KR20230145129A - 관절증 치료제의 제조 방법 및 관절증 치료제 - Google Patents
관절증 치료제의 제조 방법 및 관절증 치료제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20230145129A KR20230145129A KR1020237030724A KR20237030724A KR20230145129A KR 20230145129 A KR20230145129 A KR 20230145129A KR 1020237030724 A KR1020237030724 A KR 1020237030724A KR 20237030724 A KR20237030724 A KR 20237030724A KR 20230145129 A KR20230145129 A KR 20230145129A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- mesenchymal stem
- stem cells
- therapeutic agent
- arthrosis
- colony
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 title claims description 65
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 202
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 195
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 52
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 52
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 100
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 64
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 claims description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 32
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 32
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 32
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 6
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 claims description 5
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 claims description 5
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 13
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 53
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 40
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 26
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 25
- 230000006870 function Effects 0.000 description 23
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 23
- 238000010801 machine learning Methods 0.000 description 20
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 15
- 210000005222 synovial tissue Anatomy 0.000 description 14
- 230000005499 meniscus Effects 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 10
- 108010052014 Liberase Proteins 0.000 description 9
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 9
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 7
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 206010007710 Cartilage injury Diseases 0.000 description 4
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 4
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 4
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 4
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 2
- 206010072970 Meniscus injury Diseases 0.000 description 2
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 2
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 description 2
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010003267 Arthritis reactive Diseases 0.000 description 1
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 description 1
- 206010061762 Chondropathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010031264 Osteonecrosis Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N Procaine hydrochloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 HCBIBCJNVBAKAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000011130 autologous cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003237 epithelioid cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229960001309 procaine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 208000002574 reactive arthritis Diseases 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0662—Stem cells
- C12N5/0668—Mesenchymal stem cells from other natural sources
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4044—Concentrating samples by chemical techniques; Digestion; Chemical decomposition
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T7/00—Image analysis
- G06T7/0002—Inspection of images, e.g. flaw detection
- G06T7/0012—Biomedical image inspection
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T7/00—Image analysis
- G06T7/60—Analysis of geometric attributes
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06T—IMAGE DATA PROCESSING OR GENERATION, IN GENERAL
- G06T2207/00—Indexing scheme for image analysis or image enhancement
- G06T2207/30—Subject of image; Context of image processing
- G06T2207/30004—Biomedical image processing
- G06T2207/30024—Cell structures in vitro; Tissue sections in vitro
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
Abstract
배양하고 있는 복수의 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단을 촬영함으로써, 세포 화상을 취득하고, 세포 화상을 해석함으로써, 세포 화상 내의 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며, 밀도 정보에 근거하여, 집단에 있어서 간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니를 검출하고, 검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 또는 콜로니 형성 단위에 근거하여, 집단의 선별을 행하는, 관절증 치료제의 제조 방법, 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제.
Description
본 개시는, 관절증 치료제의 제조 방법 및 관절증 치료제에 관한 것이다.
정형외과 영역에 있어서, 관절 연골 손상 및 반월판 손상 등의 관절증은, 일상적인 진료 행위의 대상으로서 빈번하게 볼 수 있으며, 다수의 환자가 있는 질병으로서 널리 인식되고 있다.
연골 손상 또는 반월판 손상에 대한 외과적 치료의 일례로서, 손상부에 있어서의 파편을 제거하는 외과적 처치가 행해진다.
상기 처치에 의하여, 병상의 진행이 억제됨과 함께 조직의 자기 재생이 촉진되지만, 조직의 자기 재생은 충분하지 않았다.
한편, 최근의 재생 의료 기술의 진보에 의하여, 세포 치료가 활발해지고 있다. 특히, 간엽계 줄기세포(MSC: Mesenchymal Stem Cell)는, 유용한 세포 치료의 세포원으로서 기대되고 있다. 간엽계 줄기세포는, 다양한 생체 조직으로부터 채취가 가능하고, 골수 조직(Prockop, D. J., 1997, Science. 276: 71-4), 지방 조직(Zuk, P. A. et al., 2002, Mol Biol Cell. 13: 4279-95), 근육 조직(Cao et al., 2003, Nat Cell Biol. 5: 640-6), 활막 조직(De Bari, C. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44: 1928-42) 및 골막 조직(Fukumoto, T. et al., 2003, OsteoarthritisCartilage. 11: 55-64) 등으로부터 단리(單離)할 수 있는 것이 보고되고 있다.
또, 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 골수 등의 다양한 간엽계 조직 유래의 간엽계 줄기세포에 비하여 우수한 증식능 및 연골 형성능을 갖는 것이 보고되고 있다(Sakaguchi, et al., 2005, Arthritis Rhum. 52: 2521-9).
간엽계 줄기세포는, 배양에 의하여 원하는 수가 될 때까지 증식이 실시된 후에, 관절증 치료제로서, 손상부로의 이식이 행해지지만, 간엽계 줄기세포가, 이식을 실시하는 날까지 원하는 수에 도달하는지 아닌지의 정보는 중요하고, 배양 기간의 도중에 상기의 정보를 얻어질 것이 강하게 요망된다.
상기 요구에 대하여, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2019-4794호에서는, 제1 시점의 간엽계 줄기세포의 배양 상태에 근거하여, 간엽계 줄기세포의 장래의 증식 상태를 예측하기 위한 지표를 산출하는 산출 스텝과, 지표와 판별식에 근거하여, 제1 시점보다 이후의 제2 시점의 간엽계 줄기세포의 증식 상태를 예측하는 예측 스텝을 포함하는 증식 예측 방법이 제안된다.
간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니는, 상피양(樣) 세포 및 림프 아구(芽球)양 세포 등의 다른 세포의 콜로니와는 달리, 경계가 불명료하다.
일본 공개특허공보 2019-4794호에 있어서는, 어느 세포로부터 일정한 거리에 존재하는 세포수를 카운트하고, 4개 이상의 세포가 확인되었을 때에 콜로니라고 판정하고 있다.
본 발명자들은, 일본 공개특허공보 2019-4794호의 증식 예측 방법에 있어서 채용되는 콜로니 판정 방법에서는, 증식한 간엽계 줄기세포가 밀집되어 존재하는 경우에는, 이들 세포는 1개의 콜로니에 속한다고 판정되게 되어, 1개의 콜로니에 속하는 세포수가 너무 커져, 정확한 증식 예측이 곤란해질 우려가 있다는 새로운 지견(知見)을 알아냈다.
본 개시는, 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 그 해결하려는 과제는, 배양의 도중에 있어서 간엽계 줄기세포의 증식 예측을 우수한 정밀도로 행할 수 있고, 관절증 치료에 적합한 관절증 치료제를 제조할 수 있는, 관절증 치료제의 제조 방법 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제를 제공하는 것이다.
<1> 배양하고 있는 복수의 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단을 촬영함으로써, 세포 화상을 취득하고,
세포 화상을 해석함으로써, 세포 화상 내의 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며,
밀도 정보에 근거하여, 집단에 있어서 간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니를 검출하고,
검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위 중 적어도 일방에 근거하여, 집단의 선별을 행하는, 관절증 치료제의 제조 방법.
<2> 밀도 정보가, 커널 밀도 추정에 의하여 도출되는, 세포 화상에 있어서의 간엽계 줄기세포의 추정 밀도 분포인, <1>에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<3> 콜로니의 검출이, 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행하고, 추정 밀도 분포 내의 동일한 극대점에 수렴하는 간엽계 줄기세포의 집합을 콜로니로서 검출함으로써 행해지는, <2>에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<4> 콜로니의 검출이, 배양 개시일로부터 4일째~6일째에 있어서 행해지고,
집단의 선별이, 하기 조건 a1) 및 조건 b1) 중 적어도 일방을 충족시키는 집단을 선별함으로써 행해지는, <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
a1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈가 0.740mm 이상이다.
b1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 콜로니 형성 단위가 0.250/mm2 이상이다.
<5> 간엽계 줄기세포가, 생체 조직을 효소에 의하여 처리함으로써 얻어지는, <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<6> 생체 조직의 효소에 의한 처리에 있어서, 콜라게나제 및 중성 프로테아제를 적어도 1종씩 포함하는, 효소 혼합물이 사용되는, <5>에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<7> 생체 조직의 효소에 의한 처리에 있어서, 효소의 사용량에 대한 생체 조직의 사용량의 비가, 질량 기준으로, 10~1000인, <5> 또는 <6>에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<8> 간엽계 줄기세포가, 생체 조직의 효소에 의한 처리에 의하여 얻어지는 조직 소화액을, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 세정함으로써 얻어지는, <5> 내지 <7> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<9> 간엽계 줄기세포가, 활막 유래의 세포인, <1> 내지 <8> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<10> 간엽계 줄기세포가, 인간 유래의 세포인, <1> 내지 <9> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<11> <1> 내지 <10> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는, 관절증 치료제.
본 개시에 의하면, 배양의 도중에 있어서 간엽계 줄기세포의 증식 예측을 우수한 정밀도로 행할 수 있고, 관절증 치료에 적합한 관절증 치료제를 제조할 수 있는, 관절증 치료제의 제조 방법 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제를 제공할 수 있다.
도 1은, 세포 화상 해석 장치 등을 나타내는 도이다.
도 2는, 세포 화상 해석 장치를 구성하는 컴퓨터를 나타내는 블록도이다.
도 3은, 세포 화상 해석 장치의 CPU의 처리부를 나타내는 블록도이다.
도 4는, 밀도 정보 도출부의 상세를 나타내는 도이다.
도 5는, 커널 밀도 추정의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 6은, mean-shift의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 7은, mean-shift의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 8은, 검출 결과의 상세를 나타내는 도이다.
도 9는, 평가 정보의 상세를 나타내는 도이다.
도 10은, 콜로니의 사이즈를 나타내는 도이다.
도 11은, 세포 화상 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 12는, 해석 결과 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 13은, 특정 영역에 대하여, 3종의 밴드폭에서 커널 밀도 추정을 행함으로써, 3종의 추정 밀도 분포를 도출하는 모습을 나타내는 도이다.
도 14는, 특정 영역에 대하여, 3종의 추정 밀도 분포의 각각을 참조한 mean-shift를 행함으로써, 3종의 추정 밀도 분포에 대응하는 3종의 콜로니의 검출 결과를 출력하는 모습을 나타내는 도이다.
도 15는, 지정 화면을 나타내는 도이다.
도 16은, 지시 접수부에 있어서 밴드폭의 지정을 접수하는 모습을 나타내는 도이다.
도 17은, 세포 화상 해석 장치의 처리 수순을 나타내는 플로 차트이다.
도 18은, 세포 화상 해석 장치의 처리 수순을 나타내는 플로 차트이다.
도 19는, 평가 정보의 다른 예를 나타내는 도이다.
도 20은, 평가 정보의 또 다른 예를 나타내는 도이다.
도 21은, 1배양 일수당 평균 콜로니 사이즈의 변화량이 임곗값 미만인 경우에, 경고를 표시하는 양태를 나타내는 도이다.
도 22는, 지정 밴드폭의 지정 방법의 다른 예를 나타내는 플로 차트이다.
도 23은, 세포 화상에 있어서의 섬유아양 세포의 면적률이 설정 범위 내인 경우에 한하여, 밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행하는 제2 실시형태를 나타내는 도이다.
도 24는, 제2 실시형태의 다른 예를 나타내는 도이다.
도 25는, 제2 실시형태의 또 다른 예를 나타내는 도이다.
도 26은, 도 23~도 25에서 나타낸 양태를, 세로축을 면적률, 가로축을 배양 일수로 한 그래프로 정리한 도이다.
도 27은, 면적률이 설정 범위 외인 경우의 세포 화상 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 28은, 기설정된 탐색 프레임 내의 섬유아양 세포의 개수를, 밀도 정보로서 도출하는 제3 실시형태를 나타내는 도이다.
도 29는, 세포 화상 내의 복수의 영역에 탐색 프레임을 순차 주사하는 모습을 나타내는 도이다.
도 30은, 탐색 프레임 내의 섬유아양 세포의 개수가 콜로니 조건을 충족시킨 경우를 나타내는 도이다.
도 31은, 기계 학습 모델을 이용하여 화상 해석을 행하는 제4 실시형태를 나타내는 도이다.
도 32는, 기계 학습 모델의 학습 페이즈에 있어서의 처리의 개요를 나타내는 도이다.
도 2는, 세포 화상 해석 장치를 구성하는 컴퓨터를 나타내는 블록도이다.
도 3은, 세포 화상 해석 장치의 CPU의 처리부를 나타내는 블록도이다.
도 4는, 밀도 정보 도출부의 상세를 나타내는 도이다.
도 5는, 커널 밀도 추정의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 6은, mean-shift의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 7은, mean-shift의 개략을 나타내는 그래프이다.
도 8은, 검출 결과의 상세를 나타내는 도이다.
도 9는, 평가 정보의 상세를 나타내는 도이다.
도 10은, 콜로니의 사이즈를 나타내는 도이다.
도 11은, 세포 화상 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 12는, 해석 결과 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 13은, 특정 영역에 대하여, 3종의 밴드폭에서 커널 밀도 추정을 행함으로써, 3종의 추정 밀도 분포를 도출하는 모습을 나타내는 도이다.
도 14는, 특정 영역에 대하여, 3종의 추정 밀도 분포의 각각을 참조한 mean-shift를 행함으로써, 3종의 추정 밀도 분포에 대응하는 3종의 콜로니의 검출 결과를 출력하는 모습을 나타내는 도이다.
도 15는, 지정 화면을 나타내는 도이다.
도 16은, 지시 접수부에 있어서 밴드폭의 지정을 접수하는 모습을 나타내는 도이다.
도 17은, 세포 화상 해석 장치의 처리 수순을 나타내는 플로 차트이다.
도 18은, 세포 화상 해석 장치의 처리 수순을 나타내는 플로 차트이다.
도 19는, 평가 정보의 다른 예를 나타내는 도이다.
도 20은, 평가 정보의 또 다른 예를 나타내는 도이다.
도 21은, 1배양 일수당 평균 콜로니 사이즈의 변화량이 임곗값 미만인 경우에, 경고를 표시하는 양태를 나타내는 도이다.
도 22는, 지정 밴드폭의 지정 방법의 다른 예를 나타내는 플로 차트이다.
도 23은, 세포 화상에 있어서의 섬유아양 세포의 면적률이 설정 범위 내인 경우에 한하여, 밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행하는 제2 실시형태를 나타내는 도이다.
도 24는, 제2 실시형태의 다른 예를 나타내는 도이다.
