JP4095811B2

JP4095811B2 - 剥離細胞選別装置、剥離細胞選別方法及びそのプログラム

Info

Publication number: JP4095811B2
Application number: JP2002043549A
Authority: JP
Inventors: 良太梅垣; 正博紀ノ岡; 正仁田谷
Original assignee: 正仁田谷; 株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2022-02-20
Also published as: JP2003235540A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、剥離細胞選別装置、剥離細胞選別方法及びそのプログラムに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く報告されている。特にヒト皮膚組織については、欧米において商品化レベルにまで達している。ここで、ヒト皮膚組織、例えばヒト表皮角化細胞(Keratinocyte)による培養細胞シートの製品化のフローを図８に基づいて説明する。まず、患者又はドナーの健康な部位から少量の組織片を採取し、酵素処理によって細胞を分散させた後、角化細胞を分離・回収する（ステップＳ１）。次に、その角化細胞を用いて初代培養を行う（ステップＳ２）。その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容器に分けて接種（播種）し（ステップＳ３）、培地交換等の操作を必要に応じて行うと、細胞が培養面に接着したあと増殖して培養面での細胞の占める面積が徐々に増加し、所定面積に達してコンフルエントな状態となる（ステップＳ４）。このとき、製品として総合的に必要となる十分な面積（細胞数）が確保されたか否かをチェックし（ステップＳ５）、確保されていなければ培地を除去したあと培養面に接着している細胞をトリプシンなどのプロテアーゼによって培養面から剥離させたあと回収し（ステップＳ６）、必要な面積が確保されるまで継代培養を繰り返し行うことで面積を増やす。一方、必要な面積が確保されたならば、組織構築のために三次元培養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステップＳ８）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
ところで、ステップ６の剥離操作において、プロテアーゼの処理時間が長いと、細胞がダメージを受けてその後の継代培養に支障が生じることがある。このため、剥離操作において、時間経過に伴って細胞の剥離状況を逐次把握することにより、プロテアーゼ処理時間の最適化を図ることが望ましい。
【０００４】
一方、ステップ６の剥離操作におけるプロテアーゼの処理では、細胞が剥離するまでに要する時間が個々の細胞で異なるため、この点も考慮して培養面から剥離した細胞を回収することが望ましい。
【０００５】
本発明は上述した問題点を解決することを課題とするものであり、培養容器で培養している細胞につき容易に剥離の有無を選別できる剥離細胞選別装置、剥離細胞選別方法、及びそのプログラムを提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】
本発明は上述した目的を達成するために以下の構成を採用した。
【０００７】
本発明の第１は、培養容器内の個々の接着依存性細胞につき前記培養容器の所定の面に投影された投影面積を算出する投影面積算出手段と、前記投影面積に基づいて個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別する選別手段とを備えた剥離細胞選別装置に関する。この装置では、培養容器内の個々の接着依存性細胞につき、培養容器の所定の面に投影された投影面積に基づいて培養容器から剥離したか否かを選別するため、特別な熟練などを要することなく細胞が剥離したか否かを容易に選別できる。
【０００８】
