：７２時間毎
インキュベーション：３７℃、５％ＣＯ2
｛予備単層培養試験｝
ヒト角化細胞を１．０×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種し、上記単層培養条件で２ヶ月間培養しながらその細胞の様子を観察するとともに、接着濃度Ｘa（細胞／ｃｍ2）を適時計測した。さらに、前記接着濃度Ｘaの計測結果から見かけの倍加時間ｔd（時間）を決定するとともに、培養容器底面上での接着面積Ａc（ｃｍ2）を決定した。なお、前記接着濃度Ｘaの計測方法は、培養容器の底面に接着している細胞をトリプシンにてその底面から剥離させ、その剥離された細胞数を血球計算盤を用いて顕微鏡下で計測し、その計測結果を用いて算出することによって行われた。その結果、この細胞の増殖及び形態には顕著な変化は見られなかった。一方、このヒト角化細胞の培養容器底面上での接着面積Ａcは約２．０５×１０-5ｃｍ2であり、見かけの倍加時間ｔdは約６４．５時間であったことが判明した。
【００８１】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価１｝
ヒト角化細胞を５．０×１０3、９．８×１０3、１．６×１０4及び２．７×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでそれぞれ培養容器内に接種した。これらの細胞を上記単層培養条件で培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果及びその結果から導出される計算線を図４に示す。
【００８２】
（細胞接着期の評価１）
図４に示されるように、９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで接種したヒト角化細胞の接着濃度Ｘaを経時的にモニタリングした結果及びその計算線から、この接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したとき、細胞接種からほぼ１５時間後（ｔ＝０〜１５時間）までは接着濃度Ｘaが急激に増大したことが示され、この期間が細胞接着期１１であることが推測される。また、その他の接種濃度Ｘoにおける細胞接着期１１についてもほぼ同様であったことが示された。
【００８３】
（誘導期の評価）
図４に示される９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したときの計算線から、ｔ＝１５〜４４時間まではおよそ５．０×１０3細胞／ｃｍ2の接着濃度Ｘaでほぼ一定であったことが示され、この期間が誘導期１２であることが推測される。従って、この接種濃度ＸoにおけるラグタイムｔLは４４時間であることが判明した。また、その他の接種濃度ＸoにおけるラグタイムｔLは、図４に示されるように、Ｘo＝５．０×１０3細胞／ｃｍ2のときにｔL＝６０時間、Ｘo＝１．６×１０4細胞／ｃｍ2のときにｔL＝２５時間、Ｘo＝２．７×１０4細胞／ｃｍ2のときにｔL＝２０時間であったことが示された。
【００８４】
これら各接種濃度ＸoとラグタイムｔLとの関係を図５に示される片対数グラフ上にプロットするとともに上記方程式（２）に代入することによって、誘導係数β＝−２５．２時間及び基準誘導時間γ＝２７４時間が導出された。また、前記誘導係数βの値は、図５に示されるグラフの傾きに対応して負の値となっており、接種濃度Ｘoの増加とともにラグタイムｔLの減少が見られることが判明した。
【００８５】
（対数増殖期の評価）
図４に示される９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したときの計算線から、ｔ＝４４時間以降の接着濃度Ｘaが急激に増大したことが示され、この期間が対数増殖期１３であることが推測される。そして、接着濃度Ｘaがおよそ４．５×１０4細胞／ｃｍ2になったところでその上昇が停止し、ヒト角化細胞が定常期１４に入ったことが推測される。
【００８６】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価２｝
（細胞接着期の評価２）
ヒト角化細胞を１．０×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種した。この細胞を上記単層培養条件で３６時間培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果及びその結果から導出される計算線を図３に示す。
【００８７】
図３に示されるように、この接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したとき、細胞接種からほぼ１２時間後（ｔ＝０〜１２時間）までは接着濃度Ｘaが急激に上昇したことが示され、この期間が細胞接着期１１であることが推測される。また、ｔ＝１２時間以降の接着濃度Ｘaはおよそ５．０×１０3細胞／ｃｍ2であったことが示され、約５５％の細胞が生存細胞であったことが示された。さらに、図３に示される培養時間ｔと接着細胞割合（Ｘa／Ｘo）との関係を上記方程式（１）に代入することによって、接着可能率α＝０．５５２及び時定数τ＝４．００時間が導出された。
【００８８】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価３｝
（増殖度の評価及び予測）
ヒト角化細胞を５．２×１０2〜５．２×１０4細胞／ｃｍ2の範囲内の種々の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種し、これらの細胞を上記単層培養条件で１４４時間培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果から、各接種濃度Ｘoにおける増殖度Ｙ（１４４）を算出し、図６に示される片対数グラフ上にプロットするとともに、非線形最小二乗法を用いて導出された計算線（実線で示される）を図６に示した。
【００８９】
図６に示されるように、１４４時間培養した後の増殖度Ｙ（１４４）は、接種濃度Ｘoが５．２×１０2から１．７×１０4細胞／ｃｍ2へと増大するのに伴って増大し、１．７×１０4細胞／ｃｍ2を越えると減少することが示された。また、接種濃度Ｘoが１．７×１０4細胞／ｃｍ2のときに最大となる増殖度Ｙ（１４４）はおよそ１．８であり、この増殖度は接種濃度Ｘoが５．２×１０2及び５．２×１０4細胞／ｃｍ2のときの増殖度Ｙ（１４４）に対して、それぞれおよそ２．５倍及び１．９倍大きいことが示された。
【００９０】
また、この試験における増殖度Ｙ（１４４）の実測値と計算値と間の相関係数は０．９６であった。従って、様々な接種濃度Ｘoにおけるヒト角化細胞の単層培養において、上記モデルが細胞の培養過程を非常に適切に表現することができるものであることが確認された。
【００９１】
さらに、上記ヒト角化細胞の単層培養過程を評価したときに得られた種々のパラメータを用いて、この細胞を同条件で９６時間及び１９２時間培養した場合の増殖予測を行った計算線を、それぞれ図６の一点鎖線及び点線で示した。
【００９２】
＜ヒト角化細胞の組織培養シミュレーション＞
ヒト角化細胞を１．１×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで上記単層培養条件で２００時間培養した後、１．２ｍＭカルシウムイオン含有無血清培地 Keratinocytes−ＳＦＭを培地とした多層化培養条件で３００時間多層化培養を行った場合について、ＩＢＭコンピュータ（Mebius,Sharp Co.,Osaka；Lab VIEW software(National Instrument Co.,TX,USA)）を用いてシミュレーションを行った。そのシミュレーション結果を図７（ａ）に示すとともに、そのシミュレーション結果から導出される２００時間後、３００時間後及び４００時間後の各層における被覆率を図７（ｂ）に示す。
【００９３】
図７（ａ）及び（ｂ）の結果より、培養時間ｔの増加とともに培養容器内の３次元培養組織の層数が増加し、皮膚移植が可能な時期（例えば、７層目が完成した時間である約５００時間）を推定することができた。
