CN116322718A - 关节治疗用细胞制剂的制造方法、关节治疗用细胞制剂及间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

关节治疗用细胞制剂的制造方法、关节治疗用细胞制剂及间充质干细胞的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种关节治疗用细胞制剂的制造方法及间充质干细胞的培养方法、以及通过上述方法制造的关节治疗用细胞制剂，所述关节治疗用细胞制剂能够提高细胞的增殖倍率，能够减少必要的血清量，且能够抑制培养过程中的核型异常。根据本发明，提供一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，该方法包括以下步骤：在包含抗坏血酸‑2‑磷酸酯三钠、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养间充质干细胞。

Description

关节治疗用细胞制剂的制造方法、关节治疗用细胞制剂及间 充质干细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及关节治疗用细胞制剂的制造方法以及间充质干细胞的培养方法，所述关节治疗用细胞制剂的制造方法包括以下步骤：如下步骤：在包含规定成分的培养基中培养间充质干细胞。本发明还涉及通过上述方法制造的关节治疗用细胞制剂。
背景技术
在整形外科领域中，关节软骨损伤或半月板损伤作为日常诊疗行为的对象频繁可见，被广泛认为是多数患者所具有的疾病。当发生关节软骨损伤或半月板损伤的情况下，会引起关节痛、运动范围的减少、关节水肿及运动障碍等。患有外伤引起的关节软骨损伤或半月板损伤的患者通常接受整形外科医生的治疗。对软骨损伤或半月板损伤的外科治疗目的在于去除成为关节进一步恶化的要因的碎片以使患部关节的功能恢复。然而，已知软骨及半月板组织很难自我再生。
另一方面，近年来随着再生医疗技术的进歩，能够修复软骨或半月板的细胞治疗兴盛起来。其中，间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)可期待成为有用的细胞治疗的细胞源。间充质干细胞能够从各种身体组织中采集，有报告称，能够从骨髓组织、脂肪组织、肌肉组织、滑膜组织、骨膜组织等中分离(非专利文献1)。尤其，报告有与源自骨髄等各间叶组织的间充质干细胞相比，滑膜来源间充质干细胞具有高的增殖能力及软骨形成能力(非专利文献2)。并且，在专利文献1及专利文献2中公开有使用滑膜来源间充质干细胞治疗关节软骨损伤或半月板损伤的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Na Li,et al.,2020,Stem Cell Research&Therapy.11:381
非专利文献2：Sakaguchi,et al.,2005,Arthritis Rheum.52:2521-9
专利文献
专利文献1：日本特许专利第5928961号公报
专利文献2：日本特许专利第5656183号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
已表明，在包括间充质干细胞在内的干细胞中，有时在细胞培养过程中发生核型异常。在用于关节治疗的细胞移植中，为了确保安全性，需要降低核型异常。并在确保安全性的基础上，为了达成治疗效果，需要确保足够的细胞数量。进一步地，在自体治疗中使用自体血清的情况下，由于能够采集的血清量有限，因此还需要减少血清量。
本发明要解决的课题在于提供一种关节治疗用细胞制剂的制造方法及间充质干细胞的培养方法、以及通过上述方法制造的关节治疗用细胞制剂，所述关节治疗用细胞制剂能够提高细胞的增殖倍率，能够减少必要的血清量，且能够抑制培养过程中的核型异常。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行深入研究的结果，发现通过在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺(Alanyl Glutamine)及吡哆醇(Pyridoxine)的培养基中培养间充质干细胞，能够解决上述问题。本发明根据上述见解而完成。
即，根据本发明可提供以下发明。
＜1＞一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，包括以下步骤：在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养间充质干细胞。
＜2＞根据＜1＞所述的方法，其中，上述间充质干细胞为滑膜来源间充质干细胞。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，上述间充质干细胞源自自体。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基包含同种血清。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基不包含抗坏血酸。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基包含生物素或硫辛酸中的任一种以上。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的方法，其中，使用5层以上的多层烧瓶培养间充质干细胞。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的方法，该方法还包括以下步骤：将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；及采集上述两层中的下层，
在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养包含于上述下层的间充质干细胞。
＜9＞一种关节治疗用细胞制剂，其通过＜1＞至＜8＞中任一项所述的方法制造。
＜10＞根据＜9＞所述的关节治疗用细胞制剂，其不包含细胞外基质或支架。
＜11＞根据＜9＞或＜10＞所述的关节治疗用细胞制剂，其为半月板治疗剂或变形性关节病治疗剂。
＜12＞根据＜9＞至＜11＞中任一项所述的关节治疗用细胞制剂，其中，间充质干细胞为人间充质干细胞，间充质干细胞的染色体数为46条，染色体的核型分析(karyotyping)为一对1号到22号的染色体和XX染色体或XY染色体。
＜13＞一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；
采集上述两层中的下层；及
在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养包含于上述下层的间充质干细胞。
＜14＞根据＜13＞所述的方法，其中，上述间充质干细胞为滑膜来源间充质干细胞。
＜15＞根据＜13＞或＜14＞所述的方法，其中，上述间充质干细胞源自自体。
＜16＞根据＜13＞至＜15＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基包含同种血清。
＜17＞根据＜13＞至＜16＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基不包含抗坏血酸。
