JP2003235540A - 剥離細胞選別装置、剥離細胞選別方法及びそのプログラム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 培養容器で培養している細胞につき容易に剥
離の有無を選別できる。 【解決手段】 剥離細胞選別装置１０は、支持台１１、
ＬＥＤランプ１３、ＣＣＤカメラ１５、制御装置１７を
備えている。ＣＣＤカメラ１５は、ＬＥＤランプ１３に
よって上方から照らされた培養容器２０の下方から底面
を撮影して投影画像を得、その投影画像のデータを制御
装置１７に送信する。制御装置１７は、この投影画像に
画像解析処理を施し、培養容器２０内の個々の細胞２１
が底面に投影された投影面積Ａｃを算出し、予め記憶し
ておいた剥離開始前の投影面積Ａｃ＊を用いて面積比Ａ
ｃ／Ａｃ＊を算出し、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊を予め定
めておいた閾値Ｔと比較することにより、個々の細胞２
１が培養容器２０の底面から剥離したか否かを選別す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、剥離細胞選別装
置、剥離細胞選別方法及びそのプログラムに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、ヒト組織をインビトロ(in vitro)
で培養し、培養した組織を患者に適用する技術が数多く
報告されている。特にヒト皮膚組織については、欧米に
おいて商品化レベルにまで達している。ここで、ヒト皮
膚組織、例えばヒト表皮角化細胞(Keratinocyte)による
培養細胞シートの製品化のフローを図８に基づいて説明
する。まず、患者又はドナーの健康な部位から少量の組
織片を採取し、酵素処理によって細胞を分散させた後、
角化細胞を分離・回収する（ステップＳ１）。次に、そ
の角化細胞を用いて初代培養を行う（ステップＳ２）。
その後、初代培養で増殖させた細胞を別の複数の培養容
器に分けて接種（播種）し（ステップＳ３）、培地交換
等の操作を必要に応じて行うと、細胞が培養面に接着し
たあと増殖して培養面での細胞の占める面積が徐々に増
加し、所定面積に達してコンフルエントな状態となる
（ステップＳ４）。このとき、製品として総合的に必要
となる十分な面積（細胞数）が確保されたか否かをチェ
ックし（ステップＳ５）、確保されていなければ培地を
除去したあと培養面に接着している細胞をトリプシンな
どのプロテアーゼによって培養面から剥離させたあと回
収し（ステップＳ６）、必要な面積が確保されるまで継
代培養を繰り返し行うことで面積を増やす。一方、必要
な面積が確保されたならば、組織構築のために三次元培
養（重層化）を施し（ステップＳ７）、これを移植用の
培養細胞シートとして病院へ輸送し、移植を行う（ステ
ップＳ８）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところで、ステップ６
の剥離操作において、プロテアーゼの処理時間が長い
と、細胞がダメージを受けてその後の継代培養に支障が
生じることがある。このため、剥離操作において、時間
経過に伴って細胞の剥離状況を逐次把握することによ
り、プロテアーゼ処理時間の最適化を図ることが望まし
い。

【０００４】一方、ステップ６の剥離操作におけるプロ
テアーゼの処理では、細胞が剥離するまでに要する時間
が個々の細胞で異なるため、この点も考慮して培養面か
ら剥離した細胞を回収することが望ましい。

【０００５】本発明は上述した問題点を解決することを
課題とするものであり、培養容器で培養している細胞に
つき容易に剥離の有無を選別できる剥離細胞選別装置、
剥離細胞選別方法、及びそのプログラムを提供すること
を目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段及び発明の効果】本発明は
上述した目的を達成するために以下の構成を採用した。

【０００７】本発明の第１は、培養容器内の個々の接着
依存性細胞につき前記培養容器の所定の面に投影された
投影面積を算出する投影面積算出手段と、前記投影面積
に基づいて個々の接着依存性細胞が前記培養容器から剥
離したか否かを選別する選別手段とを備えた剥離細胞選
別装置に関する。この装置では、培養容器内の個々の接
着依存性細胞につき、培養容器の所定の面に投影された
投影面積に基づいて培養容器から剥離したか否かを選別
するため、特別な熟練などを要することなく細胞が剥離
したか否かを容易に選別できる。