【００９４】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 接着依存性細胞を培養容器内で３次元培養して組織形成させる際に、その細胞固有の組織形成過程を評価するための組織培養評価方法であって、前記組織形成過程を、前記細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでの細胞接着期と、前記接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの誘導期と、前記細胞分裂の開始後から培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの対数増殖期と、前記コンフルエント状態になってから細胞が３次元培養されるまでの定常期と、前記細胞の３次元培養が開始された後の３次元培養期と、からなる５種のステージに分類するとともに、これら５種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出し、前記接着依存性細胞の組織形成過程を定量評価することを特徴とする組織培養評価方法。
【００９５】
このように構成した場合、接着依存性細胞から構成される組織形成過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその組織形成過程全体を容易に把握することができる。
【００９６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、接着依存性細胞の単層培養過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその培養過程全体を容易に把握することができる。
【００９７】
請求項２に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１に記載の発明の効果に加えて、対数増殖期を容易に定量評価することができる。
請求項３に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１又は請求項２に記載の発明の効果に加えて、細胞接着期を容易に定量評価することができる。
【００９８】
請求項４に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項３に記載の発明の効果に加えて、誘導期を容易に定量評価することができる。
請求項５に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１から請求項４のいずれかに記載の発明の効果に加えて、対数増殖期又は定常期を容易に定量評価することができる。
【００９９】
請求項６に記載の発明の培養細胞増殖予測方法によれば、接着依存性細胞の増殖過程を的確に予測することができる。
請求項７に記載の発明の培養細胞増殖制御方法によれば、接着依存性細胞の増殖を適切に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 接着依存性細胞の単層培養過程を模式的に示す片対数グラフ。
【図２】 培養容器底面上での細胞分裂過程を模式的に示す平面図。
【図３】 細胞接着期での培養時間と接着細胞割合の関係を示すグラフ。
【図４】 培養時間と接着細胞濃度の関係を示す片対数グラフ。
【図５】 誘導期の接種細胞濃度とラグタイムの関係を示す片対数グラフ。
【図６】 接種細胞濃度と増殖度の関係を示す片対数グラフ。
【図７】 （ａ）は組織培養シミュレーションにおける培養時間と層数の関係を示すグラフ、（ｂ）は同じく層数と被覆率の関係を示すグラフ。
【符号の説明】
１１…細胞接着期、１２…誘導期、１３…対数増殖期、１４…定常期、２４，２４ａ…接着依存性細胞。
【発明の属する技術分野】
この発明は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するための培養細胞評価方法、その評価方法により評価された結果を利用して、その細胞の増殖過程を予測する培養細胞増殖予測方法、及びその予測方法により予測された結果を利用して、その細胞の増殖を制御する培養細胞増殖制御方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の培養細胞評価方法としては、K.Zygourakisらがバイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング誌（Biotechnology and Bioengineering,Vol.38,Pp.459-470(1991)及びBiotechnology and Bioengineering,Vol.38,Pp.471-479(1991)）で報告している接着依存性細胞の接触阻害増殖モデルが知られている。この増殖モデルは、接着依存性細胞の増殖過程を、接触阻害のない状況における対数増殖期（第１ステージ）と、細胞コロニーが形成された後から隣接する細胞コロニー同士が接触しない状況における第２ステージと、細胞コロニー同士が接触した状況における定常期（最終ステージ）の３種に分類している。
【０００３】
さらに、この増殖モデルは、前記第１ステージにおいて、細胞接種時の細胞分散性、接種密度及び増殖幾何学と、増殖速度との関係を示すとともに、その後のステージにおいて、分裂過程（細胞周期）の異なる細胞の増殖を接触阻害の影響に基づいてシミュレートしている。また、実際に、培養ウシ肺動脈血管内皮細胞を用いて、前記増殖モデルの裏付けとなる実験を行った結果が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の増殖モデルでは、培養細胞を培養する際の培養過程の一部である増殖過程のみに着目してモデル化されていたことから、その増殖過程のみを評価するに止まっていた。
【０００５】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、接着依存性細胞の単層培養過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその培養過程全体を容易に把握することができる培養細胞評価方法を提供することにある。それ以外の目的とするところは、接着依存性細胞の増殖過程を的確に予測することができる培養細胞増殖予測方法を提供することにある。それら以外の目的とするところは、接着依存性細胞の増殖を適切に制御することができる培養細胞増殖制御方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明の培養細胞評価方法は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するための培養細胞評価方法であって、前記単層培養過程を、前記接着依存性細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでの細胞接着期と、前記接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの誘導期と、前記細胞分裂の開始後から培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの対数増殖期と、前記コンフルエント状態になった後の定常期と、からなる４種のステージに分類するとともに、これら４種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出し、前記接着依存性細胞の単層培養過程を定量評価することを特徴とするものである。
【０００７】
請求項２に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１に記載の発明において、隣接する接着依存性細胞同士が接触しない接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期をモニタリングすることにより、見かけの倍加時間ｔdを決定し、この見かけの倍加時間ｔdを対数増殖期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記細胞接着期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘaとのモニタリング結果を得、それらを下記方程式（１）に代入して接着可能率αと時定数τを決定し、これら接着可能率α及び時定数τを細胞接着期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【０００９】
【数４】
【００１０】
【数５】
【００１１】
請求項５に記載の発明の培養細胞評価方法は、請求項１から請求項４のいずれかに記載の発明において、種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期又は定常期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘatとのモニタリング結果を得、それらを下記数式（３）に代入して前記培養時間ｔにおける増殖度Ｙ（ｔ）を決定し、この増殖度Ｙ（ｔ）を対数増殖期又は定常期におけるパラメータとすることを特徴とするものである。
