JP6864303B1 - 滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法および関節治療用細胞製剤の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
<1> 滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
滑膜組織の消毒工程を経ずに、滑膜組織を、1種以上のコラゲナーゼと1種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素で2時間以上処理すること、
を含む、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法。
<2> 混合酵素が、リベラーゼである、<1>に記載の方法。
<3> 酵素処理における酵素濃度が、0.01mg/ml〜10mg/mlである、<1>又は<2>に記載の方法。
<4> 滑膜組織がヒト由来である、<1>から<3>の何れか一に記載の方法。
<5> 滑膜組織が、単一ドナー由来の滑膜組織である、<1>から<4>の何れか一に記載の方法。
<6> 滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である、<1>から<5>の何れか一に記載の方法。
<7> 滑膜組織と酵素の質量比率が、1000:1〜10:1である、<1>から<6>の何れか一に記載の方法。
<8> 酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を10日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させることを含む、<1>から<7>の何れか一に記載の方法。
<9> 上記10日間以上の培養を、培地交換なしで行う、<8>に記載の方法。
<10> 上記10日間以上の培養を、自己の血清を含む培地中で行う、<8>または<9>に記載の方法。
<11> 酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を、100細胞/cm2以上5000細胞/cm2以下の細胞数で播種して、10日間以上培養する、<8>から<10>の何れか一に記載の方法。
<12> 上記10日間以上の培養における増殖倍率が、3倍以上50倍以下である、<8>から<11>の何れか一に記載の方法。
<13> 滑膜由来間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、滑膜由来間葉系幹細胞が製造される、<1>から<12>の何れか一に記載の方法。
<14> <1>から<13>の何れか一に記載の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
上記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。
<15> 関節治療が、半月板損傷の治療である、<14>に記載の関節治療用細胞製剤の製造方法。
<16> <1>から<13>の何れか一に記載の方法により製造された、滑膜由来間葉系幹細胞。
<17> <14>または<15>に記載の方法により製造された、関節治療用細胞製剤。
滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でin situで軟骨組織を再生させる工程;
を含む、関節の治療方法。
[滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法]
本発明による滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法は、
滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
滑膜組織の消毒工程を経ずに、滑膜組織を、1種以上のコラゲナーゼと1種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素で2時間以上処理すること、
を含む。
滑膜組織は、麻酔下で関節の非荷重部分から採取することができる。
滑膜組織の生物由来は特に限定されず、任意の生物、好ましくは哺乳動物に由来する滑膜組織を使用することができる。例えば、霊長類(例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト)由来の滑膜組織を使用することができ、特に好ましくは、ヒト由来の滑膜組織を使用することができる。
本発明においては、滑膜組織を酵素で2時間以上処理する。
酵素としては、1種以上のコラゲナーゼと1種以上の中性プロテアーゼを含む混合酵素を使用する。特に好ましい酵素は、リベラーゼである。リベラーゼとしては、例えば、リベラーゼMNP−S(ロシュ製)を使用することができるが、これはコラゲナーゼクラスIとコラゲナーゼクラスIIと中性プロテアーゼ(サーモシリン)とを含む酵素である。