도 25는, 제2 실시형태의 또 다른 예를 나타내는 도이다.
도 26은, 도 23~도 25에서 나타낸 양태를, 세로축을 면적률, 가로축을 배양 일수로 한 그래프로 정리한 도이다.
도 27은, 면적률이 설정 범위 외인 경우의 세포 화상 표시 화면을 나타내는 도이다.
도 28은, 기설정된 탐색 프레임 내의 섬유아양 세포의 개수를, 밀도 정보로서 도출하는 제3 실시형태를 나타내는 도이다.
도 29는, 세포 화상 내의 복수의 영역에 탐색 프레임을 순차 주사하는 모습을 나타내는 도이다.
도 30은, 탐색 프레임 내의 섬유아양 세포의 개수가 콜로니 조건을 충족시킨 경우를 나타내는 도이다.
도 31은, 기계 학습 모델을 이용하여 화상 해석을 행하는 제4 실시형태를 나타내는 도이다.
도 32는, 기계 학습 모델의 학습 페이즈에 있어서의 처리의 개요를 나타내는 도이다.
이하, 본 개시를 실시하기 위한 형태에 대하여 상세하게 설명한다. 단, 본 개시는 하기 실시형태에 한정되는 것은 아니다. 하기 실시형태에 있어서, 그 구성 요소는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 필수는 아니다. 수치 및 그 범위에 대해서도 동일하며, 본 개시를 제한하는 것은 아니다.
본 개시에 있어서 "간엽계 줄기세포"란, 중배엽성 조직(간엽)에서 유래하는 체성(體性) 줄기세포이다.
간엽계 줄기세포는 골수, 활막, 골막, 지방 조직, 근육 조직에 존재하는 것이 알려져 있고, 또한 골아 세포, 연골 세포, 지방 세포, 및 줄기세포로 분화하는 능력을 갖는 것이 알려져 있다. 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화에 관련하여, BMP 또는 TGF-β를 배양액에 첨가함으로써, 미분화 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화가 촉진되고, 또한 연골 조직이 in vitro 조건하에서 재생할 수 있는 것이 알려져 있다.
간엽계 줄기세포는, 간엽계 줄기세포에 특징적인 분자(효소, 리셉터 및 저분자 화합물 등)를 검출하여 확인할 수 있다.
간엽계 줄기세포에 특징적인 분자로서는, 세포 표면 마커(포지티브 마커)인 CD73, CD90, CD105 및 CD166 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또, 간엽계 줄기세포에는 발현되어 있지 않은 세포 표면 마커(네거티브 마커)로서는, CD(Clusters of Differentiation) 19, CD34, CD45, HLA-DR(Human Leukocyte Antigen-D-Related), CD11b 및 CD14 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 포지티브 마커 및 네거티브 마커를 이용하여, 간엽계 줄기세포인 것을 확인할 수 있다.
이들 마커의 검출에는 면역학적 방법을 이용할 수 있지만, 각 분자의 mRNA양의 정량에 의하여 검출을 실시해도 된다.
본 개시에 있어서, "집단"이란, 간엽계 줄기세포의 배양을 실시하는 계(系)를 의미하고, 집단 내에 있어서, 간엽계 줄기세포는, 콜로니를 형성한다.
본 개시에 있어서, "평균 콜로니 사이즈"란, 간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니의 사이즈의 평균값을 의미한다.
콜로니 사이즈가 일정 이하인 경우, 고립된 세포나 배지 중의 이물이 검출될 가능성이 높아진다. 그 때문에, 본 개시에 있어서는, 평균 콜로니 사이즈의 측정은, 콜로니 사이즈 0.54mm 초과의 콜로니에 대하여 실시한다.
본 개시에 있어서, "콜로니 형성 단위"는, CFU(Colony Forming Unit)라고도 불리고, 세포 화상 1mm2당에 있어서의 콜로니의 개수를 의미한다. 또한, 세포 화상에 대해서는, 후술한다.
본 개시에 있어서, "관절증"이란, 관절의 손상, 손해 또는 염증을 수반하는 질환이다.
보다 구체적으로는, 관절증으로서는, 예를 들면, 반월판 손상, 외상성 연골 손상, 이단성(離斷性) 골연골염, 무부성(無腐性) 골괴사, 변형성 관절증(예를 들면, 변형성 무릎 관절증, 변형성 팔꿈치 관절증 및 변형성 어깨 관절증 등), 류마티스 관절염(예를 들면, 만성 류마티스 관절염), 통풍, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 약년성 관절염, 염증성 관절염 및 관절 연골 결손 등을 들 수 있지만, 이들에 한정하는 것은 아니다.
본 개시에 있어서 "~"를 이용하여 나타난 수치 범위에는, "~"의 전후에 기재되는 수치가 각각 최솟값 및 최댓값으로서 포함된다.
본 개시 중에 단계적으로 기재되어 있는 수치 범위에 있어서, 하나의 수치 범위로 기재된 상한값 또는 하한값은, 다른 단계적인 기재의 수치 범위의 상한값 또는 하한값으로 치환해도 된다. 또, 본 개시 중에 기재되어 있는 수치 범위에 있어서, 그 수치 범위의 상한값 또는 하한값은, 실시예에 나타나 있는 값으로 치환해도 된다.
(관절증 치료제의 제조 방법)
본 개시에 관한 관절증 치료제의 제조 방법은,
배양하고 있는 복수의 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단을 촬영함으로써, 세포 화상을 취득하고,
세포 화상을 해석함으로써, 세포 화상 내의 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며,
밀도 정보에 근거하여, 집단에 있어서의 간엽계 줄기세포의 콜로니를 검출하고,
검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위 중 적어도 일방에 근거하여, 집단의 선별을 행한다.
본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에 의하면, 배양의 도중에 있어서 간엽계 줄기세포의 증식 예측을 우수한 정밀도로 행할 수 있고, 관절증 치료에 적합한 관절증 치료제를 제조할 수 있는, 관절증 치료제의 제조 방법을 제공할 수 있다.
상기 효과가 나타나는 이유는 이하와 같이 추측되지만, 이에 한정되지 않는다.
상기한 바와 같이, 일본 공개특허공보 2019-4794호 등에서 제안되는 종래의 간엽계 줄기세포의 증식 예측은, 간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니의 경계의 불명료함으로부터, 콜로니의 검출을 우수한 정밀도로 행하는 것이 곤란한 경우가 있고, 증식 예측의 정확성에 개선의 여지가 있었다.
본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에 있어서는, 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며, 밀도 정보에 근거하여 간엽계 줄기세포의 콜로니를 검출하고 있고, 간엽계 줄기세포의 콜로니를 우수한 정밀도로 검출하는 것이 가능하다.
우수한 정밀도로 검출된 콜로니의 정보로부터, 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위를 도출하며, 이것에 근거하여, 간엽계 줄기세포의 증식의 정도 및 증식 속도 등이 우수한 집단의 선별을 실시함으로써, 관절증 치료에 적합한 관절증 치료제를 제조할 수 있다고 추측된다.
(간엽계 줄기세포의 배양)
간엽계 줄기세포의 배양은, 통상의 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 사용할 수 있다.
배지로서는, 예를 들면, α-MEM, 둘베코 개변 이글 배지(DMEM: Dulbecco Modified Eagle Medium), DMEM 및 F12의 혼합 배지(DMEM:F12=1:1), RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 배지(GIBCO(등록 상표) RPMI1640 배지 등), DMEM 및 F12의 혼합 배지와 RPMI 배지의 혼합 배지(DMEM 및 F12의 혼합 배지:RPMI 배지=1:1) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 괄호 내의 비는, 질량 기준의 비이다.
배지는, 혈청을 포함하는 배지여도 되고, 혈청을 포함하지 않는 배지여도 된다.
생체로의 이식을 목적으로 하여, 자기의 조직으로부터 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우에는, 배지는, 동종 혈청을 함유하는 것이어도 된다.
즉, 인간으로의 이식을 목적으로 하여, 인간의 조직으로부터 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우에는, 인간 혈청을 포함하는 배지를 사용해도 된다.
혈청을 사용하는 경우, 자기의 혈청이어도 되고, 동종 이형(異型)의 혈청이어도 되지만, 바람직하게는 자기의 혈청이다. 혈청을 사용하는 경우에는, 배지에 있어서의 혈청의 첨가량은, 20체적% 이하인 것이 바람직하고, 10체적% 이하인 것이 보다 바람직하다.
세포의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 통상의 세포 배양의 조건을 채용할 수 있다.
예를 들면, 세포 배양의 온도는, 30℃~40℃로 할 수 있다.
또, 세포 배양의 CO2 농도는, 3%~7%로 할 수 있다.
일례로서는, 온도 37℃, CO2 농도 5%의 조건으로 할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양 기간 중에는, 배지의 교환을 행하지 않는 것이 바람직하다.
또, 배양 기간이 10일간 이상이 되는 경우, 간엽계 줄기세포 이외의 다른 세포와 공배양(公培養)되지 않고, 간엽계 줄기세포가 배양되는 것이 바람직하다.
간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화는, 배양 기간이 길어질수록 진행된다.
그 때문에, 배양 기간이 특정 길이를 초과하면 간엽계 줄기세포의 in situ에서의 연골 형성능은 저하되는 것이 알려져 있다.
간엽계 줄기세포를 미분화 또한 양호한 in situ 연골 형성능을 갖는 상태로 증식 시키기 위하여, 배양 기간을 조정하는 것이 바람직하다.
또, 이식한 간엽계 줄기세포에 의하여 환부를 재생시키기 위해서는, 집단은, 미분화의 간엽계 줄기세포를 어느 정도 포함하고 있을 필요가 있다.
이들을 고려하면, 배양 기간은, 5일간 이상인 것이 바람직하고, 7일간 이상인 것이 보다 바람직하며, 10일간 이상인 것이 더 바람직하다.
또, 배양 기간은 28일 이하인 것이 바람직하고, 21일 이하인 것이 보다 바람직하며, 17일 이하인 것이 더 바람직하다.
간엽계 줄기세포를, 트랜스포밍 증식 인자 β3(TGF-β3), 덱사메타손 또는 골형성 인자 2(BMP-2)를 첨가한 배지에서 배양함으로써, 연골 세포로 분화하고, in vitro에서 연골 조직을 제조 가능한 것이 알려져 있다.
따라서, 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화 억제의 관점에서는, 상기한 배지는, TGF-β3, 덱사메타손 및 BMP-2를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
간엽계 줄기세포는, in vitro에서의 간엽계 줄기세포의 계대(繼代)수와 반비례하여, in situ 연골 형성능이 저하되는 것도 알려져 있다.
그 때문에, 제조되는 간엽계 줄기세포는, 초대(初代) 또는 제1 계대의 간엽계 줄기세포인 것이 바람직하다.
효소 처리 후의 간엽계 줄기세포를 배지에 파종할 때, 세포 밀도가, 100개/cm2~5000개/cm2가 되도록 파종하는 것이 바람직하고, 200개/cm2~4500개/cm2가 되도록 파종하는 것이 보다 바람직하며, 300개/cm2~2500개/cm2가 되도록 파종하는 것이 더 바람직하고, 400개/cm2~2000개/cm2가 되도록 파종하는 것이 특히 바람직하다.
관절증 치료제로서의 적성의 관점에서, 배양 종료 시에 회수되는 세포수는, 0.5×107개가 바람직하고, 1.0×107개 이상이 보다 바람직하며, 2.0×107개 이상이 더 바람직하다.
또, 배양 종료 시에 회수되는 세포수는, 3.0×107 세포 이상이어도 되고, 4.0×107 세포 이상이어도 되며, 5.0×107 세포 이상이어도 되고, 6.0×107 세포 이상이어도 된다.
이하, 본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에서 사용하는 간엽계 줄기세포에 대하여 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
간엽계 줄기세포의 유래 생물은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 포유류 동물 유래의 세포인 것이 바람직하고, 영장류 동물 유래의 세포인 것이 보다 바람직하며, 인간 유래의 세포인 것이 특히 바람직하다.
간엽계 줄기세포는, 생체 조직을 효소 처리함으로써 얻을 수 있다.
생체 조직으로서는, 예를 들면, 활막 조직, 골수 조직, 골막 조직, 지방 조직 및 근육 조직 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 제조되는 관절증 치료제가, 반월판 치료제 및 변형성 관절증 치료제 등으로서 관절증에 특히 유용하다는 관점에서, 활막 조직을 효소 처리함으로써 얻어지는 간엽계 줄기세포(활막 유래의 간엽계 줄기세포)가 바람직하다.
예를 들면, 활막 조직은, 마취하에서 관절의 비하중 부분으로부터 채취할 수 있다.
활막 유래의 간엽계 줄기세포인지 아닌지는, 예를 들면, 세포 표면 마커 발현의 유무 및 연골 분화능을 확인함으로써 판정 가능하다.
활막 유래 간엽계 줄기세포는, CD90 양성, CD45 음성이고, 연골 분화능을 갖는다.
생체 조직은, 단일 도너 유래의 생체 조직이어도 되고, 복수의 도너에서 유래하는 생체 조직이어도 되지만, 바람직하게는 단일 도너 유래의 생체 조직이다.
인간으로의 이식을 목적으로 하여, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우, 환자와 조직 적합성 항원의 타입이 일치 또는 유사한 도너로부터 채취된 생체 조직을 사용하는 것이 바람직하다.
보다 바람직하게는, 활막이 채취되는 대상과, 활막 유래 간엽계 줄기세포가 이식되는 대상이, 동일 대상이다. 즉, 환자 자신으로부터 채취된 활막 조직을 사용하는 것(자가 이식)이 바람직하다.
생체 조직의 채취량은, 도너의 종류 및 필요시되는 간엽계 줄기세포의 양을 고려하여, 적절히 변경하는 것이 바람직하다.
예를 들면, 채취량은, 0.10g~10.00g이 바람직하고, 0.20g~5.00g이 보다 바람직하며, 0.30g~4.50g이 더 바람직하다.
채취한 생체 조직은, 필요에 따라 가위 등으로 세단(細斷)한 후, 이후에 기재하는 효소 처리에 제공된다.
효소로서는, 프로테아제를 포함하는 효소이면 특별히 한정되지 않지만, 생체 조직에서의 소화 속도의 관점에서, 바람직하게는, 콜라게나제 및 중성 프로테아제를 적어도 1종씩 포함하는 혼합 효소이다.