＜18＞根据权利要求＜13＞至＜17＞中任一项所述的方法，其中，上述培养基包含生物素或硫辛酸中的任一种以上。
＜19＞根据＜13＞至＜18＞中任一项所述的方法，其中，使用5层以上的多层烧瓶培养间充质干细胞。
＜20＞一种关节治疗用细胞制剂，其包含通过＜13＞至＜19＞中任一项所述的方法培养的间充质干细胞。
＜21＞根据＜20＞所述的关节治疗用细胞制剂，其不包含细胞外基质或支架。
＜22＞根据＜20＞或＜21＞所述的关节治疗用细胞制剂，其为半月板治疗剂或变形性关节病治疗剂。
＜23＞根据＜20＞至＜22＞中任一项所述的关节治疗用细胞制剂，其中，间充质干细胞为人间充质干细胞，间充质干细胞的染色体数为46条，染色体的核型分析为一对1号到22号的染色体和XX染色体或XY染色体。
＜A＞一种关节的治疗方法，包括以下步骤：
以用间充质干细胞覆盖软骨损伤部或半月板损伤部的方式，移植通过本发明的方法制造的关节治疗用细胞制剂或通过本发明的方法培养的间充质干细胞；及
通过使间充质干细胞分化为软骨细胞，从而在软骨损伤部或半月板损伤部的insitu上使软骨组织再生。
发明效果
根据本发明，从组织制造足够量的细胞时，能够提高细胞的增殖倍率，能够减少必要的血清量，进而能够在培养过程中抑制核型异常。
附图说明
图1表示在使用类型培养基或培养基A的情况下的间充质干细胞的增殖曲线。
图2表示在使用类型培养基或培养基A的情况下的间充质干细胞核型分析。
图3表示在使用在类型培养基中添加了bFGF的培养基或培养基A的情况下的间充质干细胞核型分析。
图4表示从施用了大鼠滑膜来源间充质干细胞(rSMSC)或PBS的大鼠中切除的双膝关节内侧半月板。
具体实施方式
以下对本发明的内容进行详细说明。另外，在本说明书中，“～”以将记载于其前后的数值作为下限值及上限值而包括的含义使用。
＜1＞关节治疗用细胞制剂的制造方法
本发明涉及一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，该方法包括以下步骤：在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养间充质干细胞。通过在包含上述特定成分的培养基中培养间充质干细胞，在核型异常的发生得到抑制的情况下也能够得到高的细胞增殖，也就是能够兼顾抑制核型异常的发生和高的细胞增殖，这并不是能够从以往见解中预想到的，而是完全意料之外的结果。
基于本发明的关节治疗用细胞制剂的制造方法也可以包括以下步骤：在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养间充质干细胞；及使用上述中培养的间充质干细胞来制造关节治疗用细胞制剂。
＜间充质干细胞＞
所谓的间充质干细胞，广义上表示能够分化成成骨细胞、软骨母细胞、脂肪母细胞、肌细胞等间充质细胞全部或其中的一部分细胞的干细胞或其前体细胞的群体。已知间充质干细胞存在于骨髓、滑膜、骨膜、脂肪组织、肌肉组织。关于间充质干细胞分化成软骨细胞，已知将BMP(bone morphogenetic protein：骨形成蛋白)或者TGF-β(Transforminggrowth factor-β：转化生长因子-β)添加到培养液中会促进未分化间充质干细胞分化成软骨细胞，并且软骨组织能够在in Vitro条件下再生。
间充质干细胞能够通过检测间充质干细胞中的特征分子，例如酶、受体、低分子化合物等来确认。作为间充质干细胞中的特征分子，可举出作为细胞表面标志物(阳性标志物)的CD73、CD90、CD105、CD166等，但是并不限定于这些。并且，作为间充质干细胞中未表达的阴性标志物，可举出CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b、CD14等，但是并不限定于这些。另外，CD为Clusters of differentiation(分化簇)的缩写，HLA-DR为human leukocyteantigen-D-related(人类白细胞抗原DR)的缩写。利用这些阳性标志物及阴性标志物，能够确认其为间充质干细胞。这些标志物的检测中能够利用免疫学方法，但是也可以根据各分子的mRNA量的定量来实施检测。
间充质干细胞来源的动物种类无特别限定，例如，也可以是大鼠、小鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类动物，兔子等兔科动物，猪、牛、山羊、绵羊等有蹄类动物，狗、猫等猫科动物，人、猴、恒河猴、狨猴、红毛猩猩、黑猩猩等灵长类等。
间充质干细胞优选为人间充质干细胞。
间充质干细胞的来源并无特别限定，但优选为来源于滑膜、骨髓、脂肪、牙髓、胎儿来源或来源于人造多能干细胞。间充质干细胞更优选为滑膜来源间充质干细胞或骨髓来源间充质干细胞，进一步优选为滑膜来源间充质干细胞。
间充质干细胞可以来源于自体也可以来源于异体，但优选来源于自体。
间充质干细胞可以是基因修饰的细胞也可以是基因没有修饰的细胞，但优选为基因没有修饰的细胞。
间充质干细胞能够通过常规方法从上述的组织中采集。优选为间充质干细胞通过下述步骤来采集：将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；及采集上述两层中的下层。例如，可以通过离心法将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层。
作为一例，对从滑膜组织采集滑膜来源间充质干细胞的方法进行说明。
滑膜组织能够在麻醉下从关节的非负重部分采集。滑膜组织的采集量能够考虑供体的种类或所需滑膜来源间充质干细胞的量来确定。例如能够由0.1g～10g、优选为0.1g～2.0g、更优选为0.1g～1.5g、进一步优选为0.1g～1.0g的滑膜组织获得滑膜来源间充质干细胞。所采集的滑膜组织根据需要用剪刀等切碎之后供进行酶处理。作为酶，只要为含有蛋白酶的酶，则并无特别限定，但是优选为含有1种以上胶原蛋白酶及1种以上中性蛋白酶的混合酶。特别优选的酶是释放酶(liberase)。作为释放酶，例如能够使用释放酶MNP-S(Roche Diagnostics K.K.制造)，其是一种含有胶原蛋白酶等级I、胶原蛋白酶等级II及中性蛋白酶(thermolysin)的酶。酶处理中的酶浓度优选为0.01mg/ml～10mg/ml，更优选为0.1mg/ml～10mg/ml，进一步优选为0.5mg/ml～10mg/ml，进一步更优选为0.5mg/ml～5.0mg/ml，尤其优选为0.5mg/ml～2.0mg/ml，最优选为0.7mg/ml～2.0mg/ml。滑膜组织与酶的质量比例优选为1000:1～10:1，更优选为500:1～20:1，进一步优选为200:1～40:1。
酶反应能够在优选为15℃～40℃、更优选为20℃～40℃的温度下进行。反应时间为30分钟以上即可，优选为2小时以上，更优选为2小时30以上，进一步优选为3小时以上。反应时间的上限没有特别限定，但一般在4小时以内。经酶处理的混合物中含有滑膜来源间充质干细胞。将经酶处理的混合物通过细胞过滤器移到离心管并进行离心处理，由此能够回收滑膜来源间充质干细胞。
＜培养基＞
本发明中使用的培养基优选包含必需氨基酸。即，培养基优选包含组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸及缬氨酸。培养基中的必需氨基酸的浓度没有特别限定，但各必需氨基酸的浓度优选为0.003mmol/L以上，更优选为0.005mmol/L以上，进一步优选为0.01mmol/L以上。作为上限值，通常为5mmol/L以下。
