WO2024117025A1 - 細胞剥離方法、細胞剥離システム及び情報処理装置 - Google Patents

細胞剥離方法、細胞剥離システム及び情報処理装置 Download PDF

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WO2024117025A1
WO2024117025A1 PCT/JP2023/042136 JP2023042136W WO2024117025A1 WO 2024117025 A1 WO2024117025 A1 WO 2024117025A1 JP 2023042136 W JP2023042136 W JP 2023042136W WO 2024117025 A1 WO2024117025 A1 WO 2024117025A1
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WO
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cell
cells
time
detachment
information
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PCT/JP2023/042136
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English (en)
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秀春 下澤
貴昭 古井
文生 山内
Original Assignee
キヤノン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell detachment method, a cell detachment system, and an information processing device.
  • the desired cells are obtained through the steps of culturing the cells on a culture substrate such as a polystyrene dish, detaching the cells from the substrate, and recovering and washing the cells.
  • a so-called passaging operation is performed in which some of the acquired cells are transferred to a new substrate and cultured.
  • research is being conducted on the detachment process, in which the cells are detached from the substrate, in order to provide an efficient and stable supply of cells.
  • Patent Document 1 describes a method for determining whether or not cells have been detached from a substrate by calculating the ratio of the projected area of each adherent cell before the start of detachment to that during the detachment process and comparing this with a predetermined threshold value in a detached cell sorting device.
  • Patent document 2 describes a cell detachment determination device that compares brightness information based on data obtained by photographing cells with a predetermined brightness level to determine whether or not cells have detached.
  • Patent document 3 describes a cell proliferation evaluation device that repeatedly photographs individual adhesion-dependent cells after a release agent is added, and displays data on cell proliferation based on the change over time in the projected area of the cells.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose that the end of the detachment operation is determined and cell proliferation ability is evaluated by measuring cell information.
  • Patent Documents 1 to 3 do not disclose a method for determining the start time of the detachment operation.
  • the inventors focused on the fact that the adhesive strength of cells varies depending on conditions such as cell type and culture conditions. As a result of extensive investigation, the inventors found that if the detachment operation is performed without setting the start time to an appropriate time that matches the state of the cells to be detached, the survival rate and detachment efficiency of the cells obtained by the detachment process may decrease.
  • the present invention aims to provide a cell detachment method that has high cell survival rate and detachment efficiency.
  • the cell detachment method disclosed in this specification is a cell detachment method for detaching cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including an adhesion reducing step of stimulating the cells to reduce the adhesion of the cells while the cells remain adhered to the cell culture vessel, a measurement step of measuring the cells and acquiring cell information at at least two times, a detachment step of detaching the cells from the culture surface, and a determination step of determining, based on the cell information, a time t2 that is later than time t1 and at which to start the detachment step, where the later of the at least two times is time t1.
  • the cell detachment method disclosed in this specification is a cell detachment method for detaching cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including an adhesion reducing step of applying a stimulus to the cells to reduce the adhesion of the cells while the cells remain adhered to the cell culture vessel, a measurement step of measuring the cells and acquiring time series data related to the cells, a detachment step of detaching the cells from the culture surface, and a prediction step of predicting the time to start the detachment step based on the time series data.
  • the cell detachment system disclosed in this specification is a cell detachment system that detaches cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by having an adhesion reducing unit that applies a stimulus to the cells to reduce the adhesion of the cells while the cells remain adhered to the cell culture vessel, a measuring unit that measures the cells and obtains cell information at at least two times, a detachment unit that detaches the cells from the culture surface, and a determination unit that, when the later of the at least two times is time t1, determines a time t2 after time t1 at which to start a detachment process for detaching the cells from the culture surface based on the cell information.
  • the cell detachment system disclosed in this specification is a cell detachment system that detaches cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including an adhesion reducing unit that applies a stimulus to the cells to reduce the adhesion of the cells while the cells remain adhered to the cell culture vessel, a measurement unit that measures the cells and obtains time series data related to the cells, a detachment unit that detaches the cells from the culture surface, and a prediction unit that predicts the time to start the detachment process to detach the cells from the culture surface based on the time series data.
  • the information processing device disclosed in this specification is an information processing device that controls a cell detachment device that detaches cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including a measurement unit that acquires cell information of cells that have had their adhesive strength to the culture surface reduced by applying a stimulus at at least two times, and a determination unit that, when the later of the at least two times is time t1, determines a time t2 after time t1 at which to start a detachment process for detaching the cells from the culture surface based on the cell information.
  • the information processing device disclosed in this specification is an information processing device that controls a cell detachment device that detaches cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including a measurement unit that acquires time series data on cells whose adhesive strength to the culture surface has been reduced by applying a stimulus at at least two times, and a prediction unit that predicts the time to start the detachment process for detaching the cells from the culture surface based on the time series data.
  • the present invention provides a cell detachment method that has high cell survival rate and detachment efficiency.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of an information processing system capable of executing a program according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cell peeling device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of measuring the area ratio of halo regions as cell information in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing the measurement results of cell information and the results of curve fitting in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing the measurement results of cell information and the results of curve fitting in Example 4 of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing the measurement results of cell information and the results of curve fitting in Example 5 of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of an information processing system capable of executing a program according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cell peeling device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing an example of
  • FIG. 13 is a diagram showing the measurement results of cell information and the results of curve fitting in Example 6 of the present invention.
  • FIG. 13 is a diagram showing a shear stress applying mechanism according to a seventh embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a cell detachment method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a cell detachment method according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a cell detachment system according to an embodiment of the present invention.
