KR20240041985A - 관절증 치료제, 및 관절증 치료제의 제조 방법 - Google Patents
관절증 치료제, 및 관절증 치료제의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 관절 치료에 필수인 분자를 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 관절증 치료제, 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의하면, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는, 관절증 치료제가 제공된다.
Description
본 발명은, 관절 치료에 필수인 분자를 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 관절증 치료제, 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법에 관한 것이다.
최근, 재생 의료 기술 및 세포 치료 기술의 진보에 의하여, 자가, 동종 또는 이종의 세포를 이용한 각종 세포 치료나 연구용 세포 제품 개발이 활발히 실시되고 있다. 그중에서도 간엽계 줄기세포(mesenchymal stem cell: MSC)는, 유용한 세포 치료의 세포원으로서 기대되고 있다. 간엽계 줄기세포는 다양한 체조직으로부터 채취가 가능하고, 골수 조직(비특허문헌 1), 지방 조직(비특허문헌 2), 근육 조직(비특허문헌 3), 활막 조직(비특허문헌 4), 및 골막 조직(비특허문헌 5) 등으로부터 단리할 수 있는 것이 보고되어 있다. 특히, 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 골수 등의 다양한 간엽계 조직 유래 간엽계 줄기세포에 비하여 높은 증식능 및 연골 형성능을 갖는 것이 보고되고 있다(비특허문헌 6). 또, 특허문헌 1~3에는, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 이용하여 관절 연골 손상이나 반월판 손상을 치료하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 4에는, CD140b 등의 분자를 이용한 지아(肢芽) 간엽계 세포 집단, 연골 전구 세포 집단, 골아 전구 세포 집단의 조제 방법 및 품질 관리 방법이 기재되어 있다.
비특허문헌 1: Prockop, D.J., 1997, Science. 276:71-4
비특허문헌 2: Zuk, P.A. et al., 2002, Mol Biol Cell. 13:4279-95
비특허문헌 3: Cao et al., 2003, Nat Cell Biol. 5:640-6
비특허문헌 4: De Bari, C. et al., 2001, Arthritis Rheum. 44:1928-42
비특허문헌 5: Fukumoto, T. et al., 2003, OsteoarthritisCartilage. 11:55-64
비특허문헌 6: Sakaguchi, et al., 2005, Arthritis Rhum. 52:2521-9
세포 제품의 품질 관리에 있어서, 각 로트의 동등성 및 동일성을 담보하는 것이 과제이다. 그러나, 제품을 구성하는 세포 자체가 완전히 균일한 구성물이 아니고, 그 특징을 특정하는 것이 곤란한 점에서, 각 로트의 동등성 및 동일성을 담보하는 것은 일반적으로 곤란하다. 따라서, 제품의 품질을 관리하기 위해서는, 최종 제품의 품질 시험뿐만 아니라, 의료 기기에서 적용되어 온 QMS(Quality Management System) 개념을 도입하여, 제조 원료, 재료 관리, 제조 공정 관리, 공정 관리 시험을 기록 및 제어함으로써, 프로세스 전체에서의 관리가 실시되어 왔다. 그러나, 과학 기술의 진전에 따라, 최종 제품인 세포 자체의 특징을 동정(同定)해 가는 중요성이 높아지고 있다.
세포의 품질 관리 방법으로서는, 예를 들면, 세포종 특이적인 표면 마커를 지표로 하여, 목적으로 하는 최종 제품의 세포종을 동정하는(예를 들면, 간엽계 줄기세포인 것을 동정하는) 것이 행해지고 있다. 그러나, 이와 같은 품질 관리 방법으로 얻어지는 세포는, 치료 효과가 일정하지 않다는 우려가 있어, 아직 충분히 만족할 수 있는 것은 아니다.
지금까지 활막 줄기세포를 이용한 관절 치료제의 제조 방법이 보고되어 있다. 그러나, 치료제의 유효성을 담보하기 위한 품질 관리가 충분히 행해지고 있지 않아, 치료 효과가 일정하지 않다는 문제가 있었다. 세포 제품은 주로 세포종을 특정하기 위한 마커로 품질 관리가 행해지고 있고, 역가(力價)(유효성)에 관한 품질 관리는 행해지고 있지 않았다.
역가(유효성)를 나타내는 마커는 작용 메커니즘에 근거하여 동정되는 점에서, 본 발명에 있어서는, 세포 치료 제품의 유효성에 관한 작용 메커니즘을 해명하고, 작용 메커니즘에 근거한 마커를 동정하며, 또한 그 마커에 근거한 치료제의 제조 방법을 제공하는 것을 목표로 했다. 즉, 본 발명의 과제는, 관절 치료에 필수인 분자를 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 관절증 치료제, 및 상기 관절증 치료제의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상이, 활막 줄기세포에 의한 관절 질환의 치료의 유효성에 필수인 품질 관리 마커인 것을 알아냈다. 본 발명은 상기의 지견(知見)에 근거하여 완성한 것이다.
즉, 본 발명에 의하면, 이하의 발명이 제공된다.
<1> 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는, 관절증 치료제.
<2> 활막 유래 간엽계 줄기세포가, 인테그린 β1 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 양방의 표면 항원을 갖는, <1>에 기재된 관절증 치료제.
<3> II형 콜라겐 α1쇄를 코드하는 유전자를 갖고, 이식 후에 II형 콜라겐 α1쇄를 산생하는, <1> 또는 <2>에 기재된 관절증 치료제.
<4> FGFR3의 표면 항원을 갖는, <1> 내지 <3> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제.
<5> 관절증 치료제에 포함되는 세포 전체에 대한, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포의 비율이, 30% 이상인, <1> 내지 <4> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제.
<6> 활막 조직을 효소로 처리하는 공정 A,
효소 처리 후의 혼합물을 세정하는 공정 B,
세정 후의 혼합물에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재에서 배양하는 공정 C, 및
배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재로부터 분리하는 공정 D를 포함하는, <1> 내지 <5> 중 어느 하나에 기재된 관절증 치료제의 제조 방법.
<7> 상기 공정 B가, 효소 처리 후의 혼합물을, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 세정하는 공정인, <6>에 기재된 방법.
<8> 상기 공정 C에 있어서, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 배양하는 기간이 28일 이내인, <6> 또는 <7>에 기재된 방법.
<9> 상기 공정 D에 있어서, 간엽계 줄기세포에 세포 박리액을, 120분 이내의 시간, 작용시킴으로써 분리를 행하는, <6> 내지 <8> 중 어느 하나에 기재된 방법.
<10> 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 선별하는 공정을 더 포함하는, <6> 내지 <9> 중 어느 하나에 기재된 방법.
본 발명의 관절증 치료제는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함함으로써, 관절증에 대한 치료 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명에 의하면, 제조되는 관절증 치료제의 치료 효과의 변동을 억제할 수 있어, 제품의 치료 효과에 대한 품질 관리가 가능해진다.
도 1은, 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 인테그린 β1 저해에 의한 세포 외 기질 접착능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 2는, 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 PDGFRb 저해에 의한 세포 증식능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 3은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(전반)을 나타낸다.
도 4는, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(후반)을 나타낸다.
도 5는, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(전반)을 나타낸다.
도 6은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(후반)을 나타낸다.
도 7은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 8은, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 9는, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 10은, CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열을 나타낸다.
도 11은, CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 12는, CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열을 나타낸다.
도 13은, CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 14는, Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 15는, CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 16은, CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 17은, 인테그린 β1을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은, PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는, CD44를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 20은, Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(Col2A1KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 21은, CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD120aKO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 22는, CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD106KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 23은, FGFR3을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는, 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 PDGFRb 저해에 의한 세포 증식능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 3은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(전반)을 나타낸다.
도 4는, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(후반)을 나타낸다.
도 5는, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(전반)을 나타낸다.
도 6은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열(후반)을 나타낸다.
도 7은, Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 8은, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 9는, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 10은, CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열을 나타낸다.
도 11은, CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 12는, CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열을 나타낸다.
도 13은, CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 나타낸다.
도 14는, Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 15는, CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 16은, CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제를 조사한 결과를 나타낸다.
도 17은, 인테그린 β1을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 18은, PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는, CD44를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 20은, Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(Col2A1KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 21은, CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD120aKO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 22는, CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD106KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 23은, FGFR3을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
이하에 있어서, 본 발명의 내용에 대하여 상세하게 설명한다. 또한, 본 명세서에 있어서 "~"란 그 전후에 기재되는 수치를 하한값 및 상한값으로서 포함하는 의미로 사용된다.
본 발명의 관절증 치료제는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β(본 명세서에 있어서는 PDGFRb라고도 한다) 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함한다.
활막 유래 간엽계 줄기세포는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 일방만을 갖고 있어도 되지만, 바람직하게는, 인테그린 β1 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 양방을 갖고 있다.
활막 유래 간엽계 줄기세포는, 바람직하게는, II형 콜라겐 α1쇄를 코드하는 유전자를 갖고, 이식 후에 II형 콜라겐 α1쇄를 산생함으로써 치료 효과를 발휘할 수 있다.
활막 유래 간엽계 줄기세포는, 바람직하게는, FGFR3(fibroblast growth factor receptor 3)의 표면 항원을 갖는다.
본 발명의 관절증 치료제에 포함되는 세포 전체에 대한, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포의 비율은, 바람직하게는 30% 이상이며, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상이어도 된다.
본 발명의 관절증 치료제는,
활막 조직을 효소로 처리하는 공정 A,
효소 처리 후의 혼합물을 세정하는 공정 B,
세정 후의 혼합물에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재에서 배양하는 공정 C, 및
배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재로부터 분리하는 공정 D를 포함하는 방법에 의하여 제조할 수 있다.