【０００８】ここで、「接着依存性細胞」とは、まず培
養容器の所定の面に直接接着するか又は細胞外マトリッ
クスを介して間接的に接着し、次いでその接着面積が広
がっていき、その後細胞分裂する細胞のことをいう。例
えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスタ
ー、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、イ
ヌ、ネコ、サル等の温血動物から採取された種々の細胞
が挙げられる。この温血動物の細胞としては、例えば、
角化細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細
胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細
胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細
胞、脂肪細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細
胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞若しくは間質細胞、又
はこれらの細胞の前駆細胞、幹細胞若しくは接着依存性
のガン細胞が挙げられる。また、胚性幹細胞を使用する
こともできる。或いは、エリスロポエチン、成長ホルモ
ン、顆粒球コロニー刺激因子、インスリン、インターフ
ェロン、血液凝固第VIII因子等の血液凝固因子、グルカ
ゴン、組織プラスミノーゲンアクチゲーター、ドーパミ
ン、ガン遺伝子、ガン抑制遺伝子等をコードする外来遺
伝子を前記細胞に導入し、それらの遺伝子を種々のプロ
モータを用いて強制的に又は特定の条件下で発現させる
ように構成した形質転換細胞を使用してもよい。また、
細胞外マトリックスとしては、例えば、インテグリン、
コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサ
ミノグリカン、糖タンパク質等が挙げられる。

【０００９】また、「培養容器」としては、細胞が培養
できるものであれば特に限定されないが、例えば、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート、ポリ塩化ビニル、ポリテトラフルオロエチレン
等の合成樹脂、ヒドロキシアパタイトセラミックス、ア
ルミナセラミックス、ガラス等から構成されたものが好
適に使用される。

【００１０】本発明の第１の剥離細胞選別装置におい
て、前記投影面積算出手段は、接着依存性細胞が接着し
ている培養容器内に剥離剤が投入されたあとの時間経過
に伴って前記投影面積を算出してもよい。こうすれば、
剥離剤が投入されたあとの経過時間と接着依存性細胞の
剥離状況との関係を把握できる。ここで、「剥離剤」と
は、接着している接着依存性細胞を剥離する作用を有す
るものであれば特に限定されないが、例えばトリプシン
やディスパーゼなどのプロテアーゼが挙げられる。

【００１１】本発明の第１の剥離細胞選別装置におい
て、前記選別手段は、剥離開始前の前記投影面積と測定
時の前記投影面積との面積比に基づいて個々の接着依存
性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを選別しても
よい。この面積比は接着依存性細胞の剥離状況を示すパ
ラメータとなり得るため、この面積比に基づいて剥離の
有無を選別すれば適切に接着依存性細胞の剥離状況を把
握できる。

【００１２】このとき、前記選別手段は、予め経験的に
接着依存性細胞が剥離した時点における前記面積比を求
めてこれを閾値と定め、測定時の前記面積比と前記閾値
とを比較することにより、個々の接着依存性細胞が前記
培養容器から剥離したか否かを選別してもよい。こうす
れば、測定時の前記面積比と前記閾値とを比較して、例
えば前者が後者以下又は後者未満ならば剥離している、
前者が後者以上又は後者を上回るならば剥離していない
という具合に選別できる。

【００１３】本発明の第１の剥離細胞選別装置は、前記
培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記所定の面に投
影された投影画像を撮影する撮影手段を備え、前記投影
面積算出手段は、前記撮影手段によって得られた投影画
像に基づいて前記投影面積を算出してもよい。こうすれ
ば、個々の接着依存性細胞の投影面積を容易且つ安価に
得ることができ、ひいては本装置全体のコストを低く抑
えることができる。このとき、前記培養容器を照らすこ
とにより前記培養容器内の個々の接着性細胞を前記所定
の面に投影させる照明手段を更に備え、前記撮影手段
は、前記照明手段によって前記培養容器が照らされてい
るときに前記培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記
所定の面に投影された投影画像を撮影してもよい。

