CN115777016A - 滑膜来源间充质干细胞的制造方法及关节治疗用细胞制剂的制造方法 - Google Patents

滑膜来源间充质干细胞的制造方法及关节治疗用细胞制剂的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够由滑膜组织获得充分量的滑膜来源间充质干细胞的滑膜来源间充质干细胞的制造方法、利用了上述的滑膜来源间充质干细胞的制造方法的关节治疗用细胞制剂的制造方法、滑膜来源间充质干细胞及关节治疗用细胞制剂。根据本发明，可提供一种由滑膜组织制造滑膜来源间充质干细胞的制造方法，所述方法包括：用酶将滑膜组织处理2小时以上；及清洗经酶处理后的混合物直至上清液中的残留酶浓度成为0.5ng/mL以下，由此获得滑膜来源间充质干细胞。

Description

滑膜来源间充质干细胞的制造方法及关节治疗用细胞制剂的 制造方法
技术领域
本发明涉及一种滑膜来源间充质干细胞的制造方法，该方法包括清洗用酶对滑膜组织进行规定时间的处理之后的混合物。本发明还涉及一种利用上述方法的关节治疗用细胞制剂的制造方法。
背景技术
在整形外科领域中，关节软骨损伤或半月板损伤作为日常诊疗行为的对象频繁可见，被广泛认为是多数患者所具有的疾病。当发生关节软骨损伤或半月板损伤的情况下，会引起关节痛、运动范围的减少、关节水肿及运动障碍等。患有外伤引起的关节软骨损伤或半月板损伤的患者通常接受整形外科医生的治疗。对软骨损伤或半月板损伤的外科治疗目的在于去除成为关节进一步恶化的要因的破片以使患部关节的功能恢复。然而，众所周知，软骨及半月板组织很难自我再生。
另一方面，近年来随着再生医疗技术的进歩，能够修复软骨或半月板的细胞治疗兴盛起来。其中，间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)可期待成为有用的细胞治疗的细胞源。间充质干细胞能够从各种体组织采集，报告有能够从骨髄组织(非专利文献1)、脂肪组织(非专利文献2)、肌肉组织(非专利文献3)、滑膜组织(非专利文献4)、骨膜组织(非专利文献5)等分离。尤其，报告有与源自骨髄等各间叶组织的间充质干细胞相比，滑膜来源间充质干细胞具有高的增殖能力及软骨形成能力(非专利文献6)。并且，在日本专利第5928961号公报及日本专利第5656183号公报中公开有使用滑膜来源间充质干细胞治疗关节软骨损伤或半月板损伤的方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Prockop,D.J.,1997,Science.276:71-4
非专利文献2：Zuk,P.A.et al.,2002,Mol Biol Cell.13:4279-95
非专利文献3：Cao et al.,2003,Nat Cell Biol.5:640-6
非专利文献4：De Bari,C.et al.,2001,Arthritis Rheum.44:1928-42
非专利文献5：Fukumoto,T.et al.,2003,OsteoarthritisCartilage.11:55-64
非专利文献6：Sakaguchi,et al.,2005,Arthritis Rhum.52:2521-9
专利文献
专利文献1：日本特许专利第5928961号公报
专利文献2：日本特许专利第5656183号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
专利文献1及2中，公开有使用滑膜来源间充质干细胞的治疗。另一方面，在实际上制造细胞的过程中，明显存在以上述中所公开的制造法有时无法实现供于自我治疗的充分的细胞产量的课题。