作为必需氨基酸合计浓度，优选为0.5mmol/L以上，更优选为1mmol/L以上，进一步优选为1.5mmol/L以上。作为上限值，通常为15mmol/L以下。
培养基优选包含非必需氨基酸等。在此，非必需氨基酸等是规定非必需氨基酸和谷氨酰胺类的术语。作为非必需氨基酸等，可以举出选自包括甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺类、谷氨酸、脯氨酸、丝氨酸及酪氨酸的组中的一种以上物质。
包含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺酸、谷氨酰胺类或/及谷氨酸作为非必需氨基酸等的情况下，它们分别为0.005mmol/L(5μmol/L)以上，优选为0.01mmol/L以上，更优选为0.05mmol/L以上。作为上限值，通常为3mmol/L以下。作为谷氨酰胺类，可优选举出丙氨酰谷氨酰胺。但是，本发明中使用的培养基将丙氨酰谷氨酰胺作为必须成分而含有。
作为丙氨酰谷氨酰胺以外的非必需氨基酸等的合计浓度，优选为0.5mmol/L以上，更优选为1.5mmol/L以上，进一步优选为2.5mmol/L以上。作为上限值，通常为30mmol/L以下。
作为丙氨酰谷氨酰胺的浓度，优选为0.5mmol/L以上，更优选为1.0mmol/L以上，进一步优选为1.5mmol/L以上。作为上限值，通常为10mmol/L以下。
培养基优选不包含谷氨酰胺。这里的不包含是指，在与本发明的效果的关系中实质上不包含的意思，并不是指排除不可避免地混入的成分。作为实质上不包含的例子，一般小于5×10-5mmol/L，优选为0mmol/L。
氨基酸的检测及测定方法使用公知的方法即可，例如能够通过基于高效液相色谱法(HPLC)的氨基酸定量、基于茚三酮法的氨基酸分析方法(例如参考CLinical ChemistrY(1997),VoL.43,no.8,p1421-1428)等进行。
本说明书中所述的氨基酸可以是L-体、D-体、DL-体中的任一种。并且，氨基酸不仅可以是游离体，也可以形成盐。盐的形态可以举出酸加成盐或碱盐等。作为酸，例如可以举出：氯化氢、溴化氢、硫酸、磷酸等无机酸，乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、马来酸、富马酸或单甲基硫酸等有机酸。并且，作为形成这种盐的碱，例如可以举出：钠、钾、钙等金属的氢氧化物或碳酸化物，或氨等无机碱、乙二胺、丙二胺、乙醇胺、单烷基乙醇胺、二烷基乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺等有机碱。盐可以是水合物(含水盐)。
培养基包含吡哆醇。
培养基也可以包含生物素(biotin)。
培养基除了吡哆醇及生物素以外，也可以进一步含有至少一种其他维生素类。作为其他维生素类，可以举出：维生素B12、氯化胆碱、泛酸钙、叶酸、烟酰胺、吡哆醛类(吡哆醇除外)、核黄素、硫胺素盐酸盐和i-肌醇。作为吡哆醛类，可以举出吡哆醛。
上述的吡哆醇、生物素及至少一种其他维生素类不仅可以是游离体，也可以形成盐。盐的形态可以举出酸加成盐或碱盐等。具体而言，可以举出对氨基酸的叙述中的上述物质。
培养基中的、吡哆醇、生物素及至少一种其他维生素类的含有浓度分别优选为0.00005mmol/L以上，更优选为0.0001mmol/L以上，进一步优选为0.0002mmol/L以上。作为上限值，通常为1mmol/L以下。
培养基中的维生素类的含有浓度以合计优选为0.001mmol/L以上，更优选为0.005mmol/L以上，进一步优选为0.01mmol/L以上。作为上限值，通常为2mmol/L以下。
培养基优选不包含吡哆醛或吡哆醛类(吡哆醇除外)。这里的不包含是指，在与本发明的效果的关系中实质上不包含的意思，并不是指排除不可避免地混入的成分。作为实质上不包含的例子，吡哆醛的情况一般小于5×10-5mmol/L，优选为0mmol/L。
培养基优选包含至少一种无机盐。无机盐优选为选自包括氯化钙、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠及磷酸二氢钠的组中的一种以上。无机盐的浓度没有特别限定，但合计优选为10mmol/L以上，更优选为50mmol/L以上，进一步优选为80mmol/L以上。作为上限值，通常为1，000mmol/L以下。
培养基优选包含糖类和丙酮酸盐中的至少一种。作为糖类，可以举出D-葡萄糖。作为丙酮酸盐，可以举出丙酮酸钠。糖类及丙酮酸盐的浓度以合计优选为0.1mmol/L以上，更优选为0.3mmol/L以上，进一步优选为1mmol/L以上。作为上限值，通常为50mmol/L以下。
培养基优选包含硫辛酸。硫辛酸的浓度优选为5×10-5mmol/L以上，更优选为0.0001mmol/L以上，进一步优选为0.0005mmol/L以上。作为上限值，通常为0.005mmol/L以下。
本发明中使用的培养基，代替抗坏血酸，包含抗坏血酸衍生物。作为抗坏血酸衍生物，可以举出抗坏血酸-2-磷酸、抗坏血酸-2-磷酸酯三钠、抗坏血酸-2-磷酸酯镁盐及抗坏血酸-2-糖苷，可以选择使用这些组中的一种，也可以组合使用两种以上。优选使用抗坏血酸-2-磷酸酯三钠。
本发明中使用的培养基优选不包含抗坏血酸。
[化学式1]
Figure BDA0004166056240000101
抗坏血酸
Figure BDA0004166056240000102
抗坏血酸-2-磷酸酯三钠
在本发明中，重要的是代替抗坏血酸而包含抗坏血酸衍生物。这可以认为，通过代替不稳定的抗坏血酸而采用抗坏血酸衍生物，提高了作为培养基的稳定性。
在本发明的培养基组合物中，抗坏血酸衍生物的浓度以合计优选为0.03mmol/L以上，更优选为0.1mmol/L以上，进一步优选为0.14mmol/L以上。作为上限值，优选为5.0mmol/L以下，更优选为1.0mmol/L以下，进一步优选为0.57mmol/L以下。
培养基优选不包含亚油酸进一步地，培养基优选不包含核酸。
这里的不包含是指，在与本发明的效果的关系中实质上不包含的意思，并不是指排除不可避免地混入的成分。作为实质上不包含的例子，抗坏血酸的情况一般小于5×10- 5mmol/L，优选为0mmol/L。亚油酸的情况一般小于0.0015mmol/L，优选为0.001mmol/L以下，更优选为0.0005mmol/L以下，进一步优选为0.0003mmol/L以下，尤其优选为0.00015mmol/L以下，最优选为0mmol/L。并且，核酸的情况一般小于5×10-5mmol/L，优选为0mmol/L。
已知通过在添加有转化增殖因子β3(TGF-β3)、地塞米松、骨形成因子2(BMP-2)的软骨形成培养基中培养间充质干细胞，能够分化成软骨细胞，在in vitro下制作软骨组织。因此，为了使间充质干细胞不分化成软骨细胞，培养基优选不包含TGF-β3、地塞米松及BMP-2。
这里的不包含是指，实质上不包含，并不是指排除不可避免地混入的成分。作为实质上不包含的例子，TGF-β3的情况一般小于0.1ng/mL，优选为0ng/mL。地塞米松的情况一般小于1.0nmol/L，优选为0nmol/L。并且，BMP-2的情况一般小于0.1ng/mL，优选为0ng/mL。
培养基优选不包含胰岛素，转铁蛋白，亚硒酸，BSA(牛血清白蛋白)。
