JP4394376B2

JP4394376B2 - 細胞増殖能評価装置及びその方法

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Publication number: JP4394376B2
Application number: JP2003143881A
Authority: JP
Inventors: 正博紀ノ岡; 正仁田谷
Original assignee: 正仁田谷; 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング
Priority date: 2003-05-21
Filing date: 2003-05-21
Publication date: 2010-01-06
Anticipated expiration: 2023-05-21
Also published as: JP2004344049A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞の増殖能を評価する細胞増殖能評価装置及びその方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
近年、ヒト細胞をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特に、ヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。一方、薬品や化粧品などの試験・研究用の組織としても、これらの培養組織は利用されている。このような培養組織製品は、採取組織から所望の細胞を単離するか市販品として購入したあと、培養することによって作製されるが、年齢や採取部位などの採取元の状況、酵素の種類や処理時間などの単離条件、冷凍又は低温時の保存条件、常温への解凍条件、継代培養の回数など多くの要素によって細胞の特性が容易に変化する。このため、個々の細胞特性を把握することが、同じ性状の培養製品を安定して供給するために必要となる。
【０００３】
ところで、本発明者らは、今までに多くの細胞増殖能評価方法を提案している。例えば、特許文献１では、個々の細胞の投影面積、伸展速度、接触細胞数などから細胞集団の増殖能を評価することを提案している。このような細胞増殖能評価方法は、できるだけ種々の方法を用意しておき、培養製品を提供する際にその目的や必要に応じてその中から最適な方法を選択することが好ましい。そういう観点から、今までとは異なる細胞増殖能評価方法やその装置の開発が望まれている。
【０００４】
本発明は、このような課題に鑑みなされたものであり、新たな細胞増殖能評価方法及びその装置を提供することを目的の一つとする。
【０００５】
【特許文献１】
特開２００２−２１８９９５号公報
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
本発明は、細胞の増殖能を評価する細胞増殖能評価装置であって、
予め接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータと細胞増殖能との対応関係を求め該対応関係を記憶した対応関係記憶手段と、
細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出する算出手段と、
前記算出手段によって算出されたパラメータの値に対応する細胞増殖能を前記対応関係記憶手段に記憶された前記対応関係から読み出し報知手段に出力する増殖能出力制御手段と、
を備えたものである。
【０００７】
この細胞増殖能評価装置では、細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際のその培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出し、そのパラメータの値に対応する細胞増殖能を、予め求めておいたそのパラメータと細胞増殖能との対応関係から読み出して報知手段に出力する。したがって、個々の接着依存性細胞の剥離時の挙動を調べることにより各接着依存性細胞の細胞増殖能を比較的簡単に知ることができる。