【００１４】本発明の第１の剥離細胞選別装置は、前記
培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段と、前記選
別手段によって剥離したと選別された接着依存性細胞を
前記細胞回収手段に回収させる細胞回収制御手段とを備
えていてもよい。こうすれば、培養容器から剥離した接
着依存性細胞を早期に回収できる。例えば剥離したあと
の接着依存性細胞を剥離剤で処理し続けるとダメージを
受けて増殖能力が低下することがあるが、この装置によ
れば早期に回収できるため、そのようなおそれは解消さ
れる。

【００１５】このとき、前記選別手段によって剥離した
と選別された接着依存性細胞の位置を検出する位置検出
手段を備え、前記細胞回収制御手段は、前記位置検出手
段によって検出された位置の接着依存性細胞を前記細胞
回収手段に回収させてもよい。こうすれば、剥離した接
着依存性細胞を的確に回収できる。

【００１６】さらに、本発明の第１の剥離細胞選別装置
には、前記培養容器に剥離剤を投入したあとの経過時間
を計測する計時手段と、該計時手段による計時結果に基
づいて前記剥離剤により剥離した剥離細胞を分類分けし
て回収する分類回収手段を設けてもよい。これによれ
ば、回収した剥離細胞を計時情報に基づいて分類するこ
とができ、剥離した時間に基づいて剥離細胞に能力（例
えば増殖能等）の差がある場合などでは、その能力差に
応じて分取することができる。又、剥離した細胞から順
に回収できるので、剥離剤による細胞ダメージを抑える
ことができる。

【００１７】本発明の第２は、コンピュータを、本発明
の第１の剥離細胞選別装置の前記投影面積算出手段及び
前記選別手段として、又は前記投影面積算出手段、前記
選別手段及び前記細胞回収制御手段として機能させるた
めのプログラムに関する。また、本発明の第３は、コン
ピュータに、培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記
培養容器の所定の面に投影された投影面積に基づいて個
々の接着依存性細胞につき前記培養容器から剥離したか
否かを選別する工程を実行させるためのプログラムに関
する。これらのプログラムは、コンピュータが読み取り
可能な記録媒体（例えばハードディスク、ＲＯＭ、Ｆ
Ｄ、ＣＤ、ＤＶＤなど）に記録されていてもよいし、伝
送媒体（インターネットやＬＡＮなどの通信網）を介し
てあるコンピュータから別のコンピュータへ送信されて
もよいし、その他どのような形で授受されてもよい。こ
れらのプログラムをコンピュータに実行させれば、本発
明の第１の剥離細胞選別装置と同様の作用効果を得るこ
とができる。

【００１８】

【発明の実施の形態】［第１実施形態］図１は剥離細胞
選別装置の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞選
別装置１０は、支持台１１と、照明手段としてのＬＥＤ
ランプ１３と、撮影手段としてのＣＣＤカメラ１５と、
投影面積算出手段及び選別手段としての制御装置１７と
を備えている。

【００１９】支持台１１は、培地で培養された接着依存
性細胞（以下単に細胞という）２１が底面に接着してい
る培養容器２０を、その底面が下方に視覚的に露出した
状態で支持している。即ち、支持台２２は、培養容器２
０の底面縁部のみを支持したり、培養容器２０の底面部
分に相当する箇所を透明部材としたりすることで、ＣＣ
Ｄカメラ１５による撮影が妨げられないように構成され
ている。

【００２０】ＬＥＤランプ１３は、支持台１１に支持さ
れた培養容器２０を上方から照らすことにより培養容器
２０内の個々の細胞２１を培養容器２０の底面に投影さ
せる。

【００２１】ＣＣＤカメラ１５は、培養容器２０の底面
を撮影できるように培養容器２０の下方に設置されてい
る。このＣＣＤカメラ１５は、制御装置１７からの指令
信号を受信すると、ＬＥＤランプ１３によって上方から
照らされた培養容器２０の下方から底面を撮影し、培養
容器２０内の個々の細胞２１が培養容器２０の底面に投
影された投影画像を得、その投影画像のデータを制御装
置１７に送信する。また、ＣＣＤカメラ１５は、三次元
ステージ１６に取り付けられ、上下・左右・前後に移動
可能である。この三次元ステージ１６は制御装置１７か
らの指令信号によって作動して所定の位置にＣＣＤカメ
ラ１５を位置決めする。