특히 바람직한 효소는, 리베라제이다. 리베라제로서는, 예를 들면, 리베라제 MNP-S(에프·호프만·라·로셰제)를 사용할 수 있지만, 이것은 콜라게나제 클래스 I과 콜라게나제 클래스 II와 중성 프로테아제(써몰리신)를 포함하는 효소이다.
효소 반응은, 효소를 포함하는 수용액 중에서 행할 수 있고, 인간 혈청을 포함하는 수용액을 이용해도 된다.
인간 혈청은, 자기의 혈청이어도 되고, 동종 이형의 혈청이어도 되지만, 바람직하게는 자기의 혈청이다.
수용액에 있어서의 효소 농도는, 바람직하게는 0.01mg/ml~10mg/ml이고, 보다 바람직하게는 0.1mg/ml~10mg/ml이며, 더 바람직하게는 0.5mg/ml~10mg/ml이고, 한층 더 바람직하게는 0.5mg/ml~5.0mg/ml이며, 특히 바람직하게는 0.5mg/ml~2.0mg/ml이고, 가장 바람직하게는 0.7mg/ml~2.0mg/ml이다.
생체 조직의 효소에 의한 처리에 있어서, 효소의 사용량에 대한 생체 조직의 사용량의 비(생체 조직의 사용량/효소의 사용량)는, 질량 기준으로, 10~1000인 것이 바람직하고, 20~500인 것이 보다 바람직하며, 40~200인 것이 더 바람직하다.
효소 반응 온도는, 15℃~45℃가 바람직하고, 20℃~43℃가 보다 바람직하며, 25℃~40℃가 더 바람직하다.
효소 반응 시간은, 45분~180분이 바람직하고, 60분~180분이 보다 바람직하며, 90분~180분이 더 바람직하고, 120분~180분이 특히 바람직하다.
생체 조직을 효소 처리함으로써 얻어지는 혼합물(이하, 조직 소화액이라고도 한다.)에는, 간엽계 줄기세포가 포함되어 있으며, 셀 스트레이너를 통과시켜 원심관으로 옮기고, 원심 처리함으로써, 간엽계 줄기세포를 회수할 수 있다.
원심 조건은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 원심력 200g~600g, 원심 시간 1분간~10분간으로 할 수 있다.
효소 처리에 의하여 얻어진 혼합물에 대하여, 세정을 1회 이상 행해도 된다. 세정을 복수 회 행하는 것이 바람직하고, 세정을 2회 행하는 것이 보다 바람직하다.
세정은, 상기한 원심 처리에 의하여 회수한 간엽계 줄기세포를 배지에 현탁하고, 재차, 원심 처리함으로써 행할 수 있다.
원심 조건은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 원심력 200g~600g, 원심 시간 1분간~10분간으로 할 수 있다.
배지는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, α 개변형 이글 최소 필수 배지(α-MEM: Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification)를 사용할 수 있다.
혼합물의 세정은, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 행하는 것이 바람직하고, 0.3ng/mL 이하가 될 때까지 행하는 것이 보다 바람직하며, 0.2ng/mL 이하가 될 때까지 행하는 것이 더 바람직하고, 0.1ng/mL 이하가 될 때까지 행하는 것이 특히 바람직하다.
(세포 화상의 취득, 밀도 정보의 도출 및 콜로니 검출)
본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에 있어서는, 배양하고 있는, 복수의 간엽계 줄기세포의 세포 화상을 취득하고, 세포 화상을 해석함으로써, 세포 화상 내의 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며, 도출되는 밀도 정보에 근거하여, 집단에 있어서의 간엽계 줄기세포의 콜로니를 검출하고, 검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위 중 적어도 일방에 근거하여, 집단의 선별이 행해진다.
세포 화상의 취득 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니고, 종래 공지의 촬영 장치에 의하여 행할 수 있다.
도출되는 밀도 정보는, 커널 밀도 추정에 의하여 도출되는, 세포 화상에 있어서의 간엽계 줄기세포의 추정 밀도 분포인 것이 바람직하다.
또, 콜로니의 검출은, 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행하고, 추정 밀도 분포 내의 동일한 극대점에 수렴하는 간엽계 줄기세포의 집합을 콜로니로서 검출함으로써 행해지는 것이 바람직하다.
세포 화상의 취득, 밀도 정보의 도출 및 콜로니 검출은, 적어도 하나의 프로세서를 구비하는 세포 화상 해석 장치를 사용함으로써 행할 수 있다.
이하에, 세포 화상 해석 장치의 일 실시형태(제1 실시형태라고도 한다.)를, 도 1~도 22를 참조하면서 설명한다.
이하의 세포 화상 해석 장치를 사용하는 관절증 치료제의 제조 방법에 의하면, 타임 랩스 화상을 사용할 필요가 없다. 그 때문에, 전용 기기를 준비할 필요가 없어, 비용을 삭감할 수 있다. 또, 타임 랩스 화상을 사용할 필요가 없기 때문에, 화상 취득의 시간을 단축할 수 있다. 또한, 타임 랩스 화상을 사용할 필요가 없기 때문에, 해석 부하 및 데이터 저장의 비용을 억제할 수 있다.
도 1에 있어서, 세포 화상 해석 장치(10)는, 예를 들면, 데스크톱형의 퍼스널 컴퓨터이며, 촬영 장치(11)가 접속되어 있다. 촬영 장치(11)는, 예를 들면, 위상차 현미경 또는 명시야(明視野) 현미경이며, 배양 용기(12) 내에서 배양 중의 간엽계 줄기세포(13)를 촬영한다. 그리고, 이로써 얻어진 세포 화상(14)을 세포 화상 해석 장치(10)에 송신한다.
간엽계 줄기세포를 적당한 수 포함하는 집단이 배지에 파종된다. 그리고, 집단에 있어서, 간엽계 줄기세포는 경시적으로 증식하여, 콜로니를 형성한다. 세포 화상 해석 장치(10)는, 세포 화상(14)으로부터 콜로니를 검출한다.
간엽계 줄기세포의 배양 방법에 대해서는 하기한다.
도 2에 있어서, 세포 화상 해석 장치(10)를 구성하는 컴퓨터는, 스토리지 디바이스(30), 메모리(31), CPU(Central Processing Unit)(32), 통신부(33), 디스플레이(34) 및 입력 디바이스(35)를 구비하고 있다. 이들은 버스 라인(36)을 통하여 상호 접속되어 있다.
스토리지 디바이스(30)는, 세포 화상 해석 장치(10)를 구성하는 컴퓨터에 내장되는 또는 케이블, 네트워크를 통하여 접속되는 하드 디스크 드라이브이다. 혹은 스토리지 디바이스(30)는, 하드 디스크 드라이브를 복수 대 연장(連裝)한 디스크 어레이이다. 스토리지 디바이스(30)에는, 오퍼레이딩 시스템 등의 제어 프로그램, 각종 애플리케이션 프로그램 및 이들 프로그램에 부수하는 각종 데이터 등이 기억되어 있다. 또한, 하드 디스크 드라이브 대신에 솔리드 스테이트 드라이브를 이용해도 된다.
메모리(31)는, CPU(32)가 처리를 실행하기 위한 워크 메모리이다. CPU(32)는, 스토리지 디바이스(30)에 기억된 프로그램을 메모리(31)로 로딩하고, 프로그램에 따른 처리를 실행함으로써, 컴퓨터의 각부(各部)를 통괄적으로 제어한다.
통신부(33)는, LAN(Local Area Network) 등의 네트워크를 통한 각종 정보의 전송 제어를 행하는 네트워크 인터페이스이다. 디스플레이(34)는 각종 화면을 표시한다. 세포 화상 해석 장치(10)를 구성하는 컴퓨터는, 각종 화면을 통하여, 입력 디바이스(35)로부터의 조작 지시의 입력을 접수한다. 입력 디바이스(35)는, 키보드, 마우스 또는 터치 패널 등이다.
도 3에 있어서, 세포 화상 해석 장치(10)의 스토리지 디바이스(30)에는, 작동 프로그램(40)이 기억되어 있다. 작동 프로그램(40)은, 컴퓨터를 세포 화상 해석 장치(10)로서 기능시키기 위한 애플리케이션 프로그램이다.
스토리지 디바이스(30)에는, 세포 화상(14), 지정 밴드폭(41), 콜로니의 검출 결과(42) 및 간엽계 줄기세포(13)의 증식능을 나타내는 평가 정보(43)도 기억된다.
작동 프로그램(40)이 기동되면, 세포 화상 해석 장치(10)를 구성하는 컴퓨터의 CPU(32)는, 메모리(31) 등과 협동하여, 리드 라이트(이하, RW(Read Write)라고 약칭한다) 제어부(50), 지시 접수부(51), 밀도 정보 도출부(52), 검출부(53), 평가 정보 도출부(54) 및 표시 제어부(55)로서 기능한다. CPU(32)는, "프로세서"의 일례이다.
RW 제어부(50)는, 스토리지 디바이스(30)로의 각종 데이터의 기억 및 스토리지 디바이스(30) 내의 각종 데이터의 독출을 제어한다. 예를 들면, RW 제어부(50)는, 촬영 장치(11)로부터의 세포 화상(14)을 수신하여, 스토리지 디바이스(30)에 기억한다. 또, RW 제어부(50)는, 세포 화상(14)을 스토리지 디바이스(30)로부터 독출하여, 밀도 정보 도출부(52)에 출력한다. 즉, RW 제어부(50)는, "취득부"의 일례이다.
지시 접수부(51)는, 밀도 정보 도출부(52)에서 행하는 커널 밀도 추정의 밴드폭 BW의, 입력 디바이스(35)를 통한 유저에 의한 지정을 접수한다. 지시 접수부(51)는, 접수한 밴드폭 BW를, 지정 밴드폭(41)으로서 RW 제어부(50)에 출력한다. RW 제어부(50)는, 지정 밴드폭(41)을 스토리지 디바이스(30)에 기억한다. 또, RW 제어부(50)는, 지정 밴드폭(41)을 스토리지 디바이스(30)로부터 독출하여, 세포 화상(14)과 함께 밀도 정보 도출부(52)에 출력한다.
지정 밴드폭(41)은, 어느 1명의 환자로부터 채취된 세포를 바탕으로 생성된 간엽계 줄기세포(13)의 배양 프로젝트마다 지정된다. 이 때문에, 1개의 배양 프로젝트에 있어서는, 한 번 지정된 지정 밴드폭(41)이, 배양 프로젝트를 통하여 반복하여 사용된다.
밀도 정보 도출부(52)는, 세포 화상(14)을 화상 해석하여, 세포 화상(14) 내의 간엽계 줄기세포(13)의 밀도 정보를 도출한다.
보다 자세하게는, 밀도 정보 도출부(52)는, 지정 밴드폭(41)에서 커널 밀도 추정을 행함으로써, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 추정 밀도 분포(60)를 도출한다.
밀도 정보 도출부(52)는, 도출한 추정 밀도 분포(60)를, 밀도 정보로서 검출부(53)에 출력한다. 밀도 정보 도출부(52)는, "도출부"의 일례이다.
검출부(53)는, 추정 밀도 분포(60)에 근거하여 간엽계 줄기세포(13)의 콜로니를 검출한다. 검출부(53)는, 콜로니의 검출 결과(42)를 RW 제어부(50) 및 평가 정보 도출부(54)에 출력한다. RW 제어부(50)는, 검출 결과(42)를 스토리지 디바이스(30)에 기억한다. 검출 결과(42)는, 세포 화상(14)과 관련지어 기억된다.
평가 정보 도출부는, 검출 결과에 근거하여 평가 정보를 도출한다. 평가 정보 도출부는, 평가 정보를 RW 제어부에 출력한다. RW 제어부는, 평가 정보를 스토리지 디바이스에 기억한다. 평가 정보(43)는, 검출 결과(42)와 동일하게, 세포 화상(14)과 관련지어 기억된다.
RW 제어부(50)는, 관련지어 기억된 세포 화상(14), 검출 결과(42) 및 평가 정보(43)의 세트를 스토리지 디바이스(30)로부터 독출하여, 표시 제어부(55)에 출력한다.
표시 제어부(55)는, 디스플레이(34)에 각종 화면을 표시하는 제어를 행한다. 각종 화면에는, 세포 화상(14)을 표시하는 세포 화상 표시 화면(80)(도 11 참조), 세포 화상(14), 검출 결과(42) 및 평가 정보(43)를 표시하는 해석 결과 표시 화면(85)(도 12 참조) 등이 포함된다.
도 4에 있어서, 밀도 정보 도출부(52)는, 세포 무게중심 위치 추출부(65)와 커널 밀도 추정부(66)를 갖는다. 세포 무게중심 위치 추출부(65)는, 세포 화상(14)에 대하여 2치화 처리를 행한다.
2치화 처리는, 먼저, 세포 화상(14) 내의 간엽계 줄기세포(13)와 그 이외의 영역을 나누는 휘돗값의 임곗값을 설정한다. 그리고, 세포 화상(14)의 각 화소에 대하여, 휘돗값이 임곗값 미만이면 간엽계 줄기세포(13)인 것으로서 화솟값을 0으로, 휘돗값이 임곗값 이상이면 간엽계 줄기세포(13) 이외의 영역인 것으로서 화솟값을 1로 각각 치환한다.
2치화 처리 후, 세포 무게중심 위치 추출부(65)는, 간엽계 줄기세포(13)인 것으로서 화솟값을 0으로 치환한 영역에 대하여, 개개의 간엽계 줄기세포(13)를 인식하는 주지의 화상 인식 처리를 행한다. 그리고, 이로써 인식한 개개의 간엽계 줄기세포(13)의 무게중심(68)(십자 마크로 나타낸다)을 추출한다. 세포 무게중심 위치 추출부(65)는, 무게중심(68)의 추출 결과를 커널 밀도 추정부(66)에 출력한다. 무게중심(68)의 추출 결과는, 구체적으로는, 세포 화상(14)의 장변을 따르는 축을 X축, 단변을 따르는 축을 Y축으로 하여, 세포 화상(14)의 좌상 측 모서리를 원점으로 한 경우의 무게중심(68)의 XY 좌표이다.
커널 밀도 추정부(66)는, 무게중심(68)을 표본점으로 한 커널 밀도 추정을 행하고, 그 결과로서 추정 밀도 분포(60)를 출력한다. 보다 자세하게는 도 5에 나타내는 바와 같이, 커널 밀도 추정부(66)는, 커널 함수로서 파선으로 나타내는 가우스 함수를 이용한다. 가우스 함수는 지정 밴드폭(41)을 갖는다. 커널 밀도 추정부(66)는, 복수의 무게중심(68)의 각각에 대하여 가우스 함수를 할당하고, 할당한 복수의 가우스 함수를 합산함(중첩함)으로써 추정 밀도 분포(60)를 산출한다. 추정 밀도 분포(60)는, 무게중심(68)의 정보도 포함한다. 또한, 커널 함수로서는, 가우스 함수 대신에, 직사각형 함수 또는 삼각형 함수를 이용해도 된다.