  • the cell detachment method disclosed in this specification is a cell detachment method for detaching cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including a measurement step of measuring cells and acquiring cell information at at least two times, a detachment step of detaching the cells from the culture surface, and a determination step of determining, based on the cell information, a time t2 that is later than time t1 and at which the detachment step is to be started, where time t1 is the later of the at least two times at which the cell information is measured.
  • the cell detachment method disclosed in this specification is a cell detachment method for detaching cells adhered to the culture surface of a cell culture vessel, and is characterized by including an adhesion force reducing step of stimulating the cells to reduce the adhesion of the cells while the cells remain adhered to the cell culture vessel, a measurement step of measuring the cells and acquiring time series data related to the cells, a detachment step of detaching the cells from the culture surface, and a prediction step of predicting the time to start the detachment step based on the time series data.
  • a cell detachment system may be configured such that a measuring device that measures cell information and a detachment device that performs the detachment operation are installed separately, and the culture vessel is moved from the measuring device to the detachment device during the reserve time for operation.
  • the device that performs the detachment operation for example an ultrasonic irradiation device, can prepare to start operation, so that the detachment operation can be performed at the appropriate timing.
  • the inventors have found from the results of the above investigation that by providing a method for determining the start time of the detachment operation after the time at which cell information is measured during the cell detachment process, it is possible to provide a cell detachment method that has high cell survival rate and detachment efficiency.
  • the substrate in this embodiment means a cell culture vessel used for cell culture.
  • the cell culture vessel is not particularly limited as long as it is a cell-adhesive culture vessel.
  • Examples of cell culture vessels include flasks, tissue culture flasks, dishes, Petri dishes, tissue culture dishes, multi-dishes, microplates, multi-well plates, multi-plates, petri dishes, culture bags, bottles, and the like.
  • the material of the cell culture vessel in this embodiment may be any material that is chemically stable and capable of culturing the desired cells.
  • the material of the cell culture vessel include at least one selected from the group consisting of polyethylene, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyvinyl chloride, nylon, polyurethane, polyurea, polylactic acid, polyglycolic acid, polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, poly(meth)acrylic acid, poly(meth)acrylic acid derivatives, polyacrylonitrile, poly(meth)acrylamide, poly(meth)acrylamide derivatives, polysulfone, cellulose, cellulose derivatives, polysilicone, polymethylpentene, glass, and metal.
  • polystyrene is preferred as the material of the cell culture vessel.
  • the cells in this embodiment are not particularly limited as long as they can be cultured in vitro as adherent to a culture substrate.
  • various cultured cell lines such as Chinese hamster ovary-derived CHO cells, mouse connective tissue L929 cells, mouse skeletal muscle myoblasts (C2C12 cells), human fetal lung-derived normal diploid fibroblasts (TIG-3 cells), human fetal kidney-derived cells (HEK293 cells), human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived A549 cells, and human cervical cancer-derived HeLa cells
  • examples of the cell lines include epithelial cells and endothelial cells that constitute various tissues and organs in the body, skeletal muscle cells that exhibit contractility, smooth muscle cells, cardiac muscle cells, neuron cells that constitute the nervous system, glial cells, and fibroblasts, hepatic parenchymal cells, non-parenchymal liver cells, and adipocytes that are involved in the metabolism of the body, and
  • the cell detachment method according to the present embodiment is suitable for cells with strong intercellular bonds and cells with high adhesive strength to the culture surface of a cell culture vessel. Due to the need for mass cell culture, the method is particularly suitable for, for example, CHO cells used for protein production and mesenchymal stem cells that can be used in cell therapy.
  • the cells in the present embodiment may be cell sheets cultured in a sheet form.
  • the type of medium is not particularly limited, and examples thereof include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM/F12 medium, McCoy's 5A medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), ⁇ MEM medium (alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM)), and MEM medium (Minimum Essential Medium (MEM)).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • DMEM/F12 DMEM/F12 medium
  • McCoy's 5A medium Eagle's Minimum Essential Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • ⁇ MEM medium alpha Modified Eagle's Minimum Essential Medium ( ⁇ MEM)
  • MEM medium Minimum Essential Medium (MEM)
  • Suitable medium include Repro FF or Repro FF2 (manufactured by ReproCell), NutriStem medium (manufactured by Biological Industries), and MF-Medium mesenchymal stem cell proliferation medium (manufactured by Toyobo Co., Ltd.).
  • the above medium may contain serum or antibiotics.
  • serum include fetal bovine serum (FBS), calf serum, adult bovine serum, horse serum, sheep serum, goat serum, pig serum, chicken serum, rabbit serum, and human serum, with FBS being commonly used due to its ease of availability.
  • FBS fetal bovine serum
  • the medium may be a serum-free medium that does not contain any untreated or unpurified serum, but contains purified blood-derived components or animal tissue-derived components (such as growth factors).
  • antibiotics added to the medium include penicillin, streptomycin, ampicillin, carbenicillin, tetracycline, bleomycin, actinomycin, kanamycin, actinomycin D, amphotericin B, and the like.
  • the cell culture conditions can be appropriately selected according to the cells to be cultured.
  • an appropriate medium is added to a dish, and cells are seeded therein at about 1.0 ⁇ 10 1 to 5.0 ⁇ 10 4 cells/cm 2 and cultured in an environment of 37° C. and 5% CO 2 concentration.
  • it is preferable to culture until the cell occupancy rate in the substrate is about 70 to 80%, that is, until the so-called subconfluent state is reached.
  • the cell detachment method according to an embodiment of the present invention is a method for detaching cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel.
  • a flow chart of the cell detachment method according to the present embodiment is shown in Fig. 9.