【００２２】制御装置１７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、
ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置１７は、三次
元ステージ１６に指令信号を出力してＣＣＤカメラ１５
を所定の位置に位置決めしたあと、ＣＣＤカメラ１５に
指令信号を出力して投影画像を撮影させ、その投影画像
をＣＣＤカメラ１５から入力して画像解析処理を施し、
画像解析処理後の投影画像に基づいて培養容器２０内の
個々の細胞２１が底面に投影された投影面積Ａｃを算出
し、予め記憶しておいた剥離開始前の投影面積Ａｃ＊を
用いて面積比Ａｃ／Ａｃ＊を算出し、この面積比Ａｃ／
Ａｃ＊を予め定めておいた閾値Ｔと比較することによ
り、個々の細胞２１が培養容器２０の底面から剥離した
か否かを選別する。

【００２３】ここで、投影面積Ａｃは、例えば紀ノ岡ら
の論文（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，６７，Ｐ２
３４−２３９（２０００））の画像解析手法を投影画像
に施すことにより得られる。この場合、原画像に対して
背景分離処理、ルックアップテーブル変換処理、平滑化
処理、二値化抽出処理、孤立点除去処理、クロージング
処理、穴埋め処理、エリア抽出処理、画素数計測処理の
順に画像解析を行い、個々の細胞像を抽出し、各細胞の
投影部分の画素数を計測し、この画素数に１画素あたり
の面積を乗算した値を投影面積Ａｃとする。

【００２４】剥離処理時における投影面積Ａｃの変遷を
図２に基づいて説明する。この図２において、Ａｃは細
胞が底面に投影された投影面積を表し、Ａａは細胞が底
面に接着している接着面積を表す。底面に細胞２１が接
着している培養容器２０に剥離剤を添加すると、時間の
経過に伴って、図２（ａ）に示すように細胞２１と底面
との接着面積Ａａが大きな状態から、図２（ｂ）に示す
ように細胞２１と底面との接着面積Ａａが小さな状態を
経て、図２（ｃ）に示すように細胞２１が剥離して底面
に沈降した状態又は剥離して浮遊した状態（剥離状態）
に至る。この図２からわかるように、細胞２１は接着状
態から剥離状態に至る過程で投影面積Ａｃ及び接着面積
Ａａの両方とも徐々に小さくなっていき、剥離状態では
両面積Ａｃ，Ａａはほぼ一定値となる。

【００２５】閾値Ｔは以下の手順（１）及び（２）によ
り予め定めておいた。

【００２６】（１）培養容器２０として７５ｃｍ²のＴ
型フラスコ（ヌンク社）、細胞２１としてヒト角化細胞
であるテロメラーゼ活性化細胞（ｈＴＥＲＴ−ＨＭＥ
１，クロンテック社）、培地としてヒト角化細胞用無血
清培地（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２，倉敷紡績（株））を
用いて、温度３７℃、５％ＣＯ₂含有エアという条件下
でコンフルエント状態になるまで培養した。このような
底面に細胞が接着している培養容器２０を複数作製し
た。次に、各培養容器２０につき、剥離剤としてのトリ
プシン溶液を滴下する前に、培養容器２０を支持台１１
に載せてＬＥＤランプ１３を点灯し培養容器２０の下方
に設置したＣＣＤカメラ１５により培養容器２０の底面
に投影された細胞２１の投影画像を撮影し、制御装置１
７によりこの投影画像のデータに画像解析処理を施し、
単位面積当たりに接着している細胞数をカウントし、こ
れを剥離処理前の接着細胞濃度Ｘａ１（ｃｅｌｌ／ｃｍ
²）とした。次に、各培養容器２０に培地を排出しリン
スしたあとトリプシン溶液を滴下し、トリプシン溶液滴
下後の経過時間（以下、トリプシン処理時間という）が
０．５分になった時点で１つの培養容器２０にトリプシ
ンインヒビタを投入してトリプシンの作用を停止させ、
その後溶液（剥離状態の細胞を含む）を培養容器２０か
ら回収し遠心分離したあと得られた剥離細胞につき増殖
能力の一指標である倍加時間を調べる一方、培養容器２
０の底面を緩衝液で２回リンスしたあと底面をＣＣＤカ
メラ１５で撮影し、画像解析処理を施し、トリプシン処
理時間が０．５分の接着細胞濃度Ｘａ２（ｃｅｌｌ／ｃ
ｍ²）を求めた。また、トリプシン処理時間が１分、２
分、３分、６分、９分、１２分、１５分となった時点で
各１つの培養容器２０に先ほどと同様の処理を施し、剥
離細胞の倍加時間を調べる一方、接着細胞濃度Ｘａ２
（ｃｅｌｌ／ｃｍ²）を求めた。そして、下記数１式に
より剥離率を求め、横軸をトリプシン処理時間、縦軸を
剥離率（実測値）とするグラフを作成した。そのグラフ
を図３に示す。なお、テロメラーゼ活性化細胞はトリプ
シン処理時間によらず増殖能力に大きな差異は見られな
かった。