【００１２】
【数６】
【００１３】
請求項７に記載の発明の培養細胞増殖制御方法は、請求項６に記載の培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、接着依存性細胞の増殖制御を行うものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
（第１実施形態）
以下、この発明の第１実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
【００１５】
本実施形態の培養細胞評価方法は、接着依存性細胞（以下、細胞と記載する）を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するためのものである。
【００１６】
前記細胞は、培養容器の底面に直接又は細胞外マトリックスを介して接着することができるとともに、その容器の底面上で単層培養することができる性質を有する細胞である。前記培養容器としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、テフロン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。また、前記細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【００１７】
このような細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が使用される。さらに、この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞（Embryonic Stem Cells）を使用することもできる。
【００１８】
或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、インターロイキン、インスリン様成長因子、グルコシルセラミダーゼ、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモーターを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。このとき、遺伝子治療等による病気の治療を行うことができる形質転換細胞や、特定の外来遺伝子を発現させることができる研究目的の形質転換細胞の培養過程を評価することができる。
【００１９】
また、前記外来遺伝子として、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を用いることによって、内在的な遺伝子の機能を破壊したり、プロモーター機能を調査したりすることができる治療又は研究目的の形質転換細胞の培養過程を評価することもできる。
【００２０】
図１に模式的に示されるように、上記細胞の単層培養過程は、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４からなる４種のステージに分類される。
【００２１】
細胞接着期１１は、細胞を必要に応じて血清又は増殖因子が添加された所定の培養液とともに培養容器内に接種してから、その容器底面に接着するまでの期間である。このステージは、前記細胞が培養容器の底面に接着するための細胞接着期間として位置付けられる。
【００２２】
このステージの細胞の中には、接種するための細胞懸濁液を調製する際のダメージによって生存不能となる細胞が見られ、この生存不能細胞とそれ以外の生存細胞とが混在している。前記ダメージとしては、例えば、採取された組織から細胞を単離するための単離操作や、培養容器の底面から細胞を剥離させるための剥離操作を行うための酵素（プロテイナーゼ等）処理によるダメージや、凍結保存された細胞を培養温度に戻すための温度変化ダメージ等が挙げられる。そして、前記生存不能細胞は培養容器の底面に接着せずに死滅し、生存細胞は所定時間経過後に培養容器の底面に接着して生存する。
【００２３】
誘導期１２は、前記細胞接着期１１の終了後から、培養容器底面に接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの期間である。このステージは、前記生存細胞が新しい環境に順応するための細胞順応期間と位置付けることができ、所定のラグタイムｔLの後にそれらの細胞は正常な細胞分裂を開始する。なお、前記ラグタイムｔLは誘導期１２全体の期間を表す。
【００２４】
対数増殖期１３は、前記誘導期１２の終了後（細胞分裂開始後）から、培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの期間である。前記コンフルエント状態は、培養容器底面の大半が細胞によって単層に覆われている状態である。このコンフルエント状態としては、好ましくは培養容器底面の８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％が細胞によって占有されている状態である。このステージは、各生存細胞が盛んに細胞分裂を行う細胞分裂期間として位置付けられる。
【００２５】
この細胞の培養容器底面上での単層培養過程は、図２に模式的に示されるように、培養容器の底面２１全体を、縦横に等間隔に延びる多数の２次元グリッド２２で仕切ることによってモデル化される。さらに、前記グリッド２２によってほぼ正方形状に仕切られた各グリッドスクエア２３（以下、スクエア２３と記載する）は、１つの細胞２４の接着面の面積Ａc（ｃｍ2）とほぼ同じ大きさに形成されている。すなわち、接種細胞濃度Ｘo（細胞／ｃｍ2又はcells／ｃｍ2；以下、接種濃度Ｘoと記載する）が充分に小さいとき、各細胞２４は互いに隣接することなく分散した位置に接着する。このとき、前記各細胞（親細胞）２４は、培養容器の底面２１上で１つのスクエア２３を占有する。
【００２６】
次に、前記親細胞２４が細胞分裂する際には、その親細胞２４が占有するスクエア２３に隣接する８つのスクエア２３のいずれか１つを、親細胞２４から分裂した２点鎖線で示される娘細胞２４ａが占有する。この娘細胞２４ａは、親細胞２４の横方向に隣接して位置する４つのスクエア２３ａに対しては、それぞれ６分の１の確率で配置され、親細胞２４の斜め方向に隣接して位置する４つのスクエア２３ｂに対しては、それぞれ１２分の１の確率で配置される。続いて、前記親細胞２４又は娘細胞２４ａが細胞分裂を行い、それらの細胞２４，２４ａに隣接するスクエア２３を占有する。
【００２７】
このような細胞増殖過程を経て、前記親細胞２４に隣接する８つのスクエア２３が全て占有されたとき、前記親細胞２４は、その周囲に隣接する娘細胞２４ａによる接触阻害によって細胞分裂を停止する。さらに、前記親細胞２４に隣接して生成された娘細胞２４ａの周囲のスクエア２３が全て占有されたときにも、同様にその娘細胞２４ａは細胞分裂を停止する。これらの過程を経て、前記親細胞２４の周囲には、多数の娘細胞２４ａがコロニー様に密集した図示しない細胞コロニーが形成される。
【００２８】
一方、前記親細胞２４から離間した位置に接着した別の親細胞２４の周囲にも同様に細胞コロニーが形成される。そして、これらの細胞コロニーの端縁同士が接触したところで、その端縁におけるコロニーの伸展が停止され、細胞２４によって占有されていないスクエア２３を覆うように細胞コロニーが伸展する。最後に、ほとんど全ての細胞コロニー同士が接触したところで、細胞２４は培養容器の底面２１上でコンフルエント状態になる。
【００２９】
定常期１４は、前記細胞２４が培養容器の底面２１上でコンフルエント状態になった後の期間である。このステージは、細胞分裂が停止された細胞静止期間として位置付けられる。このステージの細胞２４は、ほとんど全ての隣接する細胞２４同士が接触した状態にあり、培養容器の底面２１上に娘細胞２４ａが接着するためのスクエア２３がなく、接触阻害状態となって細胞分裂がほとんど起こらない。
【００３０】
これら４種のステージに分類される細胞の単層培養過程は、培養容器の底面に接着している生存細胞の数又はその状態をモニタリングすることによって評価される。前記モニタリング方法としては、例えば、培養容器の底面に接着している細胞をプロテイナーゼ等の酵素を用いて容器底面から剥離させ、その剥離された細胞数を血球計算器（血球計算盤）又は細胞数測定装置（コールターカウンター）を用いて計測することによって行われる。或いは、顕微鏡下で接着細胞数を目視によって数えたり、写真撮影又はＣＣＤ（電荷結合素子）カメラを利用した画像解析手段を用いて計測することによってモニタリングされる。また、例えばホルマザン量に対する特定波長での吸光度測定等の比色定量法を用いて測定することによってモニタリングしてもよい。