<활막 조직을 효소로 처리하는 공정 A>
활막 조직은, 마취하에서 관절의 비하중 부분으로부터 채취할 수 있다.
활막 조직의 생물 유래는 특별히 한정되지 않고, 임의의 생물, 바람직하게는 포유 동물에서 유래하는 활막 조직을 사용할 수 있다. 예를 들면, 영장류(예를 들면, 침팬지, 일본 원숭이, 인간) 유래의 활막 조직을 사용할 수 있고, 특히 바람직하게는, 인간 유래의 활막 조직을 사용할 수 있다.
활막 조직은, 단일 도너 유래의 활막 조직이어도 되고, 복수의 도너에서 유래하는 활막 조직이어도 되지만, 바람직하게는 단일 도너 유래의 활막 조직이다.
인간으로의 투여를 목적으로 하여, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우, 레시피언트와 조직 적합성 항원의 타입이 일치 또는 유사한 도너로부터 채취된 활막 조직을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 활막이 채취되는 대상과, 활막 유래 간엽계 줄기세포가 이식되는 대상이, 동일 대상이다. 즉, 레시피언트 자신으로부터 채취된 활막 조직을 사용하는 것(자가 이식)이 바람직하다.
활막 조직의 채취량은, 도너의 종류, 또는 필요로 하는 활막 유래 간엽계 줄기세포의 양을 고려하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 0.1g~10g, 바람직하게는 0.1g~2.0g, 보다 바람직하게는 0.1g~1.5g, 더 바람직하게는 0.1g~1.0g의 활막 조직으로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포를 얻을 수 있다. 채취한 활막 조직은, 필요에 따라 가위 등으로 세단(細斷)한 후, 이후에 기재하는 효소 처리에 제공된다.
활막 조직은 효소로 처리한다.
효소로서는, 프로테아제를 포함하는 효소이면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는, 1종 이상의 콜라게나제와 1종 이상의 중성 프로테아제를 포함하는 혼합 효소이다. 특히 바람직한 효소는, 리베라제(등록 상표)이다. 리베라제(등록 상표)로서는, 예를 들면, 리베라제 MNP-S(로슈제)를 사용할 수 있지만, 이것은 콜라게나제 클래스 I과 콜라게나제 클래스 II와 중성 프로테아제(서모리신)를 포함하는 효소이다.
효소 반응은, 효소를 포함하는 수용액 중에서 행할 수 있고, 인간 혈청을 포함하는 수용액을 이용해도 된다. 인간 혈청은, 자기의 혈청이어도 되고, 동종 이형(異型)의 혈청이어도 되지만, 바람직하게는 자기의 혈청이다.
효소 처리에 있어서의 효소 농도는, 바람직하게는 0.01mg/ml~10mg/ml이고, 보다 바람직하게는 0.1mg/ml~10mg/ml이며, 더 바람직하게는 0.5mg/ml~10mg/ml이고, 보다 더 바람직하게는 0.5mg/ml~5.0mg/ml이며, 특히 바람직하게는 0.5mg/ml~2.0mg/ml이고, 가장 바람직하게는 0.7mg/ml~2.0mg/ml이다.
활막 조직과 효소의 질량 비율은, 바람직하게는 1000:1~10:1이고, 보다 바람직하게는 500:1~20:1이며, 더 바람직하게는 200:1~40:1이다.
효소 반응은, 바람직하게는 15℃ 내지 40℃, 보다 바람직하게는 20℃ 내지 35℃, 더 바람직하게는 25℃ 내지 35℃의 온도에서 행할 수 있다.
반응 시간은, 2시간 이상이면 되고, 보다 바람직하게는, 2.5시간 이상, 더 바람직하게는 3시간 이상이다. 반응 시간의 상한은 특별히 한정되지 않지만, 10시간 이내, 9시간 이내, 8시간 이내, 7시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 또는, 4시간 이내여도 된다.
효소 처리된 혼합물에는, 활막 유래 간엽계 줄기세포가 포함되어 있다.
효소 처리된 혼합물은, 셀 스트레너를 통과시켜 원심관에 옮기고, 원심 처리함으로써 활막 유래 간엽계 줄기세포를 회수할 수 있다.
<효소 처리 후의 혼합물을 세정하는 공정 B>
공정 B에 있어서는, 효소 처리 후의 혼합물을 세정한다.
공정 B에 있어서는, 바람직하게는, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 세정할 수 있다. 상등액 중의 잔존 효소 농도는, 보다 바람직하게는 0.3ng/mL 이하이며, 더 바람직하게는 0.2ng/mL 이하이고, 특히 바람직하게는 0.1ng/mL 이하이다.
세정은, 상기한 원심 처리에 의하여 회수한 활막 유래 간엽계 줄기세포를 배지에 재현탁하고, 재차 원심(400g으로 5분간 등)함으로써 행할 수 있다. 배지로서는, α 개변 이글 최소 필수 배지(αMEM)를 이용할 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다. 세정은, 상기와 같이 배지를 이용하여 복수 회(2회 이상) 행해도 된다.
<세정 후의 혼합물에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재에서 배양하는 공정 C>
공정 C에 있어서는, 세정 후의 혼합물에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재에서 배양한다.
기재로서는, 배양 플레이트 등의 평면 플라스틱 기재, 및 배양 백, 마이크로 캐리어 또는 젤 등의 입체 기재 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
배양에 있어서 사용하는 배지는, 통상의 동물 세포의 배양에 이용되는 배지를 기초 배지로서 조제할 수 있다. 통상의 동물 세포의 배양에 이용되는 배지로서는, αMEM, DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium), DMEM과 F12의 혼합 배지(DMEM:F12=1:1), RPMI 배지(GIBCO(등록 상표) RPMI1640 배지 등), DMEM/F12와 RPMI의 혼합 배지(DMEM/F12:RPMI=1:1) 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되지 않는다.
배지로서는, 혈청을 포함하는 배지여도 되고, 혈청을 포함하지 않는 배지여도 된다. 생체로의 투여를 목적으로 하여, 자기의 조직으로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우에는, 배지는, 동종 혈청을 함유하는 것이어도 된다. 즉, 인간으로의 투여를 목적으로 하여, 인간의 조직으로부터 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제조하는 경우에는, 인간 혈청을 포함하는 배지를 사용해도 된다. 혈청을 사용하는 경우, 자기의 혈청이어도 되고, 동종 이형의 혈청이어도 되지만, 바람직하게는 자기의 혈청이다. 혈청을 사용하는 경우에는, 배지에 있어서의 혈청의 첨가량은, 예를 들면, 20체적% 이하, 10체적% 이하, 또는 5체적% 이하이다.
세포의 배양 조건은 특별히 한정되지 않고, 통상의 세포 배양의 조건을 채용할 수 있다. 예를 들면, 온도 30~40℃, 3~7% CO2에서의 배양을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 일례로서는, 온도 37℃, 5% CO2에서의 배양을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, 배양은, 배지 교환 없이 행하는 것이 바람직하다. 또, 상기한 배양에 있어서는, 활막 유래 간엽계 줄기세포 이외의 다른 세포와 공배양(共培養)되지 않고, 활막 유래 간엽계 줄기세포가 제조되는 것이 바람직하다.
활막 유래 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화는, 배양 기간이 길어질수록 진행되고, 따라서 배양 기간이 특정 길이를 초과하면 활막 유래 간엽계 줄기세포의 in situ에서의 연골 형성능은 저하되는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 본 발명에 있어서는, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 미분화의 상태에서, 그리고 양호한 in situ 연골 형성능을 갖는 상태에서 증식시키기 위하여, 배양 기간을 조정하는 것이 바람직하다. 공정 C에 있어서, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 배양하는 기간이 28일 이내인 것이 바람직하다.
또, 본 발명에 있어서는, 연골 손상부를 덮고, 또한 환부를 재생시키기 위하여 충분한 수의 미분화 활막 줄기세포를 준비할 필요성을 고려하는 것이 필요하다. 따라서, 배양 기간은, 5일간 이상, 7일간 이상, 또는 10일간 이상인 것이 바람직하고, 10~14일간, 10~21일간, 또는 10~28일간이 보다 바람직하며, 10~21일간이 더 바람직하다.
간엽계 줄기세포를, 트랜스포밍 증식 인자 β3(TGF-β3), 덱사메타손, 골형성 인자 2(BMP-2)를 첨가한 연골 형성 배지 중에서 배양함으로써, 연골 세포로 분화하여, in vitro로 연골 조직을 제작하는 것이 가능하다는 것이 알려져 있다. 따라서, 본 발명에서는, 활막 유래 간엽계 줄기세포가 연골 세포로 분화하지 않도록 하기 위해서는, TGF-β3, 덱사메타손, 또는 BMP-2의 비존재하에서, 단리한 활막 유래 간엽계 줄기세포를 배양하는 것이 바람직하다.
활막 유래 간엽계 줄기세포는, in vitro에서의 간엽계 줄기세포의 계대(繼代)수와 반비례하여, in situ 연골 형성능이 저하되는 것도 알려져 있다. 따라서, 미분화의 간엽계 줄기세포를 조제하기 위해서는, 초대 혹은 제1 계대에서의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서는, 자가 치료에 있어서 사용하는 혈청은 자기 유래이며, 자가 치료에 있어서 도너로부터 채취할 수 있는 혈청의 양은 한정되어 있고, 또, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 증식의 관점에서 일정 이상의 세포 밀도가 필요하기 때문에, 효소 처리 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를, 100세포/cm2 이상 5000세포/cm2 이하, 200세포/cm2 이상 5000세포/cm2 이하, 500세포/cm2 이상 5000세포/cm2 이하, 500세포/cm2 이상 2500세포/cm2 이하, 또는 500세포/cm2 이상 2000세포/cm2 이하의 세포 밀도로 파종하여, 배양하는 것이 바람직하다. 또, 효소 처리 후에 활막 유래 간엽계 줄기세포를 증식시키기 위하여, 10일간 이상 배양하는 것이 보다 바람직하다.