本发明的课题在于提供一种滑膜来源间充质干细胞的制造方法，利用该方法能够由滑膜组织获得充分量的滑膜来源间充质干细胞。本发明的课题还在于提供一种利用上述滑膜来源间充质干细胞的制造方法的关节治疗用细胞制剂的制造方法。本发明的课题还在于提供一种滑膜来源间充质干细胞及关节治疗用细胞制剂。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行深入研究的结果，借由调节对滑膜组织进行酶处理的时间并且赋予清洗细胞的工序，成功制造了可供于治疗的充分量的滑膜来源间充质干细胞。另外，由于增加滑膜组织的酶处理时间会带来滑膜组织的损伤，因此会考虑尽量避免这种情况。实际上，当将酶处理时间由1小时变为1.5小时的情况下，细胞产量大量减少而无法使细胞产量增加。另一方面，发现了如下：通常因自体血清而酶不活化，因此借由特意赋予被认为不必要的细胞清洗工序，出乎预料地能够增加细胞产量。本发明人借由延长酶处理时间及赋予细胞清洗工序这2个途径，首次发现了可获得大幅增加细胞产量的效果。本发明根据上述发现而完成。
即、根据本发明可提供以下发明。
＜1＞一种由滑膜组织制造滑膜来源间充质干细胞的制造方法，所述方法包括：
用酶将滑膜组织处理2小时以上；及
清洗经酶处理后的混合物直至上清液中的残留酶浓度成为0.5ng/mL以下，由此获得滑膜来源间充质干细胞。
＜2＞根据＜1＞所述的方法，其中，
酶为含有1种以上胶原蛋白酶及1种以上中性蛋白酶的混合酶。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，
酶为Liberase(注册商标)。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的方法，其中，
酶处理中的酶浓度为0.01mg/ml～10mg/ml。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织源自人。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织为源自单一供体(donor)的滑膜组织。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的方法，其中，
滑膜采集对象与滑膜来源间充质干细胞的移植对象为同一对象。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织与酶的质量比例为1000:1～10:1。
＜9＞根据＜1＞至＜8＞中任一项所述的方法，其中，
上述清洗包括使用培养基清洗多次。
＜10＞根据＜9＞所述的方法，其中，
上述培养基为α改良Eagle最低基础培养基。
＜11＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的方法，该方法包括：将清洗后的滑膜来源间充质干细胞培养10天以上，由此使滑膜来源间充质干细胞增殖。
＜12＞根据＜11＞所述的方法，其中，
在不更换培养基的情况下进行上述10天以上的培养。
＜13＞根据＜11＞或＜12＞所述的方法，其中，
在含有自体血清的培养基中进行上述10天以上的培养。
＜14＞根据＜1＞至＜13＞中任一项所述的方法，其中，
不与除了滑膜来源间充质干细胞以外的其他细胞共培养而制造滑膜来源间充质干细胞。
＜15＞一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，该方法包括：
借由＜1＞至＜14＞中任一项所述的方法制造滑膜来源间充质干细胞；及
使用所述滑膜来源间充质干细胞来制造关节治疗用细胞制剂。
＜16＞根据＜15＞所述的关节治疗用细胞制剂的制造方法，其中，
关节治疗为半月板损伤的治疗。
＜17＞一种滑膜来源间充质干细胞，其借由＜1＞至＜14＞中任一项所述的方法来制造。
＜18＞一种关节治疗用细胞制剂，其借由＜15＞或＜16＞所述的方法来制造。
<A>一种关节治疗方法，该方法包括如下工序：
以用滑膜来源间充质干细胞覆盖软骨损伤部或半月板损伤部的方式来移植通过本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞；及
使滑膜来源间充质干细胞分化为软骨细胞，借此在软骨损伤部或半月板损伤部的in situ(原位)上使软骨组织再生。
发明效果
根据本发明，能够由滑膜组织获得充分量的滑膜来源间充质干细胞。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
[滑膜来源间充质干细胞的制造方法]
本发明的滑膜来源间充质干细胞的制造方法中，由滑膜组织制造滑膜来源间充质干细胞，所述方法包括：