【０００８】
ここで、「接着依存性細胞」とは、培養面に直接又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着したあとその接着面積を広げていき、その後細胞分裂する細胞のことをいい、足場依存性細胞とも呼ばれる。この接着依存性細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれら細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。また、「培養容器」としては、細胞が培養できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。更に、「報知手段」とは、外部に報知する手段であれば特に限定されないが、例えばディスプレイ等の表示手段や、プリンタ等の印刷手段や、スピーカ等の音声手段などが挙げられる。
【０００９】
本発明の細胞増殖能評価装置において、前記パラメータは、投影面積から算出される接着依存性細胞の外郭の収縮速度又は該収縮速度の逆数であることが好ましい。これらのパラメータは、接着依存性細胞の細胞増殖能と良好な相関関係があるからである。ここで、前記収縮速度は、投影面積が円であると仮定したときの円の径の時間変化割合としてもよい。
【０００１０】
本発明の細胞増殖能評価装置において、前記細胞増殖能は、細胞の残り分裂回数、比増殖速度又は倍加時間であることが好ましい。細胞の残り分裂回数は、接着依存性細胞の投影面積の時間変化に関連するパラメータと良好な相関関係があるからである。延いては、残り分裂回数と相関関係の深い比増殖速度や倍加時間も、接着依存性細胞の投影面積の時間変化に関連するパラメータと良好な相関関係となる。ここで、「残り分裂回数」とは、予め実験的に求めておいた限界分裂回数から現在までの分裂回数を差し引いた値をいい、寿命パラメータの一種である。「比増殖速度」とは、時間に対する細胞数の対数値の変化割合（μ＝（ｌｏｇＮ２−ｌｏｇＮ１）／ｔ２−ｔ１）であり、「倍加時間」とは、細胞集団としての細胞の数が倍になるのに要する時間（ｔｄ＝（ｔ２−ｔ１）・ｌｏｇ２／（ｌｏｇＮ２−ｌｏｇＮ１））であって、いずれも増殖パラメータの一種である。なお、Ｎ１，Ｎ２は各々培養時間ｔ１，ｔ２における細胞数である。
【００１１】
本発明の細胞増殖能評価装置は、前記対応関係記憶手段、前記算出手段及び前記増殖能出力制御手段を備えた細胞増殖能評価コンピュータからなるものとしてもよい。こうすれば、本発明の細胞増殖能評価装置を比較的容易に実現することができる。
【００１２】
本発明は、細胞の増殖能を評価する細胞増殖能評価方法であって、
（ａ）予め接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータと細胞増殖能との対応関係を求めるステップと、
（ｂ）細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で算出されたパラメータの値に対応する細胞増殖能を前記ステップ（ａ）で求めた前記対応関係から読み出し外部に報知するステップと、
を含むものとしてもよい。
【００１３】