배양 종료 시에 얻어지는 세포수는, 1.0×107세포 이상, 2.0×107세포 이상, 2.5×107세포 이상, 또는, 3.0×107세포 이상인 것이 바람직하고, 4.0×107세포 이상인 것이 보다 바람직하며, 5.0×107세포 이상인 것이 더 바람직하고, 6.0×107세포 이상인 것이 특히 바람직하다.
<배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재로부터 분리하는 공정 D>
공정 D에 있어서는, 배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재로부터 분리한다. 공정 D에 있어서는, 바람직하게는, 간엽계 줄기세포에 세포 박리액을, 120분 이내의 시간, 작용시킴으로써 분리를 행할 수 있다. 세포 박리액으로서는, 트립신 유사 효소와 EDTA를 포함하는 용액이다. 특히 바람직한 효소는 TrypLE이다. TrypLE로서는, 예를 들면, TrypL Express(Gibco사제), TrypLE Select(gibco사제) 등을 사용할 수 있다.
간엽계 줄기세포에 세포 박리액을 작용시키는 시간은, 충분히 세포를 박리시키는 관점에서, 10분간 이상 행하는 것이 바람직하다. 간엽계 줄기세포에 세포 박리액을 작용시키는 시간은, 10분간~120분간인 것이 바람직하고, 10분간~60분간 이내의 시간인 것이 더 바람직하다. 10분간~50분간, 10분간~40분간, 20분간~60분간, 20분간~50분간, 또는, 20분간~40분간이어도 된다.
간엽계 줄기세포란, 중배엽성 조직(간엽)에서 유래하는 체성(體性) 줄기세포이다. 간엽계 줄기세포는 골수, 활막, 골막, 지방 조직, 근육 조직에 존재하는 것이 알려져 있고, 또한 골아 세포, 연골 세포, 지방 세포, 및 줄기세포로 분화하는 능력을 갖는 것이 알려져 있다. 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화에 관련하여, BMP 또는 TGF-β를 배양액에 첨가함으로써, 미분화 간엽계 줄기세포의 연골 세포로의 분화가 촉진되고, 또한 연골 조직이 in vitro 조건하에서 재생할 수 있는 것이 알려져 있다.
간엽계 줄기세포는, 간엽계 줄기세포에 특징적인 분자, 예를 들면 효소, 리셉터, 저분자 화합물 등을 검출하여 확인할 수 있다. 간엽계 줄기세포에 특징적인 분자로서는, 세포 표면 마커(포지티브 마커)인 CD73, CD90, CD105, CD166 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또, 간엽계 줄기세포에는 발현되어 있지 않는 네거티브 마커로서는, CD19, CD34, CD45, HLA-DR, CD11b, CD14 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, CD는, Clusters of differentiation의 약어이며, HLA-DR은, human leukocyte antigen-D-related의 약어이다. 이들의 포지티브 마커 및 네거티브 마커를 이용하여, 간엽계 줄기세포인 것을 확인할 수 있다. 이들 마커의 검출에는 면역학적 방법을 이용할 수 있지만, 각 분자의 mRNA양의 정량에 의하여 검출을 실시해도 된다.
본 명세서에 있어서 활막 유래 간엽계 줄기세포란, 활막에 포함되는 줄기세포이다. 활막 유래 간엽계 줄기세포는 간엽계 줄기세포의 일종이다. 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 예를 들면, CD90 양성, CD45 음성, 연골 분화능을 검출함으로써 검출할 수 있지만, 검출 방법은 특별히 한정되지 않는다.
상기 방법에 의하여 제조된 활막 유래 간엽계 줄기세포를, 관절증 치료제로 하는 경우에는, 통상의 방법에 의하여, 상기 세포를 의약적으로 허용되는 담체와 혼합하는 등 하여, 개체로의 투여에 적합한 형태의 제제(製劑)로 하면 된다. 담체로서는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약(예를 들면, D-소비톨, D-만니톨, 염화 나트륨 등)을 더하여 등장으로 한 주사용 증류수를 들 수 있다. 또한, 완충제(예를 들면, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제(예를 들면, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글라이콜 등), 보존제, 산화 방지제 등을 배합해도 된다.
본 발명의 관절증 치료제의 제조 방법은, 바람직하게는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 선별하는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 선별하는 공정으로서는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨을 관리하는 것을 들 수 있다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨이란, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 유전자 또는 단백질의 발현량을 말한다. 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨은, 절댓값 또는 상댓값(비교 대조 또는 기준 발현량과의 비율이나 차 등)으로서 산출할 수 있다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨은, 당업자에게 공지의 임의의 방법에 의하여 측정할 수 있고 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 발현 레벨의 측정으로서는, 유전자의 전사 산물인 mRNA양을 측정해도 된다. mRNA양의 측정은, 원하는 mRNA양을 측정할 수 있는 방법이면 특별히 한정되지 않고, 공지의 방법으로부터 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 예를 들면, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β를 코드하는 유전자에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 한 유전자 증폭법, 또는, 특정 단백질 분자를 코드하는 유전자에 하이브리다이즈하는 올리고(폴리)뉴클레오타이드를 프로브로 한 하이브리다이제이션법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, RT-PCR(역전사 폴리머라제 연쇄 반응)법, 리얼타임 RT-PCR법, DNA 마이크로 어레이법, 셀 어레이법, 노던 블롯법, 도트 블롯법, RN아제 프로텍션 어세이법 등을 들 수 있다.
상기의 측정 방법에 이용하는 프라이머나 프로브는, 표지하고, 상기 표지의 시그널 강도를 조사함으로써 mRNA양을 측정할 수 있다. 리얼타임 RT-PCR법은 RNA를 직접 샘플에 사용할 수 있고, 유전자 증폭 과정을 광학적으로 측정함으로써 증폭에 필요한 온도 사이클의 횟수로부터 유전자 정량이 가능한 점에서 바람직하다. 또, 컨트롤로서, 하우스키핑 유전자인 글리셀알데하이드-3-인산 데하이드로게나아제(GAPDH)나, 베타 액틴 등의 mRNA의 발현량을 이용하여, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β를 코드하는 유전자의 발현량을 표준화할 수 있다. 또한, 상기의 측정 방법에 이용하는 프라이머 및 프로브는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β를 코드하는 유전자의 염기 배열의 정보에 근거하여 당업자라면 적절히 설계하고, 조제할 수 있다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨의 측정은, 예를 들면, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β에 대한 항체 또는 항체 단편을 이용하여 면역학적으로 측정하는 방법을 이용할 수 있다. 구체적으로는, 플로 사이토메트리, 웨스턴 블로팅법, 효소 면역 측정법(ELISA), 방사선 면역 측정법(RIA), 형광 항체법, 셀 어레이법 등을 들 수 있다. 이들 측정 방법에 대해서도, 통상의 프로토콜, 또는 통상의 프로토콜을 적절히 수정·변경한 프로토콜에 의하여 실시할 수 있다.
예를 들면, 플로 사이토메트리에 의하여 세포에 있어서의 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨을 측정하는 경우에는, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 양성률이, 바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상인 경우에, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포로서 선별할 수 있다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 선별할 때에는, 예를 들면, 상기의 방법으로 측정한 세포에 있어서의 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨과, 미리 정한 기준 발현량을 비교함으로써 행할 수 있다. 기준 발현량으로서는, 예를 들면, 일정한 품질을 갖는 것이 이미 확인되어 있는 세포(포지티브 컨트롤)에 있어서의 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨이어도 되고, 일정한 품질을 갖고 있지 않은 것이 이미 확인되어 있는 세포(네거티브 컨트롤)의 발현 레벨이어도 된다.
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨과, 기준 발현 레벨의 비교에 의하여, 세포에 있어서의 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨이 포지티브 컨트롤의 발현량과 동등 이상인 경우의 세포를 선별하여, 관절증 치료제로서 사용할 수 있다.
또, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨의 컷 오프값을 미리 설정해 두고, 세포에 대하여 측정한 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨과 컷 오프값을 비교해도 된다. 컷 오프값은, 예를 들면, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현량과, 치료 효과의 상관관계를 나타내는 회귀 직선에 근거하여, 원하는 치료 효과를 부여하는 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨로 할 수 있다. 예를 들면, 세포에 있어서의 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 발현 레벨이 컷 오프값 이상인 경우의 세포를 선별하여, 관절증 치료제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 관절증 치료제는, 관절 치료를 위하여 사용할 수 있다. 관절 치료로서는, 관절의 손상, 손해 또는 염증을 수반하는 질환의 치료를 들 수 있으며, 연골 등의 결합 조직의 변성 및/또는 염증으로부터 일어나는 관절 질환, 또는 비염증성의 관절 질환의 치료를 들 수 있다. 관절 치료로서는, 예를 들면, 반월판 손상, 외상성 연골 손상, 이단성(離斷性) 골 연골염, 무부성골 괴사, 변형성 관절증(예를 들면, 변형성 무릎 관절증), 관절 류머티즘(예를 들면, 만성 관절 류머티즘), 통풍, 반응성 관절염, 건선성 관절염, 약년성 관절염, 염증성 관절염, 관절 연골 결손으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 들 수 있지만, 이들 질환에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 관절증 치료제를 이용한 관절의 치료 방법은,
연골 손상부 또는 반월판 손상부를 활막 유래 간엽계 줄기세포에 의하여 덮도록, 본 발명의 관절증 치료제를 이식하는 공정; 및
관절증 치료제에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 연골 세포로 분화시킴으로써, 연골 손상부 또는 반월판 손상부에서 in situ로 연골 조직을 재생시키는 공정을 포함한다.