【００２７】

【数１】実測の剥離率＝（Ｘａ１−Ｘａ２）／Ｘａ１

【００２８】（２）一方、一つの培養容器２０につい
て、培地を排出しリンスしたあとトリプシン溶液を滴下
し、トリプシン処理時間０．５分における個々の細胞２
１（細胞数：２０）の投影面積を初期投影面積Ａｃ＊と
した。この培養容器２０についてはトリプシンインヒビ
タを投入せず、引き続き、トリプシン処理時間が１分、
２分、３分、６分、９分、１２分、１５分となった時点
で投影面積Ａｃを求め、横軸を面積比Ａｃ／Ａｃ＊、縦
軸を細胞数とするグラフつまり面積比と細胞数との関係
を表すグラフを作製した（図４（ａ）参照）。ここで、
面積比Ａｃ／Ａｃ＊の閾値Ｔを適当に定め、この閾値Ｔ
を越えない細胞を剥離細胞としその細胞数をＮＳとし、
この閾値Ｔを越える細胞を未剥離細胞としその細胞数を
ＮＬとし、推定の剥離率を下記数２式により求めた。そ
して、横軸をトリプシン処理時間、縦軸を剥離率とする
グラフとして、剥離率が実測値つまり数１式のもの（図
３参照）と剥離率が推定値つまり数２式のものとを作製
し、両グラフが一致するような閾値Ｔを求めたところ、
Ｔ＝０．６のときに良好に一致した。そのときの様子を
図４に示す。なお、図４（ａ）は面積比と細胞数との関
係を表すグラフであり、図４（ｂ）はトリプシン処理時
間と剥離率との関係を表すグラフである。また、図４
（ａ）における点線は閾値Ｔ（＝０．６）を示す。

【００２９】

【数２】推定の剥離率＝ＮＳ／（ＮＳ＋ＮＬ）

【００３０】上述した実施形態のテロメラーゼ活性化細
胞に代えて、ヒト角化細胞である０才（包皮）ドナー由
来の細胞（ＫＫ−４００９，倉敷紡績（株））を用いて
本実施形態と同様の実験を行い、同様の手法により閾値
Ｔを求めたところ、Ｔ＝０．６のときの良好な結果が得
られた。そのときの様子を図５に示す。なお、図５
（ａ）は面積比と細胞数との関係を表すグラフであり、
図５（ｂ）はトリプシン処理時間と剥離率との関係を表
すグラフである。また、図５（ａ）における点線は閾値
Ｔ（＝０．６）を示す。この結果、細胞特性の異なる株
に対しても面積比を指標とした剥離状況の評価は可能で
あることがわかった。

【００３１】また、ここで用いた０才ドナー由来の細胞
につき、トリプシン処理時間と増殖能力の一指標である
倍加時間との関係を調べたところ、表１に示す結果が得
られた。この表１からわかるように、トリプシン処理時
間が３分及び１５分の剥離細胞では増殖能力が低くなっ
ている。これは、処理時間が３分では分化により接着能
力や増殖能力の低くなった細胞群が優先的に浮遊し、１
５分では過度のトリプシン処理による障害で活性の低下
が引き起こされたためと考えられる。このようにトリプ
シン処理時間は細胞の増殖能力と密接に関係しているこ
とから、トリプシン処理時間を細胞増殖能力の一指標と
見ることができる。したがって、トリプシン処理時間に
応じて剥離細胞を分類分けして回収すれば、同様の細胞
増殖能力を持つ細胞ごとの回収が可能となる。