【００３１】
上記のモデルにおいて、対数増殖期１３を定量評価するためのパラメータとしては、細胞の見かけの倍加時間ｔd（時間）、平均の比増殖速度μave、又は１細胞の倍加時間ｔd1（時間）が挙げられる。
【００３２】
前記見かけの倍加時間ｔdは、培養容器内に接種された細胞集団をモニタリングすることによって得られるパラメータである。この見かけの倍加時間ｔdは、隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、対数増殖期１３における接着細胞濃度Ｘa（細胞／ｃｍ2又はcells／ｃｍ2；以下、接着濃度Ｘaと記載する）を経時的にモニタリングすることによって平均の比増殖速度μaveを測定し、その測定結果から算出される。さらに、これらのパラメータをより実践的に利用できるようにするために、隣接する細胞同士が接触しない種々の接種濃度Ｘoで細胞を培養したときの結果の平均値を算出するとよい。
【００３３】
前記１細胞の倍加時間ｔd1は、培養容器内に接種された１つの細胞をモニタリングすることによって得られるパラメータである。この１細胞の倍加時間ｔd1は、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、対数増殖期１３における生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いて経時的にモニタリングし、１回の細胞分裂に要する時間を測定することによって決定される。さらにこのとき、複数回の細胞分裂についてモニタリングして得られた倍加時間ｔd1の平均値を算出することによって決定するのが好ましく、複数の細胞についてそれぞれ決定された倍加時間ｔd1の平均値を算出することによって決定するのがより好ましい。
【００３４】
細胞接着期１１を定量評価するためのパラメータとしては、接着可能率α及び時定数τ（時間）が挙げられる。前記時定数τは、培養容器の底面を構成する素材と細胞との相性（接着難易性）を示すパラメータである。
【００３５】
これら接着可能率αと時定数τは、種々の接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、接種開始後からの培養時間ｔ（時間）に対する接着濃度Ｘaを経時的にモニタリングすることによって決定される。すなわち、図３に示されるように、前記モニタリング結果を用いて、培養時間ｔに対して、各接種濃度Ｘoにおける接着濃度Ｘaの割合である接着細胞割合（Ｘa／Ｘo）をグラフ上にプロットすることによって、下記方程式（１）に示されるような指数関数的な対応関係が得られる。そして、これらの結果を非線形最小二乗法を用いて演算処理することにより、接着可能率αと時定数τが決定される。
【００３６】
【数７】
【００３７】
誘導期１２を定量評価するためのパラメータとしては、誘導係数β（時間）及び基準誘導時間γ（時間）が挙げられる。また、ラグタイムｔL（時間）をパラメータとしてもよい。なお、前記基準誘導時間γは、接種濃度Ｘoを１．０細胞／ｃｍ2としたときのラグタイムｔLを示し、通常は正の値をとる。
【００３８】
前記ラグタイムｔLは、前記パラメータとしての接着可能率α及び時定数τ、並びに見かけの倍加時間ｔd又は１細胞の倍加時間ｔd1を上記モデルに適用し、図４に示されるように、種々の接種濃度Ｘoでの培養過程に対して非線形最小二乗法によるフィッティングを行った後、最も計算線が実測値に一致したときのラグタイムｔL値を算出することによって決定される。
【００３９】
さらに、図５に示されるように、前記種々の接種濃度Ｘoに対してラグタイムｔLを片対数グラフ上にプロットすることによって、下記方程式（２）に示されるような直線的（対数関数的）な対応関係が得られる。そして、これらの結果を最小二乗法を用いて演算処理することにより、誘導係数β及び基準誘導時間γが決定される。
【００４０】
【数８】
【００４１】
一方、前記ラグタイムｔLは、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、誘導期１２における生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いて経時的にモニタリングし、培養容器の底面に接着してから最初の細胞分裂を開始するまでの時間を測定することによって決定することもできる。さらにこのとき、複数の細胞についてそれぞれ決定されたラグタイムｔLの平均値を算出することによって決定するのが好ましい。
【００４２】
また、対数増殖期１３又は定常期１４を評価するためのパラメータとしては、例えば、所定の培養時間ｔにおける増殖度Ｙ（ｔ）が挙げられる。この増殖度Ｙ（ｔ）は、ある接種濃度Ｘoで細胞を培養する際に、対数増殖期１３又は定常期１４の所定の培養時間ｔにおける接着濃度Ｘatを計測し、その接着濃度Ｘatに対する前記接種濃度Ｘoの割合としての接着率（Ｘat／Ｘo）を算出することによって決定される。すなわち、この増殖度Ｙ（ｔ）は、前記接種濃度Ｘoと、前記培養時間ｔにおける接着濃度Ｘatとを、下記数式（３）に代入することによって算出される。
【００４３】
【数９】
【００４４】
また、この増殖度Ｙ（ｔ）は、好ましくは隣接する細胞同士が接触しない接種濃度Ｘoで細胞を培養容器内に接種し、細胞接着期１１から対数増殖期１３を通して生存細胞１つをＣＣＤカメラ等の画像解析手段を用いてモニタリングし、所定の培養時間ｔにおいて、その親細胞に由来する娘細胞（通常は親細胞の周囲に隣接して接着している）の細胞数を計測することによって決定することもできる。さらにこのとき、複数の親細胞についてそれぞれ決定された増殖度Ｙ（ｔ）の平均値を算出することによって決定するのがより好ましい。
【００４５】
本実施形態の培養細胞増殖予測方法は、上記培養細胞評価方法によって評価された結果を用いて、細胞の増殖過程を予測するものである。この増殖予測方法としては、例えば、上記パラメータを用いて、図４に示されるようなグラフ上に、培養時間ｔに対する接着濃度Ｘaの関係を示す計算線を作製し、その計算線に基づいて同一株の細胞の増殖過程を予測することができる。このとき、前記細胞を接種濃度Ｘoにて培養容器内に接種してから、その細胞が細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４に到達するまでの培養時間ｔをそれぞれ的確に予測することができる。また、接種濃度Ｘoと現在の接着濃度Ｘaとから、その細胞のステージを予測することができるうえ、その後の培養過程の進行を的確に予測することができる。
【００４６】
本実施形態の培養細胞増殖制御方法は、上記培養細胞増殖予測方法によって予測された結果を用いて、細胞の増殖を制御するものである。この増殖制御方法としては、例えば、培地交換時期の制御、培地種類の切替え時期の制御、培養温度の制御等の培養操作の制御が挙げられる。
【００４７】
培地交換時期の制御は、生存細胞数（接着濃度Ｘa）と培地成分の消費速度との間に存在する関係を求め、その関係を用いて、全ての生存細胞に対して、培地成分の不足による増殖抑制を起こさせずに、培地成分が最も有効に消費される交換時期を予測し、その予測に基づいて培地交換を実行するものである。また、培地中に含有されている各成分の残量を、それらの成分の含量を測定するための測定機器等を用いて経時的にモニタリングすることによって最適な培地交換時期を予測し、その予測に基づいて培地交換を実行してもよい。
【００４８】
培地種類の切替え時期の制御は、例えば、増殖因子や血清を大量に必要とする対数増殖期１３において、増殖因子濃度又は血清濃度を高めた培地に切替えることにより、対数増殖期１３の進行をより一層促進させるものである。或いは、培地中の成分のうち、特定のステージにおいて特に消費速度が速い物質の濃度を高めた培地を、そのステージになったところで切替えることにより、単層培養過程を迅速かつ円滑に進行させるように制御してもよい。一方、外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、その遺伝子の発現を調節するための遺伝子発現調節因子を含有する培地に切替えることによって、その遺伝子の発現を制御してもよい。
【００４９】