본 발명의 관절증 치료제를 환자에게 이식할 때, 연골 손상부 또는 반월판 손상부를 효율적으로 치료하기 위해서는, 연골 손상부 또는 반월판 손상부당, 2.0×107~1.0×1011개, 또는, 2.5×107~1.0×1011개, 또는, 3.0×107~1.0×1011개, 4.0×107~1.0×1011개, 또는, 2.5×107~1.0×1010개, 또는, 2.5×107~1.0×109개, 또는, 2.5×107~1.0×108개의 활막 유래 간엽계 줄기세포, 혹은 2.0×107~1.0×108개의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 적용하는 것이 바람직하다.
활막 유래 간엽계 줄기세포를 연골 손상부 또는 반월판 손상부에 이식함으로써, 연골 손상부 또는 반월판 손상부는 활막 유래 간엽계 줄기세포로 덮인다. 활막 유래 간엽계 줄기세포의 이식은, 관혈적 수술에 의하여, 또는 관절 경시하 수술에 의하여 행할 수 있다. 침습을 가능한 한 작게 하기 위하여, 관절 경시하에 활막 유래 간엽계 줄기세포를 이식하는 것이 바람직하다.
연골 손상부 또는 반월판 손상부는, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 현탁액으로 덮여도 되고, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 세포 시트로 덮여도 된다. 예를 들면, 젤라틴이나 콜라겐 등의 생체 흡수성의 젤을 젤상 물질로서 사용할 수 있다. 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 연골 손상부나 반월판 손상부에 접착하는 능력이 높다.
연골 손상의 치료의 경우, 본 발명의 저침습성 수기(手技)는, 활막 유래 간엽계 줄기세포에 의하여 연골 손상부를 덮는 것을 특징으로 하고 있으며, 이하의 스텝:
연골 손상부를 상방을 향하도록 체위를 유지하는 것;
활막 유래 간엽계 줄기세포의 세포 시트, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 현탁액, 또는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는 젤상 물질을 연골 손상부의 표면에 정치하는 것; 그리고
특정 시간 체위를 유지하여, 그로써 활막 유래 간엽계 줄기세포를 연골 손상부의 표면에 접착시키는 것을 포함한다.
반월판 손상의 치료의 경우, 본 발명의 저침습성 수기는, 활막 유래 간엽계 줄기세포에 의하여 반월판 손상부를 덮는 것을 특징으로 하고 있으며, 이하의 스텝:
반월판 손상부가 아래를 향하도록 체위를 유지하는 것;
활막 유래 간엽계 줄기세포의 현탁액을 무릎 관절 내에 주사하는 것; 그리고
특정 시간 체위를 유지하여, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 반월판 손상부에 접착시키는 것을 포함한다.
연골 손상부 혹은 반월판 손상부의 표면에 활막 유래 간엽계 줄기세포를 확실히 접착시키기 위하여, 이식한 활막 유래 간엽계 줄기세포를, 연골 손상부 혹은 반월판 손상부의 표면에 적어도 10분간, 바람직하게는 15분간, 유지한다. 이것을 실현하기 위하여, 연골 손상부 또는 반월판 손상부를 상방을 향하게 하는 것, 그리고 상방을 향한 연골 손상부 또는 반월판 손상부에 활막 유래 간엽계 줄기세포를 유지하는 것을 목적으로 하여, 체위를 적어도 10분간, 바람직하게는 15분간 유지한다.
활막 유래 간엽계 줄기세포를 수반하는 연골 손상부나 반월판 손상부를 추가로, 활막 유래 간엽계 줄기세포의 연골 손상부 또는 반월판 손상부에 대한 접착을 보다 강고하게 하기 위하여, 골막으로 덮을 수 있다. 활막 유래 간엽계 줄기세포를 연골 손상부의 표면이나 반월판 손상부의 표면에 적어도 10분간 유지한 후 수술은 완료된다.
본 발명에 있어서, 이식한 활막 유래 간엽계 줄기세포는, 연골 손상부나 반월판 손상부에서 연골 세포로 분화하고, 또한 연골 손상부 또는 반월판 손상부에서 in situ로 연골 조직을 재생한다.
활막 유래 간엽계 줄기세포의 in situ에서의 연골 형성 과정의 사이, 국소 미소 환경(영양 공급 및 사이토카인 환경 등)에 따라, 연골 조직이 재생되기 때문에, 외부로부터의 조작은 필요로 하지 않는다. 활막 유래 간엽계 줄기세포의 in situ 연골 형성의 결과, 연골 조직이 연골 손상부 또는 반월판 손상부에서 재생되어, 손상을 수복하고, 또한 연골 손상의 경우에는 뼈 영역, 연골과 뼈와의 경계, 연골 중심부, 표면 영역, 그리고 원래의 연골에 인접하는 영역이 원래의 연골 조직으로서 형성되거나 또는 반월판 손상의 경우에는 반월판 연골이 형성된다.
이하의 실시예에 의하여 본 발명을 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
<실시예 1> 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 제작
래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 수립에 LEW/CrlCrlj 래트를 이용했다. 아이소플루레인 마취하에서 채취한 활막 조직은 αMEM no nucleosides(Gibco Cat. No. 12561056) 배지에 대하여, 2 또는 3mg/mL의 농도가 되도록 CollagenaseV(Sigma Cat. No. C9263)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 냉각한 배지를 첨가하여 반응을 멈추고, 40μm의 셀 스트레너에 통과시켜, 잔사 조직을 제거했다. 회수한 세포를 세포 배양 플라스크에 파종하고, 종농도 20%가 되도록 Fetal Bovine Serum(Gibco Cat. No. 10270106), 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L(Gibco Cat. #25030081) 및 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100X)(Gibco Cat. No. 15240062)을 더한 αMEM no nucleosides로 CO2 농도 5%, 37℃에서 배양했다. 8일간 배양 후, 플라스크 내의 배지를 파기하고 PBS(인산 완충 생리 식염수)로 2회 세정한 후, TrypLE Express(Gibco Cat. No. 12604-013)를 첨가하고, 37℃의 인큐베이터에서 5분간 정치, 세포를 활막 유래 간엽계 줄기세포로서 회수했다. 원심에 의하여 상등액을 파기, COS-banker(COSMO BIO Cat. No. COS-CFM01)로 치환하여, 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 동결의 스톡을 제작했다.
<실시예 2> 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 인테그린 β1 저해에 의한 세포 외 기질 접착능 억제
인테그린 β1을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 실시예 1에서 제작한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 동결 스톡을 기면(起眠)하고, 종농도 20%가 되도록 Fetal Bovine Serum, 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L 및 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100X)을 더한 αMEMno nucleosides를 이용하여, CO2 농도 5%, 37℃에서 1주간 배양하고, 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다. 세포수 5×106cell당 12μg의 Purified anti-mouse/rat CD29 Antibody(BioLegend Cat. No. 102202)를 첨가하고, 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후 세포를 회수했다(인테그린 β1-rSMSC). 인테그린 β1 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Purified Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl(BioLegend Cat. No. 400902)을 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 세포를 회수했다(IgG-rSMSC). 또, 반응 용매만으로의 동일한 반응을 행한 미처리 세포(Non-treated-rSMSC)를 마련하여, 이하의 접착 처리에 제공했다.
인테그린 β1이 저해되어 있는 것을 확인하기 위하여, 인테그린 β1의 기능 중 하나인 세포 외 기질에 대한 접착 기능에 대하여 확인을 행했다. 세포 외 기질 접착 반응으로서 10mmol/L MgCl2·6H2O 함유 PBS(이하 PBS(+))로 세정을 행하고, 재차 세포를 PBS(+)로 현탁하여, 1×105cells/10μL/well이 되도록 조정하여 Collagen Type I Cellware 8-Well Culture Slide(Corning Cat. No. 354630)에 파종했다. 10분간 실온에서 정치 후, PBS(+)로 세정했다. 그 후, 현미경(OLIMPUS Cat. No. IX71) 대물 렌즈 10배로 관찰을 행했다. 또 접착 세포가 가장 많이 보인 개소 1시야의 화상을 취득하여, 접착 세포수의 계측을 행했다.
결과를 도 1에 나타낸다. 접착 세포수는 Non-treated-rSMSC로 1637cells, IgG-rSMSC로 1214cells, 인테그린 β1-rSMSC로 194cells이며, 세포의 인테그린 β1 저해에 의하여 접착 세포수의 대폭적인 감소가 보였다. 이 점에서 Purified anti-mouse/rat CD29 Antibody로 처리함으로써, 래트 활막 줄기세포 중의 인테그린 β1을 저해할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 3> 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 PDGFRb 저해에 의한 세포 증식능 억제
PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 실시예 1에서 제작한 동결 스톡을 기면, 종농도 20%가 되도록 Fetal Bovine Serum, 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L 및 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100X)을 더한 αMEM no nucleosides를 이용하여, CO2 농도 5%, 37℃에서 1주간 배양하고, 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다.