这里的不包含是指，实质上不包含，并不是指排除不可避免地混入的成分。作为实质上不包含的例子，胰岛素的情况一般小于10ng/mL，优选为0ng/mL。
转铁蛋白的情况一般小于10ng/mL，优选为0ng/mL。亚硒酸的情况一般小于0.01ng/mL，优选为0ng/mL。BSA的情况一般小于10μg/mL，优选为0μg/mL。
培养基可以含有酚红。酚红的浓度优选为0.001mmol/L以上，更优选为0.005mmol/L以上，进一步优选为0.01mmol/L以上。作为上限值，通常为0.2mmol/L以下。
作为培养基，可以为含有血清的培养基，也可以为不含血清的培养基。含有血清的培养基中的血清的量，作为下限值，优选为2体积％以上，更优选为5体积％以上，进一步优选为10体积％以上。作为上限值，通常为20体积％以下。
作为血清，可以举出动物来源的血清，但优选为人的血清。
作为血清，可以是同种血清也可以是异种血清，但优选为同种血清。即，在以投与到人为目的而由人组织制造间充质干细胞的情况下，可以使用含有人血清的培养基。使用同种血清的情况下，可以是自体血清，也可以是同种异型的血清，但优选为自体血清。
培养基也可以进一步包含抗生物质。作为抗生物质，可以举出链霉素、庆大霉素(庆大霉素硫酸盐等)、青霉素、两性霉素B等。抗生物质的浓度，作为其合计浓度，优选为0.1mg/L以上，更优选为0.5mg/L以上，进一步优选为10.0mg/L以上。作为上限值，通常为1000mg/L以下。
培养基中除了上述的成分以外，能够根据需要包含公知的添加物。作为添加物，例如可以举出：多胺类(例如腐胺等)、还原剂(例如2-巯基乙醇等)、缓冲剂(例如HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)等)等。
＜培养方法＞
用于培养间充质干细胞的培养器只要能够培养间充质干细胞则无特别限定，可以举出：烧瓶、组织培养用烧瓶、培养平皿(dish)、培养皿(petri dish)、组织培养用平皿、多联培养平皿(multi dish)、微量平板(microplate)、微孔平板(microwell plate)、多层板(multiplate)、多孔平板(multiwell plate)、载玻片(Micro slide)、室载玻片(chamberslide)、碗(schale)、管(tube)、托盘(tray)、培养袋、滚瓶(roller bottle)。在本发明中也可以优选使用5层以上(例如，5～10层)的多层烧瓶培养间充质干细胞。作为5层以上的多层烧瓶的一例，能够使用10层细胞培养室(cell stack)(聚苯乙烯制细胞培养室-10腔室，Corning公司制)。作为烧瓶，能够使用设有通气盖的烧瓶。使用设有通气盖的烧瓶，一边强制性地从通气盖进行通气一边进行培养，由此能够显著提高间充质干细胞的增殖率。
培养器可以是细胞粘附性，也可以是细胞非粘附性，可以根据目的适当选择。为了提高培养器表面与细胞的粘附性，细胞粘附性培养器可以是涂覆有细胞外基质(ECM)等任意细胞支撑用基质的培养器。细胞支撑用基质可以是以粘附间充质干细胞为目的的任意物质，可以举出：使用了ECM的基质胶、或者胶原蛋白或明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘蛋白、纤连蛋白等。
培养条件可酌情设置。例如，培养温度没有特别限定，可以为约30～40℃，优选为约37℃。CO2浓度可以为约1～10％，优选为约2～5％。氧浓度可以为1～20％，优选为1～10％。
为了使间充质干细胞以未分化的状态、并且以具有良好的in situ软骨形成能力的状态增殖，优选调整培养期间。并且，需要考虑准备充分数量的未分化间充质干细胞的必要性，以覆盖软骨损伤部而使患部再生。因此，间充质干细胞的培养期间优选为5天以上、7天以上、10天以上，也可以是10～100天、10～90天、10～80天、10～70天、10～60天、10～50天、10～40天、10～30天、10～28天、10～21天，或者10～14天。作为间充质干细胞使用滑膜来源间充质干细胞的情况下，为了使滑膜来源间充质干细胞以未分化的状态，并且以具有良好的in situ软骨形成能力的状态增殖，优选调整培养期间。并且，需要考虑准备充分数量的未分化的滑膜来源间充质干细胞的必要性，以覆盖软骨损伤部而使患部再生。因此，滑膜来源间充质干细胞的培养期间优选为5天以上、7天以上、10天以上，也可以是10～100天、10～90天、10～80天、10～70天、10～60天、10～50天、10～40天、10～30天、10～28天、10～21天或10～14天。
还已知间充质干细胞的in situ软骨形成能力以与in vitro下的间充质干细胞的传代次数成反比例的方式降低。因此，为了制备未分化的间充质干细胞，优选为10传代以下，更优选为5传代以下，进一步优选为用初代或者第1传代制备间充质干细胞。
还已知滑膜来源间充质干细胞的in situ软骨形成能力以与in vitro下的滑膜来源间充质干细胞的传代次数成反比例的方式降低。因此，为了制备未分化的滑膜来源间充质干细胞，优选为10传代以下，更优选为5传代以下。
＜2＞间充质干细胞的培养方法
本发明关于间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；
采集上述两层中的下层；及
在包含抗坏血酸-2-磷酸酯三钠、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养包含于上述下层的间充质干细胞。
上述的基于本发明的间充质干细胞的培养方法中，间充质干细胞、培养基及培养方法的具体例、优选方式如本说明书中所述。
＜3＞关节治疗用细胞制剂
根据本发明提供一种关节治疗用细胞制剂，其由基于本发明的关节治疗用细胞制剂来制造。根据本发明，进一步提供一种关节治疗用细胞制剂，其包含基于本发明的间充质干细胞的培养方法培养的间充质干细胞。
根据本发明，能够制造将通过本发明的方法获得的间充质干细胞作为有效成分而含有的关节治疗用细胞制剂。
关节治疗用细胞制剂优选不包含细胞外基质或支架。
作为这里所说的细胞外基质或支架，能够举出：胶原蛋白、透明质酸、藻酸、聚乳酸、聚乙醇酸。
作为关节治疗用细胞制剂中作为有效成分使用的间充质干细胞，优选为不包含核型异常的细胞。作为不包含核型异常细胞，在为人间充质干细胞的情况下，能够举出：间充质干细胞的染色体数为46条，染色体的核型分析为一对1号到22号的染色体和XX染色体或XY染色体的细胞。
作为关节治疗用细胞制剂中作为有效成分使用的间充质干细胞，如上所述的不包含核型异常的正常细胞的比率优选高于90％，更优选为91％以上，进一步优选为93％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为98％以上，特别优选为99％以上，最优选为100％。
作为关节治疗，能够举出对伴随关节的损伤、损害或炎症的疾病的治疗，并能够举出软骨等结缔组织的变性和/或由炎症引起的关节疾病或非炎症性关节疾病的治疗。作为关节治疗，例如能够举出对选自包括半月板损伤、外伤性软骨损伤、离断性骨软骨炎、无腐性骨坏死、变形性关节病、类风湿性关节炎(例如慢性类风湿性关节炎)、痛风、反应性关节炎、干癣性关节炎、幼年关节炎、炎性关节炎、关节软骨缺损的组中的疾病的治疗，但是并不限定于这些疾病。变形性关节病可以是膝骨关节炎，关节部位可以是膝关节，也可以是肘关节、指关节、髋关节、肩关节、踝关节、颈椎等关节部位，也可以是多个关节部位的组合。本发明的关节治疗用细胞制剂优选为半月板治疗剂或变形性关节病治疗剂。