  • the cell detachment method includes an adhesive force reducing step S101 for reducing the adhesive force of the cells, a measuring step S102 for acquiring cell information, a determining step S103 for determining a time t2 for starting the detachment step, and a detachment step S104 for detaching the cells from the culture surface.
  • FIG. 10 shows a flowchart of another example of a cell detachment method according to an embodiment of the present invention.
  • This example of the cell detachment method includes an incubation step S201 of contacting cells with cells and incubating them, and a measurement step S202 of measuring the change over time in the average brightness value of the image of the cells.
  • This example of the cell detachment method further includes a step S203 of obtaining an approximation curve from the average brightness value and time, a determination step S204 of determining the start time of the detachment step, and a detachment step S205 of detaching the cells by ultrasonic vibration.
  • the adhesive force reducing step is a step of reducing the adhesive force of cells while the cells are still attached to the substrate by applying a stimulus to the cells.
  • Specific means for reducing the adhesive force of cells include chemical stimuli such as a cell detachment solution, mechanical stimuli such as tapping and flow, electromagnetic stimuli such as light, electricity, and magnetism, and thermal stimuli such as heating and cooling, and a combination of multiple means may be used.
  • chemical stimulation using a cell detachment solution is preferred from the viewpoint of the quality of the cells after detachment, and among these, chemical stimulation using a cell detachment solution that is substantially free of proteolytic enzymes is particularly preferred.
  • protease breaks down parts of cells, making them easier to detach from the substrate.
  • protease include trypsin, accutase, collagenase, natural proteases, chymotrypsin, elastase, papain, pronase, and recombinant forms thereof.
  • Substantially free of protease means that the amount of protease relative to the total mass of the cell detachment solution is 0.0005% by mass or less.
  • the cells are observed while the culture vessel is rocked, and it can be determined whether the cells are attached to the culture vessel if they do not move.
  • some cells with weak adhesive strength such as cells before and after cell division, may detach.
  • Cell detachment solution A cell detachment solution is a solution used to reduce the adhesive strength of cells.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably in the neutral range.
  • the neutral range is defined as a range from pH 6 to pH 8.
  • the neutral range is suitable for cell culture, as it can maintain a stable high cell viability.
  • the pH can be adjusted appropriately using hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.
  • various buffer solutions are preferably used to maintain a stable pH.
  • the viscosity of the cell detachment solution is preferably 1.80 mPa ⁇ s or less.
  • the viscosity of the cell detachment solution can be adjusted as appropriate by adding polymers or sugars, etc.
  • a solution containing a metal ion chelating agent (hereinafter sometimes referred to as a chelating agent) is particularly preferred as a cell detachment solution. This is because the use of a cell detachment solution containing a chelating agent can effectively reduce the adhesive strength of cells.
  • the chelating agent is not particularly limited.
  • the chelating agent may be at least one selected from the group consisting of ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter sometimes referred to as EDTA), ethylenediamine, ethylenediaminetetramethylenephosphonic acid, glycoletherdiaminetetraacetic acid, nitrilotriacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, iminodiacetic acid, dihydroxyethylglycine, dicarboxymethylglutamic acid, ethylenediaminedisuccinic acid, etidronic acid, citric acid, gluconic acid, and phosphonobutanetriacetic acid.
  • chelating agents that form chelates with divalent cations are preferred, chelating agents that form chelates with Ca 2+ and Mg 2+ are particularly preferred, and ethylenediaminetetraacetic acid is the most preferred.
  • the pH of the cell detachment solution is preferably 7.0 or more and 8.0 or less. This is because a higher pH, even within the neutral range in which high cell viability can be maintained, can enhance the chelating ability of ethylenediaminetetraacetic acid, making it possible to increase the efficiency of reducing the adhesive force of cells.
  • Chelating agents may be used alone or in combination of two or more types.
  • the content of the chelating agent is preferably 0.01 mM or more and 5.0 mM or less. By being in this range, the chelating effect can be reliably obtained, and the decrease in the proliferation ability of cells due to the presence of an excess of the chelating agent can be reduced.
  • the cell detachment solution may contain a hydrophilic polymer that contains a polyalkylene glycol structure.
  • a hydrophilic polymer that contains a polyalkylene glycol structure is polyethylene glycol.
  • the hydrophilic polymer preferably has a peak molecular weight Mp of 800 or more and 50,000 or less, and more preferably 1,200 or more and 20,000 or less, as measured by gel permeation chromatography. This is because the polymer has little effect on cells and the thickening effect of the polymer can be reduced.
  • the buffer used in the cell detachment solution can be used without any limitation as long as it can maintain a neutral region.
  • Tris buffers such as Tris-HCl buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, citrate-phosphate buffer, glycylglycine-sodium hydroxide buffer, Britton-Robinson buffer, GTA buffer, etc.
  • phosphate buffers that are close to the environment in a living body are preferred, and phosphate buffered saline (PBS) adjusted to be isotonic with intracellular fluid is more preferably used as the phosphate buffer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the incubation step when a chemical stimulus using a cell detachment solution is used, i.e., when an incubation step is provided in which the cells are brought into contact with the cell detachment solution and incubated, the incubation step preferably includes the following steps. [1-1] A step of contacting cells adhered to a substrate with a cell detachment solution. [1-2] Incubation step.
  • Step [1-1] is a step of replacing the growth medium used for cell culture with a cell detachment solution.
  • the cells may be washed with a buffer solution before or after step [1-1].
  • the effect of the cell detachment solution may be increased by first removing the growth medium and washing the cells with a buffer solution while they are still attached to the cell culture vessel before adding the cell detachment solution. This is because the growth medium generally contains factors such as serum that inhibit the decrease in the adhesive strength of the cells.