酵素処理における酵素濃度は、好ましくは0.01mg/ml〜10mg/mlであり、より好ましくは0.1mg/ml〜10mg/mlであり、さらに好ましくは0.5mg/ml〜10mg/mlであり、さらに一層好ましくは0.5mg/ml〜5.0mg/mlであり、特に好ましくは0.5mg/ml〜2.0mg/mlであり、最も好ましくは0.7mg/ml〜2.0mg/mlである。
滑膜組織と酵素の質量比率は、好ましくは1000:1〜10:1であり、より好ましくは500:1〜20:1であり、さらに好ましくは200:1〜40:1である。
反応時間は、2時間以上であればよく、より好ましくは、2.5時間以上、さらに好ましくは3時間以上である。反応時間の上限は特に限定されないが、10時間以内、9時間以内、8時間以内、7時間以内、6時間以内、5時間以内、または、4時間以内でもよい。
酵素処理された混合物には、滑膜由来間葉系幹細胞が含まれている。
酵素処理された混合物は、セルストレーナーを通して遠沈管に移し、遠心処理することにより滑膜由来間葉系幹細胞を回収することができる。
本発明においては、酵素処理後の混合物を、洗浄してもよい。
洗浄は、上記した遠心処理により回収した滑膜由来間葉系幹細胞を培地に再懸濁し、再度遠心(400gで5分間など)することにより行うことができる。培地としては、α改変イーグル最小必須培地(αMEM)を用いることができるが、特に限定されない。洗浄の回数は1回でもよいし、複数回でもよい。
本発明においては、滑膜由来間葉系幹細胞を10日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させてもよい。
上記した10日間以上の培養における増殖倍率は、3倍以上50倍以下であることが好ましく、4倍以上30倍以下であることがより好ましく、5倍以上20倍以下であることがさらに好ましく、7倍以上15倍以上であることが特に好ましい。
間葉系幹細胞とは、中胚葉性組織(間葉)に由来する体性幹細胞である。間葉系幹細胞は骨髄、滑膜、骨膜、脂肪組織、筋肉組織に存在することが知られており、そして骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、および筋細胞に分化する能力を有することが知られている。間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化に関連して、BMPあるいはTGF−βを培養液に添加することにより、未分化間葉系幹細胞の軟骨細胞への分化が促進され、そして軟骨組織がin vitro条件下で再生できることが知られている。
本発明の方法で製造される滑膜由来間葉系幹細胞は、関節治療用細胞製剤として使用することができる。さらに、本発明の方法で製造される滑膜由来間葉系幹細胞は、例えば、間葉系幹細胞の分化に関する研究や種々の疾患に関する医薬スクリーニング、医薬候補化合物の効能・安全性評価等に使用することもできる。
本発明は、上記した本発明の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
上記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法に関する。本発明によれば、上記した関節治療用細胞製剤の製造方法方法により製造された、関節治療用細胞製剤が提供される。
即ち、本発明によれば、本発明の方法で得られる滑膜由来間葉系幹細胞を有効成分として含有する関節治療用細胞製剤を製造することができる。
本発明はさらに、関節の治療方法に関する。より具体的には、本発明は、半月板損傷、外傷性軟骨損傷、離断性骨軟骨炎、無腐性骨壊死変形性関節症(例えば、変形性膝関節症)、関節リウマチ(例えば、慢性関節リウマチ)、痛風、反応性関節炎、乾癖性関節炎、若年性関節炎、炎症性関節炎、関節軟骨欠損からなる群より選択される疾患の治療方法に関する。
軟骨損傷部または半月板損傷部を滑膜由来間葉系幹細胞により覆うように、本発明の方法により製造した滑膜由来間葉系幹細胞を移植する工程;および
滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨細胞に分化させることによって、軟骨損傷部または半月板損傷部でin situで軟骨組織を再生させる工程;
を含む。
軟骨損傷部を上方に向けるように体位を保持すること;
滑膜由来間葉系幹細胞の細胞シート、滑膜由来間葉系幹細胞の懸濁液、または滑膜由来間葉系幹細胞を含むゲル状物質を軟骨損傷部の表面に静置すること;そして
特定の時間体位を保持して、それにより滑膜由来間葉系幹細胞を軟骨損傷部の表面に接着させること;
を含む。
半月板損傷部が下向きになるように体位を保持すること;
滑膜由来間葉系幹細胞の懸濁液を膝関節内に注射すること;そして
特定の時間体位を保持して、滑膜由来間葉系幹細胞を半月板損傷部に接着させること;
を含む。