用酶将滑膜组织处理2小时以上；及
清洗经酶处理后的混合物直至上清液中的残留酶浓度成为0.5ng/mL以下，由此获得滑膜来源间充质干细胞。
＜滑膜组织＞
滑膜组织能够在麻酔下从关节的非负重部分采集。
滑膜组织的生物来源并无特别限定，能够使用任意生物、优选为源自哺乳动物的滑膜组织。例如，能够使用源自灵长类(例如，黑猩猩、日本猕猴、人)的滑膜组织，尤其优选能够使用源自人的滑膜组织。
滑膜组织可以为源自单一供体的滑膜组织，也可以为源自多个供体的滑膜组织，但是优选为源自单一供体的滑膜组织。
以投与到人为目的而制造滑膜来源间充质干细胞的情况下，优选使用从组织适合性抗原的类型与受体一致或类似的供体采集的滑膜组织。更优选滑膜采集对象与滑膜来源间充质干细胞的移植对象为同一对象。即、优选使用从受体本身采集的滑膜组织(自我移植)。
滑膜组织的采集量能够考虑供体的种类或所需滑膜来源间充质干细胞的量来确定。例如能够由0.1g～10g、优选为0.1g～2.0g、更优选为0.1g～1.5g、进一步优选为0.1g～1.0g的滑膜组织获得滑膜来源间充质干细胞。所采集的滑膜组织根据需要用剪刀等切碎之后供进行后述的酶处理。
＜基于酶的处理＞
本发明中，用酶将滑膜组织处理2小时以上。
作为酶，只要为含有蛋白酶的酶，则并无特别限定，但是优选为含有1种以上胶原蛋白酶及1种以上中性蛋白酶的混合酶。尤其优选的酶为Liberase(注册商标)。作为Liberase(注册商标)，例如能够使用Liberase(注册商标)MNP-S(Roche Diagnostics K.K.制造)，其是一种含有胶原蛋白酶等级I、胶原蛋白酶等级II及中性蛋白酶(thermolysin)的酶。
酶反应能够在含有酶的水溶液中进行，也可以使用含有人血清的水溶液。人血清可以为自身的血清，也可以为同种异型的血清，但是优选为自身的血清。
酶处理中的酶浓度优选为0.01mg/ml～10mg/ml，更优选为0.1mg/ml～10mg/ml，进一步优选为0.5mg/ml～10mg/ml，进一步更优选为0.5mg/ml～5.0mg/ml，尤其优选为0.5mg/ml～2.0mg/ml，最优选为0.7mg/ml～2.0mg/ml。
滑膜组织与酶的质量比例优选为1000:1～10:1，更优选为500:1～20:1，进一步优选为200:1～40:1。
酶反应能够在优选为15℃至40℃、更优选为20℃至35℃、进一步优选为25℃至35℃的温度下进行。
反应时间为2小时以上即可，更优选为2.5小时以上，进一步优选为3小时以上。反应时间的上限并无特别限定，可以为10小时以内、9小时以内、8小时以内、7小时以内、6小时以内、5小时以内或4小时以内。
经酶处理的混合物中含有滑膜来源间充质干细胞。
将经酶处理的混合物借由细胞过滤器移到离心管并进行离心处理，由此能够回收滑膜来源间充质干细胞。
＜清洗＞
本发明中，清洗经酶处理后的混合物直至上清液中的残留酶浓度成为0.5ng/mL以下。上清液中的残留酶浓度优选为0.3ng/mL以下，更优选为0.2ng/mL以下，尤其优选为0.1ng/mL以下。
清洗能够通过使借由上述离心处理回收的滑膜来源间充质干细胞再悬浮于培养基中并再次进行离心(400g进行5分钟等)来进行。作为培养基，能够使用α改良Eagle最低基础培养基(αMEM)，但是并无特别限定。清洗可以使用如上述的培养基进行多次(2次以上)。
＜增殖＞
本发明中，可以借由将清洗后的滑膜来源间充质干细胞培养10天以上来使滑膜来源间充质干细胞增殖。
关于上述培养中所使用的培养基，能够将通常用于培养动物细胞的培养基制备成基础培养基。作为通常用于培养动物细胞的培养基，能够举出αMEM、DMEM(DulbeccoModified Eagle Medium)、DMEM与F12的混合培养基(DMEM:F12＝1:1)、RPMI培养基(GIBCO(注册商标)RPMI1640培养基等)、DMEM/F12与RPMI的混合培养基(DMEM/F12:RPMI＝1:1)等，但是并无特别限定。