  • the incubation step in step [1-2] refers to carrying out a step including at least one of a step of adjusting the temperature, a step of adjusting the humidity, and a step of adjusting the air composition.
  • the step of adjusting the temperature is, for example, a step of controlling a heater so that the temperature around the cell culture vessel is about 37°C.
  • the step of adjusting the humidity is, for example, a step of adjusting the humidity to 90% or more by installing a humidifying tray so that the culture medium does not dry out.
  • the step of adjusting the air composition is, for example, a step of supplying CO2 so that the CO2 partial pressure is about 5% in order to prevent oxidation of the culture medium.
  • the incubation time is, for example, in the range of 30 seconds to 20 minutes, but is not particularly limited.
  • the incubation temperature is not particularly limited, but from the viewpoint of maintaining cell viability, 10°C to 40°C is preferable, and 30°C to 40°C is particularly preferable as it is the optimal temperature for cell growth.
  • the measurement step in the cell detachment method is a step of acquiring cell information of cells adhered to a cell culture vessel.
  • the measurement step (acquisition of cell information) may also be performed before the step of reducing the adhesive force of the cells.
  • the acquisition of cell information may be performed at least two times.
  • the acquisition of cell information may also be performed multiple times at regular intervals. Of the two times at which the cell information is acquired, the later time is designated as time t1.
  • Time t2 at which the detachment step is started, which will be described later, is a time later than time t1.
  • the measurement process may also be configured to acquire time series data related to the cells.
  • the time series data refers to cell information measured at at least two times and the times at which the cell information was measured.
  • the number of time points at which cell information is acquired is preferably 2 or more and 10,000 or less, more preferably 3 or more and 1,000 or less, and even more preferably 5 or more and 300 or less.
  • the start time of the detachment process can be determined with high accuracy.
  • cell information previously obtained under the same conditions may be used as the cell information at the start time of the adhesion reduction process, for example.
  • the processing time for determining the start time of the detachment process can be shortened.
  • Examples of cell information measured in the measurement process include the area of the cell, the area of the halo region in a phase contrast microscope image (also called a phase contrast image), the brightness value in a phase contrast image, and the brightness value when observing the cell culture surface of a cell culture vessel using oblique incidence lighting.
  • a phase contrast microscope image also called a phase contrast image
  • the brightness value in a phase contrast image the brightness value when observing the cell culture surface of a cell culture vessel using oblique incidence lighting.
  • a phase contrast image of an adherent cell can be obtained and the area occupied by a single cell can be measured by image processing, thereby quantifying the cell area.
  • adherent cells appear larger in area in phase contrast images, while cells with reduced adhesion take on a nearly spherical shape due to surface tension, and therefore appear smaller in area in phase contrast images. Utilizing this phenomenon, the area of cells in phase contrast images is quantified and the changes observed.
  • cellular information examples include the brightness value in phase contrast images or the area of the halo region.
  • phase contrast images of cells in an adherent state only areas with small phase differences (when the cells are flat) are detected overall.
  • the phase difference increases and a halo region appears, where the image brightness value is higher than in other areas. In other words, as cell adhesion weakens, the area of the halo region increases.
  • Another type of cell information is the brightness value when observing the cell culture surface of a cell culture vessel using oblique incidence lighting.
  • Cells with reduced adhesive strength have shrunken pseudopodia and a reduced microscopic adhesive surface with the cell culture vessel, which makes light more likely to scatter at the interface between the cell and the cell culture vessel. Therefore, when observing using oblique incidence lighting, which increases the proportion of scattered light, the brightness value of the cell culture surface of the cell culture vessel increases if the adhesive strength of the cells decreases.
  • cell information can be measured by various methods.
  • a phase-contrast image of the cell is obtained using a phase-contrast microscope, and the various pieces of cell information can be measured by analyzing this image.
  • the luminance value of the culture surface can be measured using an illumination means that illuminates the cell culture surface of the cell culture vessel at an oblique incidence and an observation means that is arranged vertically to the culture surface. Note that the illumination means and observation means may be positioned opposite each other across the cell culture vessel, or may be positioned in the same direction, as long as they are positioned to easily receive scattered light from the culture surface.
  • the cell information is preferably luminance information about the cells, and more preferably luminance information of a cell image.
  • the luminance information is preferably luminance information of the culture surface observed by oblique incidence illumination. From the viewpoint of reducing unevenness in luminance, the oblique incidence illumination is preferably ring illumination. Furthermore, the luminance information is preferably the average luminance value of the culture surface, or the area of the culture surface where the luminance value exceeds a threshold value.
  • phase contrast images of the cells were taken over time. Specific cells were marked and their area was quantified using image processing software.
  • the cell area determined in this way decreases over time as the adhesion of the cells to the cell culture vessel weakens. For example, the cell area, which was 237 square micrometers, decreased to 113 square micrometers after 10 minutes of incubation.
  • the rate of change in cell area calculated in this way increases over time as the adhesion of the cells to the substrate weakens. For example, after 1 minute of incubation, the rate was 0.15, but after 5 minutes of incubation, it increased to 0.5.
  • phase contrast images of the cells were taken over time. These phase contrast images of the cells were binarized, thresholded, and measured using image processing software to measure the area ratio of the halo region. A certain brightness value on the image was set as the threshold, and the area with a brightness above the threshold was defined as the halo region, and the area of the halo region relative to the total area of the image was calculated.
  • the area ratio of the halo region determined in this way increases over time as the adhesion of the cells to the substrate weakens.
  • An example of the acquired phase contrast microscope image and the binarized image are shown in Figure 3.
  • the halo region is shown in black.