ここで、「接着依存性細胞」とは、まず培養容器の所定の面に直接接着するか又は細胞外マトリックスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広がっていき、その後細胞分裂する細胞のことをいう。例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用することもできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロモータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させるように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。
【０００９】
また、「培養容器」としては、細胞が培養できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、アルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好適に使用される。
【００１０】
本発明の第１の剥離細胞選別装置において、前記投影面積算出手段は、接着依存性細胞が接着している培養容器内に剥離剤が投入されたあとの時間経過に伴って前記投影面積を算出してもよい。こうすれば、剥離剤が投入されたあとの経過時間と接着依存性細胞の剥離状況との関係を把握できる。ここで、「剥離剤」とは、接着している接着依存性細胞を剥離する作用を有するものであれば特に限定されないが、例えばトリプシンやディスパーゼなどのプロテアーゼが挙げられる。
【００１１】
本発明の第１の剥離細胞選別装置において、前記選別手段は、剥離開始前の前記投影面積と測定時の前記投影面積との面積比に基づいて個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別してもよい。この面積比は接着依存性細胞の剥離状況を示すパラメータとなり得るため、この面積比に基づいて剥離の有無を選別すれば適切に接着依存性細胞の剥離状況を把握できる。
【００１２】
このとき、前記選別手段は、予め経験的に接着依存性細胞が剥離した時点における前記面積比を求めてこれを閾値と定め、測定時の前記面積比と前記閾値とを比較することにより、個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別してもよい。こうすれば、測定時の前記面積比と前記閾値とを比較して、例えば前者が後者以下又は後者未満ならば剥離している、前者が後者以上又は後者を上回るならば剥離していないという具合に選別できる。
【００１３】
本発明の第１の剥離細胞選別装置は、前記培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記所定の面に投影された投影画像を撮影する撮影手段を備え、前記投影面積算出手段は、前記撮影手段によって得られた投影画像に基づいて前記投影面積を算出してもよい。こうすれば、個々の接着依存性細胞の投影面積を容易且つ安価に得ることができ、ひいては本装置全体のコストを低く抑えることができる。このとき、前記培養容器を照らすことにより前記培養容器内の個々の接着性細胞を前記所定の面に投影させる照明手段を更に備え、前記撮影手段は、前記照明手段によって前記培養容器が照らされているときに前記培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記所定の面に投影された投影画像を撮影してもよい。
【００１４】
本発明の第１の剥離細胞選別装置は、前記培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段と、前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性細胞を前記細胞回収手段に回収させる細胞回収制御手段とを備えていてもよい。こうすれば、培養容器から剥離した接着依存性細胞を早期に回収できる。例えば剥離したあとの接着依存性細胞を剥離剤で処理し続けるとダメージを受けて増殖能力が低下することがあるが、この装置によれば早期に回収できるため、そのようなおそれは解消される。
【００１５】
このとき、前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性細胞の位置を検出する位置検出手段を備え、前記細胞回収制御手段は、前記位置検出手段によって検出された位置の接着依存性細胞を前記細胞回収手段に回収させてもよい。こうすれば、剥離した接着依存性細胞を的確に回収できる。
【００１６】