この細胞増殖能評価方法では、細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離する際のその培養容器の所定の面に投影された投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出し、そのパラメータの値に対応する細胞増殖能を、予め求めておいたそのパラメータと細胞増殖能との対応関係から読み出して報知手段に出力する。したがって、個々の接着依存性細胞の剥離時の挙動を調べることにより各接着依存性細胞の細胞増殖能を比較的簡単に知ることができる。この細胞増殖能評価方法において、前記パラメータは、投影面積から得られる該細胞の外郭の収縮速度又は該収縮速度の逆数であることが好ましく、収縮速度は、投影面積が円であると仮定したときの円の径の時間変化割合としてもよい。また、前記細胞増殖能は、細胞の残り分裂回数、比増殖速度又は倍加時間であることが好ましい。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。図１は培養容器内の接着依存性細胞の接着状態及び剥離状態を模式的に示す断面図、図２は細胞増殖能評価装置の概略構成図、図３は剥離剤処理時間と接着依存性細胞の円相当径との関係を表すグラフである。
【００１５】
本発明の細胞増殖能評価装置及びその方法の一実施形態は、図２に示すように、接着依存性細胞（以下、細胞という）１１を培地１２で満たされた培養容器１３内で培養し、ほぼコンフルエントな状態になったとき剥離剤を加えて培養容器１３の底面に接着している細胞１１を剥離させたあと回収したときの、細胞１１の細胞増殖能を評価するためのものである。
【００１６】
細胞１１は、培養容器１３の底面に直接又は細胞外マトリックスを介して接着することができると共に、その培養容器１３の底面上で培養することができる性質を有する。この細胞１１の培養過程は、細胞接着期、細胞誘導期及び細胞増殖期からなる３種のステージに分類されるが、この点は周知であるためここではその説明を省略する。そして、細胞１１の増殖が進み、培養容器１３の底面が細胞１１でほぼ覆いつくされてサブコンフルエントな状態になったとき、培養容器１３の底面から細胞１１を剥離させるための剥離剤（トリプシンやプロテイナーゼなど）を加える。すると、剥離した細胞１１が浮遊してくるのでこれを回収し、回収した細胞１１を新たに培養容器１３に播種して培養を行う（継代培養）。ここで、細胞１１が培養容器１３の底面に接着している状態では、図１（ａ）に示すように、細胞１１はやや扁平な状態で培養容器１３の底面と接着面積Ｓａで接着している。このとき、上方から細胞１１を照らしたときの投影面積Ｐａは、接着面積Ｓａに等しいか、大きくなる。一方、細胞１１が培養容器１３の底面から剥離した状態では、図１（ｂ）に示すように、細胞１１はほぼ球状であり接着面積Ｓａはゼロである。このとき、上方から細胞１１を照らしたときの投影面積Ｐａは、浮遊した細胞１１の投影面積となる。このような事情から、剥離剤投入後の経過時間（剥離剤処理時間）ｔＴと細胞１１の投影面積Ｐａとの関係をグラフ化すると、剥離剤投入後しばらくの間は細胞１１の投影面積Ｐａは徐々に減少していくが、剥離剤処理時間ｔＴがある時間に達したあとは細胞１１の投影面積Ｐａはほぼ一定となる。また、剥離剤投入後の細胞１１の投影面積Ｐａの形状を円形と仮定すると、円相当径（半径）ｒはｒ＝（Ｐａ／π）^０．５となる。ここで、剥離剤処理時間ｔＴと細胞１１の円相当径ｒとの関係をグラフ化し、剥離剤処理時間ｔＴがある時間に達するまでのプロットを最小二乗法により一次関数に近似し、そのときの直線の傾きｄｒ／ｄｔの正負を変換した−ｄｒ／ｄｔを収縮速度Ｖとする。このときのグラフの一例を図３に示す。また、この収縮速度Ｖの逆数１／Ｖを接着密度パラメータＤと定義する。なお、δを単位面積あたりの接着タンパク強度つまり細胞表面に存在するタンパク密度パラメータとし、ｋを接着タンパクの溶解速度定数とすれば、収縮速度Ｖはｋ／δ、接着密度パラメータＤはδ／ｋと表すことができる。このようにして算出される収縮速度Ｖ及び接着密度パラメータＤは、いずれも投影面積Ｐａの時間変化に関連するパラメータである。
【００１７】