도 6 및 도 7에 나타내는 바와 같이, 검출부(53)는, 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행한다.
mean-shift는, 각 무게중심(68)을 중심으로 하는 반경 R의 탐색원(70)을 이용한다. mean-shift에서는, 어느 무게중심(68)을 개시점으로 하여, 추정 밀도 분포(60)를 단서로 간엽계 줄기세포(13)의 밀도가 높은 방향으로 순차적으로 탐색원(70)을 이동시켜 가, 최종적으로, 당해 무게중심(68)이 수렴하는 간엽계 줄기세포(13)의 밀도의 극대점 71을 탐색한다.
검출부(53)는, 각각의 무게중심(68)에 대하여 mean-shift를 행한다. 검출부(53)는, 무게중심(68)이 추정 밀도 분포(60) 내의 동일한 극대점 71에 수렴한 간엽계 줄기세포(13)의 집합을, 콜로니로서 검출한다.
도 6 및 도 7에서는, 무게중심(68)이 극대점 71_1에 수렴한 간엽계 줄기세포(13)의 집합과, 무게중심(68)이 극대점 71_2에 수렴한 간엽계 줄기세포(13)의 집합을, 각각 콜로니로서 검출한 예를 나타낸다.
도 8에 나타내는 바와 같이, 검출부(53)는, 검출한 콜로니마다, No. 1, No. 2와 같은 넘버를 붙인다. 또, 검출부(53)는, 검출한 콜로니마다, 간엽계 줄기세포(13)의 무게중심(68)에 외접하는 직사각형 프레임(75)을 생성한다. 그리고, 넘버와 함께, 직사각형 프레임(75)의 좌상 측 모서리와 우하 측 모서리의 대각점 PA, PB의 XY 좌표를, 검출 결과(42)로서 출력한다. 도 8에서는, 콜로니 No. 1의 직사각형 프레임 75_1의 대각점 PA_1 및 PB_1, 및 콜로니 No. 2의 직사각형 프레임 75_2의 대각점 PA_2 및 PB_2를 포함하는 검출 결과(42)를 예시하고 있다.
도 9에 나타내는 바와 같이, 평가 정보 도출부(54)는, 검출부(53)가 검출한 콜로니의 개수, 콜로니 형성 단위(CFU: Colony Forming Unit) 및 평균 콜로니 사이즈를, 평가 정보(43)로서 도출한다.
이와 같이, 평가 정보(43)는, 1개의 시점에 있어서의 콜로니의 개수, CFU 및 평균 콜로니 사이즈 중 적어도 하나에 관한 정보이다.
또, 배양액의 희석 배수 및 파종한 간엽계 줄기세포(13)의 양은, 입력 디바이스(35)를 통하여 유저에 의하여 입력된다.
콜로니의 사이즈는, 도 10에 나타내는 바와 같이, 직사각형 프레임(75)의 X축 방향의 폭 WX와 Y축 방향의 폭 WY를 가산하여, 2로 나눈 값이다. 평균 콜로니 사이즈는, 이렇게 하여 산출한 콜로니 사이즈의 적산값을, 콜로니의 개수로 나눈 값이다.
도 11은, 표시 제어부(55)의 제어하, 디스플레이(34)에 표시되는 세포 화상 표시 화면(80)을 나타낸다. 세포 화상 표시 화면(80)에는, 유저의 요구에 따른 세포 화상(14)이 표시된다.
세포 화상 표시 화면(80)의 하부에는, 해석 버튼(81)이 마련되어 있다. 세포 화상(14)의 화상 해석을 행하고자 하는 경우, 유저는 해석 버튼(81)을 선택한다. 해석 버튼(81)이 선택된 경우, 화상 해석 지시가 지시 접수부(51)로 접수된다. 이로써, 밀도 정보 도출부(52)에 의한 추정 밀도 분포(60)의 도출, 검출부(53)에 의한 콜로니의 검출 및 평가 정보 도출부(54)에 의한 평가 정보(43)의 도출이 행해진다.
도 12는, 표시 제어부(55)의 제어하, 디스플레이(34)에 표시되는 해석 결과 표시 화면(85)을 나타낸다. 해석 결과 표시 화면(85)에는, 검출부(53)에서 검출한 콜로니마다, 넘버 및 직사각형 프레임(75)이 중첩된 세포 화상(14)이 표시된다. 즉, 콜로니의 검출 결과(42)가 유저에게 제시된다. 세포 화상(14)의 하부에는, 평가 정보(43)가 표시된다. 즉, 평가 정보(43)가 유저에게 제시된다.
해석 결과 표시 화면(85)의 하부에는, 확인 버튼(86)이 마련되어 있다. 확인 버튼(86)이 선택된 경우, 표시 소거 지시가 지시 접수부(51)로 접수된다. 이 경우, 표시 제어부(55)는, 해석 결과 표시 화면(85)의 표시를 지운다.
도 13~도 16은, 지정 밴드폭(41)을 지정하는 일련의 처리를 나타낸다. 먼저, 도 13에 나타내는 바와 같이, 밀도 정보 도출부(52)는, 세포 무게중심 위치 추출부(65)에 의하여, 세포 화상(14)의 일부의 특정 영역(90)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 무게중심(68)을 추출한다. 특정 영역(90)은, 세포 화상(14)의 1/2의 사이즈로, 또한 세포 화상(14)과 중심이 일치하는 직사각형 프레임 내의 영역이다.
커널 밀도 추정부(66)는, 특정 영역(90)에 대하여, 밴드폭 BW_L의 가우스 함수를 이용한 커널 밀도 추정과, 밴드폭 BW_M의 가우스 함수를 이용한 커널 밀도 추정과, 밴드폭 BW_S의 가우스 함수를 이용한 커널 밀도 추정을 행한다. 즉, 커널 밀도 추정부(66)는, 복수 종의 밴드폭 BW에서 커널 밀도 추정을 행한다.
밴드폭 BW_L, BW_M 및 BW_S에는, 하기 식 (1)에 나타내는 대소 관계가 있다.
BW_L>BW_M>BW_S…(1)
즉, 밴드폭 BW_L이 가장 크고, 밴드폭 BW_S가 가장 작다. 그리고, 밴드폭 BW_M은, 밴드폭 BW_L 및 BW_S의 사이의 크기이다. 또한, 밴드폭 BW는 3종에 한정되지 않는다. 2종이어도 되고, 4종 이상이어도 된다.
커널 밀도 추정부(66)는, 밴드폭 BW_L에 대응하는 추정 밀도 분포 60_L, 밴드폭 BW_M에 대응하는 추정 밀도 분포 60_M, 및 밴드폭 BW_S에 대응하는 추정 밀도 분포 60_S를 각각 도출한다.
즉, 커널 밀도 추정부(66)는, 복수 종의 추정 밀도 분포(60)를 도출한다. 추정 밀도 분포 60_L은 가장 매끄러운 형상이며, 추정 밀도 분포 60_S는 가장 뾰족한 형상을 하고 있다. 추정 밀도 분포 60_M은, 추정 밀도 분포 60_L 및 60_S의 중간의 형상을 하고 있다.
도 14에 나타내는 바와 같이, 검출부(53)는, 특정 영역(90)에 대하여, 추정 밀도 분포 60_L, 60_M 및 60_S의 각각을 참조한 mean-shift를 행함으로써, 추정 밀도 분포 60_L, 60_M 및 60_S에 대응하는 콜로니의 검출 결과(42)를 출력한다.
보다 자세하게는, 검출부(53)는, 추정 밀도 분포 60_L을 참조한 mean-shift를 행함으로써 검출한 콜로니의 직사각형 프레임 75_L(2점 쇄선으로 나타낸다)의 대각점 PA_L 및 PB_L의 XY 좌표를, 검출 결과(42)로서 출력한다.
또, 검출부(53)는, 추정 밀도 분포 60_M을 참조한 mean-shift를 행함으로써 검출한 콜로니의 직사각형 프레임 75_M(실선으로 나타낸다)의 대각점 PA_M 및 PB_M의 XY 좌표를, 검출 결과(42)로서 출력한다.
또한, 검출부(53)는, 추정 밀도 분포 60_S를 참조한 mean-shift를 행함으로써 검출한 콜로니의 직사각형 프레임 75_S(파선으로 나타낸다)의 대각점 PA_S 및 PB_S의 XY 좌표를, 검출 결과(42)로서 출력한다.
직사각형 프레임 75_L은 비교적 커지고, 직사각형 프레임 75_S는 비교적 작아진다. 직사각형 프레임 75_M은, 직사각형 프레임 75_L 및 75_S의 중간의 크기가 된다. 이들의 검출 결과(42)는, 표시 제어부(55)에 출력된다.
표시 제어부(55)는, 도 15에 나타내는 지정 화면(95)을 디스플레이(34)에 표시한다. 지정 화면(95)에는, 검출 결과(42)로서의 직사각형 프레임 75_L, 75_M, 75_S가 중첩된 특정 영역(90)이 표시된다. 직사각형 프레임 75_L, 75_M, 75_S는, 색으로 구분하여 표시된다(예를 들면, 직사각형 프레임 75_L이 청색, 직사각형 프레임 75_M이 황색, 직사각형 프레임 75_S가 녹색 등).
특정 영역(90)의 하부에는, 콜로니로서 적절하다고 생각되는 직사각형 프레임(75)을 지정하는 취지의 메시지와 함께, 프레임 지정 버튼(96L, 96M, 96S)이 마련되어 있다. 프레임 지정 버튼 96L은 직사각형 프레임 75_L, 프레임 지정 버튼 96M은 직사각형 프레임 75_M, 프레임 지정 버튼 96S는 직사각형 프레임 75_S에 각각 대응한다. 프레임 지정 버튼(96L, 96M, 96S)은, 1개를 선택하면 다른 2개는 선택할 수 없는 택일적인 버튼이다. 즉, 표시 제어부(55)는, 복수 종의 검출 결과(42)를 유저에게 제시하고, 복수 종의 검출 결과(42) 중 하나를 유저에게 선택시킨다. 프레임 지정 버튼(96L, 96M, 96S)의 하부에는 지정 버튼(97)이 추가로 마련되어 있다.
도 16에 나타내는 바와 같이, 프레임 지정 버튼 96L, 96M 및 96S 중 하나가 선택된 상태로 지정 버튼(97)이 선택된 경우, 지시 접수부(51)는 밴드폭 BW의 지정을 접수한다. 지시 접수부(51)는, 유저가 선택한 1개의 프레임 지정 버튼(96)에 대응하는 밴드폭 BW를, 지정 밴드폭(41)으로 한다. 즉, 지시 접수부(51)는, 유저가 선택한 1개의 검출 결과(42)에 대응하는 밴드폭 BW를, 지정 밴드폭(41)으로 한다. 도 16에서는, 프레임 지정 버튼(96M)이 유저에 의하여 선택되고, 밴드폭 BW_M이 지정 밴드폭(41)이 된 경우를 예시하고 있다.
다음으로, 상기 구성에 의한 작용에 대하여, 도 17 및 도 18의 플로 차트를 참조하여 설명한다.
먼저, 세포 화상 해석 장치(10)에 있어서 작동 프로그램(40)이 기동되면, 도 3에서 나타낸 바와 같이, 세포 화상 해석 장치(10)의 CPU(32)는, RW 제어부(50), 지시 접수부(51), 밀도 정보 도출부(52), 검출부(53), 평가 정보 도출부(54) 및 표시 제어부(55)로서 기능된다.
RW 제어부(50)에 의하여, 스토리지 디바이스(30)로부터, 유저의 요구에 따른 세포 화상(14)이 독출된다(스텝 ST100). 세포 화상(14)은, RW 제어부(50)로부터 표시 제어부(55)에 출력된다.
표시 제어부(55)의 제어하, 도 11에서 나타낸 세포 화상 표시 화면(80)이 디스플레이(34)에 표시된다(스텝 ST110). 이로써 세포 화상(14)이 유저에게 제시된다.
유저에 의하여 해석 버튼(81)이 선택되어 화상 해석 지시가 지시 접수부(51)로 접수되고(스텝 ST120에서 YES), 또한 스토리지 디바이스(30)에 이미 지정 밴드폭(41)이 기억되어 있는 경우(스텝 ST130에서 YES), RW 제어부(50)에 의하여, 스토리지 디바이스(30)로부터 세포 화상(14) 및 지정 밴드폭(41)이 독출된다(스텝 ST140). 세포 화상(14) 및 지정 밴드폭(41)은, RW 제어부(50)로부터 밀도 정보 도출부(52)에 출력된다. 또한, 스텝 ST140은, "취득 스텝"의 일례이다.
도 4 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 밀도 정보 도출부(52)에 있어서, 지정 밴드폭(41)에서 커널 밀도 추정이 행해진다. 이로써, 추정 밀도 분포(60)가 밀도 정보로서 도출된다(스텝 ST150). 추정 밀도 분포(60)는, 밀도 정보 도출부(52)로부터 검출부(53)에 출력된다. 스텝 ST150은, "도출 스텝"의 일례이다.
도 6 및 도 7에서 나타낸 바와 같이, 검출부(53)에 있어서, 추정 밀도 분포(60)를 참조한 mean-shift가 행해진다. 이로써, 세포 화상(14) 내의 간엽계 줄기세포(13)의 콜로니가 검출된다(스텝 ST160). 콜로니의 검출 결과(42)는, 검출부(53)로부터 RW 제어부(50)에 출력되어, 스토리지 디바이스(30)에 기억된다. 또, 콜로니의 검출 결과(42)는, 검출부(53)로부터 평가 정보 도출부(54)에 출력된다. 스텝 ST160은, "검출 스텝"의 일례이다.
도 9에서 나타낸 바와 같이, 평가 정보 도출부(54)에서는, 검출 결과(42)에 근거하여, 콜로니의 개수, 콜로니 형성 단위 및 평균 콜로니 사이즈가 평가 정보(43)로서 도출된다(스텝 ST170). 평가 정보(43)는, 평가 정보 도출부(54)로부터 RW 제어부(50)에 출력되어, 스토리지 디바이스(30)에 기억된다.