さらに、本発明の第１の剥離細胞選別装置には、前記培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間を計測する計時手段と、該計時手段による計時結果に基づいて前記剥離剤により剥離した剥離細胞を分類分けして回収する分類回収手段を設けてもよい。これによれば、回収した剥離細胞を計時情報に基づいて分類することができ、剥離した時間に基づいて剥離細胞に能力（例えば増殖能等）の差がある場合などでは、その能力差に応じて分取することができる。又、剥離した細胞から順に回収できるので、剥離剤による細胞ダメージを抑えることができる。
【００１７】
本発明の第２は、コンピュータを、本発明の第１の剥離細胞選別装置の前記投影面積算出手段及び前記選別手段として、又は前記投影面積算出手段、前記選別手段及び前記細胞回収制御手段として機能させるためのプログラムに関する。また、本発明の第３は、コンピュータに、培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記培養容器の所定の面に投影された投影面積に基づいて個々の接着依存性細胞につき前記培養容器から剥離したか否かを選別する工程を実行させるためのプログラムに関する。これらのプログラムは、コンピュータが読み取り可能な記録媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、ＦＤ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介してあるコンピュータから別のコンピュータへ送信されてもよいし、その他どのような形で授受されてもよい。これらのプログラムをコンピュータに実行させれば、本発明の第１の剥離細胞選別装置と同様の作用効果を得ることができる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
［第１実施形態］
図１は剥離細胞選別装置の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞選別装置１０は、支持台１１と、照明手段としてのＬＥＤランプ１３と、撮影手段としてのＣＣＤカメラ１５と、投影面積算出手段及び選別手段としての制御装置１７とを備えている。
【００１９】
支持台１１は、培地で培養された接着依存性細胞（以下単に細胞という）２１が底面に接着している培養容器２０を、その底面が下方に視覚的に露出した状態で支持している。即ち、支持台２２は、培養容器２０の底面縁部のみを支持したり、培養容器２０の底面部分に相当する箇所を透明部材としたりすることで、ＣＣＤカメラ１５による撮影が妨げられないように構成されている。
【００２０】
ＬＥＤランプ１３は、支持台１１に支持された培養容器２０を上方から照らすことにより培養容器２０内の個々の細胞２１を培養容器２０の底面に投影させる。
【００２１】
ＣＣＤカメラ１５は、培養容器２０の底面を撮影できるように培養容器２０の下方に設置されている。このＣＣＤカメラ１５は、制御装置１７からの指令信号を受信すると、ＬＥＤランプ１３によって上方から照らされた培養容器２０の下方から底面を撮影し、培養容器２０内の個々の細胞２１が培養容器２０の底面に投影された投影画像を得、その投影画像のデータを制御装置１７に送信する。また、ＣＣＤカメラ１５は、三次元ステージ１６に取り付けられ、上下・左右・前後に移動可能である。この三次元ステージ１６は制御装置１７からの指令信号によって作動して所定の位置にＣＣＤカメラ１５を位置決めする。
【００２２】
制御装置１７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置１７は、三次元ステージ１６に指令信号を出力してＣＣＤカメラ１５を所定の位置に位置決めしたあと、ＣＣＤカメラ１５に指令信号を出力して投影画像を撮影させ、その投影画像をＣＣＤカメラ１５から入力して画像解析処理を施し、画像解析処理後の投影画像に基づいて培養容器２０内の個々の細胞２１が底面に投影された投影面積Ａｃを算出し、予め記憶しておいた剥離開始前の投影面積Ａｃ＊を用いて面積比Ａｃ／Ａｃ＊を算出し、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊を予め定めておいた閾値Ｔと比較することにより、個々の細胞２１が培養容器２０の底面から剥離したか否かを選別する。
【００２３】