ヒト検体を用いて、通常の製造法により滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、M1検体(滑膜組織0.62g)に対して、組織消毒工程として0.1%イソジン溶液で1分間消毒を実施した。その後、上記の組織をハサミで細断し、リベラーゼ水溶液5.0mLに浸漬させた。尚、リベラーゼ水溶液はリベラーゼMNP−S(ロシュ製)5.0mgを、最終濃度20%ヒト自己血清を含む注射用水5.0mLに溶解したものを用いた。酵素反応は室温25℃で1時間1分反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、50mL遠沈管に移して400gで5分間遠心した。上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した(1000個/cm2)。尚、培地はαMEMに最終濃度10%ヒト自己血清を溶解させた物を用いた。培養はCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて行い、2週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。尚、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。こうして、最終的に得られた細胞収量はM1で1.5×107cellsであった。また、播種時の細胞数に対する、2週間培養後の細胞数の比率として計算される、増殖倍率は2.0倍であった。結果のまとめを表1に記載した。
ヒト検体を用いて、通常の製造法よりも酵素処理時間を30分延長した条件で、滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、M2検体(滑膜組織0.85g)に対して、組織消毒工程として0.1%イソジン溶液で1分間消毒を実施した。その後、上記の組織をハサミで細断し、リベラーゼ水溶液5.0mLに浸漬させた。尚、リベラーゼ水溶液はリベラーゼMNP−S(ロシュ製)5.0mgを、最終濃度20%ヒト自己血清を含む注射用水5.0mLに溶解したものを用いた。酵素反応は室温25℃で1.5時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、50mL遠沈管に移して400gで5分間遠心した。上清を除き、得られた細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した(1880個/cm2)。尚、培地はαMEMに最終濃度10%ヒト自己血清を溶解させたものを用いた。培養はCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて行い、2週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。尚、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。こうして、最終的に得られた細胞収量はM2として0.8×107cellsとなった。これは治療に必要と考えられる1.0×107cellsを下回っており、治療に必要な細胞量を提供出来ない水準になった。また、播種時の細胞数に対する、2週間培養後の細胞数の比率として計算される、増殖倍率は0.6倍であった。結果のまとめを表1に記載した。
ヒト検体を用いて、通常の製造法と異なり、組織消毒工程をなくし、かつ酵素処理時間を2時間延長した条件で、滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を作製した。具体的には、N1検体(滑膜組織0.42g)、N2検体(滑膜組織0.60g)、N3検体(滑膜組織0.86g)、N4検体(滑膜組織0.33g)について、組織消毒工程を経ずに、当上記の組織をハサミで細断し、リベラーゼ水溶液5.0mLに浸漬させた。尚、リベラーゼ水溶液はリベラーゼMNP−S(ロシュ製)5.0mgを、最終濃度20%ヒト自己血清を含む注射用水5.0mLに溶解したものを用いた。酵素反応は室温25℃で3時間反応させた。その後、組織消化液をセルストレーナーを通して、50mL遠沈管に移して400gで5分間遠心した。上清を除き、回収された細胞濃厚懸濁液を培地に懸濁しフラスコへ全量を播種した(N1が690個/cm2、N2が1059個/cm2、N3が1028個/cm2、N4が787個/cm2)。尚、培地はαMEMに最終濃度10%ヒト自己血清を溶解させたものを用いた。培養はCO2インキュベーター(37℃、5%CO2)にて行い、2週間後にフラスコから細胞を回収し、滑膜由来間葉系幹細胞を製造した。尚、培養期間中、培地交換を実施しない点は本細胞製造の特徴でもある。こうして、最終的に得られた細胞収量はN1が4.9×107cells、N2が7.6×107cells、N3が7.0×107cells、N4が6.5×107cellsとなった。これは治療に必要と考えられる1.0×107cellsを大幅に上回っており、治療に必要な細胞量を十分に、かつ安定に提供出来る水準であった。また、播種時の細胞数に対する、2週間培養後の細胞数の比率として計算される、増殖倍率はそれぞれ9.5倍、9.6倍、9.1倍、11.0倍であり、顕著な増殖倍率の向上効果が認められた。結果のまとめを表1に記載した。