  • the area ratio of the halo region in the phase contrast image after incubation in the cell detachment solution for 30 seconds was 2.8%, and the area ratio of the halo region in the phase contrast image after incubation in the cell detachment solution for 5 minutes increased to 49.9%.
  • phase contrast images of the cells were taken over time, and the brightness values of these phase contrast images of the cells were measured using image processing software.
  • the brightness value of the phase contrast image obtained in this way increases over time because the halo area increases as the adhesion of the cells to the substrate weakens.
  • the brightness value of the phase contrast image after 30 seconds of incubation in the cell detachment solution was 7.2
  • the brightness value of the phase contrast image after 5 minutes of incubation in the cell detachment solution increased to 127.2.
  • the brightness value of the cell culture surface observed with oblique incidence illumination calculated in this way increases over time because the intensity of scattered light increases as the adhesion of the cells to the cell culture vessel weakens.
  • the average brightness value of the entire culture surface of the cell culture vessel after 30 seconds of incubation in the cell detachment solution was 96.2. After 5 minutes of incubation in the cell detachment solution, the average brightness value of the entire culture surface of the cell culture vessel increased to 108.0.
  • the determination step in the cell detachment method according to the embodiment of the present invention is a step of determining a time to start a detachment operation after the time at which the cell information is measured, based on cell information measured at at least two times.
  • the cell detachment method according to the embodiment of the present invention may also include a prediction step of predicting a time to start the detachment step based on time-series data related to the cells.
  • the time here may be an absolute time such as 1:30 p.m.
  • the determined start time may also be a relative time, such as 30 seconds after the starting point, which is either the time at which the incubation step is started, the time at which the acquisition of cell information is started, or the time at which the start time is determined.
  • the interval at which the cell information is measured is preferably at least 1 second and not more than 1 minute. In other words, it is desirable that the interval between at least two of the times at which the cell information is acquired is at least 1 second and not more than 1 minute.
  • the start time t2 of the peeling operation can be determined with high accuracy.
  • the measurement intervals may be either equal or non-equal.
  • the time t1 at which the cell information is measured is preferably one hour or less from the incubation start time t0 (start time of the adhesion reduction process), and is particularly preferably 15 minutes or less from t0.
  • the time t1 at which the cell information is measured is preferably 10 seconds or more from the incubation start time t0 (start time of the adhesion reduction process), and is particularly preferably 30 seconds or more from t0.
  • t0, t1, and t2 preferably satisfy the relationship (t2-t0)/(t1-t0) ⁇ 1.1.
  • t0 is the start time of the adhesive strength reduction process.
  • the determination step may also include a step of determining the end time t3 of the peeling operation.
  • a step of determining the end time t3 of the peeling operation There are no particular limitations on the method of determining t3, but examples include a method of determining t3 by multiplying a constant by a value obtained by curve fitting based on the time series data of the cell information.
  • the determination step it is preferable to obtain an approximation curve based on the cell information and the time when the cell information was obtained, and to determine the time t2 based on the approximation curve. Furthermore, in the determination method, it is preferable to obtain the approximation curve using curve fitting.
  • the function representing the approximation curve used in the curve fitting and an appropriate function is used depending on the cell type and cell information used, and the means and conditions for reducing the adhesive force of the cells.
  • the functions represented by the following formulas (2-1) to (2-9) can be mentioned.
  • t represents the time when the cell information is measured, with the time when the process of reducing the cell adhesive force is started being set as 0, and f(t) represents the cell information measured at time t.
  • the values of the parameters other than t in formulas (2-1) to (2-9) may be determined in advance or based on the time-series data of the cell information, but there is at least one fitting parameter determined by curve fitting of the time-series data of the cell information.
  • C 0 , C 1 , ⁇ , and ⁇ may all be fitting parameters, or C 0 may be the cell information at time 0, ⁇ may be determined in advance, and C 1 and ⁇ may be fitting parameters.
  • Methods for determining the fitting parameter values by curve fitting include, but are not limited to, the least squares method and the least absolute value method.
  • Example 1 of determining start time t2 A brightness threshold value Th1 at which the detachment operation is started is set in advance according to the type of cell, culture conditions, and the detachment operation.
  • the average brightness value is measured up to time t1, and the time at which the curve of the function of formula (2-1) obtained by curve fitting reaches Th1 is calculated, and this time is set as the start time t2.
  • the cells detached by the detachment operation may be seeded on a new substrate, dish, flask or other culture vessel, or may be subjected to a process such as cell labeling.
  • the cells may also be used as samples for measuring cell count and cell viability.
  • the obtained cells aggregate to form cell clusters, they may be subjected to a single cell treatment as appropriate.
  • FIG. 1 is a block diagram showing an example of the hardware configuration of an information processing system 110 capable of executing a program according to an embodiment of the present invention.
  • the various components that make up the information processing system 110 are shown as integrated devices, but some of these functions may be configured by external devices.
  • the display device 1106 and the input device 1107 may be external devices separate from the components that make up the functions of the computer, including the CPU 1101, etc.
  • the CPU 1101 performs predetermined operations according to programs stored in the RAM 1102, HDD 1104, etc., and also has the function of controlling each part of the information processing system 110.
  • the RAM 1102 is composed of a volatile storage medium, and provides a temporary memory area necessary for the operation of the CPU 1101.
  • the ROM 1103 is composed of a non-volatile storage medium, and stores necessary information such as programs used in the operation of the information processing system 110.
  • the HDD 1104 is composed of a non-volatile storage medium, and is a storage device that stores information regarding the number and positions of the individual independent separation compartments, fluorescent light intensity, etc.