ここで、投影面積Ａｃは、例えば紀ノ岡らの論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，Ｐ２３４−２３９（２０００））の画像解析手法を投影画像に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の順に画像解析を行い、個々の細胞像を抽出し、各細胞の投影部分の画素数を計測し、この画素数に１画素あたりの面積を乗算した値を投影面積Ａｃとする。
【００２４】
剥離処理時における投影面積Ａｃの変遷を図２に基づいて説明する。この図２において、Ａｃは細胞が底面に投影された投影面積を表し、Ａａは細胞が底面に接着している接着面積を表す。底面に細胞２１が接着している培養容器２０に剥離剤を添加すると、時間の経過に伴って、図２（ａ）に示すように細胞２１と底面との接着面積Ａａが大きな状態から、図２（ｂ）に示すように細胞２１と底面との接着面積Ａａが小さな状態を経て、図２（ｃ）に示すように細胞２１が剥離して底面に沈降した状態又は剥離して浮遊した状態（剥離状態）に至る。この図２からわかるように、細胞２１は接着状態から剥離状態に至る過程で投影面積Ａｃ及び接着面積Ａａの両方とも徐々に小さくなっていき、剥離状態では両面積Ａｃ，Ａａはほぼ一定値となる。
【００２５】
閾値Ｔは以下の手順（１）及び（２）により予め定めておいた。
【００２６】
（１）培養容器２０として７５ｃｍ²のＴ型フラスコ（ヌンク社）、細胞２１としてヒト角化細胞であるテロメラーゼ活性化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ１，クロンテック社）、培地としてヒト角化細胞用無血清培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２，倉敷紡績（株））を用いて、温度３７℃、５％ＣＯ₂含有エアという条件下でコンフルエント状態になるまで培養した。このような底面に細胞が接着している培養容器２０を複数作製した。次に、各培養容器２０につき、剥離剤としてのトリプシン溶液を滴下する前に、培養容器２０を支持台１１に載せてＬＥＤランプ１３を点灯し培養容器２０の下方に設置したＣＣＤカメラ１５により培養容器２０の底面に投影された細胞２１の投影画像を撮影し、制御装置１７によりこの投影画像のデータに画像解析処理を施し、単位面積当たりに接着している細胞数をカウントし、これを剥離処理前の接着細胞濃度Ｘａ１（ｃｅｌｌ／ｃｍ²）とした。次に、各培養容器２０に培地を排出しリンスしたあとトリプシン溶液を滴下し、トリプシン溶液滴下後の経過時間（以下、トリプシン処理時間という）が０．５分になった時点で１つの培養容器２０にトリプシンインヒビタを投入してトリプシンの作用を停止させ、その後溶液（剥離状態の細胞を含む）を培養容器２０から回収し遠心分離したあと得られた剥離細胞につき増殖能力の一指標である倍加時間を調べる一方、培養容器２０の底面を緩衝液で２回リンスしたあと底面をＣＣＤカメラ１５で撮影し、画像解析処理を施し、トリプシン処理時間が０．５分の接着細胞濃度Ｘａ２（ｃｅｌｌ／ｃｍ²）を求めた。また、トリプシン処理時間が１分、２分、３分、６分、９分、１２分、１５分となった時点で各１つの培養容器２０に先ほどと同様の処理を施し、剥離細胞の倍加時間を調べる一方、接着細胞濃度Ｘａ２（ｃｅｌｌ／ｃｍ²）を求めた。そして、下記数１式により剥離率を求め、横軸をトリプシン処理時間、縦軸を剥離率（実測値）とするグラフを作成した。そのグラフを図３に示す。なお、テロメラーゼ活性化細胞はトリプシン処理時間によらず増殖能力に大きな差異は見られなかった。
【００２７】
【数１】
実測の剥離率＝（Ｘａ１−Ｘａ２）／Ｘａ１
【００２８】
（２）一方、一つの培養容器２０について、培地を排出しリンスしたあとトリプシン溶液を滴下し、トリプシン処理時間０．５分における個々の細胞２１（細胞数：２０）の投影面積を初期投影面積Ａｃ＊とした。この培養容器２０についてはトリプシンインヒビタを投入せず、引き続き、トリプシン処理時間が１分、２分、３分、６分、９分、１２分、１５分となった時点で投影面積Ａｃを求め、横軸を面積比Ａｃ／Ａｃ＊、縦軸を細胞数とするグラフつまり面積比と細胞数との関係を表すグラフを作製した（図４（ａ）参照）。ここで、面積比Ａｃ／Ａｃ＊の閾値Ｔを適当に定め、この閾値Ｔを越えない細胞を剥離細胞としその細胞数をＮＳとし、この閾値Ｔを越える細胞を未剥離細胞としその細胞数をＮＬとし、推定の剥離率を下記数２式により求めた。そして、横軸をトリプシン処理時間、縦軸を剥離率とするグラフとして、剥離率が実測値つまり数１式のもの（図３参照）と剥離率が推定値つまり数２式のものとを作製し、両グラフが一致するような閾値Ｔを求めたところ、Ｔ＝０．６のときに良好に一致した。そのときの様子を図４に示す。なお、図４（ａ）は面積比と細胞数との関係を表すグラフであり、図４（ｂ）はトリプシン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。また、図４（ａ）における点線は閾値Ｔ（＝０．６）を示す。