【００３２】

【表１】

【００３３】以上のことから、本実施形態の剥離細胞選
別装置１０によれば、培養容器２０内の個々の細胞２１
につき面積比Ａｃ／Ａｃ＊と閾値Ｔとを比較することに
より、底面から剥離したか否かを特別な熟練など要する
ことなく容易且つ適切に選別することができる。また、
図４（ｂ）や図５（ｂ）の推定値のグラフを作製すれ
ば、トリプシン処理時間と細胞の剥離状況との関係を容
易に把握することができる。さらに、個々の細胞２１の
投影画像をＬＥＤランプ１３とＣＣＤカメラ１５とによ
り容易且つ安価に得ることができ、ひいては剥離細胞選
別装置１０の全体のコストを低く抑えることができる。

【００３４】［第２実施形態］図６は剥離細胞選別装置
の概略構成図である。本実施形態の剥離細胞選別装置３
０は、支持台３１と、照明手段としてのＬＥＤランプ３
３と、撮影手段としてのＣＣＤカメラ３５と、細胞回収
手段としての吸引ノズル３６と、投影面積算出手段、選
別手段、細胞回収制御手段及び位置検出手段としての制
御装置３７とを備えている。

【００３５】支持台３１は、培地で培養された細胞４１
が底面に接着している培養容器４３を、その底面が下方
に視覚的に露出した状態で支持している。この支持台３
１の近傍には、支持台３１に支持された培養容器４０内
に剥離剤であるトリプシン溶液を注入可能な注入管３２
が設けられている。注入管３２には注入管３２の開閉を
行うソレノイドバルブ３４が取り付けられ、このソレノ
イドバルブ３４は制御装置３７の指令信号に応じて開閉
する。

【００３６】ＬＥＤランプ３３は、支持台３１に支持さ
れた培養容器３３を上方から照らすことにより培養容器
４０内の個々の細胞４１を培養容器４０の底面に投影さ
せる。

【００３７】ＣＣＤカメラ３５は、培養容器４０の底面
を複数に区分したときの各区分に対応して培養容器４０
の下方に複数個設置されている。このＣＣＤカメラ３５
は、制御装置３７からの指令信号を受信すると、ＬＥＤ
ランプ３３によって上方から照らされた培養容器４０の
下方から底面を撮影し、培養容器４０内の個々の細胞４
１が培養容器４０の底面に投影された投影画像を得、そ
の投影画像のデータを制御装置３７に送信する。

【００３８】吸引ノズル３６は、細胞４１を１つずつ吸
引可能なノズルであり、三次元アーム３８によって上下
・左右・前後に動かされる。この三次元アーム３８は制
御装置３７からの指令信号によって作動して所定の位置
に吸引ノズル３６を位置決めする。

【００３９】制御装置３７は、周知のＣＰＵ、ＲＯＭ、
ＲＡＭ等で構成されている。この制御装置３７は、各Ｃ
ＣＤカメラ３５に指令信号を出力して投影画像を撮影さ
せ、その投影画像をＣＣＤカメラ３５から入力して第１
実施形態と同様の画像解析処理を施し、画像解析処理後
の投影画像に基づいて培養容器４０内の個々の細胞４１
が底面に投影された投影面積Ａｃを算出し、予め記憶し
ておいた剥離開始前の投影面積Ａｃ＊を用いて面積比Ａ
ｃ／Ａｃ＊を算出し、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊を予め定
めておいた閾値Ｔと比較することにより、個々の細胞４
１が培養容器４０の底面から剥離したか否かを選別す
る。なお、閾値Ｔの定め方は第１実施形態で述べた通り
である。そして、剥離している細胞４１の位置を認識
し、三次元アーム３８を駆動制御して吸引ノズル３６を
その位置に移動させたあとその位置にある細胞４１を吸
引させる。なお、剥離した細胞４１の位置は、ＣＣＤカ
メラ３５の設置位置及び投影画像のデータに基づいて検
出する。