培養温度の制御は、例えば、所望とする培養時間ｔに細胞を所望のステージに移行させるために、培養温度を低下させることによって行われる。すなわち、この培養温度の制御は、通常３７℃で培養される細胞の単層培養過程におけるステージの進行を遅延させ、所望とする培養時間ｔに所望のステージに移行させるために、遅延の程度に応じて培養温度を低下させることによって達成される。この培養温度としては、好ましくは０℃以上３７℃未満、より好ましくは２５℃以上３７℃未満、さらに好ましくは３０℃以上３７℃未満である。この培養温度が０℃未満の場合には、培地が凍結したりする不具合が生じるおそれがある。
【００５０】
また、熱ショックタンパク質のプロモーターとともに細胞内に導入された外来遺伝子を有する形質転換細胞に対しては、前記外来遺伝子の転写を促進させることができることから、培養温度を４２〜４７℃の温度に急激に上昇させるのが好ましい。さらに、前記形質転換細胞の死を抑制するために、培地全体が前記温度になった直後に通常の培養温度に戻すのがより好ましい。
【００５１】
一方、上記培養細胞評価方法を利用して、例えば細胞年齢の推定を行うことができ、その細胞の残りの分裂回数の予測等を行うことができる。前記細胞年齢は、その細胞に分化してから後、その分化状態を維持しながら細胞分裂を行った分裂回数で表され、通常は有限である。この細胞年齢の推定は、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞について培養細胞評価方法による評価を行った結果としてのパラメータを用いて、その細胞の細胞年齢を推定するものである。
【００５２】
この細胞年齢の推定方法としては、例えば、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞をそれぞれ上記培養細胞評価方法に従って評価し、それによって得られた結果としての各パラメータをグラフ上にプロットして検量線を作製する。そして、細胞年齢未知の同一株の細胞を上記と同じ方法にて評価し、各パラメータを前記検量線上で比較することによって、その細胞の細胞年齢が推定される。
【００５３】
また、複数の細胞年齢が異なる同一株の細胞について、前記評価結果としての複数のパラメータ間の関係を求め、必要であればその関係を示すグラフを作製し、その関係から細胞年齢未知の同一株の細胞の細胞年齢を推定することもできる。この細胞年齢の推定に用いられる複数のパラメータとしては、例えば、見かけの倍加時間ｔdと接着可能率α、見かけの倍加時間ｔdと時定数τが挙げられる。また、細胞の培養容器底面上での接着面積Ａc又は細胞の大きさと、細胞年齢との関係を求め、その関係を用いて細胞年齢の推定を行うこともできる。
【００５４】
さらに、この細胞年齢の推定結果を上記培養細胞増殖予測方法に反映させて、細胞の増殖過程を予測することによって、細胞年齢を加味したより的確な予測（例えばその細胞が目的とするステージに到達するまでの培養時間ｔの予測）を行うことができる。さらには、その予測結果を利用して、前記細胞の増殖をより適切に制御することもできる。また、例えば、老化した生物個体から採取した細胞年齢の高い老化細胞に対しては、その細胞が目的とするステージまで培養過程を進めることができるか否かを予測することができ、そのステージまで培養過程を進めることができないと予測された場合には、その細胞を培養すること自体に意味がないことをあらかじめ判断することができて大変便利である。
【００５５】
上記第１実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ この培養細胞評価方法は、細胞の単層培養過程を、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４の４種のステージに分類するとともに、これら４種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出して定量評価するものである。このため、前記パラメータを用いて細胞の単層培養過程をステージ毎に部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を単層培養過程全体に適用することによって、その培養過程全体を容易に把握することができる。
【００５６】
一方、R.-C.Ruaanらはバイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング誌（Biotechnology and Bioengineering,Vol.41,Pp.380-389(1993)）で、本実施形態における細胞接着期１１と誘導期１２とを合わせた期間に相当する期間であるラグタイムを定義して評価した論文を報告している。この論文は、本実施形態における細胞接着期１１と誘導期１２との両ステージを区別することなく同一視して評価している。しかしながら、本実施形態において前記両ステージが明らかに異なる性質のステージであることが確認されていることから、前記報告にあるラグタイムの評価自体がその細胞の培養過程を的確に表現するには不足したものであると言える。
【００５７】
・ 見かけの倍加時間ｔd、平均の比増殖速度μave又は１細胞の倍加時間ｔd1を、対数増殖期１３におけるパラメータとすることによって、対数増殖期１３を容易に定量評価することができる。接着可能率α及び時定数τを細胞接着期１１におけるパラメータとすることによって、細胞接着期１１を容易に定量評価することができる。誘導係数β及び基準誘導時間γを誘導期１２におけるパラメータとすることによって、誘導期１２を容易に定量評価することができる。増殖度Ｙ（ｔ）を対数増殖期１３又は定常期１４におけるパラメータとすることによって、それらのステージを容易に定量評価することができる。
【００５８】
・ この培養細胞増殖予測方法は、上記パラメータを用いて細胞の増殖過程を定量的に予測するものであることから、その細胞の増殖過程をより的確かつ詳細に予測することができる。また、この培養細胞増殖制御方法は、前記培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、細胞の増殖制御を定量的に行うものであることから、その細胞の増殖制御をより適切に行うことができる。さらに、培養細胞評価方法を細胞年齢の推定に利用し、その推定結果を加味することによって、より一層的確な増殖予測を行うことができるうえ、より一層適切な増殖制御を行うことができる。
（第２実施形態）
この発明の第２実施形態を上記第１実施形態と異なる点を中心に説明する。
【００５９】
本実施形態の組織培養評価方法は、細胞から構成される組織を培養容器内で３次元培養して組織形成させる際に、その細胞固有の組織形成過程を評価するためのものである。前記細胞は上記第１実施形態と同じ種類の細胞が使用される。
【００６０】
前記組織形成過程は、単層培養過程と３次元培養過程とから構成される。前記単層培養過程は、上記第１実施形態の単層培養過程と同様に、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４の４種のステージから構成される。また、前記３次元培養過程は、細胞を培養容器内で３次元培養する過程であり、３次元培養期から構成される。
【００６１】
前記３次元培養としては、多層化培養又は３次元空間培養が挙げられる。前記多層化培養は、培養容器の底面上で細胞が複数の層状構造を形成するように培養することであり、通常は上層ほど細胞分化が進行した細胞によって構成される。すなわち、この多層化培養は、生体内で多層化されて存在する皮膚等の組織を培養容器内で再構築するための培養である。
【００６２】
一方、前記３次元空間培養は、培養容器内に１枚又は複数枚のスポンジシートを積層し、それら各スポンジシート表面又はスポンジシート内部のスポンジ表面上に細胞を単層で培養するものである。前記スポンジシートとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、テフロン等からなる合成樹脂シート、コラーゲン、フィブロネクチン、ケラチン等からなる生体高分子シート、又はポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体等からなる生分解性高分子シートが好適に使用される。さらに、このスポンジシートの培養面には、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等の細胞外マトリックスがコーティングされているのが好ましい。
【００６３】