在制造关节治疗用细胞制剂的情况下，可以通过常规方法将间充质干细胞与药学上可接受的载体进行混合等以形成适合于给个体施用的形式的制剂。作为载体，例如能够举出加入生理盐水、葡萄糖或其他辅助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)进行等渗的注射用蒸馏水。进而，也可以掺合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、安抚剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂、抗氧化剂等。
[关节的治疗方法]
本发明还涉及一种关节的治疗方法。更具体而言，本发明涉及选自包括半月板损伤、创伤性软骨损伤、骨软骨炎、骨坏死、骨关节炎(例如，关节部位为膝盖的膝骨关节炎、关节部位为肘关节、指关节、髋关节、肩关节、踝关节、颈椎、多个关节部位的组合。)、类风湿性关节炎(例如，类风湿性关节炎)、痛风、反应性关节炎、干癣性关节炎、幼年关节炎、炎症性关节炎、关节软骨缺损的组中的疾病的治疗方法。
本发明的关节治疗方法包括如下步骤：
以用间充质干细胞覆盖软骨损伤部或半月板损伤部的方式，移植本发明的关节治疗剂的步骤；及
通过使间充质干细胞分化为软骨细胞，从而在软骨损伤部或半月板损伤部的insitu上使软骨组织再生。
将本发明的关节治疗剂移植给患者时，为了有效地治疗软骨损伤部或半月板损伤部，在每个软骨损伤部或半月板损伤部，优选适用1×106～1.0×1011个、2×106～1.0×1011个、5×106～1.0×1011个、1×107～1.0×1011个、2.0×107～1.0×1011个、2.5×107～1.0×1011个、3.0×107～1.0×1011个、4.0×107～1.0×1011个、1×106～1.0×1010个、2.5×107～1.0×1010个、1×106～1.0×109个、2.5×107～1.0×109个、1×106～1.0×108个、2.5×107～1.0×108个或2.0×107～1.0×108个间充质干细胞，更优选适用2.0×107～1.0×108个间充质干细胞。
通过将间充质干细胞移植到软骨损伤部或半月板损伤部，软骨损伤部或半月板损伤部被间充质干细胞覆盖。间充质干细胞的移植能够通过开放手术或通过关节内窥镜手术来进行。为了尽量减少侵入，优选在关节内窥镜下移植间充质干细胞。
软骨损伤部或半月板损伤部可以被间充质干细胞的悬浮液覆盖，也可以被间充质干细胞的细胞片覆盖。间充质干细胞粘附在软骨损伤部或半月板损伤部的能力高。
对软骨损伤进行治疗的情况下，本发明的微侵袭手术的特征在于用间充质干细胞覆盖软骨损伤部，包括以下步骤：
将体位保持为软骨损伤部朝上；
将间充质干细胞的细胞片、间充质干细胞的悬浮液或含有间充质干细胞的凝胶状物质放置在软骨损伤部的表面上；及
将体位保持特定时间，从而使间充质干细胞粘附在软骨损伤部表面。
对半月板损伤进行治疗的情况下，本发明的微侵袭手术的特征在于用间充质干细胞覆盖半月板损伤部，包括以下步骤：
将体位保持为半月板损伤部朝下；
将间充质干细胞的悬浮液注射到膝关节内；及
将体位保持特定时间，从而使间充质干细胞粘附在半月板损伤部。
为了使间充质干细胞确实地粘附于软骨损伤部或半月板损伤部的表面，使移植的间充质干细胞在软骨损伤部或半月板损伤部的表面保持至少10分钟，优选保持15分钟。为了实现这一目标，使软骨损伤部或半月板损伤部朝向上方，而且以将间充质干细胞保持在朝向上方的软骨损伤部或半月板损伤部为目的，将体位保持至少10分钟，优选保持15分钟。
为了使间充质干细胞更牢固地粘附于软骨损伤部或半月板损伤部，能够进一步使用骨膜覆盖伴随间充质干细胞的软骨损伤部或半月板损伤部。使间充质干细胞在软骨损伤部的表面或半月板损伤部的表面上保持至少10分钟之后，手术结束。
本发明中，移植的间充质干细胞在软骨损伤部或半月板损伤部上分化成软骨细胞，而且在软骨损伤部或半月板损伤部的in situ上再生软骨组织。
在间充质干细胞在in situ上的软骨形成过程期间，按照局部微小环境(营养供给及细胞因子环境等)再生软骨组织，因此不需要从外部操作。滑膜来源间充质干细胞形成insitu软骨的结果，软骨组织在软骨损伤部或半月板损伤部再生而修复损伤，而且在软骨损伤的情况下，骨区域、软骨与骨的边界、软骨中心部、表面区域、而且与原来的软骨相邻的区域形成为原来的软骨组织，或者在半月板损伤的情况下形成半月板软骨。
通过以下实施例对本发明进行进一步具体说明，但是本发明并不限定于实施例。
实施例
[实验A]
＜材料及方法＞
(1)细胞
使用了从在ALLcells公司购买的人骨髓组织(Whole Bone Marrow，Fresh，10mL，型号：ALL-ABM001，批次：B009、B012)中分离的间充质干细胞(MSC)。
(2)基础培养基
类型基础培养基：
Thermo Fisher Scientific公司，MEM alpha no nucleosides(型号：12561)
基础培养基A：
将类型培养基的抗坏血酸、谷氨酰胺、吡哆醛分别替换成抗坏血酸-2-磷酸酯三钠、丙氨酰谷氨酰胺、吡哆醇的培养基
类型基础培养基及基础培养基A的培养基组成如表1所示。
[表1]
Figure BDA0004166056240000181
(3)间充质干细胞的培养
间充质干细胞的培养中使用了(2)所述的各个基础培养基中，所述基础培养基中作为抗生物质添加了20μg/mL的庆大霉素硫酸盐(“高田制药硫酸庆大霉素注射液60”)以及最终浓度成为15％(v/v)的胎牛血清(SAFC公司，型号：12007C或Selborne公司，型号：FBS-04)。以下，将它们分别称之为类型培养基、培养基A。并且，为了提高增殖能力，在上述类型培养基中添加bFGF(将曲弗明基因重组喷雾剂250(科研制药)溶解到注射用水中，调制成10μg/mL的药液)以至最终浓度为10ng/mL而使用。以下，称之为类型培养基+bFGF。另外，bFGF是碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor)的简称。
间充质干细胞的分离是将购买的人骨髓组织(批次：B009、B012)的组织悬浊液以1,000rpm进行10分钟的离心，分离层两层。采集其中的下层使用。在去除血浆的该下层中加入类型培养基、培养基A或者类型培养基+bFGF，使其成为去除血浆之前的10倍量，以成为0.20mL/cm2的方式播种到烧瓶中，在37℃、5％CO2气氛下的培养箱内进行培养。每隔3天或4天换一次培养基，播种后培养12天～13天，然后用0.05％的胰蛋白酶-EDTA溶液(以下，胰蛋白酶，(日本)生命科技有限公司，型号：25300)进行剥离。剥离后，在等量的培养基中进行胰蛋白酶的中和，并转移到另外准备的管中。将培养烧瓶进而用等量的培养基进行清洗，并加入到上述管中，回收剩余的细胞。将管以200×g进行5分钟离心，除去其上清。在剩余的颗粒中加入适量的培养基，使用血球计算板进行细胞计数。在烧瓶中播种以至最终浓度成为0.20～0.50×104cells/cm2，并在37℃、5％CO2气氛下的培养箱内进行培养。培养3天或4天，在细胞满到烧瓶底面的60％以上时，用与上述同样的操作反复传代。B009是在第9传代结束时，B012是在第4传代结束时对细胞进行了离心，利用混合到类型培养基的冻结液调整至100×104cells/cm2，以使二甲基亚砜(SIGMA-ALDRICH，型号：D2650)的终浓度为10％(v/v)，来制备了用于评价核型分析的细胞原液。