比較例1および2、並びに実施例1で作製した滑膜由来間葉系幹細胞について、間葉系幹細胞マーカーの発現について確認試験を実施した。その結果、いずれの細胞においても、CD90陽性、CD45陰性、軟骨分化能が示されたことから滑膜由来間葉系幹細胞であることが確認できた。
表1に記した結果から、細胞収量に対して滑膜組織の重量が支配的なパラメータではなく、増殖倍率には酵素処理時間の延長と消毒工程の削除という2つが必須であることが明らかとなった。また、、酵素処理時間を延長することは、滑膜組織に対して損傷を与えることから忌避するべきものと考えられていた通り、実際に、M1に対して酵素処理時間を30分延長したM2では細胞収量が著しく減じ、増殖倍率も低下してしまうことが分かった。一方で、組織消毒工程を経ないことは、組織中の製造工程由来不純物、特に細菌や微生物等が酵素処理時間および培養期間において増加する可能性を高めることから、忌避すべきことだと考えていた。しかし、あえて組織消毒工程をなくすことと酵素処理時間を大幅に延長することにより、予想外に増殖倍率という部分に良い影響を及ぼすということが明らかとなった。加えて、上記の増殖倍率を達成することにより、結果として本発明による製造により得られる細胞収量は、治療に必要と考えられる1.0×107cellsを大幅に上回り、これが他家細胞であっても効果を示し得る細胞量(2.0×107cells)をも大幅に上回ることになった。本増殖倍率を達成する組合せは、自家細胞治療を想定とした滑膜由来間葉系幹細胞製造の方法において顕著な価値を有すると考えられた。
N1〜N4として製造された滑膜由来間葉系幹細胞は、実際に半月板損傷患者自身の検体から製造され、製造後に自家細胞治療として半月板損傷患者に投与された。その結果、N1〜N4として製造された滑膜由来間葉系幹細胞が投与された全ての半月板損傷患者において、投与52週後までに良好な症状緩和が認められた。症状のスコアとして知られるリスホルムスコア(下記表2を参照)において、治療前と比較し投与52週後では、22点以上の改善が確認され、MRI(磁気共鳴画像診断)での半月板確認においても、整復されていることが認められ、良好な治療成績を示すことが分かった。
Claims (16)
- 滑膜組織から滑膜由来間葉系幹細胞を製造する方法であって、
滑膜組織の消毒工程を経ずに、滑膜組織を、コラゲナーゼクラスIとコラゲナーゼクラスIIと中性プロテアーゼとを含む混合酵素で20〜35℃の温度で2時間以上処理すること、および
酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を、100細胞/cm2以上5000細胞/cm2以下の細胞数で播種し培養すること、
を含む、滑膜由来間葉系幹細胞の製造方法。 - 前記処理が、ヒト血清を含む水溶液中で行われる、請求項1に記載の方法。
- 混合酵素が、リベラーゼ(登録商標)である、請求項1又は2に記載の方法。
- 酵素処理における酵素濃度が、0.01mg/ml〜10mg/mlである、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- 滑膜組織がヒト由来である、請求項1から4の何れか一項に記載の方法。
- 滑膜組織が、単一ドナー由来の滑膜組織である、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 滑膜が採取される対象と、滑膜由来間葉系幹細胞が移植される対象とが、同一対象である、請求項1から6の何れか一項に記載の方法。
- 滑膜組織と酵素の質量比率が、1000:1〜10:1である、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- 酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を10日間以上培養することにより、滑膜由来間葉系幹細胞を増殖させることを含む、請求項1から8の何れか一項に記載の方法。
- 前記10日間以上の培養を、培地交換なしで行う、請求項9に記載の方法。
- 前記10日間以上の培養を、自己の血清を含む培地中で行う、請求項9または10に記載の方法。
- 酵素処理後の滑膜由来間葉系幹細胞を、100細胞/cm2以上5000細胞/cm2以下の細胞数で播種して、10日間以上培養する、請求項9から11の何れか一項に記載の方法。
- 前記10日間以上の培養における増殖倍率が、3倍以上50倍以下である、請求項9から12の何れか一項に記載の方法。
- 滑膜由来間葉系幹細胞以外の他の細胞と共培養されることなく、滑膜由来間葉系幹細胞が製造される、請求項1から13の何れか一項に記載の方法。
- 請求項1から14の何れか一項に記載の方法により滑膜由来間葉系幹細胞を製造すること、および
前記滑膜由来間葉系幹細胞を用いて関節治療用細胞製剤を製造すること、
を含む、関節治療用細胞製剤の製造方法。 - 関節治療が、半月板損傷の治療である、請求項15に記載の関節治療用細胞製剤の製造方法。
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