多層化培養における３次元培養期は、培養容器の底面上で単層でコンフルエント状態になった細胞の多層化が開始されてから後の期間である。このステージの細胞は、例えば、細胞の分化誘導因子を含有する多層化培養用の培地中で培養されることによって、親細胞の下に娘細胞が配置されるように細胞分裂が進行する。さらに、前記親細胞は、通常それ以降の細胞分裂が抑制されて分化誘導される。前記分化誘導因子としては、例えばカルシウムイオンが挙げられ、ヒト角化細胞の培養においては、通常、単層培養用の培地には０．１ｍＭのカルシウムイオンが含有され、多層化培養用の培地には１．２ｍＭのカルシウムイオンが含有される。
【００６４】
或いは、熱ショックタンパク質のプロモーターとともに分化誘導能を有する外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、前記外来遺伝子の転写を促進させることによって分化誘導を行うことができる。このとき、３次元培養期の開始に際して、培養温度を４２〜４７℃の温度に急激に上昇させるのが好ましい。さらに、前記形質転換細胞の死を抑制するために、培地全体が前記温度になった直後に通常の培養温度に戻すのがより好ましい。
【００６５】
一方、前記３次元空間培養は、培養容器の底面上に単層でコンフルエント状態になった細胞の上面にスポンジシートを被覆した後、そのシートの上面に細胞を接種して単層培養するという操作を行い、さらに必要に応じてこれらの操作を反復することによって行われる。また、複数のスポンジシート上で同時に細胞を単層培養してもよい。従って、この３次元空間培養における３次元培養期は、最下層に位置するスポンジシート上に細胞を接種してから後の期間である。また、この３次元培養期は、各スポンジシート毎に、上記第１実施形態の単層培養過程の場合と同じ４種のステージ（細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４）が存在している。そして、この３次元空間培養における３次元培養期を定量評価するためのパラメータとしては、各スポンジシート毎に適用される上記第１実施形態と同様のパラメータが好適に使用される。
【００６６】
また、前記３次元培養としては、多層化培養と３次元空間培養とを組み合わせた３次元空間多層化培養であってもよい。この３次元空間多層化培養は、前記３次元空間培養において、培養容器の底面及び各スポンジシートから選ばれる少なくとも１種の培養面上に、多層化された細胞を培養するものである。また、前記多層化された細胞の代わりに細胞塊を培養してもよい。この３次元空間多層化培養における３次元培養期は、前記多層化培養における３次元培養期と、３次元空間培養における３次元培養期とを適宜組み合わせることによって定量評価され、それらのパラメータを好適に使用することができる。
【００６７】
この３次元培養期をモニタリングする際には、例えば、培養容器内の組織をそのまま採取して組織切片を作製した後、その組織切片を顕微鏡下で観察することによって行われる。或いは、顕微鏡の焦点深度を変化させて、培養容器内の組織の各層における生存細胞数を目視によって計測したり、写真撮影又はＣＣＤカメラを利用した画像解析手段を用いて計測することによってモニタリングすることもできる。また、培養容器内の組織を核磁気共鳴装置（ＭＲＩ）等の画像解析手段を用いて観察し、様々な方向（特に鉛直方向及び水平方向）から見たときの画像を画像処理装置によって処理することによってモニタリングすることも可能である。また、細胞の特定の分化状態にのみ発現される分化発現マーカーを検出することによってモニタリングすることもできる。
【００６８】
本実施形態の培養細胞増殖予測方法は、上記組織培養評価方法によって評価された結果を用いて、細胞の組織形成過程を予測するものである。この培養細胞増殖予測方法は、単層培養過程予測方法と、３次元培養過程予測方法とから構成される。
【００６９】
前記単層培養過程予測方法は、上記第１実施形態の培養細胞増殖予測方法と同様である。一方、前記３次元培養過程予測方法としては、前記多層化培養における組織形成過程を予測するための多層化培養過程予測方法、前記３次元空間培養における組織形成過程を予測するための３次元空間培養過程予測方法、又は前記３次元空間多層化培養における組織形成過程を予測するための３次元空間多層化培養過程予測方法が挙げられる。
【００７０】
前記多層化培養過程予測方法は、例えば、多層化培養における３次元培養期を定量評価するためのパラメータを用いて、図７（ａ）に示されるようなグラフ上に、培養時間ｔと層数との関係を示す計算線を作製し、その計算線に基づいて同一株の細胞の組織形成過程を予測することによって行われる。このとき、多層化培養において所望とする層数に到達するまでの培養時間ｔを的確に予測することができる。また、接種濃度Ｘoから、所定の培養時間ｔにおける層数を予測することができるうえ、その後の組織形成過程の進行を的確に予測することができる。
【００７１】
前記３次元空間培養過程予測方法は、各スポンジシート毎に前記単層培養過程予測方法を適用して、同一株の細胞に対してその組織形成過程を予測するものである。このとき、上記第１実施形態の培養細胞増殖予測方法と同様に、各層毎に接種濃度Ｘoと、その層における現在の接着濃度Ｘaとから、その層の細胞が細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３及び定常期１４に到達するまでの培養時間ｔをそれぞれ的確に予測することができる。また、各層における接種濃度Ｘoと現在の接着濃度Ｘaとから、その層における細胞のステージを予測することができるうえ、その層におけるその後の組織形成過程を的確に予測することができる。
【００７２】
前記３次元空間多層化培養過程予測方法は、細胞が単層培養されている培養容器底面又はスポンジシートに対しては前記単層培養過程予測方法を適用し、多層化培養されている培養容器底面又はスポンジシートに対しては、単層培養過程予測方法と多層化培養過程予測方法を適用するものである。そして、この３次元空間多層化培養予測方法は、同一株の細胞に対してその組織形成過程を予測することができる。
【００７３】
本実施形態の培養細胞増殖制御方法は、上記培養細胞増殖予測方法によって予測された結果を用いて、細胞の組織形成過程を制御するものである。この培養細胞増殖制御方法としては、例えば、培地交換時期の制御、培地種類の切替え時期の制御、培養温度の制御等の培養操作の制御が挙げられる。前記培地交換時期の制御及び培養温度の制御は、上記第１実施形態の場合と同様である。
【００７４】
前記培地種類の切替え時期の制御としては、例えば、単層培養過程から３次元培養（多層化培養）過程に移行させる際に、分化誘導因子を含有する培地に切替えるための制御が挙げられる。また、単層培養又は３次元空間培養過程において、増殖因子や血清を大量に必要とする対数増殖期１３に、増殖因子濃度又は血清濃度を高めた培地に切替えることにより、対数増殖期１３の進行をより一層促進させることができる。或いは、培地中の成分のうち、特定のステージにおいて特に消費速度が速い物質の濃度を高めた培地を、そのステージになったところで切替えることにより、組織形成過程を迅速かつ円滑に進行させるように制御してもよい。一方、外来遺伝子を導入した形質転換細胞に対しては、その遺伝子の発現を調節するための遺伝子発現調節因子を含有する培地に切替えることによって、その遺伝子の発現を制御してもよい。
【００７５】
一方、上記組織培養評価方法を利用して、例えば細胞年齢の推定を行うことができ、その細胞の残りの分裂回数を予測して組織形成過程の予測等に役立てることができる。この細胞年齢の推定方法は、前記単層培養過程における培養細胞評価方法で得られたパラメータを用いて、上記第１実施形態の場合と同様に行うのが好ましく、この場合にはモニタリングが容易であることから、より容易かつ的確に細胞年齢の推定を行うことができる。また、３次元培養における組織培養過程を評価した結果得られるパラメータを用いて細胞年齢の推定を行ってもよく、前記単層培養過程のパラメータと組織培養過程のパラメータとを組み合わせて細胞年齢の推定を行ってもよい。
【００７６】
さらに、この細胞年齢の推定結果を上記培養細胞増殖予測方法に反映させて、細胞の組織形成過程を予測することによって、細胞年齢を加味したより的確な予測を行うことができるうえ、その予測結果を利用して前記細胞の組織形成過程をより適切に制御することもできる。また、例えば、老化した生物個体から採取した細胞年齢の高い老化細胞に対しては、その細胞を用いて目的とする組織形成を最終段階まで進行させることができるか否かを予測することができて大変便利である。
【００７７】
上記第２実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