  • the communication I/F 1105 is a communication interface based on standards such as Wi-Fi (registered trademark) and 4G, and is a module for communicating with other devices.
  • the display device 1106 is a liquid crystal display, an OLED (Organic Light Emitting Diode) display, etc., and is used to display moving images, still images, characters, etc.
  • the input device 1107 is a button, a touch panel, a keyboard, a pointing device, etc., and is used by the user to operate the information processing system 110.
  • the display device 1106 and the input device 1107 may be integrally formed as a touch panel.
  • HDD 1104 may be replaced with an SSD (Solid State Drive) that uses semiconductor elements such as flash memory, or may be replaced with cloud storage.
  • SSD Solid State Drive
  • the cell detachment system includes an adhesive force reducing unit 201 that reduces the adhesive force of cells, a measuring unit 202 that measures cells at at least two times and acquires cell information, a detachment unit 204 that detaches cells from the culture surface of a cell culture vessel, and a determination unit 203 that determines the time to start a process of detaching cells based on the cell information.
  • Fig. 11 is a schematic diagram of the cell detachment system.
  • the cell detachment system 200 may be a cell detachment device described below.
  • the cell detachment system 200 may be composed of multiple devices, and the functions of the cell detachment system 200 may be realized by these devices.
  • An example of a cell detachment device is a cell detachment device that detaches cells cultured on a culture surface of a cell culture vessel.
  • the cell detachment device has a culture medium exchange unit that brings cells into contact with a cell detachment solution while the cells are still attached to the cell culture vessel, a cell information acquisition unit that acquires and measures cell information about the cells, an ultrasound irradiation determination unit that determines the timing of ultrasound irradiation, and an ultrasound irradiation unit that applies ultrasound vibration to the cells.
  • FIG. 1 An example of the configuration of a cell detachment device 100 according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the conceptual diagram of Figure 2.
  • the components of Figure 2 are: 100: cell detachment device, 1S: ultrasonic irradiation unit, 40: culture vessel movement control unit, 41: amplifier, 42: function generator, 43: cell information acquisition unit (may include a cell information analysis unit), 44: cell culture vessel, 45: pipetting unit, 46: pipetter movement control unit, 47: waste liquid recovery unit, 48: detached cell recovery unit (cell culture vessel), 49: detached cell recovery unit (tube), 50: washing medium, 51: culture medium, 52: cell detachment liquid, 53: liquid transport control unit, 54: ultrasonic irradiation determination unit (may include a cell information analysis unit).
  • P4 position of the culture vessel when acquiring cell information
  • P5 position of the culture vessel when detaching the cells (set in the ultrasonic irradiation unit)
  • P6 position of the culture vessel when adding cell detachment solution, changing the medium or recovering the cells
  • P7 position of the new culture vessel when seeding the detached cells into a new culture vessel
  • P8 position of the pipetter when adding cell detachment solution, changing the medium or recovering the cells
  • P9 position of the pipetter when discarding the medium or cell suspension
  • P10 position of the pipetter when seeding the cell suspension into a dish
  • P11 position of the pipetter when recovering the cell suspension in a tube.
  • the culture vessel movement control unit 40 is a unit that holds and moves the culture vessel 44.
  • the culture vessel movement control unit 40 may be equipped with a warmer that controls the temperature and humidity of the cell detachment environment, and examples include a heating unit or a humidification unit that can keep the temperature at 37°C.
  • a heating unit or a humidification unit that can keep the temperature at 37°C.
  • an XYZ motorized stage is used to move the culture vessel 44.
  • it may be a robot arm for holding and moving the culture vessel 44.
  • the culture vessel movement control unit 40 moves the culture vessel 44 horizontally between positions P4, P5, and P6.
  • the cell information acquisition unit 43 can acquire information on the cells cultured in the culture vessel 44, such as a phase contrast image.
  • the culture vessel 44 is irradiated with ultrasound by the ultrasound irradiation unit 1S.
  • the solution in the culture vessel 44 is collected by the pipetting unit 45, or various solutions (sometimes called culture media) are added to the culture vessel 44.
  • the pipetting unit 45 may be provided with a mechanism for automatically or manually discharging or aspirating the culture media.
  • multiple pipetting units may be provided, and they may be independent depending on the type and role of the culture medium.
  • Cells are cultured in the culture vessel 44, and when it is time to detach the cells, the culture vessel 44 is placed at position P6.
  • the culture vessel movement control unit 40 can be used to place the culture vessel 44 at position P4 as appropriate, and the state of the cells can be observed with the cell information acquisition unit 43.
  • cells are attached to the vessel.
  • the culture medium needs to be removed and replaced with a cell detachment liquid. Therefore, at position P6, the culture medium in the culture vessel 44 is collected by the pipetting unit 45. The collected culture medium is discarded in the waste liquid collection unit 47 at position P9.
  • Various culture media are stored in the washing medium 50, the culture medium 51, and the cell detachment liquid 52, and are transported to the pipetting unit 45 by the liquid transport control unit 53.
  • the pipetting unit can access the culture vessel 44 by moving up and down. If necessary, a system for opening and closing the lid of the culture vessel 44 may be provided. After removing the culture medium, the cells attached to the vessel can be washed as appropriate.
  • the washing medium 50 is transported to the pipetting unit 45 by the liquid transport control unit 53 and added to the culture vessel 44 by the pipetting unit 45 at position P6.
  • the cell detachment liquid 52 is transported to the pipetting unit 45 by the liquid transport control unit 53 and added to the culture vessel 44 by the pipetting unit 45 at position P6.
  • the culture vessel movement control unit 40 moves the culture vessel 44 to position P4.