세포수 1×106cells당 40, 120μg의 Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly(R&D Systems Cat. No. AF385)를 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 96웰 플레이트(Corning Cat No. 353072)에 1000cells/well로 세포를 파종하고 CO2 농도 5%, 37℃에서 배양을 개시했다(PDGFRb-rSMSC). PDGFRb 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Normal Goat IgG Control(R&D Systems Cat. No. AB-108-C)을 빙랭하에서 1시간 반응시켜 96웰 플레이트에 1000cells/well로 파종했다(IgG-rSMSC). 또 반응을 행하지 않고 96웰 플레이트에 1000cells/well 세포를 파종하기만 한 Non-treated-rSMSC도 마련했다.
PDGFRb가 저해되어 있는 것을 확인하기 위하여, PDGFRb의 기능인 세포 증식능에 대하여 확인을 행했다. CO2 농도 5%, 37℃에서 배양하고 배양 6일째에 Cell Titer Glo(Promega Cat. No. G7571)를 이용한 ATPassay에 의하여 세포의 증식성을 정량적으로 평가했다.
결과를 도 2a에 나타낸다. 40μg/mL PDGFRb-rSMSC의 ATP 농도가 3.78±0.84μmol/L, 120μg/mL PDGFRb-rSMSC의 ATP 농도가 4.12±1.29μmol/L, IgG-rSMSC가 6.08±0.63μmol/L, Non-treated-rSMSC가 6.81±0.82μmol/L이며, PDGFRb 저해에 의하여 세포 증식의 대폭적인 억제가 보였다. 이 점에서 Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly로 처리함으로써 래트 활막 줄기세포의 증식을 억제할 수 있는 것이 확인되었다.
PDGFRb의 리간드 특이성을 확인하기 위하여, PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 실시예 1에서 제작한 동결 스톡을 기면, 종농도 20%가 되도록 Fetal Bovine Serum, 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L 및 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100X)을 더한 αMEMno nucleosides를 이용하여, CO2 농도 5%, 37℃에서 1주간 배양하고, 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다.
세포수 1×106cells당 10, 20, 40μg의 Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly(R&D Systems Cat. No. AF385)를 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 96웰 플레이트(Corning Cat No. 353072)에 1000cells/well로 세포를 파종하고, CO2 농도 5%, 37℃에서 배양을 개시했다(PDGFRb-rSMSC). PDGFRb 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Normal Goat IgG Control(R&D Systems Cat. No. AB-108-C)을 빙랭하에서 1시간 반응시켜 96웰 플레이트에 1000cells/well로 파종했다(IgG-rSMSC). 또 반응을 행하지 않고 96웰 플레이트에 1000cells/well 세포를 파종하기만 한 Non-treated-rSMSC도 마련했다.
세포 파종 익일, 배양 상등을 파기하고, 종농도 0.5%가 되도록 Fetal Bovine Serum, 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L, 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100X), 4ng/mL가 되도록 PDGF-BB, Rat, Recombinant(R&D systems Cat. No. 520-BB-050)를 더한 αMEMno nucleosides(Gibco Cat. No. 10270106)로 배지를 교환했다. 실험 수준에는, 종농도 10, 20, 40μg/mL가 되도록 Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly(R&D Systems Cat. No. AF385)를 더하고, 배지의 총량을 100μL로 했다. 양성 대조에는 Normal Goat IgG Control(R&D Systems Cat. No. AB-108-C)을 더하고, 배지의 총량을 100μL로 했다. 음성 대조에는 항체를 더하지 않고, 배지 100μL만을 더했다. 배양 6일째에 Cell Titer Glo(Promega Cat. No. G7571)를 이용한 ATP assay에 의하여 세포의 증식성을 정량적으로 평가했다.
결과를 도 2b에 나타낸다. 10μg/mL PDGFRb-rSMSC의 ATP 농도가 0.62±0.12μmol/L, 20μg/mL PDGFRb-rSMSC의 ATP 농도가 0.65±0.05μmol/L, 40μg/mL PDGFRb-rSMSC의 ATP 농도가 0.24±0.05μmol/L, IgG-rSMSC가 0.49±0.17μmol/L, Non-treated-rSMSC가 0.24±0.11μmol/L이며, 40μg/mL PDGFRb-rSMSC는 IgG-rSMSC에 대하여 유의(有意)한 세포 증식의 감소가 보였다. 이 점에서, Anti-PDGF Receptorβ Human Goat-Poly로 처리함으로써, 래트 활막 줄기세포 중의 PDGFRb를 리간드 특이적으로 저해할 수 있는 것이 확인되었다.
<실시예 4> Col2A1 결실 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 제작
실시예 1에서 제작한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여 Col2A1의 유전자의 결실 조작을 실시하여, 생어 시퀀스 해석에 의하여 Col2A1 유전자의 결실을 확인했다. Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)과 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열을 도 3, 도 4, 도 5 및 도 6에, 그 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 도 7, 도 8 및 도 9에 나타낸다. Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 Col2A1 염기 배열을 배열 번호 1에 나타내고, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 편방의 염색체의 Col2A1 염기 배열을 배열 번호 2에 나타내며, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 다른 편방의 염색체의 Col2A1 염기 배열을 배열 번호 3에 나타낸다. Col2A1 유전자 야생형(Col2A1WT-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 4에 나타내고, Col2A1 유전자 결실형(Col2A1KO-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 5 및 6에 나타낸다. 그 결과, Col2A1KO-rSMSC에서는, 아미노산 번역 개시 코돈인 ATG를 기점으로 하여 55번째부터 62번째까지의 염기를 결실한 DNA와 59번째의 염기에 삽입을 갖는 헤테로의 프레임 시프트 변이체인 것을 알 수 있었다. 편방의 대립 유전자는 염기의 결실에 의하여 19번째의 아미노산부터 배열에 변이가 발생하고, 29번째에 스탑 코돈이 들어가는 점에서, 본래이면 1419아미노산인데, 28아미노산 잔기의 변이체가 번역되는 염기 배열인 것을 알 수 있었다. 다른 편방의 대립 유전자는, 염기의 삽입에 의하여 20번째의 아미노산부터 배열에 변이가 발생하고, 50번째에 스톱 코돈이 들어가는 점에서, 본래이면 1419아미노산인데, 49아미노산 잔기의 변이체가 번역되는 염기 배열인 것을 알 수 있었다. 이 변이체를 나타내는 염기 배열은, Col2A1의 중요 기능 도메인인 삼중 나선 구조 도메인인 133번째의 아미노산부터 1146번째의 아미노산의 배열이 번역되지 않는 점에서, Col2A1의 기능이 결실된 유전자 배열을 갖는 활막 줄기세포(Col2A1KO-rSMSC)의 취득을 할 수 있었다고 판단했다.
<비교예 1> CD120a 결실 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 제작
실시예 1에서 제작한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여 CD120a의 유전자의 결실 조작을 실시하여, 생어 시퀀스 해석에 의하여 CD120a 유전자의 결실을 확인했다. CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열 및 그 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 도 10과 도 11에 나타낸다. CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)과 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD120a 염기 배열을 배열 번호 7에 나타내고, CD120a 유전자 야생형(CD120aWT-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 8에 나타내며, CD120a 유전자 결실형(CD120aKO-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 9에 나타낸다. 그 결과, CD120aKO-rSMSC에서는, 아미노산 번역 개시 코돈인 ATG를 기점으로 하여 16번째의 염기를 결실한 DNA를 갖는 프레임 시프트 변이체인 것을 알 수 있었다. 염기의 결실에 의하여 6번째의 아미노산부터 배열에 변이가 발생하고, 19번째에 종전 코돈이 들어가는 점에서, 본래이면 461아미노산인데, 19아미노산 잔기의 변이체가 번역되는 염기 배열인 것을 알 수 있었다. 이 변이체를 나타내는 염기 배열은, CD120a를 구성하는 단백질 영역의 배열이, 번역되지 않는 점에서, CD120a의 기능이 결실된 유전자 배열을 갖는 활막 줄기세포(CD120aKO-rSMSC)를 취득할 수 있었다고 판단했다.
<비교예 2> CD106 결실 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 제작
실시예 1에서 제작한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 대하여 CD106의 유전자의 결실 조작을 실시하여, 생어 시퀀스 해석에 의하여 CD106 유전자의 결실을 확인했다. CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열 및 그 배열에 근거하여 번역되는 아미노산 배열을 도 12와 도 13에 나타낸다. CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)과 결실형(CD106KO-rSMSC)의 래트 활막 줄기세포의 CD106 염기 배열을 배열 번호 10에 나타내고, CD106 유전자 야생형(CD106WT-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 11에 나타내며, CD106 유전자 결실형(CD106KO-rSMSC)의 아미노산 배열을 배열 번호 12에 나타낸다. 그 결과, CD106KO-rSMSC에서는, 아미노산 번역 개시 코돈인 ATG를 기점으로 하여 1059번째부터 1076번째의 염기를 결실한 DNA를 갖는 프레임 시프트 변이체인 것을 알 수 있었다. 염기의 결실에 의하여 354번째의 아미노산부터 배열에 변이가 발생하고, 356번째에 종전 코돈이 들어가는 점에서, 본래이면 739아미노산인데, 355아미노산 잔기의 변이체가 번역되는 염기 배열인 것을 알 수 있었다. 이 변이체를 나타내는 염기 배열은, CD106의 막 관통 영역인 699아미노산부터 720아미노산의 배열이 번역되지 않는 점에서, CD106의 기능이 결실된 유전자 배열을 갖는 활막 줄기세포(CD106KO-rSMSC)를 취득할 수 있었다고 판단했다.