・ この組織培養評価方法は、細胞の組織培養過程を、細胞接着期１１、誘導期１２、対数増殖期１３、定常期１４及び３次元培養期の５種のステージに分類するとともに、これら５種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出して定量評価するものである。このため、前記パラメータを用いて細胞の組織形成過程をステージ毎に部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を組織培養過程全体に適用することによって、その組織形成過程全体を容易に把握することができる。
【００７８】
・ この培養細胞増殖予測方法は、上記パラメータを用いて細胞の組織形成過程を定量的に予測するものであることから、その細胞の組織形成過程をより的確かつ詳細に予測することができる。また、この培養細胞増殖制御方法は、前記培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、細胞の組織形成過程を定量的に制御するものであることから、その細胞の組織形成過程の制御をより適切に行うことができる。さらに、組織培養評価方法を細胞年齢の推定に利用し、その推定結果を加味することによって、より一層的確な組織形成過程の予測を行うことができるうえ、より一層適切な組織形成過程の制御を行うことができる。
【００７９】
【実施例】
以下、上記各実施形態を具体化した実施例について説明する。
＜ヒト角化細胞の培養細胞評価（単層培養）＞
（ヒト角化細胞の調製）
皮膚潰瘍患者（成人男性）の正常皮膚組織を採取した後、トリプシンを用いてヒト角化細胞（keratinocytes）を単離した。
【００８０】
（ヒト角化細胞の単層培養条件）
培養容器：Ｔ−フラスコ（Nuncoln Delta Flask,Nunk Co.,NY,USA；底面積２５ｃｍ2）
培地：無血清培地 Keratinocytes−ＳＦＭ(Life Technology Co.,MD,USA）
培養液量：約１０ｍｌ（前記Ｔ−フラスコに４ｍｍ深さ）
培養液交換：７２時間毎
インキュベーション：３７℃、５％ＣＯ2
｛予備単層培養試験｝
ヒト角化細胞を１．０×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種し、上記単層培養条件で２ヶ月間培養しながらその細胞の様子を観察するとともに、接着濃度Ｘa（細胞／ｃｍ2）を適時計測した。さらに、前記接着濃度Ｘaの計測結果から見かけの倍加時間ｔd（時間）を決定するとともに、培養容器底面上での接着面積Ａc（ｃｍ2）を決定した。なお、前記接着濃度Ｘaの計測方法は、培養容器の底面に接着している細胞をトリプシンにてその底面から剥離させ、その剥離された細胞数を血球計算盤を用いて顕微鏡下で計測し、その計測結果を用いて算出することによって行われた。その結果、この細胞の増殖及び形態には顕著な変化は見られなかった。一方、このヒト角化細胞の培養容器底面上での接着面積Ａcは約２．０５×１０-5ｃｍ2であり、見かけの倍加時間ｔdは約６４．５時間であったことが判明した。
【００８１】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価１｝
ヒト角化細胞を５．０×１０3、９．８×１０3、１．６×１０4及び２．７×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでそれぞれ培養容器内に接種した。これらの細胞を上記単層培養条件で培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果及びその結果から導出される計算線を図４に示す。
【００８２】
（細胞接着期の評価１）
図４に示されるように、９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで接種したヒト角化細胞の接着濃度Ｘaを経時的にモニタリングした結果及びその計算線から、この接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したとき、細胞接種からほぼ１５時間後（ｔ＝０〜１５時間）までは接着濃度Ｘaが急激に増大したことが示され、この期間が細胞接着期１１であることが推測される。また、その他の接種濃度Ｘoにおける細胞接着期１１についてもほぼ同様であったことが示された。
【００８３】
（誘導期の評価）
図４に示される９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したときの計算線から、ｔ＝１５〜４４時間まではおよそ５．０×１０3細胞／ｃｍ2の接着濃度Ｘaでほぼ一定であったことが示され、この期間が誘導期１２であることが推測される。従って、この接種濃度ＸoにおけるラグタイムｔLは４４時間であることが判明した。また、その他の接種濃度ＸoにおけるラグタイムｔLは、図４に示されるように、Ｘo＝５．０×１０3細胞／ｃｍ2のときにｔL＝６０時間、Ｘo＝１．６×１０4細胞／ｃｍ2のときにｔL＝２５時間、Ｘo＝２．７×１０4細胞／ｃｍ2のときにｔL＝２０時間であったことが示された。
【００８４】
これら各接種濃度ＸoとラグタイムｔLとの関係を図５に示される片対数グラフ上にプロットするとともに上記方程式（２）に代入することによって、誘導係数β＝−２５．２時間及び基準誘導時間γ＝２７４時間が導出された。また、前記誘導係数βの値は、図５に示されるグラフの傾きに対応して負の値となっており、接種濃度Ｘoの増加とともにラグタイムｔLの減少が見られることが判明した。
【００８５】
（対数増殖期の評価）
図４に示される９．７×１０3細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したときの計算線から、ｔ＝４４時間以降の接着濃度Ｘaが急激に増大したことが示され、この期間が対数増殖期１３であることが推測される。そして、接着濃度Ｘaがおよそ４．５×１０4細胞／ｃｍ2になったところでその上昇が停止し、ヒト角化細胞が定常期１４に入ったことが推測される。
【００８６】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価２｝
（細胞接着期の評価２）
ヒト角化細胞を１．０×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種した。この細胞を上記単層培養条件で３６時間培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果及びその結果から導出される計算線を図３に示す。
【００８７】
図３に示されるように、この接種濃度Ｘoでヒト角化細胞を培養したとき、細胞接種からほぼ１２時間後（ｔ＝０〜１２時間）までは接着濃度Ｘaが急激に上昇したことが示され、この期間が細胞接着期１１であることが推測される。また、ｔ＝１２時間以降の接着濃度Ｘaはおよそ５．０×１０3細胞／ｃｍ2であったことが示され、約５５％の細胞が生存細胞であったことが示された。さらに、図３に示される培養時間ｔと接着細胞割合（Ｘa／Ｘo）との関係を上記方程式（１）に代入することによって、接着可能率α＝０．５５２及び時定数τ＝４．００時間が導出された。
【００８８】
｛ヒト角化細胞の単層培養過程の評価３｝
（増殖度の評価及び予測）
ヒト角化細胞を５．２×１０2〜５．２×１０4細胞／ｃｍ2の範囲内の種々の接種濃度Ｘoで培養容器内に接種し、これらの細胞を上記単層培養条件で１４４時間培養しながら、前記接着濃度Ｘaの計測方法を用いて適時接着濃度Ｘaを計測した。これらの計測結果から、各接種濃度Ｘoにおける増殖度Ｙ（１４４）を算出し、図６に示される片対数グラフ上にプロットするとともに、非線形最小二乗法を用いて導出された計算線（実線で示される）を図６に示した。
【００８９】
図６に示されるように、１４４時間培養した後の増殖度Ｙ（１４４）は、接種濃度Ｘoが５．２×１０2から１．７×１０4細胞／ｃｍ2へと増大するのに伴って増大し、１．７×１０4細胞／ｃｍ2を越えると減少することが示された。また、接種濃度Ｘoが１．７×１０4細胞／ｃｍ2のときに最大となる増殖度Ｙ（１４４）はおよそ１．８であり、この増殖度は接種濃度Ｘoが５．２×１０2及び５．２×１０4細胞／ｃｍ2のときの増殖度Ｙ（１４４）に対して、それぞれおよそ２．５倍及び１．９倍大きいことが示された。
【００９０】
また、この試験における増殖度Ｙ（１４４）の実測値と計算値と間の相関係数は０．９６であった。従って、様々な接種濃度Ｘoにおけるヒト角化細胞の単層培養において、上記モデルが細胞の培養過程を非常に適切に表現することができるものであることが確認された。