  • the cells are incubated in the cell detachment solution while the cell information acquisition unit 43 acquires cell information.
  • the cell information acquisition unit 43 acquires cell information, analyzes the acquired cell information, and determines the start time of the detachment operation by curve fitting based on the time series data of the cell information. The determination is made by the ultrasound irradiation determination unit 54. After that, it instructs the culture vessel movement control unit 40 to move the culture vessel 44, and transmits instructions to activate the ultrasound irradiation unit 1S, the function generator 42, and the amplifier 41.
  • the culture vessel movement control unit 40 moves the culture vessel 44 to position P5.
  • the culture vessel 44 is set in the ultrasound irradiation unit 1S.
  • An example is a configuration that combines an ultrasound detachment unit with a function generator 42 and an amplifier 41 that input an arbitrary frequency, voltage, etc. to the ultrasound detachment unit.
  • ultrasound is irradiated from the ultrasound irradiation unit 1S to the culture vessel 44, detaching the cells adhering to the culture vessel 44.
  • the culture vessel 44 may be moved to position P4 as appropriate, and the detachment state of the cells may be monitored using the cell information acquisition unit 43.
  • the culture vessel movement control unit 40 moves the culture vessel 44 to position P6.
  • the pipetting unit 45 collects the cell detachment solution containing the detached cells in the culture vessel 44.
  • the cell detachment solution containing the collected detached cells is seeded in a detached cell recovery unit 48, for example, a new cell culture vessel installed at position P7.
  • the cells are collected in a tube 49, which is the detached cell recovery unit. These collected cells are used for subsequent assays such as cell culture, cell measurement, and cell labeling.
  • the cell detachment device may further include a control unit that controls the above-mentioned cell detachment process.
  • the control unit is a means for controlling the operation of each unit within the cell detachment device 100.
  • the control unit may be configured by a computer having an arithmetic processing unit such as a CPU, a memory such as a RAM, and a storage unit such as a hard disk drive.
  • the control unit may also include an operation unit.
  • the operation unit may have a display unit and an input unit.
  • the display unit can display image data output from the control unit and various information related to the operation of the cell detachment device 100.
  • the display unit may be, for example, a liquid crystal display.
  • the input unit accepts various instruction inputs from the user.
  • the input unit may be, for example, a keyboard or a mouse. Both the display unit function and the input unit function may be a single unit such as a touch panel display.
  • Example 1 (Culture of cells on substrates) CHO (Chinese Hamster Ovary) cells were seeded on a ⁇ 35 polystyrene dish (manufactured by Corning) at a density of 10,000 cells/ cm2 and cultured under an environment of 37°C and 5% CO2 concentration.
  • the medium used was Ham's F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10,000 U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the culture was carried out for 48 hours, and the state of the cells was observed under a phase contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell occupancy rate of the dish was about 80%.
  • Cell Detachment The medium in the dish was removed, and phosphate-buffered saline (PBS(-), manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added to the dish as a cell detachment solution. Next, an observation image of the cell culture surface of the dish was obtained using oblique incidence illumination, and the average brightness value of the entire cell culture surface of the dish was measured using image processing software. The field of view area of the image at this time was 50 cm2 . Measurement was started immediately after the cell detachment solution was added to the dish, and was performed while incubating in an incubator at 37°C. Measurement was also performed at 5 second intervals for 2.5 minutes.
  • PBS(-) phosphate-buffered saline
  • the change over time of the average brightness value obtained by the measurement is shown in FIG. 4.
  • the function expressed by the formula (2-1) was used for curve fitting to this time series data.
  • the value of ⁇ was set to 1, and the values of the fitting parameters C 0 , C 1 , and ⁇ were determined by the least squares method.
  • the obtained values of C 0 , C 1 , and ⁇ were 62.9, 30.4, and 4.4, respectively.
  • the curve obtained by curve fitting is shown in FIG. 4.
  • the dish was placed in an ultrasonic dissection device and subjected to sweep vibration (frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V) for 3 minutes from time t2 at an ambient temperature of 37°C to dissociate the cells.
  • sweep vibration frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V
  • the cell count was measured using a hemocytometer and the viability was calculated using a trypan blue staining method to distinguish between live and dead cells.
  • the suspension of detached cells was mixed with 0.4% trypan blue solution in a 1:1 ratio to stain the dead cells contained in the suspension.
  • the suspension was injected into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and the number of live and dead cells on the grid of the hemocytometer was counted by microscopic observation.
  • the viability was calculated as the ratio of the number of live cells counted to the total number of cells in the cells detached by the vibration of the cell detachment device.
  • a cell scraper was used to detach all cells that could not be detached by ultrasonic waves from the dish.
  • the suspension of detached cells was poured into a hemocytometer (NanoEntek, DHC-N01) and observed under a microscope to measure the number of detached cells.
  • the total number of cells detached by ultrasonic waves and the number of cells subsequently detached with the cell scraper were combined to determine the total number of detached cells, and the ratio of the number of cells detached by ultrasonic waves to the total number of detached cells was defined and calculated as the detachment efficiency. It was determined that the effects of the present invention had been achieved when the survival rate of detached cells and the cell detachment efficiency were both 95% or higher.
  • Example 2 Except for setting the start time t2 of the detachment operation to 0.7 times ⁇ , the cell survival rate and the cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 3 The cell survival rate and cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 1, except that the start time t2 of the detachment operation was set to the time when the average luminance value reached C 0 +C 1 ⁇ 0.5. The start time t2 of the detachment operation in this case was 3.0 minutes.
  • Example 4 The cells were cultured in the same manner as in Example 1.
  • the medium in the dish was removed, and phosphate-buffered saline (PBS(-), manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added to the dish as a cell detachment solution.