【００２９】
【数２】
推定の剥離率＝ＮＳ／（ＮＳ＋ＮＬ）
【００３０】
上述した実施形態のテロメラーゼ活性化細胞に代えて、ヒト角化細胞である０才（包皮）ドナー由来の細胞（ＫＫ−４００９，倉敷紡績（株））を用いて本実施形態と同様の実験を行い、同様の手法により閾値Ｔを求めたところ、Ｔ＝０．６のときの良好な結果が得られた。そのときの様子を図５に示す。なお、図５（ａ）は面積比と細胞数との関係を表すグラフであり、図５（ｂ）はトリプシン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。また、図５（ａ）における点線は閾値Ｔ（＝０．６）を示す。この結果、細胞特性の異なる株に対しても面積比を指標とした剥離状況の評価は可能であることがわかった。
【００３１】
また、ここで用いた０才ドナー由来の細胞につき、トリプシン処理時間と増殖能力の一指標である倍加時間との関係を調べたところ、表１に示す結果が得られた。この表１からわかるように、トリプシン処理時間が３分及び１５分の剥離細胞では増殖能力が低くなっている。これは、処理時間が３分では分化により接着能力や増殖能力の低くなった細胞群が優先的に浮遊し、１５分では過度のトリプシン処理による障害で活性の低下が引き起こされたためと考えられる。このようにトリプシン処理時間は細胞の増殖能力と密接に関係していることから、トリプシン処理時間を細胞増殖能力の一指標と見ることができる。したがって、トリプシン処理時間に応じて剥離細胞を分類分けして回収すれば、同様の細胞増殖能力を持つ細胞ごとの回収が可能となる。
【００３２】
【表１】

【００３３】
以上のことから、本実施形態の剥離細胞選別装置１０によれば、培養容器２０内の個々の細胞２１につき面積比Ａｃ／Ａｃ＊と閾値Ｔとを比較することにより、底面から剥離したか否かを特別な熟練など要することなく容易且つ適切に選別することができる。また、図４（ｂ）や図５（ｂ）の推定値のグラフを作製すれば、トリプシン処理時間と細胞の剥離状況との関係を容易に把握することができる。さらに、個々の細胞２１の投影画像をＬＥＤランプ１３とＣＣＤカメラ１５とにより容易且つ安価に得ることができ、ひいては剥離細胞選別装置１０の全体のコストを低く抑えることができる。
【００３４】
［第２実施形態］
図６は剥離細胞選別装置の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞選別装置３０は、支持台３１と、照明手段としてのＬＥＤランプ３３と、撮影手段としてのＣＣＤカメラ３５と、細胞回収手段としての吸引ノズル３６と、投影面積算出手段、選別手段、細胞回収制御手段及び位置検出手段としての制御装置３７とを備えている。
【００３５】
支持台３１は、培地で培養された細胞４１が底面に接着している培養容器４３を、その底面が下方に視覚的に露出した状態で支持している。この支持台３１の近傍には、支持台３１に支持された培養容器４０内に剥離剤であるトリプシン溶液を注入可能な注入管３２が設けられている。注入管３２には注入管３２の開閉を行うソレノイドバルブ３４が取り付けられ、このソレノイドバルブ３４は制御装置３７の指令信号に応じて開閉する。
【００３６】
ＬＥＤランプ３３は、支持台３１に支持された培養容器３３を上方から照らすことにより培養容器４０内の個々の細胞４１を培養容器４０の底面に投影させる。
【００３７】
ＣＣＤカメラ３５は、培養容器４０の底面を複数に区分したときの各区分に対応して培養容器４０の下方に複数個設置されている。このＣＣＤカメラ３５は、制御装置３７からの指令信号を受信すると、ＬＥＤランプ３３によって上方から照らされた培養容器４０の下方から底面を撮影し、培養容器４０内の個々の細胞４１が培養容器４０の底面に投影された投影画像を得、その投影画像のデータを制御装置３７に送信する。