作为培养基，可以为含有血清的培养基，也可以为不含血清的培养基。以投与到生体为目的而由自身的组织制造滑膜来源间充质干细胞的情况下，培养基可以含有同种血清。即、以投与到人为目的而由人的组织制造滑膜来源间充质干细胞的情况下，可以使用含有人血清的培养基。当使用血清的情况下，可以为自身的血清，也可以为同种异型的血清，但是优选为自身的血清。当使用血清的情况下，培养基中的血清的添加量例如为20体积％以下、10体积％以下或5体积％以下。
细胞的培养条件并无特别限定，能够采用通常的细胞培养条件。例如能够举出在温度30～40℃、3～7％CO2下的培养，但是并无特别限定。作为一例，能够举出温度37℃、5％CO2下的培养。
本发明中，优选在不更换培养基的情况下进行上述的10天以上的培养。并且，上述的10天以上的培养中，优选不与除了滑膜来源间充质干细胞以外的其他细胞共培养而制造滑膜来源间充质干细胞。
已知培养期间越长滑膜来源间充质干细胞向软骨细胞的分化越进展，因此若培养期间超过特定长度，则滑膜来源间充质干细胞的in situ下的软骨形成能力降低。因此，本发明中，为了使滑膜来源间充质干细胞在未分化的状态下而且在具有良好的in situ软骨形成力的状态下增殖，优选调节培养期间。并且，本发明中，需要考虑准备充分数量的未分化滑膜干细胞的必要性，以覆盖软骨损伤部而且使患部再生。因此，培养期间优选为5天以上、7天以上、10天以上，更优选为10～14天、10～21天、或10～28天，进一步优选为10～21天。
已知能够借由在添加有转化增殖因子β3(TGF-β3)、地塞米松、骨形成因子2(BMP-2)的软骨形成培养基中培养间充质干细胞而分化成软骨细胞，在in vitro下制作软骨组织。因此，在本发明中，为了避免滑膜来源间充质干细胞分化成软骨细胞，优选在TGF-β3、地塞米松、或BMP-2的非存在下培养分离的滑膜来源间充质干细胞。
还已知滑膜来源间充质干细胞的in situ软骨形成能力以与in vitro下的间充质干细胞的传代次数成反比例的方式降低。因此，为了制作未分化的间充质干细胞，优选制造初代或第1传代的滑膜来源间充质干细胞。
本发明中，自我治疗中所使用的血清源自自身，自我治疗中能够从供体采集的血清量有限，并且，就使源自滑膜的干细胞增殖的观点考虑，需要细胞密度为一定以上，因此优选将经酶处理后的滑膜来源间充质干细胞以100细胞/cm2以上且5000细胞/cm2以下、200细胞/cm2以上且5000细胞/cm2以下、500细胞/cm2以上且5000细胞/cm2以下、500细胞/cm2以上且2500细胞/cm2以下或500细胞/cm2以上且2000细胞/cm2以下的细胞数量进行播种来培养。并且，为了用酶处理之后使滑膜来源间充质干细胞增殖，更优选培养10天以上。
培养结束时所获得的细胞数量优选为1.0×107细胞以上、2.0×107细胞以上、2.5×107细胞以上或3.0×107细胞以上，更优选为4.0×107细胞以上，进一步优选为5.0×107细胞以上，尤其优选为6.0×107细胞以上。
＜滑膜来源间充质干细胞＞
间充质干细胞为源自中胚叶组织(间叶)的体干细胞。已知间充质干细胞存在于骨髄、滑膜、骨膜、脂肪组织、肌肉组织，而且已知具有分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞及肌细胞的能力。与间充质干细胞分化成软骨细胞相关联，已知借由将BMP或TGF-β添加到培养液而未分化间充质干细胞向软骨细胞的分化得到促进，而且软骨组织能够在in vitro条件下再生。
间充质干细胞能够通过检测间充质干细胞中的特征分子、例如酶、受体、低分子化合物等来确认。作为间充质干细胞中的特征分子，可举出作为细胞表面标志物(阳性标志物)的CD73、CD90、CD105、CD166等，但是并不限定于这些。并且，作为间充质干细胞中未表达的阴性标志物，可举出CD19、CD34、CD45、HLA-DR、CD11b、CD14等，但是并不限定于这些。另外，CD为Clusters of differentiation的缩写，HLA-DR为human leukocyte antigen-D-related的缩写。利用这些阳性标志物及阴性标志物，能够确认其为间充质干细胞。这些标志物的检测中能够利用免疫学方法，但是也可以根据各分子的mRNA量的定量来实施检测。