次に、細胞増殖能評価装置３０の構成について図２に基づいて説明する。この細胞増殖能評価装置３０は、培養容器１３内の細胞１１を培養するためのインキュベータ３１と、細胞１１を上方から照らし出す照明手段としてのＬＥＤランプ３６と、細胞１１の投影面積Ｐａを培養容器１３の底面側から撮影する撮影手段としてのＣＣＤカメラ３７と、各種テーブルを記憶したり各種制御を実行したりするコンピュータ４０とを備えている。インキュベータ３１は、培養容器１３に対して温度、湿度、ＣＯ_２濃度を調節可能な周知の装置であり、５％ＣＯ_２含有エアをボンベ３２から給湿器３３を介して培養容器１３内に供給するライン３４と、培養容器１３内からガスを排出するライン３５とを備えている。ＬＥＤランプ３６は、インキュベータ３１内の天井付近に設置され、培養容器１３を上方から照らすことにより、培養容器１３内の個々の細胞１１を培養容器１３の底面に投影させるものである。ＣＣＤカメラ３７は、インキュベータ３１内の底部に設置された三次元ステージ３８によって支持され、この三次元ステージ３８によって上下・左右・前後に動かされる。このＣＣＤカメラ３７は、ＬＥＤランプ３６によって培養容器１３が照らされているときに培養容器１３の下方から撮影することにより、培養容器１３内の個々の細胞１１が培養容器１３の底面に投影されたときの投影画像を撮影し、その投影画像のデータをケーブル３９を介してコンピュータ４０へ送信する。コンピュータ４０は、ＣＣＤカメラ３７から入力された投影画像に画像解析処理を施し、画像解析処理後の投影画像に基づいて培養容器１３内の個々の細胞１１が底面に投影されたときの投影面積Ｐａを算出し、その投影面積Ｐａから細胞１１の円相当径ｒを算出し、円相当径ｒの時間変化割合から接着密度パラメータＤ（＝−ｄｔ／ｄｒ）を算出し、接着密度パラメータＤと細胞増殖能との対応関係を示すマップ（又はテーブル）からパラメータの値に対応する細胞増殖能を読み出し、これをディスプレイに表示出力する。
【００１８】
次に、この細胞増殖能評価装置３０の動作について図４に基づいて説明する。図４は、細胞増殖能評価プログラムのフローチャートである。オペレータは、培養容器１３の底面が細胞１１でほぼ覆いつくされてサブコンフルエントな状態になったとき、培養容器１３の底面から細胞１１を剥離させるための剥離剤を加え、その直後にコンピュータ４０に細胞増殖能評価開始の指令を入力する。すると、コンピュータ４０は図示しないＨＤＤに記憶されている細胞増殖能評価プログラムを読み出してこれを実行する。このプログラムが開始されると、コンピュータ４０は、予め定められた所定時間が経過したか否かを図示しないタイマのカウント数で判定し（ステップＳ１００）、所定時間が経過していないときにはそのまま待機し、所定時間が経過したときにはＣＣＤカメラ３７から個々の細胞１１が培養容器１３の底面に投影されたときの投影画像を入力し（ステップＳ１１０）、続いてその投影画像に画像解析処理を施して個々の細胞１１の投影面積Ｐａを算出し（ステップＳ１２０）、その投影面積Ｐａから個々の細胞１１の円相当径ｒを算出する（ステップＳ１３０）。投影面積Ｐａは、例えば紀ノ岡らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，ｐ２３４−２３９（２０００））の画像解析手法を投影画像に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の順に画像解析を行い、個々の細胞像を抽出し、各細胞の投影部分の画素数を計測し、この画素数に１画素当りの面積を乗算した値を投影面積Ｐａとする。続いて、ステップＳ１１０〜Ｓ１３０の処理を所定回数だけ行ったか否かを判定し（ステップＳ１４０）、所定回数に達していないときには再びステップＳ１００に戻る。一方、所定回数に達したときには、その所定回数のデータに基づき個々の細胞１１につき最小二乗法により傾きつまり円相当径ｒの時間変化割合ｄｒ／ｄｔを算出し（ステップＳ１５０）、このｄｒ／ｄｔから前述したように接着密度パラメータＤを算出する（ステップＳ１６０）。そして、接着密度パラメータＤと細胞増殖能との対応関係を示すマップから個々の細胞１１の接着密度パラメータＤの値に対応する細胞増殖能を読み出し（ステップＳ１７０）、それらをディスプレイに表示し（ステップＳ１８０）、本プログラムを終了する。