【００３８】
吸引ノズル３６は、細胞４１を１つずつ吸引可能なノズルであり、三次元アーム３８によって上下・左右・前後に動かされる。この三次元アーム３８は制御装置３７からの指令信号によって作動して所定の位置に吸引ノズル３６を位置決めする。
【００３９】
制御装置３７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置３７は、各ＣＣＤカメラ３５に指令信号を出力して投影画像を撮影させ、その投影画像をＣＣＤカメラ３５から入力して第１実施形態と同様の画像解析処理を施し、画像解析処理後の投影画像に基づいて培養容器４０内の個々の細胞４１が底面に投影された投影面積Ａｃを算出し、予め記憶しておいた剥離開始前の投影面積Ａｃ＊を用いて面積比Ａｃ／Ａｃ＊を算出し、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊を予め定めておいた閾値Ｔと比較することにより、個々の細胞４１が培養容器４０の底面から剥離したか否かを選別する。なお、閾値Ｔの定め方は第１実施形態で述べた通りである。そして、剥離している細胞４１の位置を認識し、三次元アーム３８を駆動制御して吸引ノズル３６をその位置に移動させたあとその位置にある細胞４１を吸引させる。なお、剥離した細胞４１の位置は、ＣＣＤカメラ３５の設置位置及び投影画像のデータに基づいて検出する。
【００４０】
次に、この剥離細胞選別装置３０の動作について説明する。オペレータにより入力装置であるキーボードから制御装置３７に剥離操作開始の指令が入力されると、制御装置３７は内部メモリに記憶されている剥離操作プログラムを読み出してこれを実行する。図７はこの剥離操作プログラムのフローチャートである。このプログラムが開始されると、制御装置３７は、まず培地を排出しリンスしたあとの培養容器４０内に注入管３２のソレノイドバルブ３４を開放してトリプシン溶液を投入し、所定量したあとでソレノイドバルブ３４を閉鎖する（ステップＳ１００）。そして、閉鎖すると同時にタイマによりトリプシン処理時間の計測を開始すると共にＬＥＤランプ３３を点灯し（ステップＳ１１０）、トリプシン処理時間０．５分の時点で各ＣＣＤカメラ３５から初期の投影画像のデータを読み込んで画像解析処理を施して各細胞４１の初期の投影面積Ａｃ＊を算出し、所定の記憶領域に記憶する（ステップＳ１２０）。続いて、トリプシン処理時間が所定時間（例えば１分）経過するごとに各ＣＣＤカメラ３５から投影画像のデータを読み込んで画像解析処理を施し各細胞の投影面積Ａｃを算出し（ステップＳ１３０）、さらに面積比Ａｃ／Ａｃ＊を算出してこの面積比Ａｃ／Ａｃ＊と閾値Ｔとを比較し（ステップＳ１４０）、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊が閾値Ｔを下回ったものを剥離細胞とみなしてその剥離細胞の位置を認識し、三次元アーム３８を駆動制御してその位置にある剥離細胞を吸引ノズル３６により吸引して図示しない回収容器に回収しトリプシンインヒビタを投入してトリプシンの作用を停止させる（ステップＳ１５０）。このとき、同時期に回収した剥離細胞は同じ回収容器に回収する。その後、すべての細胞４１を回収したか否かを判定し（ステップＳ１６０）、回収していないときには再びステップＳ１３０に戻り、回収し終わったときにはこのプログラムを終了する。なお、ステップＳ１６０における全細胞が回収されたか否かの判定処理に代え、所定時間（例えば、全細胞を回収するのに十分な時間）を経過したか否かを判定するようにしてもよい。
【００４１】
以上詳述した本実施形態の剥離細胞選別装置３０によれば、培養容器４０の底面から剥離した細胞４１を早期に回収できる。このため、例えば剥離したあと更にトリプシン溶液で処理し続けるとダメージを受けて増殖能力が低下するおそれのある細胞にとっては、そのようなおそれが解消される。また、ＣＣＤカメラ３５の設置位置及び投影画像のデータに基づいて剥離した細胞の位置を検出して吸引ノズル３６でその細胞を吸引するため、剥離した細胞を的確に回収できる。
【００４２】
なお、本実施形態ではトリプシン処理時間０．５分における投影面積を初期投影面積Ａｃ＊としたが、これはトリプシン処理時間０．５分では剥離が開始しておらず、トリプシン添加前の投影面積と実質同じと判断したからである。もちろん、トリプシン添加前の投影面積を初期投影面積Ａｃ＊としてもよい。