本说明书中滑膜来源间充质干细胞为滑膜所含有的干细胞。滑膜来源间充质干细胞为间充质干细胞的一种。滑膜来源间充质干细胞能够借由检测例如CD90阳性、CD45阴性、软骨分化能力来进行检测，但是检测方法并无特别限定。
根据本发明，可提供借由本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞。
借由本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞能够用作关节治疗用细胞制剂。进而，借由本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞例如还能够用于与间充质干细胞的分化有关的研究或与各种疾病有关的药物筛选、医药候选化合物的效能及安全性评价等。
[关节治疗用细胞制剂的制造方法]
本发明涉及一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，该方法包括：
借由上述本发明的方法制造滑膜来源间充质干细胞；及
使用上述滑膜来源间充质干细胞制造关节治疗用细胞制剂。
根据本发明，可提供一种借由上述的关节治疗用细胞制剂的制造方法制造的关节治疗用细胞制剂。
即、根据本发明，能够制造将借由本发明的方法获得的滑膜来源间充质干细胞作为有效成分而含有的关节治疗用细胞制剂。
作为关节治疗，能够举出对伴随关节的损伤、损害或炎症的疾病的治疗，并能够举出软骨等结缔组织的变性和/或由炎症引起的关节疾病或非炎症性关节疾病的治疗。作为关节治疗，例如能够举出对选自包括半月板损伤、外伤性软骨损伤、离断性骨软骨炎、无腐性骨坏死、变形性关节病(例如变形性膝关节病)、类风湿性关节炎(例如慢性类风湿性关节炎)、痛风、反应性关节炎、干性关节炎、幼年关节炎、炎性关节炎、关节软骨缺损的组中的疾病的治疗，但是并不限定于这些疾病。
当将借由本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞制成关节治疗用细胞制剂的情况下，借由常规方法将上述细胞与药学上允许的载体混合等来制成适合对个体投与的方式的制剂即可。作为载体，例如能够举出加入生理盐水、葡萄糖或其他辅助剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露醇、氯化钠等)进行等渗的注射用蒸馏水。进而，也可以掺合缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液)、安抚剂(例如苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂、抗氧化剂等。
[关节的治疗方法]
本发明还涉及一种关节的治疗方法。更具体而言，本发明涉及一种对选自包括半月板损伤、外伤性软骨损伤、离断性骨软骨炎、无腐性骨坏死、变形性关节病(例如变形性膝关节病)、类风湿性关节炎(例如慢性类风湿性关节炎)、痛风、反应性关节炎、干性关节炎、幼年关节炎、炎性关节炎、关节软骨缺损的组中的疾病的治疗方法。
本发明的关节治疗方法包括如下工序：
以用滑膜来源间充质干细胞覆盖软骨损伤部或半月板损伤部的方式来移植通过本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞；及
使滑膜来源间充质干细胞分化为软骨细胞，借此在软骨损伤部或半月板损伤部的in situ上使软骨组织再生。
将借由本发明的方法制造的滑膜来源间充质干细胞移植到患者时，为了有效地治疗软骨损伤部或半月板损伤部，对每个软骨损伤部或半月板损伤部适用2.0×107～1.0×1011个或2.5×107～1.0×1011个或3.0×107～1.0×1011个、4.0×107～1.0×1011个或2.5×107～1.0×1010个或2.5×107～1.0×109个或2.5×107～1.0×108个或2.0×107～1.0×108个的滑膜来源间充质干细胞、更优选适用2.0×107～1.0×108个滑膜来源间充质干细胞。
借由将滑膜来源间充质干细胞移植到软骨损伤部或半月板损伤部，软骨损伤部或半月板损伤部被滑膜来源间充质干细胞覆盖。滑膜来源间充质干细胞的移植能够借由开放手术或借由关节内窥镜手术来进行。为了尽量减少侵袭，优选在关节内窥镜下移植滑膜来源间充质干细胞。