【００１９】
ステップＳ１００の所定時間やステップＳ１４０の所定回数は、図３のグラフにおいて剥離剤投入直後から剥離完了時間に達するまでの間で剥離剤処理時間ｔＴと円相当径ｒのプロットが複数得られるように適宜定められている。もっとも簡易な方法は所定回数を２回とした場合であり、その場合には得られるプロットが２つであるため、最小二乗法を用いなくても両円相当径ｒの差分を所定時間で除した値をｄｒ／ｄｔとすればよい。
【００２０】
細胞増殖能を表すパラメータとしては、限界細胞分裂回数Ｎｄｆから累積細胞分裂回数Ｎｄを差し引いた残り細胞分裂回数Ｎｄｒ（＝Ｎｄｆ−Ｎｄ）を用いる。ここで、累積細胞分裂回数Ｎｄについて説明する。継代回数Ｎｐにおける細胞分裂回数をＮ_ｄ，Ｎｐ、培養開始時の細胞接種濃度をＸ０とすると、Ｎ_ｄ，Ｎｐは下記式（１）で表される。そして、一連の継代培養における累積細胞分裂回数Ｎｄは、各継代培養の総和つまり下記式（２）として表される。ここで、Ｘａは培養容器の底面の単位面積あたりに接着している細胞数を表すパラメータであり、ＣＣＤカメラ３７によって撮影された画像の面積をＳ、その面積Ｓに占める接着細胞数をｎａとすると、Ｘａは下記式（３）で表される。なお、接着細胞数ｎａは、面積Ｓ内の細胞のうち投影面積Ｐａが閾値Ｔを超えるものの数である。この閾値Ｔは、細胞培養後にＰＢＳ洗浄により未接着細胞を除去し接着細胞のみとしたときの投影面積Ｐａの最小値とする。
【００２１】
【数１】
Ｎ_ｄ，Ｎｐ＝ｌｏｇ_２（Ｘａ／Ｘ０）…（１）
Ｎｄ＝ΣＮ_ｄ，Ｎｐ …（２）
Ｘａ＝ｎａ／Ｓ …（３）
【００２２】
限界細胞分裂回数Ｎｄｆは、培養時間ｔと累積細胞分裂回数Ｎｄとの関係をグラフ化し、時間ｔの変化に対する累積細胞分裂回数Ｎｄの変化がほぼゼロになった時点での累積細胞分裂回数Ｎｄを限界細胞分裂回数Ｎｄｆとする。このときのグラフの一例を図５に示す。図５のグラフにおいて、例えば点ａ，ｂ，ｃの培養時間における培養容器１３内の細胞１１につき、それらの接着密度パラメータＤの頻度分布つまり接着密度パラメータＤに対応する細胞１１の存在個数を調べ、その接着強度の平均値Ｄａｖと残り細胞分裂回数Ｎｄｒとの対応関係を予めマップにしてコンピュータ４０の図示しないＨＤＤに保存しておく。なお、培養する細胞種や培養条件ごとに対応関係を示すマップを作成しＨＤＤに保存しておき、細胞増殖能を調べようとする細胞種や培養条件に適するマップを選択して使用することが好ましい。また、接着密度パラメータＤの頻度分布からは、所定範囲内の接着密度パラメータＤを有する細胞の細胞集団に占める割合を求めることによって、個々の細胞だけでなく、細胞集団の増殖能を評価することもできる。
【００２３】
以上詳述した本実施形態の細胞増殖能評価装置３０によれば、個々の細胞１１の剥離時の挙動を調べることにより各細胞１１の細胞増殖能を比較的簡単に知ることができる。また、細胞１１の投影画像をＣＣＤカメラ３７により容易且つ安価に得ることができ、ひいては本装置全体のコストを低く抑えることができる。更に、投影面積Ｐａの時間変化に関連するパラメータである接着密度パラメータＤを用いて細胞増殖能を的確に評価することができる。特に、細胞分裂が何度も繰り返されて残り細胞分裂回数Ｎｄｒが短くなった細胞１１は、接着時の投影面積Ｐａが大きく、剥離剤を投入してから剥離するまでの収縮速度Ｖが速いという性質を持つ。一方、細胞分裂があまり繰り返されておらず残り細胞分裂回数Ｎｄｒの長い細胞１１は、接着時の投影面積Ｐａが小さく、剥離剤を投入してから剥離するまでの収縮速度Ｖが遅いという性質を持つ。これに対し、細胞の接着強度αは投影面積Ｐａ（接着面積Ｓａ）と単位面積あたりの接着タンパク強度δの積で示されるため、剥離のタイミングが一様でなく、培養容器１３内に両者が混在している場合、剥離剤処理時間がある時間となった時点で剥離して浮遊している細胞を回収すると、図６に示すように、細胞増殖能つまり余命の異なる細胞１１が回収したものの中に混在する可能性がある。これに対して、本実施形態では、投影面積Ｐａの時間変化に関連するパラメータを用いて各細胞１１を評価するため、両者を区別して回収することができる。あるいは、増殖能の異なる細胞が混在している状況を頻度分布として入手し、細胞集合全体の増殖能として評価することができる。