<실시예 5> Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제
Col2A1은 연골 구성 성분의 하나이다. Col2A1 결실을 세포 기능 레벨에서 확인하기 위하여, Col2A1KO-rSMSC의 연골 분화능을 조사했다. 실시예 4에서 제작한 Col2A1KO-rSMSC 2.5×105cells를 종농도 10ng/mL가 되도록 TGF-β3(R&DSystems Cat. No. 243-B3-002), 종농도 3.92μg/mL가 되도록 Dexamethasone(Wako Cat. No.041-18861), 종농도 50μg/mL가 되도록 L-Ascorbic Acid 2-phosphate(Cayman Chemical Cat. No. 16457), 종농도 40μg/mL가 되도록 L-프롤린(MP Biomedicals Cat. No. 194728), 종농도 1μg/mL가 되도록 Sodium Pyruvate(Invitrogen Cat. No. 11360070), 종농도 1%가 되도록 ITS-X 서플리먼트(x100)(Wako Cat. No. 094-06761), 종농도 0.5μg/mL가 되도록 BMP-2(R&D Systems Cat. No. 355-BM-010)를 더한 DMEM high glucose(Thermo Cat. No. 11965092)에 현탁하고, 450g으로 10분 원심 후, CO2 농도 5%, 37℃에서 배양을 개시하여 연골 분화를 유도했다. 또 대조 세포로서, Col2A1WT-rSMSC를 동일하게 연골 분화 유도했다. 3주간 배양 후, 세포괴(細胞塊)의 직경 및 중량을 측정하고, 세포괴의 조직 염색으로부터 연골 분화능을 평가하여, 결과를 도 14에 나타낸다. Col2A1WT-rSMSC에서는 단경 1.55±0.14mm, 장경 2.04±0.25mm, 중량 1.9±0.26mg에 대하여, Col2A1KO-rSMSC는 단경 0.54±0.04mm, 장경 0.76±0.18mm, 중량 0.85±0.4mg이며, 연골 사이즈 및 중량에 유의한 감소가 보였다. Col2A1은 연골 구성 성분인 점에서, Col2A1 결실에 의하여 연골 사이즈 및 중량이 감소한 것을 알 수 있다. 또한, Col2A1KO-rSMSC에서는, 사프라닌 O-패스트 그린 염색 및 II형 콜라겐 면역 염색으로, 염색성이 소실되어 있는 것을 알 수 있었다. 즉, Col2A1 결실에 의하여 II형 콜라겐의 산생능 소실뿐만 아니라, 무코 다당의 연골 기질 산생에도 영향을 미치는 것이 나타났다. 이것은, II형 콜라겐은, 연골 조직 골격 형성뿐만 아니라, 연골 분화·기질 산생 유도 작용에도 기여하는 것을 시사하고 있다.
<비교예 3> CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제
비교예 1에서 제작한 CD120aKO-rSMSC의 연골 분화능을 조사했다. 연골 분화 유도는 실시예 5와 동일한 분화 배지 및 배양 조건에서 실시했다. 또 대조 세포로서, CD120aWT-rSMSC를 동일하게 연골 분화 유도했다. 3주간 배양 후, 세포괴의 직경 및 무게를 측정하고, 세포괴의 조직 염색으로부터 연골 분화능을 평가하여, 결과를 도 15에 나타낸다. CD120aWT-rSMSC에서는 단경 1.55±0.14mm, 장경 2.04±0.25mm, 중량 1.9±0.26mg에 대하여, CD120aKO-rSMSC는 단경 1.19±0.17mm, 장경 1.53±0.04mm, 중량 1.55±1.20mg이며 연골 사이즈 및 중량에 유의한 감소가 보이지 않았다. 또한, CD120a 결실에 의한 사프라닌 O-패스트 그린, II형 콜라겐 면역 염색의 염색성의 차이는 보이지 않았던 점에서, CD120a는 세포의 연골 분화능에 기여하지 않는 분자라고 생각된다.
<비교예 4> CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포에 있어서의 연골 분화능 억제
비교예 2에서 제작한 CD106KO-rSMSC의 연골 분화능을 조사했다. CD106KO-rSMSC 2.5×105cells의 연골 분화 유도는 실시예 5와 동일한 분화 배지 및 배양 조건에서 실시했다. 또 대조 세포로서, CD106WT-rSMSC를 동일하게 연골 분화 유도했다. 3주간 배양 후, 세포괴의 직경 및 중량을 측정하고, 세포괴의 조직 염색으로부터 연골 분화능을 평가하여, 결과를 도 16에 나타낸다. CD106WT-rSMSMC에서는 단경 1.55±0.14mm, 장경 2.04±0.25mm, 중량 1.9±0.26mg에 대하여, CD106KO-rSMSC는 단경 1.58±0.56mm, 장경 1.75±0.52mm, 중량 2.38±1.54mg이며 연골 사이즈, 중량에 유의한 감소가 보이지 않았다. 또한, CD106 결실에 의한 사프라닌 O-패스트 그린, II형 콜라겐 면역 염색의 염색성에 차이는 보이지 않았던 점에서, CD106은 세포의 연골 분화능에 기여하지 않는 분자라고 생각된다.
<실시예 6> 인테그린 β1을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과 확인
인테그린 β1을 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 실시예 2에 기재된 바와 같이 실시했다. 동결 스톡을 기면, 1주간 배양하여 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다. 세포수 5×106cell당 12μg의 Purified anti-mouse/rat 인테그린 β1 Antibody를 첨가하고, 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 이식용으로 회수했다(인테그린 β1-rSMSC). 또 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Purified Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl을 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 이식용으로 회수했다(IgG-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델의 제작에 LEW/CrlCrlj 래트를 이용했다. 반월판 손상 및 간엽계 줄기세포를 이식하는 방법은, 아이소플루레인 마취하에서 무릎 관절부 피부를 절개하여, 무릎 관절을 노출시켰다. 무릎 아래의 내측 관절포를 노출시켜, 세로 방향으로 메스로 절개하여 대퇴골 원위부의 연골을 노출시켰다. 내측 반월판을 활막으로부터 박리하고, 내측 반월판을 노출시켜, 전체의 약 2/3를 절제했다. 무릎 인대와 활막을 봉합하고, 그 후 근육을 봉합하여 반월판 손상 모델을 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, 인테그린 β1을 저해한 활막 줄기세포(인테그린 β1-rSMSC)를 5×106cell, 저해를 행하지 않는 대조 처리를 한 활막 줄기세포(IgG-rSMSC)를 5×106cell, 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다. 세포 투여 익일에 무릎당 12μg의 Purified anti-mouse/rat 인테그린 β1 Antibody, Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl 또는 용매를 관절포 내에 투여했다. 처치 후에는 모든 래트를 케이지로 되돌려, 운동 및 음식을 자유롭게 시켰다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 17에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 양성 대조인 IgG-rSMSC군에서는, 전절부(前節部)까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 반월판 재생 부분이 크게 보인다. 한편, 분자 저해 혹은 결실한 세포인 인테그린 β1-rSMSC군에서는 양성 대조에 비하여 반월판 재생 부분이 작게 보인다.
도 17의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적을 ImageJ(version1.52)를 이용하여, 다음의 식으로 면적을 산출했다.
반월판 재생 부분 면적(mm2)=반월판 재생 부분 에어리어의 픽셀수/1mm2당 픽셀수
각 군의 재생 부분 면적의 평균값, 표준 편차 및 통계학적 해석은 모두 Microsoft Excel 2007(Microsoft Corp.)로 행했다. 통계학적 해석은 양성 대조군과 분자 저해군 및 분자 저해군과 용매군의 2회 Student's T-Test를 실시하여, 각각의 P값을 산출했다. 검정을 반복하고 있는 점에서 본페로니 보정을 적용하여, 산출한 P값에 검정 횟수 (2)를 곱한 값을 채용했다. 유의 수준은 5%(α=0.05)를 차분 있음으로 하여, 그 결과를 표 1에 기재했다.
표 1에 기재된 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, 인테그린 β1-rSMSC군의 2.1mm2는 IgG-rSMSC의 3.4mm2에 대하여 유의하게 감소하고 있었다. 한편, 인테그린 β1-rSMSC군은 용매군의 1.7mm2에 대하여 동일 정도의 재생 면적이었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 인테그린 β1 분자는 반월판 재생에 기여하는 중요한 분자인 것을 확인할 수 있었다.
[표 1]
<실시예 7> PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과 확인
PDGFRb를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 실시예 3에 기재된 바와 같이 실시했다. 동결 스톡을 기면, 1주간 배양하여 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다. 세포수 5×106cell당 12μg의 Anti-PDGF ReceptorβHuman Goat-Poly(R&D Systems Cat. No. AF385)를 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 이식용으로 회수했다(PDGFRb-rSMSC). 또 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Normal Goat IgG Control(R&D Systems Cat. No. AB-108-C)을 빙랭하에서 1시간 반응시켜 이식용으로 회수했다(IgG-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델은, 실시예 6에 기재한 바와 같이 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, PDGFRb를 저해한 활막 줄기세포(PDGFRb-rSMSC)를 5×106cell, 저해를 행하지 않는 대조 처리를 한 활막 줄기세포(IgG-rSMSC)를 5×106cell, 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다. 세포 투여 익일에 무릎당 12μg의 Anti-PDGF ReceptorβHuman Goat-Poly, Normal Goat IgG Control 또는 용매를 관절포 내에 투여했다. 처치 후에는 모든 래트를 케이지로 되돌려, 운동 및 음식을 자유롭게 시켰다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 18에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 양성 대조인 IgG-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 반월판 재생 부분이 크게 보인다. 한편, 분자 저해 혹은 결실한 세포인 PDGFRb-rSMSC군에서는 양성 대조에 비하여 반월판 재생 부분이 작게 보인다.