(4)核型分析
制备好的各细胞原液用37℃水浴解冻，并在200×g下离心5分钟，除去冻结液，并加入各培养基，以成为0.35～0.50×104cells/cm2的方式播种到烧瓶中，并在37℃、5％CO2气氛下的培养箱内培养3天或者4天。在细胞满到烧瓶底面的60％以上时，用胰蛋白酶进行剥离，并将用上述方法所回收的细胞代替各培养基而以成为0.25～0.50×104cells/cm2的方式播种到烧瓶中，并在37℃、5％CO2气氛下的培养箱内培养3天或者4天。
在各培养烧瓶中加入培养基量的1/100倍量的秋水仙碱(Demecolcine)溶液(FUJIFILM Wako Pure Chemical,Ltd.，型号：045-18761)，在37℃、5％CO2气氛下的培养箱内静置3～4小时。反应结束后，将各个细胞用胰蛋白酶进行了剥离。之后，用TransChromosomics公司的推荐方法进行卡诺氏液固定，委托进行了Q-band分析。
＜结果＞
(1)基于类型培养基或培养基A的、MSC的培养及核型分析的比较
批次：将用B009的类型培养基及培养基A进行9传代的MSC的冻结原液(P10)进行解冻，用各培养基进行2传代培养，并进行P12(进行11传代的细胞)的细胞核型分析。
比较增殖能力的结果，发现与类型培养基相比，在培养基A中培养的MSC的增殖能力明显高。图1表示用群体倍增值表示的增殖曲线的比较。群体倍增值(PDL)表示细胞的分裂次数，根据以下计算式算出。计算每个传代的PDL并进行累积，由此创建了增殖曲线。
PDL的计算式：(Log(回收细胞数量)―Log(播种细胞数量))/Log2
并且，进行核型分析的结果，在类型培养基中培养的MSC中发现核型异常，但在培养基A中培养的MSC中未发现异常。其结果如表2及图2所示。
[表2]
Figure BDA0004166056240000201
(2)基于类型培养基+bFGF或培养基A的、MSC的培养及核型分析的比较
批次：将用B012的类型培养基+bFGF及培养基A进行4传代的MSC的冻结原液(P5)进行解冻，用各培养基进行2传代培养，并进行了P7(进行6传代的细胞)的细胞核型分析。
进行增殖能力比较的结果，通过在类型培养基中加入bFGF，能够显示出与培养基A同等程度的增殖。另外，进行类型培养基+bFGF、培养基A的核型分析的结果，在培养基A中培养的MSC中未发现核型异常，但在类型培养基+bFGF中培养的MSC中发现了核型异常。其结果如表3及图3所示。
[表3]
Figure BDA0004166056240000211
上述结果表明，使用培养基A的培养法，能够单独兼顾非常显著的增殖提高和核型正常。
[实验B]
(材料及方法)
(1)细胞
实验中使用了人骨髓间充质干细胞或猪滑膜间充质干细胞。
人骨髓间充质干细胞通过[实验A]中所述的方法获得并进行了培养。
猪滑膜间充质干细胞是将从迷你猪(Fuji Micra Inc)的膝盖采集的滑膜组织用剪刀切碎，并浸渍到释放酶溶液5.0mL中。另外，释放酶溶液使用了将释放酶MNP-S(Roche公司制)5.0Mg溶解到包含最终浓度20％胎牛血清(NICHIREI BIOSCIENCES INC.,型号：174012)的注射用水5.0mL中而成的溶液。酶反应是在室温37℃下反应了3小时。之后，将组织消化液通过细胞滤网分离成两层，并将下层转移到50mL离心管中以400g进行了5分钟离心。除去上清，并将所获得的细胞浓厚悬浊液悬浮到培养基中。
(2)基础培养基
作为实施例，使用了[实验A]中所述的培养基(培养基A)。
作为比较用，使用了αMEM(Thermo公司，型号：12561-056)(类型培养基)。
(3)培养容器
培养容器使用了T烧瓶(TPP公司，细胞培养烧瓶150cm2过滤器盖，型号：90151)或10层细胞培养室(Corning公司，细胞培养室10腔室，细胞培养表面处理，型号：3270)。
(4)滑膜间充质干细胞的培养
滑膜间充质干细胞的培养中在(2)所述的各基础培养基中作为抗生物质添加了1％(v/v)的Antibiotic-Antimycotic(Thermo公司，型号：15240-062)，以及以分别成为最终浓度10～20％(v/v)的方式在人骨髓间充质干细胞的培养中添加了自体血清，在猪滑膜间充质干细胞的培养中添加了胎牛血清(NICHIREI BIOSCIENCES INC.,型号：174012)并使用。
以播种到培养容器后的细胞播种密度和培养基量成为规定条件的方式，准备以规定浓度将细胞悬浮于上述培养基中的细胞悬浊液，并将规定量播种到(3)所述的培养容器中。这里所说的播种密度是指播种到培养面每单位面积中的细胞数量，培养基量是指培养面每单位面积中的培养基体积。将播种后的培养容器静置于37℃、5％CO2气氛下的培养箱内，进行培养。从播种开始进行规定期间的培养后，从培养容器剥离回收，并测量细胞数量。将培养后的回收细胞数量除以播种细胞数量，由此算出细胞的增殖率。
[结果]
(试验1)不同培养基下的增殖率的比较
将猪滑膜间充质干细胞用添加了20％(v/v)的FBS(胎牛血清)的类型培养基进行了培养。细胞播种密度设为1000、1500个/cm2，培养基量设为0.12mL/cm2，培养容器使用了T烧瓶。播种后第12天回收细胞，并分别算出增殖率。将播种密度1000个/cm2的条件下的增殖率设为1时的相对增殖率如表2所示。
在与添加上述的FBS的类型培养基的情况相同条件下，只将培养基换成培养基A进行培养，并在播种后第12天回收细胞，并算出增殖率。将使用了添加FBS的类型培养基的情况下的播种密度1000个/cm2的条件下的增殖率设为1时的相对增殖率如表4所示。
在猪滑膜间充质干细胞的培养中，在细胞播种密度1000～1500个/cm2的范围中，可知培养基A相对于类型培养基显示出高的增殖率。
[表4]
基于不同培养基的相对增值率比较2
Figure BDA0004166056240000231
(试验2)不同培养基量下的增殖率的比较1
将人骨髓间充质干细胞使用类型培养基及培养基A进行了培养。
在比较试验1中，使用将20％(v/v)的FBS添加到类型培养基的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在比较试验2中，使用将20％(v/v)的FBS添加到类型培养基的培养基，将培养基量设为0.24mL/cm2。
在试验3中，使用将20％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在试验4中，使用将20％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.24mL/cm2。
在比较试验1及2以及试验3及4的条件下播种后第12天回收细胞，并算出增殖率。将比较试验1的增殖率设为1时的相对增殖率如表5所示。
可知，无论是类型培养基还是培养基A，通过增加培养培养基量，增殖率均提高。
[表5]
人骨髓间充质干细胞中基于不同培养基量的增值率比较
基础培养基 培养基量[mL/cm2] FBS浓度 相对增殖率
比较试验1 类型培养基 0.12 20％ 1.00
比较试验2 类型培养基 0.24 20％ 1.57
试验3 培养基A 0.12 20％ 1.35