软骨损伤部或半月板损伤部可以被滑膜来源间充质干细胞的悬浮液覆盖，也可以被滑膜来源间充质干细胞的细胞片覆盖。例如，能够将明胶或胶原等生体吸收性凝胶用作凝胶状物质。滑膜来源间充质干细胞粘附在软骨损伤部或半月板损伤部的能力高。
对软骨损伤进行治疗的情况下，本发明的微侵袭手术的特征在于用滑膜来源间充质干细胞覆盖软骨损伤部，包括以下步骤：
将体位保持为软骨损伤部朝上；
将滑膜来源间充质干细胞的细胞片、滑膜来源间充质干细胞的悬浮液或含有滑膜来源间充质干细胞的凝胶状物质放置在软骨损伤部的表面上；及
将体位保持特定时间，从而使滑膜来源间充质干细胞粘附在软骨损伤表面。
对半月板损伤进行治疗的情况下，本发明的微侵袭手术的特征在于用滑膜来源间充质干细胞覆盖半月板损伤部，包括以下步骤：
将体位保持为半月板损伤部朝下；
将滑膜来源间充质干细胞的悬浮液注射到膝关节内；及
将体位保持特定时间，从而使滑膜来源间充质干细胞粘附在半月板损伤部。
为了使滑膜来源间充质干细胞确实地粘附于软骨损伤部或半月板损伤部的表面，使移植的滑膜来源间充质干细胞在软骨损伤部或半月板损伤部的表面保持至少10分钟，优选保持15分钟。为了实现这一目标，使软骨损伤部或半月板损伤部朝向上方，而且以将滑膜来源间充质干细胞保持在朝向上方的软骨损伤部或半月板损伤部为目的，将体位保持至少10分钟、优选为15分钟。
为了使滑膜来源间充质干细胞更牢固地粘附于软骨损伤部或半月板损伤部，能够进一步使用骨膜覆盖伴随滑膜来源间充质干细胞的软骨损伤部或半月板损伤部。使滑膜来源间充质干细胞在软骨损伤部的表面或半月板损伤部的表面上保持至少10分钟之后，手术结束。
本发明中，移植的滑膜来源间充质干细胞在软骨损伤部或半月板损伤部上分化成软骨细胞，而且在软骨损伤部或半月板损伤部的in situ上再生软骨组织。
在滑膜来源间充质干细胞在in situ上的软骨形成过程期间，按照局部微小环境(营养供给及细胞因子环境等)再生软骨组织，因此不需要从外部操作。滑膜来源间充质干细胞形成in situ软骨的结果，软骨组织在软骨损伤部或半月板损伤部再生而修复损伤，而且在软骨损伤的情况下，骨区域、软骨与骨的边界、软骨中心部、表面区域、而且与原来的软骨相邻的区域形成为原来的软骨组织，或者在半月板损伤的情况下形成半月板软骨。
借由以下实施例对本发明进行进一步具体说明，但是本发明并不限定于实施例。
实施例
＜比较例1＞通过一般制造工序制造滑膜来源间充质干细胞(酶处理时间1小时、无清洗工序)
使用人受检体，借由一般的制造方法由滑膜组织制作了滑膜来源间充质干细胞。具体而言，用剪刀将C1受检体(滑膜组织0.5g)剪碎，将其浸渍于Liberase水溶液5.0mL中。另外，Liberase水溶液使用了将Liberase MNP-S(Roche Diagnostics K.K.制造)5.0mg溶解于含有最终浓度20％人自体血清的注射用水5.0mL中而得的水溶液。酶反应是在室温25℃下反应了1小时。之后，使组织消化液通过细胞过滤器，将其移到50mL离心管中，400g进行了5分钟离心。去除上清液，将所获得的细胞浓厚悬浮液悬浮于培养基并全部播种于烧瓶中(播种密度200个/cm2)。另外，培养基使用了将最终浓度10％人自体血清溶解于αMEM中而得的培养基。在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养，2周后从烧瓶回收细胞，制造了滑膜来源间充质干细胞。另外，在培养期间未实施培养基交换，这一点也为本细胞制造的特征。如此，最终获得的C1的细胞产量为1.8×107cells。将结果总结记载于表1中。
＜比较例2＞通过延长酶处理时间的制造工序制造滑膜来源间充质干细胞(酶处理时间1.5小时、无清洗工序)