도 18의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적에 대하여 실시예 6에 기재한 바와 같이 계측했다. 그 결과를 표 2에 기재했다. 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, PDGFRb-rSMSC군의 2.2mm2는 IgG-rSMSC의 3.2mm2에 대하여 유의하게 감소하고 있었다. 한편, PDGFRb-rSMSC군은 용매군의 1.3mm2에 대하여 유의하게 증가하고 있었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 PDGFRb 분자는 반월판 재생에 기여하는 분자인 것을 확인할 수 있었다.
[표 2]
<비교예 5> CD44를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 반월판 재생 효과 확인
CD44를 저해한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포의 조제로서, 동결 스톡을 기면, 1주간 동안 배양하여 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다. 세포수 5×106cell당 12μg의 Anti-CD44 Rabbit IgGclone Hermes-1(Absolute Antibody Cat. No. Ab00628-23.0)을 빙랭하에서 30분 반응시킨 후, 이식용으로 회수했다(CD44-rSMSC). 또 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Rabbit IgG Isotype Control(invitrogen Cat. No. 10500C)을 빙랭하에서 1시간 반응시켜 이식용으로 회수했다(IgG-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델은, 실시예 6에 기재한 바와 같이 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, CD44를 저해한 활막 줄기세포(CD44-rSMSC)를 5×106cell, 저해를 행하지 않는 대조 처리를 한 활막 줄기세포(IgG-rSMSC)를 5×106cell 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다. 세포 투여 익일에 무릎당 12μg의 Anti-CD44 Rabbit IgG clone Hermes-1, Rabbit IgG Isotype Control 또는 용매를 관절포 내에 투여했다. 처치 후에는 모든 래트를 케이지로 되돌려, 운동 및 음식을 자유롭게 시켰다.
동물은 처치로부터 4주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 19에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 양성 대조인 IgG-rSMSC군 및 CD44-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 반월판 재생 부분이 크게 보인다.
도 19의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적에 대하여 실시예 6에 기재한 바와 같이 계측했다. 그 결과를 표 3에 기재했다. 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, CD44-rSMSC군의 3.4mm2는 IgG-rSMSC의 4.0mm2와 비교하여 유의한 차분은 없고, 동일 정도였다. 한편, CD44-rSMSC군은 용매군의 2.7mm2에 대하여 유의하게 증가하고 있었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 CD44는 반월판 재생에 대하여 기여하지 않는 분자라고 생각된다.
[표 3]
<실시예 8> Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(Col2A1KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과 확인
Col2A1을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포는 실시예 4에 기재된 바와 같이, Col2A1 결실 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(Col2A1KO-rSMSC). 양성 대조로서 Col2A1 야생형 배열 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(Col2A1WT-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델은, 실시예 6에 기재한 바와 같이 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, Col2A1KO-rSMSC, Col2A1WT-rSMSC를 5×106cell 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 20에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 양성 대조인 Col2A1WT-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 반월판 재생 부분이 크게 보인다. 한편, Col2A1KO-rSMSC군에서는 양성 대조에 비하여 반월판 재생 부분이 작게 보인다.
도 20의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적에 대하여 실시예 6에 기재한 바와 같이 계측했다. 그 결과를 표 4에 기재했다. 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, Col2A1KO-rSMSC군의 2.9mm2에 비하여 Col2A1WT-rSMSC는 3.8mm2로 유의하게 증가하고 있었다. 한편, Col2A1KO-rSMSC군은 용매군의 2.1mm2에 비하여 유의하게 증가하고 있었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 Col2A1 분자는 반월판 재생에 기여하는 분자인 것을 확인할 수 있었다.
[표 4]
<비교예 6> CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD120aKO-rSMSC)의 반월판 재생 효과 확인
CD120a를 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포는 비교예 1에 기재된 바와 같이, CD120a 결실 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(CD120aKO-rSMSC). 양성 대조로서 CD120a 야생형 배열 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(CD120aWT-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델은, 실시예 6에 기재한 바와 같이 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, CD120aKO-rSMSC, CD120aWT-rSMSC를 5×106cell 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 21에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 한편, 양성 대조인 CD120aWT-rSMSC군 및 CD120aKO-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 용매군에 비하여 반월판 재생 부분이 크게 보인다.
도 21의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적에 대하여 실시예 6에 기재한 바와 같이 계측했다. 그 결과를 표 5에 기재했다. 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, CD120aKO-rSMSC군의 3.1mm2에 비하여 CD120aWT-rSMSC는 3.3mm2이며, 유의한 차분은 보이지 않았다. 한편, CD120aKO-rSMSC군은 용매군의 1.8mm2에 비하여 유의하게 증가하고 있었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 CD120a는 반월판 재생에 기여하지 않는 분자라고 생각된다.
[표 5]
<비교예 7> CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포(CD106KO-rSMSC)의 반월판 재생 효과 확인
CD106을 결실한 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포는 비교예 1에 기재된 바와 같이, CD106 결실 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(CD106KO-rSMSC). 양성 대조로서 CD106 야생형 배열 확인 후, 확대 배양으로 이식용으로 조정했다(CD106WT-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델은, 실시예 6에 기재한 바와 같이 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, CD106KO-rSMSC, CD106WT-rSMSC를 5×106cell 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 22에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 한편, 양성 대조인 CD106WT-rSMSC군 및 CD106KO-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 용매군에 비하여 반월판 재생 부분이 크게 보인다.
도 22의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적에 대하여 실시예 6에 기재한 바와 같이 계측했다. 그 결과를 표 6에 기재했다. 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, CD106KO-rSMSC군의 3.7mm2에 비하여 CD106WT-rSMSC는 3.3mm2이며, 유의한 차분은 보이지 않았다. 한편, CD106KO-rSMSC군은 용매군의 1.7mm2에 비하여 유의하게 증가하고 있었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 CD106은 반월판 재생에 기여하지 않는 분자라고 생각된다.
[표 6]
<실시예 9> 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포 수립 공정, 세포 회수 시의 처리 시간 차이와 인테그린 β1, PDGFRb 발현율
실시예 1과 동일하게, 래트 활막으로부터 세포를 단리하여, 8일간 배양으로 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포를 얻었다. 플라스크 내의 배지를 파기하고 PBS로 2회 세정한 후 TrypLE Express(Gibco Cat. No. 12604-013)를 첨가하며, 37℃의 인큐베이터에서 5, 30, 60 및 120분간 정치하여, 세포를 박리, 회수했다.
각각의 조건에서 회수한 세포 106cell을 500μL의 PBS에 현탁했다. 사(死)세포 염색을 위하여 LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit(Invitrogen Cat. No. L34957)를 0.5μL 세포 현탁액에 첨가하고, 실온에서 30분 인큐베이션했다. 원심 후 상등액을 파기하고, FACS 버퍼(종농도 2mmol/L EDTA·2Na, 1% bovine serum albumin 함유 PBS) 1mL를 첨가하여 세포를 현탁했다. 인테그린 β1의 발현율 측정을 위하여, PEanti-mouse/rat 인테그린 β1 Antibody(Biolgend Cat. No. 102207) 또는 PE Armenian Hamster IgG Isotype Ctrl Antibody(Biolgend Cat. No. 400907)를 5μL 첨가하여, 4℃, 30분 반응시켰다. 그 후, 원심하여 상등액을 파기하고 FACS 버퍼 1mL에 현탁하며, 재차 원심, 상등액 파기하고 FACS 버퍼 500μL에 현탁하여, 측정에 제공했다. PDGFRb의 발현율 측정을 위하여, Anti-PDGF Receptorβ, Human, Goat-Poly(R&D Systems Cat. No. AF385) 또는 Normal Goat IgG Control(R&D Systems Cat. No. AB-108-C)을 5μL 첨가하여, 4℃, 30분 반응시켰다. 그 후, 원심하여 상등액을 파기하여 FACS 버퍼 1mL에 현탁했다. 또한 Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, FITC(invitrogen Cat. No. A16006)를 1μL 첨가하여, 4℃, 30분 반응시켰다. 그 후, 원심하여 상등액을 파기하고 FACS 버퍼 1mL에 현탁하며, 재차 원심, 상등액 파기하고 FACS 버퍼 500μL에 현탁하며, 플로 사이토미터(Attune NxT, AutoFocusing Cytometer model: AFC2, invitrogen)에 제공하여 인테그린 β1 및 PDGFRb 발현율을 계측했다.
활막 유래 간엽계 줄기세포의 박리 처리 시간 차이에 의한 인테그린 β1 및 PDGFRb의 발현율을, 표 7에 기재한다. 박리 처리 시간을 통상의 5분부터 120분까지 연장해도, 인테그린 β1은 90% 이상의 발현율을 유지하고 있었다. 한편, PDGFRb는 시간 의존적으로 발현율이 감소하여, 5분에서 91.7%, 30분에서 76.9%, 60분에서 63.3%, 120분에서 32.8%가 되었다. 실시예 7과 같이 PDGFRb는 활막 줄기세포 중의 반월판 재생에 필요한 분자이며, 세포 박리 처리 시간에 있어서, PDGFRb 발현율이 과반수를 차지하는 경우에 반월판 재생 효과를 보다 기대할 수 있기 때문에, 처리 시간은 60분 이내가 바람직하고, 그 필요한 분자 발현율은 60% 이상으로 설정할 수 있다.