试验4 培养基A 0.24 20％ 2.14
(试验3)不同培养基量下的增殖率的比较2
将猪滑膜间充质干细胞使用类型培养基及培养基A进行了培养。
在比较试验11中，使用将20％(v/v)的FBS添加到类型培养基的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在比较试验12中，使用将20％(v/v)的FBS添加到类型培养基的培养基，将培养基量设为0.20mL/cm2。
试验13中，使用将20％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
试验14中，使用将20％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.20mL/cm2。
在比较试验11及12以及试验13及14的条件下播种后第12天回收细胞，并算出增殖率。将比较试验1的增殖率设为1时的相对增殖率如表6所示。
可知，无论是类型培养基还是培养基A，通过增加培养培养基量，增殖率均提高。
[表6]
猪滑膜间充质干细胞中基于不同培养基量的增值率比较
Figure BDA0004166056240000241
(试验4)不增加血清使用量而评价增殖率
将猪滑膜间充质干细胞在基础培养基中使用类型培养基及培养基A进行了培养。
在试验21中，使用将20％(v/v)的FBS添加到类型培养基的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在比较试验22中，使用将20％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在试验23中，使用以培养中所使用的FBS的总量与试验21相同的方式将10％(v/v)的FBS添加到培养基A的培养基，将培养基量设为0.24mL/cm2。
在试验21、比较试验22及试验23的条件下播种后第12天回收细胞，并算出增殖率。将试验21的增殖率设为1时的相对增殖率如表7所示。
已知，通常来说，若血清浓度降低，则增殖率降低。这是因为血清浓度最有助于细胞增殖率。另一方面，在培养基A中，即使所使用的血清量相同，通过增加基础培养基量使血清浓度降低，增殖率会出乎意料地提高。
[表7]
Figure BDA0004166056240000251
(试验5)血清浓度对增殖率的影响
将人骨髓间充质干细胞使用类型培养基及培养基A进行了培养。
在比较试验31中，使用添加了20％(v/v)的FBS的类型培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在比较试验32中，使用以培养中所使用的FBS的总量与试验31相同的方式添加了10％(v/v)的FBS的类型培养基，将培养基量设为0.24mL/cm2。
在试验33中，使用以培养中所使用的FBS的总量与试验31相同的方式添加了10％(v/v)的FBS的培养基A，将培养基量设为0.24mL/cm2。
评价在比较试验31及32以及试验33的条件下培养12天后的增殖率，将试验31的增殖率设为1时的相对增殖率如表8所示。
在类型培养基中，即使所使用的血清量相同，若血清浓度降低则增值率也降低，但若将培养基A使用到基础培养基中，通过增加基础培养基量使血清浓度降低，相对于类型培养基增殖率会出乎意料地提高。在类型培养基中确认到的降低血清浓度时增殖率降低的情况，这被理解为是一种普遍现象。
[表8]
基础培养基 培养基量[mL/cm2] FBS浓度 FBS量[mL/cm2] 增殖性
比较试验31 类型培养基 0.12 20％ 0.024 1.00
比较试验32 类型培养基 0.24 10％ 0.024 0.71
试验33 培养基A 0.24 10％ 0.024 1.31
(试验6)不同培养容器对增殖率的影响
将猪滑膜间充质干细胞使用T烧瓶及10层细胞培养室(聚苯乙烯制细胞培养室-10，腔室，Corning公司制)进行了培养。培养基使用了将20％(v/v)的FBS分别添加到类型培养基及培养基A的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。
在比较试验41-1、41-2中，使用类型培养基，分别使用T烧瓶和10层细胞培养室进行了培养。评价在各培养容器中培养12天后的增殖率，将T烧瓶的增殖率设为1时的10层细胞培养室的相对增殖率如表7所示。
在试验42-1、42-2中，使用类型培养基，分别使用T烧瓶和10层细胞培养室进行培养。
评价在各培养容器培养12天后的增殖率，将T烧瓶的增殖性设为1时的10层细胞培养室的相对增殖率如表9所示。
可知，若将培养容器从T烧瓶换成10层细胞培养室，则相对于在类型培养基中增殖率降低，在培养基A中增殖率会提高。
[表9]
Figure BDA0004166056240000261
(试验7)培养容器的盖的形态及是否进行强制通气对增殖率的影响
将猪滑膜间充质干细胞用10层细胞培养室进行了培养。培养基使用了将20％(v/v)的FBS分别添加到类型培养基及培养基A的培养基，将培养基量设为0.12mL/cm2。在各培养基中，对2个10层细胞培养室的盖使用标准过滤器盖和从标准过滤器盖换成通气盖(Corning细胞培养室用转移帽，型号：3281)的情况进行了比较。并且，在培养基A中换成通气盖，进而比较了从一侧的通气盖进行强制通气时的增殖率。使用于强制通气的气体为包含5％CO2的空气，使用了在导入到10层细胞培养室之前与培养箱环境同等环境下进行加湿(相对湿度100％)，并调温至37℃的气体。
在各培养条件下培养12天后回收细胞，并算出增殖率。将在类型培养基中使用同量的培养基量并在T烧瓶中培养的细胞的增殖结果设为1时的、相对增殖率如表10所示。另外，在表内的相对增殖率结果中记载为无法继续培养的是由于培养过程中确认到细胞没有增殖，培养不到12天。
若将10层细胞培养室的盖从标准过滤器盖换成通气盖来用类型培养基培养，则增殖显著降低，规定期间的培养无法继续。另一方面，若使用培养基A，则即使从标准过滤器盖换成通气盖，比类型培养基能够抑制增殖率的降低，培养能够继续。进而可知，若换成通气盖而强制性地进行气体通气，增殖率会显著提高。
[表10]
Figure BDA0004166056240000271
(试验7)大鼠滑膜来源干细胞的树立及半月板再生效果
本试验为显示大鼠滑膜来源间充质干细胞在大鼠体内的半月板再生能力的试验。
滑膜来源间充质干细胞的树立使用了6周大的Lewis大鼠。在异氟烷麻醉下采集的滑膜组织，在加入胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(Gibco Cat.#10270)以至浓度20％并加入抗菌-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic)(100X(Thermofisher Scientific Cat.#15240062)以至浓度1％的基础培养基A(Sigma Cat.#C9263)中，加入胶原酶V(CollagenaseV)(Sigma Cat.#C9263)以至成为3.0mg/mL，并在37℃下反应了2小时。添加经冷却的培养基使反应停止，使其通过40μm的细胞滤网(Cell Strainer)，去除残渣组织。将回收的细胞播种到75cm2的细胞培养烧瓶(Corning Inc.,型号：353136)中，在CO2浓度5％、37℃下培养6天。培养6天后，废弃烧瓶内的培养基，用PBS(磷酸缓生理盐水)清洗2次后，添加5mL的TrypLE(注册商标)Express(Thermo fisher scientific Cat.#1260413)，在37℃的培养箱内静置5分钟，将细胞作为间充质干细胞进行回收，并用生死细胞自动分析器Vi-CELL(BECKMAN COULTER，型号：731050)算出细胞数量。利用离心废弃上清，换成COS-banker(Cosmo Bio Co.,Ltd.Cat.#COS-CFM01)，来制备细胞的冻结原液。