【００４０】次に、この剥離細胞選別装置３０の動作に
ついて説明する。オペレータにより入力装置であるキー
ボードから制御装置３７に剥離操作開始の指令が入力さ
れると、制御装置３７は内部メモリに記憶されている剥
離操作プログラムを読み出してこれを実行する。図７は
この剥離操作プログラムのフローチャートである。この
プログラムが開始されると、制御装置３７は、まず培地
を排出しリンスしたあとの培養容器４０内に注入管３２
のソレノイドバルブ３４を開放してトリプシン溶液を投
入し、所定量したあとでソレノイドバルブ３４を閉鎖す
る（ステップＳ１００）。そして、閉鎖すると同時にタ
イマによりトリプシン処理時間の計測を開始すると共に
ＬＥＤランプ３３を点灯し（ステップＳ１１０）、トリ
プシン処理時間０．５分の時点で各ＣＣＤカメラ３５か
ら初期の投影画像のデータを読み込んで画像解析処理を
施して各細胞４１の初期の投影面積Ａｃ＊を算出し、所
定の記憶領域に記憶する（ステップＳ１２０）。続い
て、トリプシン処理時間が所定時間（例えば１分）経過
するごとに各ＣＣＤカメラ３５から投影画像のデータを
読み込んで画像解析処理を施し各細胞の投影面積Ａｃを
算出し（ステップＳ１３０）、さらに面積比Ａｃ／Ａｃ
＊を算出してこの面積比Ａｃ／Ａｃ＊と閾値Ｔとを比較
し（ステップＳ１４０）、この面積比Ａｃ／Ａｃ＊が閾
値Ｔを下回ったものを剥離細胞とみなしてその剥離細胞
の位置を認識し、三次元アーム３８を駆動制御してその
位置にある剥離細胞を吸引ノズル３６により吸引して図
示しない回収容器に回収しトリプシンインヒビタを投入
してトリプシンの作用を停止させる（ステップＳ１５
０）。このとき、同時期に回収した剥離細胞は同じ回収
容器に回収する。その後、すべての細胞４１を回収した
か否かを判定し（ステップＳ１６０）、回収していない
ときには再びステップＳ１３０に戻り、回収し終わった
ときにはこのプログラムを終了する。なお、ステップＳ
１６０における全細胞が回収されたか否かの判定処理に
代え、所定時間（例えば、全細胞を回収するのに十分な
時間）を経過したか否かを判定するようにしてもよい。

【００４１】以上詳述した本実施形態の剥離細胞選別装
置３０によれば、培養容器４０の底面から剥離した細胞
４１を早期に回収できる。このため、例えば剥離したあ
と更にトリプシン溶液で処理し続けるとダメージを受け
て増殖能力が低下するおそれのある細胞にとっては、そ
のようなおそれが解消される。また、ＣＣＤカメラ３５
の設置位置及び投影画像のデータに基づいて剥離した細
胞の位置を検出して吸引ノズル３６でその細胞を吸引す
るため、剥離した細胞を的確に回収できる。

【００４２】なお、本実施形態ではトリプシン処理時間
０．５分における投影面積を初期投影面積Ａｃ＊とした
が、これはトリプシン処理時間０．５分では剥離が開始
しておらず、トリプシン添加前の投影面積と実質同じと
判断したからである。もちろん、トリプシン添加前の投
影面積を初期投影面積Ａｃ＊としてもよい。

【００４３】以上、本発明の実施の形態や実施例につい
て説明したが、本発明はこれらに何等限定されるもので
はなく、本発明の技術的範囲を逸脱しない範囲内におい
て、種々なる形態で実施し得ることはいうまでもない。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１実施形態の剥離細胞選別装置の概略構成図
である。

【図２】剥離処理時における投影面積Ａｃの変遷を表す
説明図である。

【図３】テロメラーゼ活性化細胞に関し、横軸をトリプ
シン処理時間、縦軸を剥離率（実測値）としたグラフで
ある。

【図４】テロメラーゼ活性化細胞に関し、（ａ）は面積
比と細胞数との関係を表すグラフであり、（ｂ）はトリ
プシン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。