[표 7]
<실시예 10> 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포 수립 시의 세포 회수 시의 배양 일수와 인테그린 β1 발현율
실시예 1과 동일하게, 래트 활막으로부터 세포를 단리하고, 75cm2 면적의 플라스크에 7. 5×104cells를 파종하여 8, 21, 28일간 배양으로 래트 활막 유래 간엽계 줄기세포를 얻었다. 플라스크 내의 배지를 파기하고, PBS로 2회 세정한 후 TrypLE Express(Gibco Cat. No. 12604-013)를 첨가하여, 37℃의 인큐베이터에서 120분간 정치하여, 세포를 박리 회수했다. 그 후, 실시예 9와 동일하게, 사세포 및 인테그린 β1 염색 조작을 행하여, 측정에 제공했다.
활막 유래 간엽계 줄기세포의 배양 일수의 차이에 의한 인테그린 β1의 발현율을, 표 8에 기재한다. 배양 일수 의존적으로 활막 유래 간엽계 줄기세포의 인테그린 β1 발현율은 감소하여, 8일간에서 97.8%, 21일간에서 62.1%, 28일간에서 56.1%였다. 실시예 6과 같이 인테그린 β1은 활막 줄기세포 중의 반월판 재생에 필요한 분자인 점에서, 과반수의 인테그린 β1 양성률 세포가 바람직하다. 또 실시예 7과 같이, 반월판 재생에 필요한 분자 발현율을 60% 이상으로 설정할 수 있는 점에서, 배양 일수는 21일 이내가 바람직하다.
[표 8]
<실시예 11>
Articular Engineering사로부터 구입한, 인간 활막 유래 줄기세포(Cryopreserved Synoviocytes, Normal, P1 형번: CDD-H-2910-N, 로트: ST1414, ST1420, ST1434, ST1462)에 대해서도, 약효에 필수인 단백질 분자인 인테그린 β1, PDGFRb의 양성률을 플로 사이토메트리에 의하여 계측했다. 계측 기기는 Attune NxT, AutoFocusing Cytometer(model: AFC2, invitrogen)를 이용했다. 항체로서, 각각 인테그린 β1(APC Mouse Anti-Human CD29 Cat: 559883), PDGFRb(Anti-PDGF Receptorβ, Human, Goat-Poly Cat: AF385)를 이용했다.
그 결과, 인테그린 β1의 표면 항원 양성률은, 로트마다 99.4%, 99.6%, 99.6%, 99.5%였다. 또, PDGFRb의 표면 항원 양성률은, 로트마다, 92.2%, 90.7%, 95.2%, 85.9%인 것을 알 수 있었다. 이 점에서, 이 인간 활막 유래 줄기세포가 관절증 치료제로서의 치료 효과를 갖는 경우, 규격값으로서, 인테그린 β1에서는 90% 이상, PDGFRb에서는 80% 이상으로 하여 관리하는 것이 타당하다는 것을 알 수 있었다.
이와 같이, 실시예 9, 10에서의 래트 활막 유래 줄기세포뿐만 아니라, 인간 활막 유래 줄기세포에 있어서도 인테그린 β1, PDGFRb의 발현을 확인할 수 있고, 세포의 유효성 품질 관리 항목으로서 설정할 수 있는 것이 나타났다.
<실시예 12> FGFR3을 저해한 래트 활막 유래 줄기세포의 반월판 재생 효과 확인
FGFR3을 저해한 래트 활막 유래 줄기세포의 조제로서, 실시예 1에서 제작한 래트 활막 유래 줄기세포의 동결 스톡을 기면하고, 종농도 20%가 되도록 Fetal Bovine Serum, 종농도 1%가 되도록 L-glutamine 200mmol/L 및 종농도 1%가 되도록 Antibiotic-Antimycotic(100×)을 더한 αMEM no nucleosides를 이용하여, CO2 농도 5%, 37℃에서 1주간 배양하고, 회수한 세포를 반응 용매 2% FBS 함유 PBS에 현탁했다. 세포수 5×106cell당 100μg의 FGFR3 Polyclonal Antibody(Invitrogen Cat. No. PA5-34574)를 첨가하고, 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후 세포를 회수했다(FGFR3-rSMSC). FGFR3 저해를 행하지 않는 대조 처리로서 Rabbit IgG Isotype Control(Thermo Fisher Scientific Cat. No. 10500C)을 빙랭하에서 1시간 반응시킨 후, 세포를 회수했다(IgG-rSMSC).
반월판 재생 효과를 평가하기 위한 반월판 손상 모델의 제작에 LEW/CrlCrlj 래트를 이용했다. 반월판 손상 및 간엽계 줄기세포를 이식하는 방법은, 아이소플루레인 마취하에서 무릎 관절부 피부를 절개하여, 무릎 관절을 노출시켰다. 무릎 아래의 내측 관절포를 노출시켜, 세로 방향으로 메스로 절개하여 대퇴골 원위부의 연골을 노출시켰다. 내측 반월판을 활막으로부터 박리하고, 내측 반월판을 노출시켜, 전방으로부터 약 2/3를 절제했다. 무릎 인대와 활막을 봉합하고, 그 후 근육을 봉합하여 반월판 손상 모델을 제작했다. 그 후, 처치한 동물을 3군으로 분류하고, FGFR3을 저해한 활막 줄기세포(FGFR3-rSMSC)를 5×106cell, 저해를 행하지 않는 대조 처리를 한 활막 줄기세포(IgG-rSMSC)를 5×106cell, 및 용매만을 각각 관절포 내에 투여했다. 처치 후에는 모든 래트를 케이지로 되돌려, 운동 및 음식을 자유롭게 시켰다.
동물은 처치로부터 3주 후에 아이소플루레인 마취하에서 하대동맥 절단에 의한 방혈(放血)을 행하여, 안락사시켰다. 그 후, 무릎 관절로부터 반월판을 노출시키고, 내측 반월판을 적출하여 사진 촬영했다. 적출한 양 무릎 관절의 내측 반월판의 화상을 도 23에 나타낸다. 정상 반월판과의 색조 및 형상의 차이로부터 재생 부분을 특정하여, 파선으로 둘러쌌다. 음성 대조인 용매군에서는 반월판이 중절부까지의 형상을 갖는 것이 많이 차지하고 있었다. 양성 대조인 IgG-rSMSC군에서는, 전절부까지 반월판이 재생되어 있는 예가 많고, 반월판 재생 부분이 크게 보인다. 한편, 분자 저해 혹은 결실한 세포인 FGFR3-rSMSC군에서는 양성 대조에 비하여 반월판 재생 부분이 작게 보인다.
도 23의 반월판 재생 부분의 육안적 소견을 정량적으로 평가하기 위하여, 반월판 재생 부분(파선 내)의 면적을 Image J(version 1.52)를 이용하여, 다음의 식으로 면적을 산출했다.
반월판 재생 부분 면적(mm2)=반월판 재생 부분 에어리어의 픽셀수/1mm2당 픽셀수
각 군의 재생 부분 면적의 평균값, 표준 편차 및 통계학적 해석은 모두 Microsoft Excel 2007(Microsoft Corp.)로 행했다. 통계학적 해석은 양성 대조군과 분자 저해군 및 분자 저해군과 용매군의 2회 Student's T-Test를 실시하여, 각각의 P값을 산출했다. 또 유의 수준 5%(α=0.05)로서는, 본페로니 보정에 의하여 검정 횟수(2회)로 나눈 유의 수준 2.5%(α=0.025)를 차분 있음으로 하고, 그 결과를 표 9에 기재했다.
표 9에 기재된 반월판 재생 부분의 평균 면적값에 대하여, FGFR3-rSMSC군의 1.2mm2는 IgG-rSMSC의 1.9mm2에 대하여 유의하게 감소하고 있었다. 한편, FGFR3-rSMSC군은 용매군의 1.0mm2에 대하여 동일 정도의 재생 면적이었다. 이 점에서, 활막 줄기세포 중의 FGFR3 분자는 반월판 재생에 기여하는 중요한 분자인 것을 확인할 수 있었다.
[표 9]
배열표
국제 특허 협력 조약에 근거하는 국제 출원원 21F00805W1JP22032502_9.xml
Claims (10)
- 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 포함하는, 관절증 치료제.
- 청구항 1에 있어서,
활막 유래 간엽계 줄기세포가, 인테그린 β1 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β의 양방의 표면 항원을 갖는, 관절증 치료제. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
II형 콜라겐 α1쇄를 코드하는 유전자를 갖고, 이식 후에 II형 콜라겐 α1쇄를 산생하는, 관절증 치료제. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
FGFR3의 표면 항원을 갖는, 관절증 치료제. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
관절증 치료제에 포함되는 세포 전체에 대한, 인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포의 비율이, 30% 이상인, 관절증 치료제. - 청구항 1에 있어서,
활막 조직을 효소로 처리하는 공정 A,
효소 처리 후의 혼합물을 세정하는 공정 B,
세정 후의 혼합물에 포함되는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재에서 배양하는 공정 C, 및
배양 후의 활막 유래 간엽계 줄기세포를 기재로부터 분리하는 공정 D를 포함하는, 관절증 치료제의 제조 방법. - 청구항 6에 있어서,
상기 공정 B가, 효소 처리 후의 혼합물을, 상등액 중의 잔존 효소 농도가 0.5ng/mL 이하가 될 때까지 세정하는 공정인, 방법. - 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
상기 공정 C에 있어서, 활막 유래 간엽계 줄기세포를 배양하는 기간이 28일 이내인, 방법. - 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
상기 공정 D에 있어서, 간엽계 줄기세포에 세포 박리액을, 120분 이내의 시간, 작용시킴으로써 분리를 행하는, 방법. - 청구항 6 또는 청구항 7에 있어서,
인테그린 β1 또는 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β 중 어느 1종 이상의 표면 항원을 갖는 활막 유래 간엽계 줄기세포를 선별하는 공정을 더 포함하는, 방법.
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