用于评价半月板再生效果的半月板损伤模型的制作使用了10周大的Lewis大鼠。移植半月板损伤及间充质干细胞的方法中，在异氟烷麻醉下切开膝关节皮肤，露出膝关节。露出膝盖下的内侧关节包，用手术刀纵向切开露出股骨远端的软骨。将内侧半月板从滑膜进行剥离，露出内侧半月板，切除整体的约2/3。将膝盖腱与滑膜进行缝合，之后缝合后筋肉。处置半月板损伤之后分成了2组，即，大鼠滑膜来源间充质干细胞(rSMSC)组及作为对照的PBS组。在rSMSC组中，使用注射针将所施用的间充质干细胞即用包含20％胎牛血清(Gibco Cat.#10270)、1％抗生素-抗真菌素(100×)(Thermo fisher scientific Cat.#15240062)的基础培养基A唤醒由滑膜树立·冻结的细胞并培养8天进行回收的细胞数量5×106cells从缝合部位沿与膝关节垂直的方向穿刺针并移植到膝关节内缝合皮肤。手术后，将所有大鼠放回笼中，使其自由地进行运动及饮食。
动物在处理3周后进行了剖检。动物在异氟醚麻醉下通过切断下主动脉进行放血，使其安乐死。随后，取下膝关节露出半月板，切除内侧半月板，并拍照。切除的双膝关节内侧半月板的图像如图4所示。根据与残留的半月板不同的色调及形状，从图像中确定再生部分，并用虚线包围。PBS组中，半月板具有到中节部的形状的占一半，但rSMSC组中，半月板再生到前节部的例子见多数，由此可见rSMSC移植对半月板再生的效果。
为了定量比较在rSMSC组及PBS组中的半月板再生效果，用Image J(version1.52)测量了半月板再生部分(虚线内)的面积。根据半月板的色调及形状肉眼判断半月板再生部分，使用式1算出面积。
(式1)
半月板再生部分面积(mm2)＝半月板再生部分区域的像素数/每1mm2的像素数
各组再生部分面积的平均值、标准偏差及统计学分析均在Microsoft Excel2007(Microsoft Corp)中进行。关于统计学分析，在rSMSC组及PBS组之间进行了Student’s T-Test，有显著性水平小于5％(P＜0.05)的差异。
rSMSC组及PBS组的半月板再生部面积之值如表11所示。PBS组的半月板再生部分面积为1.1mm2，相对于此，在rSMSC组中为2.0mm2，具有约2倍的再生面积，显示出统计学上的显著性差异(P＜0.05)。
[表11]
半月板再生部分的面积(平均值±标准偏差)
组 半月板再生部分面积(mm2)
PBS组＝5(10膝) 1.1±0.9
rSMSC组＝5(10膝) 2.0±0.8*
*P＜0.05vs PBS组

Claims (23)

1.一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，包括以下步骤：
在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述间充质干细胞为滑膜来源间充质干细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述间充质干细胞源自自体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
所述培养基包含同种血清。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
所述培养基不包含抗坏血酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
所述培养基包含生物素或硫辛酸中的任一种以上。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
使用5层以上的多层烧瓶培养间充质干细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，该方法还包括以下步骤：
将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；及采集所述两层中的下层，
在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养包含在所述下层的间充质干细胞。
9.一种关节治疗用细胞制剂，其通过权利要求1至8中任一项所述的方法制造。
10.根据权利要求9所述的关节治疗用细胞制剂，其不包含细胞外基质或支架。
11.根据权利要求9或10所述的关节治疗用细胞制剂，其为半月板治疗剂或变形性关节病治疗剂。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的关节治疗用细胞制剂，其中，
间充质干细胞为人间充质干细胞，间充质干细胞的染色体数为46条，染色体的核型分析为一对1号到22号的染色体和XX染色体或XY染色体。
13.一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
将包含间充质干细胞的组织的悬浊液分离成上层和下层两层；
采集所述两层中的下层；及
在包含抗坏血酸衍生物、丙氨酰谷氨酰胺及吡哆醇的培养基中培养包含在所述下层的间充质干细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，
所述间充质干细胞为滑膜来源间充质干细胞。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，
所述间充质干细胞源自自体。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中，
所述培养基包含同种血清。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中，
所述培养基不包含抗坏血酸。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中，
所述培养基包含生物素或硫辛酸中的任一种以上。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中，
使用5层以上的多层烧瓶培养间充质干细胞。
20.一种关节治疗用细胞制剂，其包含通过权利要求13至19中任一项所述的方法培养的间充质干细胞。
21.根据权利要求20所述的关节治疗用细胞制剂，其不包含细胞外基质或支架。
22.根据权利要求20或21所述的关节治疗用细胞制剂，其为半月板治疗剂或变形性关节病治疗剂。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的关节治疗用细胞制剂，其中，
间充质干细胞为人间充质干细胞，间充质干细胞的染色体数为46条，染色体的核型分析为一对1号到22号的染色体和XX染色体或XY染色体。
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