【００２４】
なお、本発明は上述した実施形態に何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることは勿論である。例えば、上述した実施形態では、投影面積の時間変化に関連するパラメータとして接着密度パラメータＤを採用したが、その代わりに収縮速度Ｖを用いたり投影面積Ｐａの時間変化割合を用いたりしてもよい。また、細胞増殖能として残り細胞分裂回数Ｎｄｒを採用したが、その代わりに比増殖速度μや倍加時間（Doubling Time）ｔｄを用いてもよい。
【００２５】
【実施例】
１．継代培養方法
細胞１１として新生児由来のヒト角化細胞（Ｓｔ．ｎｏ．Ｏｃｏ２１５，クラボウ（株））、培地１２としてヒト角化細胞用無血清培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２）、培養容器１３としてＴ型フラスコを用いて培養した。具体的には、培地１２を液深さ４ｍｍになるように注入し、培養温度３７℃、ＣＯ_２濃度５％の加湿空気の下、インキュベータ３１内で培養を行った。細胞接種濃度は１．０×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２とした。培養中、培養容器１３の下部からＣＣＤカメラ３７によって画像を撮影し、上記式（１）〜（３）より累積細胞分裂回数Ｎｄを求めた。継代操作は被覆率がサブコンフルエントである７〜８割に達した時点で培養容器１３中の培地１２を抜き出し、ＰＢＳにて２回洗浄後、細胞１１をトリプシン処理により剥離、回収し、新たな培養容器１３に接種した。そして、倍加時間が２０３（ｈｒ）を超えた時点で寿命に達したとし、そのときの累積細胞分裂回数Ｎｄを限界分裂回数Ｎｄｆ（＝１９．７）とした。図７は、このときの培養時間ｔＴと累積細胞分裂回数Ｎｄとの関係をグラフ化したものである。また、残り細胞分裂回数Ｎｄｒ（＝Ｎｄｆ−Ｎｄ）を細胞の寿命パラメータとした。
【００２６】
２．円相当径の経時変化
細胞の投影面積Ｐａは３０秒毎撮影し、剥離剤投入時から１８０秒経過までの円相当径ｒの値を求め、最小二乗法により直線の傾きつまり円相当径ｒの時間変化割合ｄｒ／ｄｔを求めた。このときの一例を図８に示す。
【００２７】
３．剥離挙動解析法
図７における点Ａ，Ｂ，Ｃの各々において、剥離挙動解析を行った。剥離挙動解析は以下のようにして行った。即ち、継代操作中のトリプシン処理による剥離の際に、ＣＣＤカメラ３７を付設した顕微鏡にて剥離操作中の細胞１１の画像撮影を行った。撮影した画像より各細胞１１の投影面積Ｐａを求め、各細胞１１の円相当径ｒを算出し、ｄｒ／ｄｔより接着密度パラメータＤを求め、約２０個の細胞を観察することで、接着密度パラメータＤのヒストグラムを作成した（図９参照）。また、点Ａ，Ｂ，Ｃの各々において、各細胞１１の接着密度パラメータＤの平均値を平均接着密度パラメータＤａｖとした。その結果、図９に示すように、点Ａでは平均接着密度パラメータＤａｖが３９．１で残り細胞分裂回数Ｎｄｒが７．１、点Ｂでは平均接着密度パラメータＤａｖが３２．５で残り細胞分裂回数Ｎｄｒが３．６、点Ｃでは平均接着密度パラメータＤａｖが２０．８で残り細胞分裂回数Ｎｄｒが０．１２であった。この結果から、残り細胞分裂回数Ｎｄｒが短くなるにつれ接着密度パラメータＤが小さくなり、細胞は早く剥がれる傾向にあることが示された。このような剥離挙動解析を点Ａ，Ｂ，Ｃの３点だけでなく、より多くの点について行ったあと、それらに基づいて接着密度パラメータＤと残り細胞分裂回数Ｎｄｒとの関係をマップ化することにより、このマップを用いて個々の細胞１１の細胞増殖能を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】培養容器内の接着依存性細胞の接着状態及び剥離状態を模式的に示す断面図である。