【００９１】
さらに、上記ヒト角化細胞の単層培養過程を評価したときに得られた種々のパラメータを用いて、この細胞を同条件で９６時間及び１９２時間培養した場合の増殖予測を行った計算線を、それぞれ図６の一点鎖線及び点線で示した。
【００９２】
＜ヒト角化細胞の組織培養シミュレーション＞
ヒト角化細胞を１．１×１０4細胞／ｃｍ2の接種濃度Ｘoで上記単層培養条件で２００時間培養した後、１．２ｍＭカルシウムイオン含有無血清培地 Keratinocytes−ＳＦＭを培地とした多層化培養条件で３００時間多層化培養を行った場合について、ＩＢＭコンピュータ（Mebius,Sharp Co.,Osaka；Lab VIEW software(National Instrument Co.,TX,USA)）を用いてシミュレーションを行った。そのシミュレーション結果を図７（ａ）に示すとともに、そのシミュレーション結果から導出される２００時間後、３００時間後及び４００時間後の各層における被覆率を図７（ｂ）に示す。
【００９３】
図７（ａ）及び（ｂ）の結果より、培養時間ｔの増加とともに培養容器内の３次元培養組織の層数が増加し、皮膚移植が可能な時期（例えば、７層目が完成した時間である約５００時間）を推定することができた。
【００９４】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
・ 接着依存性細胞を培養容器内で３次元培養して組織形成させる際に、その細胞固有の組織形成過程を評価するための組織培養評価方法であって、前記組織形成過程を、前記細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでの細胞接着期と、前記接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの誘導期と、前記細胞分裂の開始後から培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの対数増殖期と、前記コンフルエント状態になってから細胞が３次元培養されるまでの定常期と、前記細胞の３次元培養が開始された後の３次元培養期と、からなる５種のステージに分類するとともに、これら５種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出し、前記接着依存性細胞の組織形成過程を定量評価することを特徴とする組織培養評価方法。
【００９５】
このように構成した場合、接着依存性細胞から構成される組織形成過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその組織形成過程全体を容易に把握することができる。
【００９６】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば、次のような効果を奏する。
請求項１に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、接着依存性細胞の単層培養過程を部分的に定量評価することができるうえ、その評価結果を用いてその培養過程全体を容易に把握することができる。
【００９７】
請求項２に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１に記載の発明の効果に加えて、対数増殖期を容易に定量評価することができる。
請求項３に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１又は請求項２に記載の発明の効果に加えて、細胞接着期を容易に定量評価することができる。
【００９８】
請求項４に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項３に記載の発明の効果に加えて、誘導期を容易に定量評価することができる。
請求項５に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、請求項１から請求項４のいずれかに記載の発明の効果に加えて、対数増殖期又は定常期を容易に定量評価することができる。
【００９９】
請求項６に記載の発明の培養細胞増殖予測方法によれば、接着依存性細胞の増殖過程を的確に予測することができる。
請求項７に記載の発明の培養細胞増殖制御方法によれば、接着依存性細胞の増殖を適切に制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 接着依存性細胞の単層培養過程を模式的に示す片対数グラフ。
【図２】 培養容器底面上での細胞分裂過程を模式的に示す平面図。
【図３】 細胞接着期での培養時間と接着細胞割合の関係を示すグラフ。
【図４】 培養時間と接着細胞濃度の関係を示す片対数グラフ。
【図５】 誘導期の接種細胞濃度とラグタイムの関係を示す片対数グラフ。
【図６】 接種細胞濃度と増殖度の関係を示す片対数グラフ。
【図７】 （ａ）は組織培養シミュレーションにおける培養時間と層数の関係を示すグラフ、（ｂ）は同じく層数と被覆率の関係を示すグラフ。
【符号の説明】
１１…細胞接着期、１２…誘導期、１３…対数増殖期、１４…定常期、２４，２４ａ…接着依存性細胞。
Claims (7)
- 接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞固有の単層培養過程を評価するための培養細胞評価方法であって、
前記単層培養過程を、
前記接着依存性細胞を培養容器に接種してからその培養容器の底面に接着するまでの細胞接着期と、
前記接着した細胞が細胞分裂を開始するまでの誘導期と、
前記細胞分裂の開始後から培養容器の底面にほぼコンフルエント状態になるまでの対数増殖期と、
前記コンフルエント状態になった後の定常期と、
からなる４種のステージに分類するとともに、これら４種のステージから選ばれる少なくとも１種のステージにおける細胞固有のパラメータを導出し、前記接着依存性細胞の単層培養過程を定量評価することを特徴とする培養細胞評価方法。 - 隣接する接着依存性細胞同士が接触しない接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期をモニタリングすることにより、見かけの倍加時間ｔdを決定し、この見かけの倍加時間ｔdを対数増殖期におけるパラメータとすることを特徴とする請求項１に記載の培養細胞評価方法。
- 種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記細胞接着期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘaとのモニタリング結果を得、それらを下記方程式（１）に代入して接着可能率αと時定数τを決定し、これら接着可能率α及び時定数τを細胞接着期におけるパラメータとすることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の培養細胞評価方法。
- 隣接する接着依存性細胞同士が接触しない接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期をモニタリングすることにより決定された見かけの倍加時間ｔdと、請求項３に記載の接着可能率α及び時定数τを用いて、対数増殖期及び細胞接着期の期間を決定することにより、各接種細胞濃度ＸoにおけるラグタイムｔLを導出するとともに、前記接種細胞濃度ＸoとラグタイムｔLを下記方程式（２）に代入して誘導係数β及び基準誘導時間γを決定し、これら誘導係数β及び基準誘導時間γを誘導期におけるパラメータとすることを特徴とする請求項３に記載の培養細胞評価方法。
- 種々の接種細胞濃度Ｘo条件下において前記対数増殖期又は定常期をモニタリングすることにより、各接種細胞濃度Ｘoにおける培養時間ｔと接着細胞濃度Ｘatとのモニタリング結果を得、それらを下記数式（３）に代入して前記培養時間ｔにおける増殖度Ｙ（ｔ）を決定し、この増殖度Ｙ（ｔ）を対数増殖期又は定常期におけるパラメータとすることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の培養細胞評価方法。
- 請求項１から請求項５のいずれかに記載のパラメータを用いて、接着依存性細胞の増殖過程を予測する培養細胞増殖予測方法。
- 請求項６に記載の培養細胞増殖予測方法により得られた予測結果を用いて、接着依存性細胞の増殖制御を行う培養細胞増殖制御方法。
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