검출 결과(42) 및 평가 정보(43)는, RW 제어부(50)에 의하여 스토리지 디바이스(30)로부터 독출되어, 표시 제어부(55)에 출력된다. 그리고, 표시 제어부(55)의 제어하, 도 12에서 나타낸 해석 결과 표시 화면(85)이 디스플레이(34)에 표시된다(스텝 ST180). 이로써 검출 결과(42) 및 평가 정보(43)가 유저에게 제시된다. 해석 결과 표시 화면(85)은, 확인 버튼(86)이 선택되어, 지시 접수부(51)에서 표시 소거 지시가 접수된 경우(스텝 ST190에서 YES)에, 표시가 지워진다. 그리고, 처리가 종료된다.
또한, 지시 접수부(51)에서 화상 해석 지시가 접수되지 않고(스텝 ST120에서 NO), 또한 종료 지시가 접수되지 않은 경우(스텝 ST200에서 NO), 세포 화상 표시 화면(80)의 표시가 계속된다. 지시 접수부(51)에서 종료 지시가 접수된 경우(스텝 ST200에서 YES)는, 세포 화상 표시 화면(80)의 표시가 지워져, 처리가 종료된다.
스토리지 디바이스(30)에 지정 밴드폭(41)이 기억되어 있지 않은 경우(스텝 ST130에서 NO)는, 도 18에 나타내는 처리가 행해진다.
구체적으로는, 먼저, 도 13에서 나타낸 바와 같이, 밀도 정보 도출부(52)에 있어서, 특정 영역(90)에 대하여, 3종의 밴드폭 BW_L, BW_M 및 BW_S에서 커널 밀도 추정이 행해지고, 이로써 3종의 추정 밀도 분포 60_L, 60_M 및 60_S가 도출된다(스텝 ST1301).
계속해서, 도 14에서 나타낸 바와 같이, 검출부(53)에 있어서, 특정 영역(90)에 대하여, 3종의 추정 밀도 분포 60_L, 60_M 및 60_S의 각각을 참조한 mean-shift가 행해지고, 이로써 3종의 추정 밀도 분포 60_L, 60_M 및 60_S에 대응하는 3종의 콜로니의 검출 결과(42)가 출력된다(스텝 ST1302).
3종의 콜로니의 검출 결과(42)는, 구체적으로는, 직사각형 프레임 75_L의 대각점 PA_L 및 PB_L, 직사각형 프레임 75_M의 대각점 PA_M 및 PB_M, 및 직사각형 프레임 75_S의 대각점 PA_S 및 PB_S의 XY 좌표이다.
다음으로, 도 15에서 나타낸 바와 같이, 표시 제어부(55)의 제어하, 지정 화면(95)이 디스플레이(34)에 표시된다(스텝 ST1303). 지정 화면(95)에는, 3종의 직사각형 프레임 75_L, 75_M 및 75_S에 각각 대응하는 프레임 지정 버튼 96L, 96M 및 96S가, 택일적으로 선택 가능하게 마련되어 있다.
도 16에서 나타낸 바와 같이, 유저는, 콜로니로서 적절하다고 생각되는 직사각형 프레임(75)에 대응하는 프레임 지정 버튼(96)을 선택하고, 지정 버튼(97)을 선택한다. 이로써, 지시 접수부(51)로 밴드폭 BW의 지정이 접수된다(스텝 ST1304). 지시 접수부(51)에 의하여, 유저가 선택한 프레임 지정 버튼(96)에 대응하는 밴드폭 BW가, 지정 밴드폭(41)이 된다. 지정 밴드폭(41)은, 지시 접수부(51)로부터 RW 제어부(50)에 출력되어, RW 제어부(50)에 의하여 스토리지 디바이스(30)에 기억된다(스텝 ST1305).
이상 설명한 바와 같이, 세포 화상 해석 장치(10)는, 취득부로서의 RW 제어부(50)와, 도출부로서의 밀도 정보 도출부(52)와, 검출부(53)를 구비한다. RW 제어부(50)는, 간엽계 줄기세포(13)를 촬영 장치(11)로 촬영하여 얻어진 세포 화상(14)을, 스토리지 디바이스(30)로부터 독출함으로써 취득한다. 밀도 정보 도출부(52)는, 세포 화상(14)을 화상 해석하여, 세포 화상(14) 내의 간엽계 줄기세포(13)의 밀도 정보로서의 추정 밀도 분포(60)를 도출한다. 검출부(53)는, 추정 밀도 분포(60)에 근거하여 간엽계 줄기세포(13)의 콜로니를 검출한다.
밀도 정보 도출부(52)는, 커널 밀도 추정을 행함으로써, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 추정 밀도 분포(60)를 도출하며, 추정 밀도 분포(60)를 밀도 정보로서 출력한다. 커널 밀도 추정이라는 자주 사용되는 방법으로 추정 밀도 분포(60)를 도출하며, 이것을 밀도 정보로 하기 때문에, 간엽계 줄기세포(13)의 밀도를 비교적 정확하게 나타낸 밀도 정보를, 간단하게 얻을 수 있다.
검출부(53)는, 추정 밀도 분포(60)를 참조한 mean-shift를 행함으로써, 추정 밀도 분포(60) 내의 동일한 극대점 71에 수렴한 간엽계 줄기세포(13)의 집합을, 콜로니로서 검출한다. mean-shift도, 커널 밀도 추정과 함께 자주 사용되는 방법이다. 이 때문에, 비교적 높은 정확도로, 간단하게 콜로니를 검출할 수 있다. 또, 유저의 육안에 의한 콜로니의 검출에 비하여, 일관된 기준으로 헤매지 않고 콜로니를 검출할 수 있다.
지시 접수부(51)는, 커널 밀도 추정의 밴드폭 BW의 유저에 의한 지정을 접수한다. 밀도 정보 도출부(52)는, 지시 접수부(51)가 접수한 밴드폭 BW인 지정 밴드폭(41)에서 커널 밀도 추정을 행한다. 이 때문에, 추정 밀도 분포(60)의 타당성을 높일 수 있다. 또, 결과적으로, 유저의 감각에 일치한 콜로니를 검출할 수 있다.
밀도 정보 도출부(52)는, 세포 화상(14)의 일부의 특정 영역(90)에 대하여, 복수 종의 밴드폭 BW에서 커널 밀도 추정을 행함으로써, 복수 종의 추정 밀도 분포(60)를 도출한다. 검출부(53)는, 복수 종의 추정 밀도 분포(60)의 각각을 참조한 mean-shift를 행함으로써, 복수 종의 추정 밀도 분포(60)에 대응하는 복수 종의 콜로니의 검출 결과(42)를 출력한다. 표시 제어부(55)는, 복수 종의 검출 결과(42)를 유저에게 제시하고, 복수 종의 검출 결과(42) 중 하나를 유저에게 선택시킨다. 지시 접수부(51)는, 유저가 선택한 1개의 검출 결과(42)에 대응하는 밴드폭 BW를, 지정 밴드폭(41)으로 한다. 유저는, 복수 종의 검출 결과(42)를 비교하면서, 자신이 콜로니로서 적절하다고 생각되는 검출 결과(42)를 선택할 수 있다. 이 때문에 검출 결과(42)의 선택이 용이하다.
표시 제어부(55)는, 콜로니의 검출 결과(42)를 유저에게 제시한다. 이 때문에 유저는 콜로니의 검출 결과(42)를 확인할 수 있다.
평가 정보 도출부(54)는, 콜로니의 검출 결과(42)에 근거하여, 간엽계 줄기세포(13)의 증식능을 나타내는 평가 정보(43)를 도출한다. 표시 제어부(55)는, 평가 정보(43)를 유저에게 제시한다. 이 때문에, 유저는 평가 정보(43)를 확인할 수 있고, 평가 정보(43)를 참조하여 간엽계 줄기세포(13)의 증식능을 평가할 수 있다.
평가 정보(43)는, 1개의 시점에 있어서의 콜로니의 개수, CFU 및 평균 콜로니 사이즈 중 적어도 어느 하나에 관한 정보이다. 이 때문에, 유저는, 1개의 시점에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 증식능을 평가할 수 있다.
또, 도출되는 평가 정보(43)가 일정한 크기를 초과하는 콜로니 사이즈를 갖는 간엽계 줄기세포(13)의 정보에 한정되도록, 검출부(53)를 설정해 두는 것이 가능하다.
구체적으로는, 콜로니 사이즈 0.54mm 초과의 콜로니에 대한 평균 콜로니 사이즈를 도출하도록, 검출부(53)를 설정할 수 있다.
또한, 평가 정보는, 도 9에서 예시한 콜로니의 개수, CFU 및 평균 콜로니 사이즈 이외의 평가 정보를 포함하고 있어도 된다.
예를 들면, 평가 정보는, 콜로니를 구성하는 간엽계 줄기세포(13)의 개수의 평균값 또는 직사각형 프레임(75)의 폭 WX와 폭 WY의 비(WX/WY)의 평균값 등이어도 된다.
직사각형 프레임(75)의 폭 WX와 폭 WY의 비가 1에 가까울수록, 즉 직사각형 프레임(75)이 정사각형에 가까울수록, 콜로니를 구성하는 간엽계 줄기세포(13)가 균일하게 증식하고 있다고 할 수 있기 때문에 바람직하다.
또, 도 19에 나타내는 평가 정보 100과 같이, 세로축의 도수를 콜로니의 개수, 가로축의 계급을 콜로니의 사이즈로 한 히스토그램 101 등의 통계적인 정보를 포함하고 있어도 된다. 또한, 부호 102는, 평균 콜로니 사이즈를 나타내는 선분이다.
또, 평가 정보는, 1개의 시점에 있어서의 정보에 한정하지 않고, 복수의 시점에 있어서의 정보여도 된다.
예를 들면, 도 20에 나타내는 평가 정보(105)와 같이, 평균 콜로니 사이즈를 세로축, 간엽계 줄기세포(13)의 배양 일수를 가로축으로 한, 평균 콜로니 사이즈의 시계열 변화를 나타내는 그래프(106)를 포함하고 있어도 된다.
그래프(106)에는, 각 배양 일수에 대한 평균 콜로니 사이즈의 플롯(×표로 나타낸다)(107), 각 플롯(107)의 근사 직선(108) 및 말풍선(109)이 표시된다. 말풍선(109) 내에는, 1배양 일수당 평균 콜로니 사이즈의 변화량이 기록된다.
또, 평균 콜로니 사이즈 변화량에 임곗값을 설정해도 된다. 그리고, 평균 콜로니 사이즈 변화량이 임곗값 미만인 경우에, 도 21에 나타내는 바와 같이 경고(110)를 표시해도 된다. 임곗값은 경험적인 견지(見地)로부터 설정된 값이며, 배양 종료 후의 간엽계 줄기세포(13)의 품질이 출하 가능 레벨에 도달하지 않는 것이 명확한 값이다. 이렇게 함으로써, 간엽계 줄기세포(13)의 배양을 중지하거나, 배지의 성분을 변경하는 등 하여 간엽계 줄기세포(13)의 품질을 출하 레벨로 높인다는 다양한 대응을 유저에게 촉구할 수 있다.
지정 밴드폭(41)의 지정 방법으로서는, 도 22에 나타내는 양태를 채용해도 된다.
먼저, 밴드폭 BW가 초깃값인 제1 밴드폭 BW_I(도시 생략)로 설정된다(스텝 ST1310). 제1 밴드폭 BW_I는, 예를 들면, 위의 밴드폭 BW_L이다.
이어서, 밀도 정보 도출부(52)에 있어서, 특정 영역(90)에 대하여, 제1 밴드폭 BW_I에서 커널 밀도 추정이 행해지고, 이로써 추정 밀도 분포 60_I(도시 생략)가 도출된다(스텝 ST1311).
계속해서, 검출부(53)에 있어서, 특정 영역(90)에 대하여, 추정 밀도 분포 60_I를 참조한 mean-shift가 행해지고, 이로써 추정 밀도 분포 60_I에 대응하는 콜로니의 검출 결과(42)가 출력된다(스텝 ST1312). 콜로니의 검출 결과(42)는, 구체적으로는, 직사각형 프레임 75_I(도시 생략)의 대각점 PA_I, PB_I(도시 생략)의 XY 좌표이다.
다음으로, 표시 제어부(55)의 제어하, 콜로니의 검출 결과(42)인 직사각형 프레임 75_I가 중첩된 세포 화상(14)의 표시 화면이 디스플레이(34)에 표시된다(스텝 ST1313). 표시 화면에는, 직사각형 프레임 75_I로 나타나는 영역이 콜로니로서 적절한지 아닌지를, 유저에게 선택시키기 위한 버튼이 마련되어 있다.
직사각형 프레임 75_I로 나타나는 영역이 콜로니로서 적절하지 않은 것을 나타내는 버튼이 유저에 의하여 선택된 경우(스텝 ST1314로 NO), 밴드폭 BW가 제1 밴드폭 BW_I로부터 제2 밴드폭 BW_SE(도시 생략)로 변경된다(스텝 ST1315). 제2 밴드폭 BW_SE는, 예를 들면 상기 제1 실시형태의 밴드폭 BW_M이다. 그리고, 제2 밴드폭 BW_SE에서 스텝 ST1311의 처리가 행해지고, 또한 스텝 ST1312, ST1313의 처리도 행해진다. 이들 스텝 ST1315부터 스텝 ST1313까지의 일련의 처리는, 직사각형 프레임(75)으로 나타나는 영역이 콜로니로서 적절한 것을 나타내는 버튼이 유저에 의하여 선택될 때까지, 반복하여 계속된다.
직사각형 프레임(75)으로 나타나는 영역이 콜로니로서 적절한 것을 나타내는 버튼이 유저에 의하여 선택된 경우(스텝 ST1314에서 YES), 지시 접수부(51)에 의하여, 그때 설정되어 있던 밴드폭 BW가, 지정 밴드폭(41)이 된다. 지정 밴드폭(41)은, 지시 접수부(51)로부터 RW 제어부(50)에 출력되어, RW 제어부(50)에 의하여 스토리지 디바이스(30)에 기억된다(스텝 ST1316).
이와 같이, 밴드폭 BW를 단계적으로 변경하여, 그때마다 콜로니의 검출 결과(42)로서의 직사각형 프레임(75)을 유저에게 제시하고, 직사각형 프레임(75)으로 나타나는 영역이 콜로니로서 적절한지 아닌지를, 유저에게 선택시켜도 된다. 또한, 콜로니로서 적절하다고 생각되는 직사각형 프레임(75)을 유저에게 입력시키고, 입력된 직사각형 프레임(75)에 따른 밴드폭 BW를 지정 밴드폭(41)으로 해도 된다.