【図５】０才ドナー由来細胞に関し、（ａ）は面積比と
細胞数との関係を表すグラフであり、（ｂ）はトリプシ
ン処理時間と剥離率との関係を表すグラフである。

【図６】第２実施形態の剥離細胞選別装置の概略構成図
である。

【図７】第２実施形態の剥離操作プログラムのフローチ
ャートである。

【図８】培養細胞シートの製品化のフローである。

【符号の説明】

１０…剥離細胞選別装置、１１…支持台、１３…ＬＥＤ
ランプ、１５…ＣＣＤカメラ、１７…制御装置、２０…
培養容器、２１…細胞、３０…剥離細胞選別装置、３１
…支持台、３２…注入管、３３…ＬＥＤランプ、３４…
ソレノイドバルブ、３５…ＣＣＤカメラ、３６…吸引ノ
ズル、３７…制御装置、３８…三次元アーム、４０…培
養容器、４１…細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 紀ノ岡 正博 大阪府豊中市西緑丘２−２−１−115 (72)発明者 田谷 正仁 大阪府豊中市宝山町10−５ Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA08 BB12 CC01 CC02 FA04 FA10 FA11 4B063 QA01 QA18 QQ08 QR16 QR77 QS40 QX01 5B057 AA10 CA12 CA16 DB02 DC04

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 培養容器内の個々の接着依存性細胞につ
   き前記培養容器の所定の面に投影された投影面積を算出
   する投影面積算出手段と、 前記投影面積に基づいて個々の接着依存性細胞が前記培
   養容器から剥離したか否かを選別する選別手段とを備え
   た剥離細胞選別装置。
2. 【請求項２】 前記投影面積算出手段は、接着依存性細
   胞が接着している培養容器内に剥離剤が投入されたあと
   の時間経過に伴って前記投影面積を算出する請求項１記
   載の剥離細胞選別装置。
3. 【請求項３】 前記選別手段は、剥離開始前の前記投影
   面積と測定時の前記投影面積との面積比に基づいて個々
   の接着依存性細胞が前記培養容器から剥離したか否かを
   選別する請求項１又は２記載の剥離細胞選別装置。
4. 【請求項４】 前記選別手段は、予め経験的に接着依存
   性細胞が剥離した時点における前記面積比を求めてこれ
   を閾値と定め、測定時の前記面積比と前記閾値とを比較
   することにより、個々の接着依存性細胞が前記培養容器
   から剥離したか否かを選別する請求項３記載の剥離細胞
   選別装置。
5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載の剥離細
   胞選別装置であって、 前記培養容器内の個々の接着依存性細胞が前記所定の面
   に投影された投影画像を撮影する撮影手段を備え、 前記投影面積算出手段は、前記撮影手段によって得られ
   た投影画像に基づいて前記投影面積を算出する剥離細胞
   選別装置。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の剥離細
   胞選別装置であって、 前記培養容器内の細胞を回収可能な細胞回収手段と、 前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性
   細胞を前記細胞回収手段に回収させる細胞回収制御手段
   とを備えた剥離細胞選別装置。
7. 【請求項７】 請求項６記載の剥離細胞選別装置であっ
   て、 前記選別手段によって剥離したと選別された接着依存性
   細胞の位置を検出する位置検出手段を備え、 前記細胞回収制御手段は、前記位置検出手段によって検
   出された位置の接着依存性細胞を前記細胞回収手段に回
   収させる剥離細胞選別装置。
8. 【請求項８】 コンピュータを、請求項１〜５のいずれ
   かに記載の剥離細胞選別装置の前記投影面積算出手段及
   び前記選別手段として機能させるか、請求項６又は７記
   載の剥離細胞選別装置の前記投影面積算出手段、前記選
   別手段及び前記細胞回収制御手段として機能させるため
   のプログラム。
9. 【請求項９】 コンピュータに、培養容器内の個々の接
   着依存性細胞が前記培養容器の所定の面に投影された投
   影面積に基づいて個々の接着依存性細胞につき前記培養
   容器から剥離したか否かを選別する工程を実行させるた
   めのプログラム。
10. 【請求項１０】 培養容器内の個々の接着依存性細胞が
    前記培養容器の所定の面に投影された投影面積に基づい
    て個々の接着依存性細胞につき前記培養容器から剥離し
    たか否かを選別する工程を含む剥離細胞選別方法。