使用人受检体，在与通常的制造法相比将酶处理时间延长了30分钟的条件下由滑膜组织制作了滑膜来源间充质干细胞。具体而言，用剪刀剪碎C2受检体(滑膜组织0.9g)，将其浸渍于Liberase水溶液5.0mL中。另外，Liberase水溶液使用了将Liberase MNP-S(RocheDiagnostics K.K.制造)5.0mg溶解于含有最终浓度20％人自体血清的注射用水5.0mL中而得的水溶液。酶反应是在室温25℃下反应了1.5小时。之后，使组织消化液通过细胞过滤器，将其移到50mL离心管中，400g进行了5分钟离心。去除上清液，将所获得的细胞浓厚悬浮液悬浮于培养基并全部播种于烧瓶中(播种密度1,880个/cm2)。另外，培养基使用了将最终浓度10％人自体血清溶解于αMEM中而得的培养基。在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养，2周后从烧瓶回收细胞，制造了滑膜来源间充质干细胞。另外，在培养期间未实施培养基交换，这一点也为本细胞制造的特征。如此，最终获得的C2的细胞产量为0.8×107cells。这低于被认为治疗所需的1.0×107cells，成为了无法提供治疗所需的细胞量的水准。将结果总结记载于表1中。
＜实施例1＞通过延长酶处理时间并且赋予酶清洗工序的制造工序制造滑膜来源间充质干细胞(酶处理时间3小时、有清洗工序)
使用人受检体，在与通常的制造法相比将酶处理时间延长了2小时的条件下由滑膜组织制作了滑膜来源间充质干细胞。具体而言，将J1受检体(滑膜组织0.8g)、J2受检体(滑膜组织0.6g)、J3受检体(滑膜组织0.7g)、J4受检体(滑膜组织0.5g)、J5受检体(滑膜组织0.3g)分别用剪刀剪碎，并浸渍于Liberase水溶液5.0mL中。另外，Liberase水溶液使用了将Liberase MNP-S(Roche Diagnostics K.K.制造)5.0mg溶解于含有最终浓度20％人自体血清的注射用水5.0mL中而得的水溶液。酶反应是在室温25℃下反应了3小时。之后，使组织消化液通过细胞过滤器，将其移到50mL离心管中，400g进行了5分钟离心。
另外，之后作为清洗工序，赋予了如下工序、即废弃上清液用20mL的αMEM再悬浮并且400g进行5分钟离心。该清洗工序重复进行共计2次。
之后，去除上清液，将所获得的细胞浓厚悬浮液悬浮于培养基并全部播种于烧瓶中(关于播种密度，J1为1,874个/cm2、J2为1,059个/cm2、J3为1,987个/cm2、J4为1,513个/cm2)。另外，培养基使用了将最终浓度10％人自体血清溶解于αMEM中而得的培养基。在CO2培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养，2周后从烧瓶回收细胞，制造了滑膜来源间充质干细胞。另外，在培养期间未实施培养基交换，这一点也为本细胞制造的特征。
如此，最终获得的细胞产量J1为4.9×107cells、J2为7.6×107cells、J3为5.8×107cells、J4为9.0×107cells、J5为6.5×107cells。这大幅超过被认为治疗所需的1.0×107cells，成为了能够充分且稳定地提供治疗所需的细胞量的水准。将结果总结记载于表1中。
＜实施例2＞残留酶Liberase的定量
对在比较例1、比较例2及实施例1中实施的制造工序中残留于培养基的Liberase量进行了定量。结果明确可知，C1为10.2ng/mL、C2为59.8ng/mL、J1～J5均为0.1ng/mL以下(试剂盒的检测极限以下)。将结果示于表1中。
＜实施例3＞间充质干细胞标志物的确认试验
对在比较例1及2以及实施例1中制作的滑膜来源间充质干细胞，对间充质干细胞标志物的表达实施了确认试验。其结果，所有细胞中显现出CD90阳性、CD45阴性、软骨分化能力，因此能够确认这些细胞为滑膜来源间充质干细胞。
[表1]
Figure BDA0004016918560000141
＜结果的解释＞
从表1所示的结果明确可知，对于细胞产量，滑膜组织的重量不是关键参数。并且，如所认知的那样，延长酶处理时间会对滑膜组织带来损伤因而应避免，实际上也可知，在与C1相比将酶处理时间延长了30分钟的C2中细胞产量显著降低。另一方面，明确可知，通过实施特意赋予由于在培养基中存在血清而被认为不必要的清洗工序并且进一步延长酶处理时间的组合，能够实现如J1～J5那样大量增加细胞产量。并发现了在由滑膜组织制造细胞的工序中迄今为止未能纳入的上述2个工序非常重要。此外，借由上述制造而获得的J1～J5细胞产量大幅超过被认为治疗所需的1.0×107cells，其还大幅超过即使为异体细胞也能够显现效果的细胞量(2.0×107cells)，因此认为该方法作为设想自身细胞治疗的制造滑膜来源间充质干细胞的方法具有显著的价值。