세포 화상 해석 장치의 다른 형태(이하, 제2 실시형태라고도 한다)를, 도 23~도 27을 참조하면서 설명한다.
제2 실시형태에서는, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 증식의 정도를 나타내는 지수가 설정 범위(123) 내인 경우에 한하여, 밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출이 실행된다.
도 23~도 25에 있어서, 세포 화상 해석 장치의 CPU는, 상기 제1 실시형태의 각 처리부 50~55에 더하여, 면적률 산출부(120) 및 판정부(121)로서 기능한다.
면적률 산출부(120)는, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 면적률(122)을 산출한다. 구체적으로는, 면적률 산출부(120)는, 세포 무게중심 위치 추출부(65)와 동일하게, 세포 화상(14)에 대하여 2치화 처리를 행한다.
다음으로, 간엽계 줄기세포(13)인 것으로서 화솟값을 0으로 치환한 화소수를 카운트한다. 그리고, 카운트한 화소수를 세포 화상(14)의 전체 화소수로 나눔으로써, 간엽계 줄기세포(13)의 면적률(122)을 산출한다. 면적률 산출부(120)는, 산출한 면적률(122)을 판정부(121)에 출력한다. 면적률(122)은, "지수"의 일례이다.
판정부(121)는, 면적률 산출부(120)로부터의 면적률(122)이, 설정 범위(123) 내인지 아닌지를 판정한다. 설정 범위(123)는 스토리지 디바이스(30)에 기억되어 있고, RW 제어부(50)에 의하여 스토리지 디바이스(30)로부터 독출되어, 판정부(121)에 전달된다.
도 23에 나타내는 바와 같이, 판정부(121)는, 면적률(122)이 설정 범위(123) 내인 경우, "밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행한다"라는 내용의 판정 결과 124A를 출력한다.
이 경우, 밀도 정보 도출부(52)는 밀도 정보인 추정 밀도 분포(60)의 도출을 실행하고, 검출부(53)도 콜로니의 검출을 실행한다.
도 24 및 도 25에 나타내는 바와 같이, 판정부(121)는, 면적률(122)이 설정 범위(123) 외인 경우, "밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행하지 않는다"라는 내용의 판정 결과 124B를 출력한다.
이 경우, 밀도 정보 도출부(52)는 밀도 정보인 추정 밀도 분포(60)의 도출을 실행하지 않고, 검출부(53)도 콜로니의 검출을 실행하지 않는다.
도 23~도 25에서는, 면적률의 설정 범위(123)를 25%~75%로 설정한 경우를 예시하고 있다.
도 23은, 면적률(122)이 41%로 설정 범위(123) 내이며, 판정부(121)가 판정 결과 124A를 출력하는 예를 나타낸다. 도 24는, 면적률(122)이 14%로 설정 범위(123) 외이며, 판정부(121)가 판정 결과 124B를 출력하는 예를 나타낸다. 도 25는, 면적률(122)이 79%로 설정 범위(123) 외이며, 판정부(121)가 판정 결과 124B를 출력하는 예를 나타낸다.
도 26은, 도 23~도 25에서 나타낸 양태를, 세로축을 면적률, 가로축을 배양 일수로 한 그래프에 집계한 것이다.
간엽계 줄기세포(13)는, 증식 속도가 매우 높은 경향이 있고, 평균 콜로니 사이즈가 비교적 조기에 플래토(Plateau)에 도달한다.
그러나, 배양 초기의 단계에서는, 콜로니라고 할 수 있을 정도의 수는 밀집되어 있지 않다.
이 때문에, 배양 초기의 단계라고 할 수 있는, 면적률(122)이 25% 미만인 경우, 판정부(121)는, "밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행하지 않는다"라고 하는 내용의 판정 결과 124B를 출력한다.
또, 평균 콜로니 사이즈가 플래토에 도달하는 배양의 최종 단계에서는, 콜로니가 배양 용기(12)의 대략 전체에 걸쳐 있고, 콜로니를 구별하는 의미가 없어진다. 이 때문에, 배양의 최종 단계라고 할 수 있는, 면적률(122)이 75%보다 큰 경우도, 판정부(121)는, "밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출을 실행하지 않는다"라고 하는 내용의 판정 결과 124B를 출력한다.
도 27은, 면적률(122)이 설정 범위(123) 외에서, 판정부(121)가 판정 결과 124B를 출력한 경우의 세포 화상 표시 화면(80)을 나타낸다. 이 경우, 해석 버튼(81)이 선택되면, 표시 제어부(55)는, 경고 윈도(130)를 팝업 표시한다. 경고 윈도(130)에는, 면적률(122)이 설정 범위(123) 외이기 때문에, 해석을 할 수 없는 취지의 메시지가 표시된다. 경고 윈도(130)는, OK 버튼(131)을 선택함으로써 표시가 지워진다.
이와 같이, 제2 실시형태에서는, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 증식의 정도를 나타내는 지수인 면적률(122)이 설정 범위(123) 내인 경우에 한하여, 밀도 정보의 도출 및 콜로니의 검출이 실행된다.
이 때문에, 배양의 초기 단계(간엽계 줄기세포(13)가 콜로니를 형성하고 있지 않은 단계) 및 배양의 최종 단계(간엽계 줄기세포(13)가 배양 용기(12)의 대략 전체에 걸친 큰 콜로니를 형성하고 있는 단계) 등, 화상 해석의 실행에 의미가 없는 경우의 불필요한 화상 해석을 피할 수 있다. 환언하면, 간엽계 줄기세포(13)의 증식능의 평가에 적절한 기간에 한하여, 화상 해석을 실행할 수 있다.
또한, 세포 화상(14)에 있어서의 간엽계 줄기세포(13)의 증식의 정도를 나타내는 지수로서는, 예시의 면적률(122)에 한정되지 않는다. 세포 화상(14) 내의 간엽계 줄기세포(13)의 개수여도 된다.
세포 화상 해석 장치의 또 다른 형태(이하, 제3 실시형태라고도 한다)를, 도 28~도 30을 참조하면서 설명한다.
도 28에 있어서, 밀도 정보 도출부(140)는, 기설정된 탐색 프레임(141) 내의 간엽계 줄기세포(13)의 개수(이하, 범위 내 세포수라고 한다)(142)를, 밀도 정보로서 도출한다. 탐색 프레임(141)은, 예를 들면 상기 제1 실시형태의 직사각형 프레임 75_M과 동등한 크기를 갖는다. 혹은, 탐색 프레임(141)은 유저가 설정한다. 범위 내 세포수(142)는, 예를 들면, 탐색 프레임(141) 내에 존재하는 간엽계 줄기세포(13)의 무게중심(68)의 개수를 카운트함으로써 얻어진다. 밀도 정보 도출부(140)는, 범위 내 세포수(142)를 검출부(143)에 출력한다.
검출부(143)는, 범위 내 세포수(142) 및 콜로니 조건(144)에 근거하여 콜로니를 검출하고, 그 검출 결과(145)를 출력한다. 콜로니 조건(144)은 스토리지 디바이스(30)에 기억되어 있고, RW 제어부(50)에 의하여 스토리지 디바이스(30)로부터 독출되어, 검출부(143)에 전달된다.
도 29에 나타내는 바와 같이, 밀도 정보 도출부(140)는, 세포 화상(14) 내의 복수의 영역 RE1_1, RE1_2, …, RE2_1, …, REM_N에 탐색 프레임(141)을 순차 주사하여, 각 영역에 있어서 범위 내 세포수(142)를 도출한다.
검출부(143)는, 각 영역 RE에 있어서의 범위 내 세포수(142)가 콜로니 조건(144)을 충족시키는지 아닌지에 의하여, 각 영역 RE가 콜로니의 영역인지 아닌지를 검출한다. 또한, 영역 RE1_2는, 영역 RE1_1로부터 X축 방향으로, 탐색 프레임(141)을 절반 어긋나게 한 영역이다. 또, 영역 RE2_1은, 영역 RE1_1로부터 Y축 방향으로, 탐색 프레임(141)을 절반 어긋나게 한 영역이다.
예를 들면, 도 30에 나타내는 바와 같이, 영역 RE2_1에 있어서의 범위 내 세포수(142)가 52개이고, 콜로니 조건(144)이 범위 내 세포수≥50개라는 내용인 경우, 검출부(143)는, 영역 RE2_1을 콜로니의 영역으로서 검출한다.
이와 같이, 제3 실시형태에서는, 추정 밀도 분포(60) 대신에, 범위 내 세포수(142)를 밀도 정보로서 도출한다. 이 때문에, 추정 밀도 분포(60)와 비교하여, 간단하게 밀도 정보를 도출할 수 있다.
또한, 탐색 프레임(141)은 1종에 한정되지 않는다. 크기 또는 형상 등이 상이한 복수 종의 탐색 프레임(141)을 설정하고, 각 탐색 프레임(141)에 대하여 콜로니를 검출해도 된다.
세포 화상 해석 장치의 또 다른 형태(이하, 제4 실시형태라고도 한다)를, 도 31 및 도 32를 참조하면서 설명한다.
제4 실시형태에서는, 기계 학습 모델(150)을 이용하여 화상 해석을 행한다.
도 31에 있어서, 기계 학습 모델(150)은, 세포 화상(14)을 입력 화상으로 하여, 콜로니의 검출 결과(42)로서의 직사각형 프레임(75)이 중첩된 세포 화상(14)을 출력 화상으로 하는 모델이다. 기계 학습 모델(150)은, 예를 들면, U-Net(U-Shaped Neural Network), SegNet, ResNet(Residual Network) 또는 DenseNet(Densely Connected Convolusional Network) 등의 중첩 뉴럴 네트워크(neural network)이다.
도 32는, 기계 학습 모델(150)의 학습 페이즈에 있어서의 처리의 개요를 나타낸다. 학습 페이즈에 있어서, 기계 학습 모델(150)은, 학습 데이터(155)가 부여되어 학습된다. 학습 데이터(155)는, 학습용 세포 화상(14L)과, 당해 학습용 세포 화상(14L)에 대응하는 정답 화상(14CA)의 세트이다. 정답 화상(14CA)은, 학습용 세포 화상(14L)의 콜로니라고 생각되는 영역에, 유저가 수동으로 직사각형 프레임(75)을 기입한 화상이다.
학습 페이즈에 있어서, 기계 학습 모델(150)에는, 학습용 세포 화상(14L)이 입력된다. 기계 학습 모델(150)은, 학습용 세포 화상(14L)에 대하여 학습용 출력 화상(14OL)을 출력한다. 학습용 출력 화상(14OL)은, 기계 학습 모델(150)에 있어서 콜로니라고 추정한 영역에 직사각형 프레임(75)이 중첩된 학습용 세포 화상(14L)이다. 이 학습용 출력 화상(14OL) 및 정답 화상(14CA)에 근거하여, 기계 학습 모델(150)의 손실 연산이 이루어진다. 그리고, 손실 연산의 결과에 따라 기계 학습 모델(150)의 각종 계수의 갱신 설정이 이루어지고, 갱신 설정에 따라 기계 학습 모델(150)이 갱신된다. 학습용 출력 화상(14OL)의 직사각형 프레임(75)과, 정답 화상(14CA)의 직사각형 프레임(75)의 사이에 큰 격차가 있는 경우는, 손실은 커지고, 기계 학습 모델(150)의 갱신 정도도 커진다. 반대로 학습용 출력 화상(14OL)의 직사각형 프레임(75)과, 정답 화상(14CA)의 직사각형 프레임(75)의 사이에 거의 격차가 없는 경우는, 손실은 작아지고, 기계 학습 모델(150)의 갱신 정도도 작아진다.
학습 페이즈에 있어서는, 학습용 세포 화상(14L)의 기계 학습 모델(150)로의 입력, 기계 학습 모델(150)로부터의 학습용 출력 화상(14OL)의 출력, 손실 연산, 갱신 설정 및 기계 학습 모델(150)의 갱신의 상기 일련의 처리가, 학습 데이터(155)가 교환되면서 반복하여 행해진다.
상기 일련의 처리의 반복은, 학습용 출력 화상(14OL)의 직사각형 프레임(75)의 추정 정밀도가, 기정해진 설정 레벨까지 도달한 경우에 종료된다. 이렇게 하여 직사각형 프레임(75)의 추정 정밀도가 설정 레벨까지 도달한 기계 학습 모델(150)이, 스토리지 디바이스(30)에 기억되어 이용된다.
이와 같이, 제4 실시형태에서는, 기계 학습 모델(150)을 이용하여 콜로니를 검출한다. 이 때문에, 보다 효율적으로 콜로니를 검출할 수 있다.
또한, 정답 화상(14CA) 대신에, 학습용 세포 화상(14L)의 콜로니라고 생각되는 직사각형 프레임(75)의 대각점 PA, PB의 XY 좌표를, 학습 데이터(155)로서 이용해도 된다.
배양 프로젝트마다가 아니라, 세포 화상(14)마다 지정 밴드폭(41)을 변경해도 된다. 또, 간엽계 줄기세포(13)의 종류에 따라 지정 밴드폭(41)을 변경해도 된다(예를 들면, A세포는 지정 밴드폭(41)을 밴드폭 BW_M으로 하고, B세포는 지정 밴드폭(41)을 밴드폭 BW_S로 하는 등).
콜로니의 검출 결과(42)로서는, 예시의 직사각형 프레임(75)에 한정되지 않고, 예를 들면, 검출한 콜로니의 영역을 둘러싸는 곡선의 프레임(원형 또는 타원형의 프레임 등)으로 해도 된다.
밴드폭 BW와 동일하게, mean-shift에서 이용하는 탐색원(70)의 반경 R을 유저에게 지정시켜도 된다.
콜로니의 검출 결과(42)를 유저에게 제시하는 양태로서는, 직사각형 프레임(75)이 중첩된 세포 화상(14)을 디스플레이(34)에 표시하는 양태에 한정되지 않는다.
예를 들면, 직사각형 프레임(75)이 중첩된 세포 화상(14)을 프린트 아웃하는 양태 또는 직사각형 프레임(75)이 중첩된 세포 화상(14)을, 유저가 소유하는 단말에 전자 메일 등으로 전달하는 양태를 채용해도 된다.
평가 정보(43)를 유저에게 제시하는 양태도 동일하게, 평가 정보(43)를 디스플레이(34)에 표시하는 양태에 한정되지 않는다.
예를 들면, 평가 정보(43)를 프린트 아웃하는 양태 또는 평가 정보(43)를 유저가 소유하는 단말에 전자 메일 등으로 전달하는 양태를 채용해도 된다.