【図２】細胞増殖能評価装置の概略構成図である。
【図３】剥離剤処理時間と接着依存性細胞の円相当径との関係を表す模式的なグラフである。
【図４】細胞増殖能評価プログラムのフローチャートである。
【図５】培養時間と累積細胞分裂回数との関係を表す模式的なグラフである。
【図６】残り細胞分裂回数の短い細胞と長い細胞の挙動を表す模式的なグラフである。
【図７】実施例における培養時間と累積細胞分裂回数との関係を表すグラフである。
【図８】実施例におけるトリプシン処理時間と接着依存性細胞の円相当径との関係を表すグラフである。
【図９】実施例における接着強度と残り細胞分裂回数との関係を表すグラフである。
【符号の説明】
１１細胞、１２培地、１３培養容器、３０細胞増殖能評価装置、３１インキュベータ、３２ボンベ、３３給湿器、３４，３５ライン、３６ＬＥＤランプ、３７ＣＣＤカメラ、３８三次元ステージ、３９ケーブル、４０コンピュータ、Ｎｄ累積細胞分裂回数、Ｎｄｆ限界細胞分裂回数、Ｎｄｒ残り細胞分裂回数、Ｐａ投影面積、Ｖ収縮速度、Ｄ接着密度パラメータ。

Claims

細胞の増殖能を評価する細胞増殖能評価装置であって、
予め接着依存性細胞につき培養容器から剥離剤により剥離する際の培養容器の所定の面に投影された剥離時投影面積の時間変化に関連するパラメータと細胞増殖能との対応関係を求め該対応関係を記憶した対応関係記憶手段と、
細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離剤により剥離する際の培養容器の所定の面に投影された剥離時投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出する算出手段と、
前記算出手段によって算出されたパラメータの値に対応する細胞増殖能を前記対応関係記憶手段に記憶された前記対応関係から読み出し報知手段に出力する増殖能出力制御手段と、
を備え、
前記パラメータは、剥離時投影面積の時間変化，剥離時投影面積から算出される接着依存性細胞の外郭の収縮速度，該収縮速度の逆数のいずれかである、
細胞増殖能評価装置。
前記収縮速度は、剥離時投影面積が円であると仮定したときの円の径の時間変化割合である、
請求項１に記載の細胞増殖能評価装置。
前記細胞増殖能は、細胞の残り分裂回数、比増殖速度又は倍加時間である、
請求項１又は２に記載の細胞増殖能評価装置。
前記対応関係記憶手段、前記算出手段及び前記増殖能出力制御手段を備えた細胞増殖能評価コンピュータからなる、
請求項１〜３のいずれかに記載の細胞増殖能評価装置。
細胞の増殖能を評価する細胞増殖能評価方法であって、
（ａ）予め接着依存性細胞につき培養容器から剥離剤により剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された剥離時投影面積の時間変化に関連するパラメータと細胞増殖能との対応関係を求めるステップと、
（ｂ）細胞増殖能の調査対象としての接着依存性細胞につき培養容器から剥離剤により剥離する際の該培養容器の所定の面に投影された剥離時投影面積の時間変化に関連するパラメータの値を算出するステップと、
（ｃ）前記ステップ（ｂ）で算出されたパラメータの値に対応する細胞増殖能を前記ステップ（ａ）で求めた前記対応関係から読み出し外部に報知するステップと、
を含み、
前記パラメータは、剥離時投影面積の時間変化，剥離時投影面積から算出される接着依存性細胞の外郭の収縮速度，該収縮速度の逆数のいずれかである、
細胞増殖能評価方法。
前記収縮速度は、剥離時投影面積が円であると仮定したときの円の径の時間変化割合である、
請求項５に記載の細胞増殖能評価方法。
前記細胞増殖能は、細胞の残り分裂回数、比増殖速度又は倍加時間である、
請求項５又は６に記載の細胞増殖能評価方法。