＜实施例4＞
作为J1～J5制造的滑膜来源间充质干细胞实际上是由半月板损伤患者自身的受检体制造，在制造之后作为自身细胞治疗投与到半月板损伤患者。其结果，在被投与作为J1～J5制造的滑膜来源间充质干细胞的所有半月板损伤患者中，至投与52周后为止观察到良好的症状缓解。并确认到，作为症状的评分已知的Lysholm评分(参阅下述表2)中，与治疗前进行比较，投与52周后确认到22分以上的改善，在MRI(核磁共振图像诊断)下的半月板确认中也确认到整复，显示出良好的治疗效果。
[表2]
Lysholm评分：评价由评价负责人实施。
Figure BDA0004016918560000161

Claims (18)

1.一种由滑膜组织制造滑膜来源间充质干细胞的制造方法，所述方法包括：
用酶将滑膜组织处理2小时以上；及
清洗经酶处理后的混合物直至上清液中的残留酶浓度成为0.5ng/mL以下，由此获得滑膜来源间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
酶为含有1种以上胶原蛋白酶及1种以上中性蛋白酶的混合酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
酶为Liberase，Liberase为注册商标。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，
酶处理中的酶浓度为0.01mg/ml～10mg/ml。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织源自人。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织为源自单一供体的滑膜组织。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
滑膜采集对象与滑膜来源间充质干细胞的移植对象为同一对象。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，
滑膜组织与酶的质量比例为1000:1～10:1。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，
所述清洗包括使用培养基清洗多次。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，
所述培养基为α改良Eagle最低基础培养基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法包括：将清洗后的滑膜来源间充质干细胞培养10天以上，由此使滑膜来源间充质干细胞增殖。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，
在不更换培养基的情况下进行所述10天以上的培养。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，
在含有自体血清的培养基中进行所述10天以上的培养。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，
不与除了滑膜来源间充质干细胞以外的其他细胞共培养而制造滑膜来源间充质干细胞。
15.一种关节治疗用细胞制剂的制造方法，所述方法包括：
借由权利要求1至14中任一项所述的方法制造滑膜来源间充质干细胞；及
使用所述滑膜来源间充质干细胞来制造关节治疗用细胞制剂。
16.根据权利要求15所述的关节治疗用细胞制剂的制造方法，其中，
关节治疗为半月板损伤的治疗。
17.一种滑膜来源间充质干细胞，其借由权利要求1至14中任一项所述的方法来制造。
18.一种关节治疗用细胞制剂，其借由权利要求15或16所述的方法来制造。
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