세포 화상 해석 장치(10)를 구성하는 컴퓨터의 하드웨어 구성은 다양한 변형이 가능하다. 세포 화상 해석 장치(10)를, 처리 능력 및 신뢰성의 향상을 목적으로 하여, 하드웨어로서 분리된 복수 대의 컴퓨터로 구성하는 것도 가능하다. 예를 들면, 밀도 정보 도출부(52) 및 검출부(53)의 기능과, 평가 정보 도출부(54)의 기능을, 2대의 컴퓨터에 분산하여 담당하게 한다. 이 경우는 2대의 컴퓨터로 세포 화상 해석 장치(10)를 구성한다.
이와 같이, 세포 화상 해석 장치(10)의 컴퓨터의 하드웨어 구성은, 처리 능력, 안전성 및 신뢰성 등의 요구되는 성능에 따라 적절히 변경할 수 있다.
또한, 하드웨어에 한정하지 않고, 작동 프로그램(40) 등의 애플리케이션 프로그램에 대해서도, 안전성 및 신뢰성의 확보를 목적으로 하여, 이중화 및 복수의 스토리지 디바이스에 분산 저장 등을 실시할 수 있다.
상기 각 실시형태에 있어서, 예를 들면, RW 제어부(50), 지시 접수부(51), 밀도 정보 도출부(52, 140), 검출부(53, 143), 평가 정보 도출부(54), 표시 제어부(55), 세포 무게중심 위치 추출부(65), 커널 밀도 추정부(66), 면적률 산출부(120) 및 판정부(121)와 같은 각종 처리를 실행하는 처리부(Processing Unit)의 하드웨어적인 구조로서는, 다음에 나타내는 각종 프로세서를 이용할 수 있다.
각종 프로세서에는, 상기한 바와 같이, 소프트웨어(작동 프로그램(40))를 실행하여 각종 처리부로서 기능하는 범용적인 프로세서인 CPU(32)에 더하여, FPGA(Field Programmable Gate Array) 등의 제조 후에 회로 구성을 변경 가능한 프로세서인 프로그래머블 로직 디바이스(Programmable Logic Device: PLD) 및 ASIC(Application Specific Integrated Circuit) 등의 특정 처리를 실행시키기 위하여 전용으로 설계된 회로 구성을 갖는 프로세서인 전용 전기 회로 등이 포함된다.
1개의 처리부는, 이들 각종 프로세서 중 하나로 구성되어도 되고, 동종 또는 이종(異種)의 2개 이상의 프로세서의 조합(예를 들면, 복수의 FPGA의 조합 및 CPU와 FPGA의 조합 등)으로 구성되어도 된다. 또, 복수의 처리부를 하나의 프로세서로 구성해도 된다.
복수의 처리부를 하나의 프로세서로 구성하는 예로서는, 첫째로, 클라이언트 및 서버 등의 컴퓨터로 대표되는 바와 같이, 하나 이상의 CPU와 소프트웨어의 조합으로 하나의 프로세서를 구성하고, 이 프로세서가 복수의 처리부로서 기능하는 형태가 있다.
둘째로, 시스템 온 칩(System On Chip: SoC) 등으로 대표되는 바와 같이, 복수의 처리부를 포함하는 시스템 전체의 기능을 하나의 IC(Integrated Circuit) 칩으로 실현되는 프로세서를 사용하는 형태가 있다.
이와 같이, 각종 처리부는, 하드웨어적인 구조로서, 상기 각종 프로세서의 하나 이상을 이용하여 구성된다.
또한, 이들 각종 프로세서의 하드웨어적인 구조로서는, 보다 구체적으로는, 반도체 소자 등의 회로 소자를 조합한 전기 회로(circuitry)를 이용할 수 있다.
이상에 나타낸 기재 내용 및 도시 내용은, 본 개시의 기술의 일례에 불과하다. 예를 들면, 상기의 구성, 기능, 작용, 및 효과에 관한 설명은, 본 개시의 기술에 관한 부분의 구성, 기능, 작용 및 효과의 일례에 관한 설명이다. 따라서, 본 개시의 기술의 주지를 벗어나지 않는 범위 내에 있어서, 이상에 나타낸 기재 내용 및 도시 내용에 대하여, 불필요한 부분을 삭제하거나, 새로운 요소를 추가하거나, 치환하거나 해도 되는 것은 말할 필요도 없다.
또, 착종(錯綜)을 회피하고, 본 개시의 기술에 관한 부분의 이해를 용이하게 하기 위하여, 이상에 나타낸 기재 내용 및 도시 내용에서는, 본 개시의 기술의 실시를 가능하게 하는 데 있어서 특별히 설명을 필요로 하지 않는 기술 상식 등에 관한 설명은 생략되어 있다.
(집단의 선별)
본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에 있어서는, 검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위 중 적어도 일방에 근거하여, 집단의 선별을 행한다.
구체예로서, 평가 정보 도출부로부터 도출되는, 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위의 평가 정보에 근거하여, 집단의 선별을 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 콜로니의 검출이, 배양 개시일로부터 4일째~6일째에 있어서 행해지며, 집단의 선별이, 하기 조건 a1) 및 조건 b1) 중 적어도 일방을 충족시키는 집단을 선별함으로써 행해지는 것이 바람직하고, 하기 조건 a1') 및 조건 b1') 중 적어도 일방을 충족시키는 집단을 선별함으로써 행해지는 것이 보다 바람직하며, 하기 조건 a1") 및 조건 b1") 중 적어도 일방을 충족시키는 집단을 선별함으로써 행해지는 것이 더 바람직하다.
a1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈가 0.740mm 이상이다.
b1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 콜로니 형성 단위가 0.250/mm2 이상이다.
a1') 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈가 0.750mm 이상이다.
b1') 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 콜로니 형성 단위가 0.270/mm2 이상이다.
a1") 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈가 0.800mm 이상이다.
b1") 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 집단에 포함되는 간엽계 줄기세포의 콜로니 형성 단위가 0.300/mm2 이상이다.
상기 조건 a1) 및 조건 b1) 중 적어도 일방을 충족시키는 집단은, 이식을 실시하는 날까지 간엽계 줄기세포가 원하는 수에 도달하는 것이 예측되고, 이와 같은 선별을 행하여 제조되는 관절증 치료제는, 관절증 치료에 적합한 것이다.
(그 외)
배양이 종료된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 의약적으로 허용되는 담체를 혼합하고, 현탁액 또는 젤상 물질로 하여, 관절증 치료제에 사용해도 된다.
또, 배양이 종료된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 담체를 혼합하지 않고, 세포 시트 등으로 하여 관절증 치료제에 사용해도 된다.
의약적으로 허용되는 담체로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당, D-소비톨, D-만니톨 및 염화 나트륨 등을 포함하는 등장액(等張液)과 같은 수성 담체를 들 수 있다.
또, 의약적으로 허용되는 담체로서, 젤라틴 및 콜라젠 등의 생체 흡수성의 젤을 사용해도 된다.
관절증 치료제는, 의약적으로 허용되는 첨가제를 포함하고 있어도 되고, 예를 들면, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액 및 아세트산 나트륨 완충액 등), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민 및 폴리에틸렌글라이콜 등), 무통화제(예를 들면, 염화 벤잘코늄 및 염산 프로카인 등), 보존제 및 산화 방지제 등을 들 수 있다.
(관절증 치료제)
본 개시에 관한 관절증 치료제는, 상기한 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제이다.
관절증 치료제에 대해서는 상기했기 때문에, 여기에서는 기재를 생략한다.
이하에, 본 개시에 관한 관절증 치료제의 사용 방법(관절증의 치료 방법)의 일례에 대하여 설명하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
관절증 치료제는, 연골 손상부 또는 반월판 손상부를 간엽계 줄기세포에 의하여 덮도록, 관절증 치료제(간엽계 줄기세포를 포함하는 현탁액, 간엽계 줄기세포의 세포 시트 또는 젤라틴 또는 콜라젠 등의 담체에 의하여 젤상 물질로 한 간엽계 줄기세포 등)를 이식하고, 손상부에 있어서 간엽계 줄기세포를 연골 세포로 분화시켜, in situ로 연골 조직을 재생시킴으로써 관절증의 치료에 사용할 수 있다.
간엽계 줄기세포의 in situ에서의 연골 형성 과정의 사이, 국소 미소 환경(영양 공급 및 사이토카인 환경 등)에 따라, 연골 조직이 재생되기 때문에, 외부로부터의 조작은 필요로 하지 않는다. 간엽계 줄기세포의 in situ 연골 형성의 결과, 연골 조직이 연골 손상부 또는 반월판 손상부에서 재생되어, 손상이 수복된다. 구체적으로는, 연골 손상의 경우에는, 뼈 영역, 연골과 뼈의 경계, 연골 중심부, 표면 영역, 원래의 연골에 인접하는 영역이, 원래의 연골 조직으로서 형성되고, 반월판 손상의 경우에는, 반월판 연골이 형성된다.
간엽계 줄기세포의 이식은, 연골 손상부 또는 반월판 손상부를, 외과적 처치에 의하여 노출시킨 후, 상기 손상부를, 관절증 치료제에 의하여 덮음으로써 행할 수 있다.
간엽계 줄기세포의 이식 방법은, 상기에 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 관절에, 간엽계 줄기세포를 포함하는 현탁액을 주사함으로써 행해도 된다.
외과적 처치로서는, 관혈적 수술 또는 관절 경시하(鏡視下) 수술에 의하여 행할 수 있다. 침습을 가능한 한 작게 할 수 있기 때문에, 관절 경시하 수술이 바람직하다.
손상부로의 간엽계 줄기세포의 접착성의 관점에서, 손상부를, 관절증 치료제에 의하여 덮는 시간은, 10분간 이상인 것이 바람직하고, 15분간 이상인 것이 보다 바람직하다.
손상부로의 간엽계 줄기세포의 접착성을 보다 향상시키기 위하여, 관절증 치료제에 의하여 덮은 개소를, 골막으로 더 덮을 수 있다.
간엽계 줄기세포를 환자에게 이식할 때, 관절증의 치료 효율의 관점에서, 손상부에 이식하는 관절증 치료제에 포함되는 간엽계 줄기세포의 수는, 0.50×107개 이상인 것이 바람직하고, 1.00×107개 이상인 것이 보다 바람직하며, 2.00×107개 이상인 것이 더 바람직하다. 또, 손상부에 이식하는 관절증 치료제에 포함되는 간엽계 줄기세포의 수는, 2.50×107개 이상이어도 되고, 3.00×107개 이상이어도 되며, 4.00×107개 이상이어도 된다.
또, 손상부에 이식하는 관절증 치료제에 포함되는 간엽계 줄기세포의 수의 상한값은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 1.0×1011개 이하여도 되고, 1.0×1010개 이하여도 되며, 1.0×109개 이하여도 되고, 1.0×108개 이하여도 된다
2021년 3월 12일에 출원된 일본 특허출원 2021-040648호의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다. 본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허출원 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허출원 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 또한 개개에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의하여 원용된다.
실시예
이하, 상기 실시형태를 실시예에 의하여 구체적으로 설명하지만, 상기 실시형태는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
반월판 손상 환자의 인간 검체를 이용하여, 활막 조직의 소독을 행한 후에, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제작했다.
구체적으로는, M1 검체(활막 조직 0.85g)의 조직을 가위로 세단하고, 리베라제 수용액 5.0mL에 침지시켜, 효소 반응을 행했다.
또한, 리베라제 수용액은, 콜라게나제 및 중성 프로테아제를 포함하는 효소 혼합물을 포함하는 리베라제 MNP-S(에프·호프만·라·로슈제) 5.0mg을, 최종 농도 20% 인간 자기 혈청을 포함하는 주사용수 5.0mL에 용해한 것을 이용했다.
효소 반응은, 37℃에 있어서 1시간 30분간 행했다.
또, 효소 반응에 있어서, 효소의 사용량에 대한 M1 검체의 사용량의 비는, 질량 기준으로, 170이다.
M1 검체를 효소 반응시킴으로써 얻어진, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 조직 소화액을, 셀 스트레이너를 통과시켜, 50mL 원심관으로 옮기고, 원심력을 400g으로 설정하여, 5분간 원심했다.
상등액을 제외하고, 얻어진 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 현탁액을 배지에 현탁시켜, 플라스크에 전량을 파종했다(1.44×107개, 1880개/cm2).
또한, 배지는 α 개변형 이글 최소 필수 배지(α-MEM)에 최종 농도 10체적% 인간 자기 혈청을 용해시킨 것을 이용했다.
또, 배양은 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 행하고, 2주일 후에 플라스크로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포를 회수했다.
배양 기간 중, 배지 교환을 실시하지 않았다.
배지에 잔존한 리베라제양을 정량한 결과, 59.8ng/mL였다.
회수한 활막 유래 간엽계 줄기세포의 세포수는 0.80×107개이며, 반월판 치료제 또는 변형성 관절증 치료제로의 적용을 검토할 수 있는 레벨이었다. 표 1 중에 있어서, 치료 적용성 평가는 B평가로 했다.
또한, 파종 시의 세포수에 대한 2주일 후에 회수된 세포수의 비(증식 배율)는, 0.6이었다.
또한, 회수한 세포수의 측정은, 육안에 의한 세포 카운트 및 듀얼 형광 광학 셀 카운터 LUNA-FL(등록 상표)(logos biosystems사제)을 이용하여 행했다.
배양 개시일(파종)부터 4일째에, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단의 세포 화상을 취득하고, 세포 화상으로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포의 밀도 정보(추정 밀도 분포)를, 커널 밀도 추정에 의하여 도출했다.
이어서, 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행하여 추정 밀도 분포 내의 동일한 극대점에 수렴한 간엽계 줄기세포의 집합을 콜로니로서 검출했다.
검출한 콜로니로부터, 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위(CFU)를 도출한 결과, 평균 콜로니 사이즈는 0.743mm이며, CFU는 0.256/mm2였다.
또한, 세포 화상의 취득 방법, 추정 밀도 분포의 도출 방법, 콜로니 검출 방법, 및 평균 콜로니 사이즈 및 CFU의 도출은, 상기한 제1 실시형태에 관한 세포 화상 해석 장치를 사용함으로써 행했다.
또, 평균 콜로니 사이즈의 측정은, 콜로니 사이즈 0.54mm 초과의 콜로니에 대하여 실시했다.
이하의 실시예 2에 대해서도 동일한 방법에 의하여, 평균 콜로니 사이즈 등의 측정을 실시했다.