【００４３】
以上、本発明の実施の形態や実施例について説明したが、本発明はこれらに何等限定されるものではなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施し得ることはいうまでもない。
【図面の簡単な説明】
【図１】第１実施形態の剥離細胞選別装置の概略構成図である。
【図２】剥離処理時における投影面積Ａｃの変遷を表す説明図である。
【図３】テロメラーゼ活性化細胞に関し、横軸をトリプシン処理時間、縦軸を剥離率（実測値）としたグラフである。
【図４】テロメラーゼ活性化細胞に関し、（ａ）は面積比と細胞数との関係を表すグラフであり、（ｂ）はトリプシン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。
【図５】０才ドナー由来細胞に関し、（ａ）は面積比と細胞数との関係を表すグラフであり、（ｂ）はトリプシン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。
【図６】第２実施形態の剥離細胞選別装置の概略構成図である。
【図７】第２実施形態の剥離操作プログラムのフローチャートである。
【図８】培養細胞シートの製品化のフローである。
【符号の説明】
１０…剥離細胞選別装置、１１…支持台、１３…ＬＥＤランプ、１５…ＣＣＤカメラ、１７…制御装置、２０…培養容器、２１…細胞、３０…剥離細胞選別装置、３１…支持台、３２…注入管、３３…ＬＥＤランプ、３４…ソレノイドバルブ、３５…ＣＣＤカメラ、３６…吸引ノズル、３７…制御装置、３８…三次元アーム、４０…培養容器、４１…細胞。

Claims

培養容器内の個々の接着依存性細胞につき前記培養容器の所定の面に投影された投影面積を算出する投影面積算出手段と、
前記投影面積に基づいて個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別する選別手段と
を備え、
前記投影面積算出手段は、接着依存性細胞が接着している培養容器内に剥離剤が投入されたあとの時間経過に伴って前記投影面積を算出し、
前記選別手段は、剥離開始前又は剥離剤投入直後の前記投影面積と剥離剤投入後の前記投影面積との面積比を閾値と比較することにより、個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別する
剥離細胞選別装置。
前記選別手段は、予め経験的に接着依存性細胞が剥離した時点における前記面積比を求めてこれを前記閾値と定める
請求項１記載の剥離細胞選別装置。
請求項１又は２に記載の剥離細胞選別装置であって、
前記培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記所定の面に投影された投影画像を撮影する撮影手段
を備え、
前記投影面積算出手段は、前記撮影手段によって得られた投影画像に基づいて前記投影面積を算出する
剥離細胞選別装置。
請求項１〜３のいずれかに記載の剥離細胞選別装置であって、
前記培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段と、
前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性細胞を前記細胞回収手段に回収させる細胞回収制御手段と
を備えた剥離細胞選別装置。
請求項４記載の剥離細胞選別装置であって、
前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性細胞の位置を検出する位置検出手段
を備え、
前記細胞回収制御手段は、前記位置検出手段によって検出された位置の接着依存性細胞を前記細胞回収手段に回収させる
剥離細胞選別装置。
剥離開始前又は剥離剤投入直後に、培養容器内の個々の接着依存性細胞につき前記培養容器の所定の面に投影された投影面積を算出するステップと、
剥離剤投入後に前記投影面積を算出するステップと、
剥離開始前又は剥離剤投入直後の前記投影面積と剥離剤投入後の前記投影面積との面積比を閾値と比較することにより、個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別するステップと、
を含む剥離細胞選別方法。
コンピュータに、請求項６に記載の剥離細胞選別方法の各工程を実行させるためのプログラム。