회수된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 특유의 세포 표면 마커의 발현을, 항원 항체 반응에 의하여 행한 결과, CD90 양성이며, CD45 음성이었다.
또, 회수된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 알시안 블루 염색을 행한 결과, 연골 세포로의 분화능이 확인되었다.
이상으로부터, 회수된 세포는, 활막 유래 간엽계 줄기세포인 것이 확인되었다.
<실시예 2>
반월판 손상 환자의 인간 검체를 이용하여, 활막 조직의 소독을 행하지 않고, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제작했다.
구체적으로는, G0 검체(활막 조직 0.80g), G1 검체(활막 조직 0.42g), G2 검체(활막 조직 0.60g), G3 검체(활막 조직 0.66g), G4 검체(활막 조직 0.86g) 및 G5 검체(활막 조직 0.33g)의 각 조직을 가위로 세단하고, 각각, 실시예 1에서도 사용한 리베라제 수용액 5.0mL에 침지시켜, 효소 반응을 행했다.
효소 반응은, 37℃에 있어서 3시간 행했다.
또, 효소 반응에 있어서, 효소의 사용량에 대한 G0 검체, G1 검체, G2 검체, G3 검체, G4 검체 및 G5 검체의 사용량의 비는, 질량 기준으로, 각각, 160, 84, 120, 132, 172, 66으로 했다.
G0 검체, G1 검체, G2 검체, G3 검체, G4 검체 및 G5 검체의 각각을 효소 반응시킴으로써 얻어진, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 조직 소화액을, 셀 스트레이너를 통과시켜, 50mL 원심관으로 옮기고, 원심력을 400g으로 설정하여, 5분간 원심했다.
또한 그 후, 세정 공정으로서, 상등액을 폐기하여 20mL의 α-MEM으로 재현탁하고 원심력을 400g으로 설정하여, 5분간 원심했다. 이 세정 공정은 합계 2회 반복하여 행했다.
상등액을 제외하고, 얻어진 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 현탁액의 각각을 배지에 현탁시켜, 플라스크에 전량을 파종했다(G0 검체가 1.43×107개, 1874개/cm2, G1 검체가 0.53×107개, 690개/cm2, G2 검체가 0.81×107개, 1059개/cm2, G3 검체가 1.52×107개, 1987개/cm2, G4 검체가 0.79×107개, 1028개/cm2, G5 검체가 0.60×107개, 787개/cm2).
또한, 배지는 실시예 1과 동일하게, α-MEM을 사용했다.
또, 배양은 CO2 인큐베이터(37℃, 5% CO2)에서 행하고, 2주일 후에 플라스크로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포를 회수했다.
배양 기간 중, 배지 교환을 실시하지 않았다.
배지에 잔존한 리베라제양을 정량한 결과, G0 검체~G5 검체는 모두 0.1ng/mL 이하(측정 키트의 검출 한계 이하)였다.
회수한 활막 유래 간엽계 줄기세포의 세포수는 G0 검체가 4.9×107개, G1 검체가 4.9×107개, G2 검체가 7.6×107개, G3 검체가 5.8×107개, G4 검체가 7.0×107개, G5 검체가 6.5×107개였다.
회수한 활막 유래 간엽계 줄기세포의 세포수의 합계는, 1.0×107개를 큰 폭으로 상회하고 있으며, 치료에 필요한 세포량을 충분히, 또한 안정적으로 제공할 수 있는 수준이었다.
또한, 증식 배율은, G0 검체가 3.5, G1 검체가 9.5, G2 검체가 9.6, G3 검체가 3.9, G4 검체가 9.1, G5 검체가 11.0이며, 현저한 증식 배율의 향상 효과가 확인되었다. 표 1 중에 있어서, 치료 적용성 평가는 A평가로 했다.
배양 개시일(파종)부터 4일째~6일째에, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단의 세포 화상을 취득하고, 세포 화상으로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포의 밀도 정보(추정 밀도 분포)를, 커널 밀도 추정에 의하여 도출했다.
이어서, 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행하여 추정 밀도 분포 내의 동일한 극대점에 수렴한 간엽계 줄기세포의 집합을 콜로니로서 검출했다.
검출한 콜로니로부터, 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위(CFU)를 도출한 결과, 이하와 같이 되었다.
·G0 검체: 배양 개시일로부터 6일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 1.150mm, CFU 0.947/mm2
·G1 검체: 배양 개시일로부터 5일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 0.830mm, CFU 0.344/mm2
·G2 검체: 배양 개시일로부터 4일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 0.782mm, CFU 0.368/mm2
·G3 검체: 배양 개시일로부터 4일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 0.816mm, CFU 0.311/mm2
·G4 검체: 배양 개시일로부터 6일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 1.030mm, CFU 0.575/mm2
·G5 검체: 배양 개시일로부터 4일 후에 콜로니 검출, 평균 콜로니 사이즈 0.777mm, CFU 0.340/mm2
회수된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 특유의 세포 표면 마커의 발현을, 항원 항체 반응에 의하여 행한 결과, CD90 양성이며, CD45 음성이었다.
또, 회수된 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여, 알시안 블루 염색을 행한 결과, 연골 세포로의 분화능이 확인되었다.
이상으로부터, 회수된 세포는, 활막 유래 간엽계 줄기세포인 것이 확인되었다.
[표 1]
표 1에 기재한 결과로부터, 본 개시의 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는 관절증 치료제는, 배양의 도중에 있어서 간엽계 줄기세포의 증식 예측을 우수한 정밀도로 행할 수 있고, 관절증 치료에 적합한 관절증 치료제를 제조 가능한 것을 알 수 있다.
또, 회수 세포수 및 증식 배율에는, 배양 중의 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈 및 CFU가 기여하는 것을 알 수 있다.
<<반월판 치료제로서의 적용>>
실시예 2에 있어서 G0 검체~G5 검체로부터 제조된 활막 유래 간엽계 줄기세포를, 자가 세포 치료로서 반월판 손상 환자의 반월판 손상 개소에 이식했다.
활막 유래 간엽계 줄기세포가 이식된 반월판 손상 환자에 있어서, 이식 52주 후까지 양호한 증상 완화가 확인되었다.
증상의 스코어로서 알려진 리스홀름 스코어(하기 표 2를 참조, 평가 담당자가 실시)에 있어서, 치료 전과 비교하여 이식 52주 후에는, 22점 이상의 개선이 확인되고, MRI(자기 공명 화상 진단)에서의 반월판 확인에 있어서도, 접골되어 있는 것이 확인되며, 양호한 치료 성적을 나타내는 것을 알 수 있었다.
[표 2]
Claims (11)
- 배양하고 있는 복수의 간엽계 줄기세포를 포함하는 집단을 촬영함으로써, 세포 화상을 취득하고,
상기 세포 화상을 해석함으로써, 상기 세포 화상 내의 상기 간엽계 줄기세포의 밀도 정보를 도출하며,
상기 밀도 정보에 근거하여, 상기 집단에 있어서 상기 간엽계 줄기세포가 형성하는 콜로니를 검출하고,
검출되는 콜로니로부터 도출되는 평균 콜로니 사이즈 및 콜로니 형성 단위 중 적어도 일방에 근거하여, 상기 집단의 선별을 행하는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 밀도 정보가, 커널 밀도 추정에 의하여 도출되는, 상기 세포 화상에 있어서의 상기 간엽계 줄기세포의 추정 밀도 분포인, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 콜로니의 검출이, 상기 추정 밀도 분포를 참조한 mean-shift를 행하고, 상기 추정 밀도 분포 내의 동일한 극대점에 수렴하는 상기 간엽계 줄기세포의 집합을 콜로니로서 검출함으로써 행해지는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
상기 콜로니의 검출이, 배양 개시일로부터 4일째~6일째에 있어서 행해지고,
상기 집단의 선별이, 하기 조건 a1) 및 조건 b1) 중 적어도 일방을 충족시키는 집단을 선별함으로써 행해지는, 관절증 치료제의 제조 방법.
a1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 상기 집단에 포함되는 상기 간엽계 줄기세포의 평균 콜로니 사이즈가 0.740mm 이상이다.
b1) 배양 개시일로부터 4일째~6일째 중 어느 하나의 시점에 있어서의 상기 집단에 포함되는 상기 간엽계 줄기세포의 콜로니 형성 단위가 0.250/mm2 이상이다. - 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가, 생체 조직을 효소에 의하여 처리함으로써 얻어지는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 생체 조직의 효소에 의한 처리에 있어서, 콜라게나제 및 중성 프로테아제를 적어도 1종씩 포함하는, 효소 혼합물이 사용되는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 5 또는 청구항 6에 있어서,
상기 생체 조직의 효소에 의한 처리에 있어서, 상기 효소의 사용량에 대한 상기 생체 조직의 사용량의 비가, 질량 기준으로, 10~1000인, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 5 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가, 상기 생체 조직의 효소에 의한 처리에 의하여 얻어지는 조직 소화액을, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 세정함으로써 얻어지는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가, 활막 유래의 세포인, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간엽계 줄기세포가, 인간 유래의 세포인, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법에 의하여 제조되는, 관절증 치료제.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021040648 | 2021-03-12 | ||
| JPJP-P-2021-040648 | 2021-03-12 | ||
| PCT/JP2021/047431 WO2022190566A1 (ja) | 2021-03-12 | 2021-12-21 | 関節症治療剤の製造方法及び関節症治療剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230145129A true KR20230145129A (ko) | 2023-10-17 |
Family
ID=83226260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020237030724A KR20230145129A (ko) | 2021-03-12 | 2021-12-21 | 관절증 치료제의 제조 방법 및 관절증 치료제 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230414669A1 (ko) |
| EP (1) | EP4292599A1 (ko) |
| JP (1) | JPWO2022190566A1 (ko) |
| KR (1) | KR20230145129A (ko) |
| CN (1) | CN117355314A (ko) |
| AU (1) | AU2021432587A1 (ko) |
| WO (1) | WO2022190566A1 (ko) |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008023829A1 (en) * | 2006-08-22 | 2008-02-28 | National University Corporation Tokyo Medical And Dental University | Application of synovium-derived mesenchymal stem cells (mscs) for cartilage or meniscus regeneration |
| RU2466680C1 (ru) * | 2011-10-03 | 2012-11-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Витацел" | Способ диагностики состояния кожи пациента (варианты) |
| WO2014201021A2 (en) | 2013-06-10 | 2014-12-18 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Methods and compositions for reducing immunosupression by tumor cells |
| JP2016158577A (ja) * | 2015-03-03 | 2016-09-05 | 富士フイルム株式会社 | 細胞コロニー検出装置および方法並びにプログラム |
| JP2019004794A (ja) | 2017-06-26 | 2019-01-17 | 大日本印刷株式会社 | 増殖予測方法、増殖予測装置およびプログラム |
| JPWO2021240986A1 (ko) * | 2020-05-29 | 2021-12-02 | ||
| JP6864302B1 (ja) * | 2020-07-03 | 2021-04-28 | 富士フイルム株式会社 | 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 |
| JP6864303B1 (ja) * | 2020-07-03 | 2021-04-28 | 富士フイルム株式会社 | 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 |
-
2021
- 2021-12-21 JP JP2023505120A patent/JPWO2022190566A1/ja active Pending
- 2021-12-21 AU AU2021432587A patent/AU2021432587A1/en active Pending
- 2021-12-21 CN CN202180095529.4A patent/CN117355314A/zh active Pending
- 2021-12-21 KR KR1020237030724A patent/KR20230145129A/ko unknown
- 2021-12-21 EP EP21930411.0A patent/EP4292599A1/en active Pending
- 2021-12-21 WO PCT/JP2021/047431 patent/WO2022190566A1/ja active Application Filing
-
2023
- 2023-09-08 US US18/463,631 patent/US20230414669A1/en active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4292599A1 (en) | 2023-12-20 |
| US20230414669A1 (en) | 2023-12-28 |
| AU2021432587A1 (en) | 2023-09-28 |
| WO2022190566A1 (ja) | 2022-09-15 |
| JPWO2022190566A1 (ko) | 2022-09-15 |
| CN117355314A (zh) | 2024-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Daltro et al. | Efficacy of autologous stem cell-based therapy for osteonecrosis of the femoral head in sickle cell disease: a five-year follow-up study | |
| Jones et al. | Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: detection and functional evaluation at the single‐cell level | |
| Kim et al. | Clinical trial of autologous differentiated adipocytes from stem cells derived from human adipose tissue | |
| JP6687757B2 (ja) | ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 | |
| Hermida-Gómez et al. | Bone marrow cells immunomagnetically selected for CD271+ antigen promote in vitro the repair of articular cartilage defects | |
| US20040077079A1 (en) | Improved in vitro method of culturing mammalian cells for autologous cell implantation/transplantation methods | |
| CN108685948B (zh) | 一种医用细胞修复剂的制备方法 | |
| CN109943520A (zh) | 汗腺细胞的分离和培养获得汗腺类器官的方法及其应用 | |
| CN108486050B (zh) | 从犬的脐带制备间充质干细胞的方法 | |
| CN109234229A (zh) | 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物 | |
| CN101922048A (zh) | 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法 | |
| Frazier et al. | Serially transplanted nonpericytic CD146− adipose stromal/stem cells in silk bioscaffolds regenerate adipose tissue in vivo | |
| JP6958846B1 (ja) | 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 | |
| García-Álvarez et al. | Chondrogenic differentiation in femoral bone marrow-derived mesenchymal cells (MSC) from elderly patients suffering osteoarthritis or femoral fracture | |
| Choi et al. | A prospective observational study of the yield of olfactory ensheathing cells cultured from biopsies of septal nasal mucosa | |
| Ichinose et al. | Morphological differences during in vitro chondrogenesis of bone marrow-, synovium-MSCs, and chondrocytes | |
| Tevlin et al. | A novel method of human adipose-derived stem cell isolation with resultant increased cell yield | |
| CN109628388A (zh) | 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞 | |
| CN107287158B (zh) | 从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法 | |
| KR20230145129A (ko) | 관절증 치료제의 제조 방법 및 관절증 치료제 | |
| CN114729313A (zh) | 培养间充质干细胞的方法 | |
| CN104630140A (zh) | 一种胎盘间充质前体干细胞的分离培养方法 | |
| Vallim et al. | Atrophic nonunion stromal cells form bone and recreate the bone marrow environment in vivo | |
| Eleotério et al. | Isolation, expansion and differentiation of mesenchymal stromal cells from rabbits' bone marrow | |
| CN114480261A (zh) | 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 |