  • PBS(-) phosphate-buffered saline
  • the dish was set on the stage of a phase contrast microscope, a phase contrast image was obtained, and the average brightness value of the phase contrast image was measured using image processing software.
  • the field of view area of the image at this time was 6 mm2 . Measurement was started immediately after the cell detachment solution was added to the dish, and was performed while incubating in a 37°C incubator. Measurement was performed at 15 second intervals for 2.5 minutes.
  • the change over time of the average brightness value obtained by the measurement is shown in FIG. 5.
  • a curve fitting was performed on this time series data using the function expressed by formula (2-1).
  • the values of fitting parameters C 0 , C 1 , ⁇ , and ⁇ were determined by the least squares method.
  • the obtained values of C 0 , C 1 , ⁇ , and ⁇ were 19.5, 90.4, 1.6, and 1.8, respectively.
  • the curve obtained by the curve fitting is shown in FIG. 5.
  • the dish was placed in an ultrasonic dissection device and subjected to sweep vibration (frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V) for 3 minutes from time t2 at an ambient temperature of 37°C.
  • sweep vibration frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V
  • the cell viability and cell dissection efficiency were then evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 5 The cells were cultured in the same manner as in Example 1.
  • the medium in the dish was removed, and phosphate-buffered saline (PBS(-), manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added to the dish as a cell detachment solution.
  • PBS(-) phosphate-buffered saline
  • the dish was set on the stage of a phase-contrast microscope, a phase-contrast image was obtained, and the cell area of multiple cells was measured from the phase-contrast image using image processing software.
  • the field of view area of the image at this time was 6 mm2 .
  • the measurement was started immediately after the cell detachment solution was added to the dish, and was performed while incubating in a 37°C incubator. In addition, the measurement was performed at 15-second intervals for 2 minutes. The measured cell areas of multiple cells were averaged, and the area of the cells immediately after contact with the cell detachment solution (zero incubation time) was designated as A1.
  • the time change of the rate of change of the cell area obtained by the measurement is shown in FIG. 6.
  • the function expressed by the formula (2-1) was used for curve fitting to this time series data.
  • the value of C0 was set to 0
  • the value of ⁇ was set to 1
  • the values of fitting parameters C1 and ⁇ were determined by the least squares method.
  • the obtained values of C1 and ⁇ were 0.70 and 3.5, respectively.
  • the curve obtained by curve fitting is shown in FIG. 6.
  • the dish was placed in an ultrasonic dissection device and subjected to sweep vibration (frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V) for 3 minutes from time t2 at an ambient temperature of 37°C.
  • sweep vibration frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V
  • the cell viability and cell dissection efficiency were then evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 1 the measurement of cell information was not performed, and the start time t2 was changed as shown in Table 1. Otherwise, the cell survival rate and cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Table 1 shows the results of the survival rate and cell detachment efficiency of detached cells in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 5.
  • Example 6 Cell Culture C2C12 cells, a mouse skeletal muscle myoblast cell line, were seeded on a ⁇ 35 polystyrene dish (manufactured by Corning) at a density of 5000 cells/ cm2 and cultured at 37°C under an environment of 5% CO2 concentration.
  • the medium used was DMEM/F12 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (manufactured by Sigma-Aldrich) and 1% penicillin-streptomycin (10000U/ml, manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the culture was carried out for 48 hours, and the state of the cells was observed under a phase contrast microscope to confirm cell adhesion and proliferation.
  • the cell occupancy rate of the dish was about 80%.
  • Cell Detachment The medium in the dish was removed, and phosphate-buffered saline (PBS(-), manufactured by Thermo Fisher Scientific) was added to the dish as a cell detachment solution. Next, an observation image of the cell culture surface of the dish was obtained using oblique incidence illumination, and the average brightness value of the entire cell culture surface of the dish was measured using image processing software. The field of view area of the image at this time was 50 cm2 . Measurement was started immediately after the cell detachment solution was added to the dish, and was performed while incubating in an incubator at 37°C. Measurement was also performed at 1 second intervals for 5 minutes.
  • PBS(-) phosphate-buffered saline
  • the change over time of the average brightness value obtained by the measurement is shown in FIG. 7.
  • the function expressed by the formula (2-5) was used for curve fitting to this time series data.
  • the values of fitting parameters C 0 , C 1 , C 2 , and ⁇ were determined by the least squares method.
  • the obtained values of C 0 , C 1 , C 2 , and ⁇ were 78.4, 16.9, 1.34, and 5.15, respectively.
  • the curve obtained by curve fitting is shown in FIG. 7.
  • the dish was placed in an ultrasonic dissection device and subjected to sweep vibration (frequency 29.5-34.5 kHz, sweep period 1 s, voltage 100 V) for 3 minutes from time t2 at an ambient temperature of 37°C to dissociate the cells. After that, the cell viability and cell dissociation efficiency were evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 6 the measurement of cell information was not performed, and the start time t2 was changed as shown in Table 2. Otherwise, the cell survival rate and cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 6.
  • Table 2 shows the results of the survival rate of detached cells and the cell detachment efficiency in Example 6 and Comparative Examples 6 to 9.
  • Example 7 Except for setting the start time t2 of the detachment operation to the time when the average brightness value reached 92.5, the procedure up to the measurement of the cell information was the same as in Example 6.
  • the start time t2 of the detachment operation in this case was 7.3 minutes.
  • the dish 10 was set in the holding mechanism 11 using the shear stress application mechanism shown in Figure 8. Using the rotation mechanism 12 and the impact application mechanism 13, a load of 5 N was applied to the outer periphery of the dish every 5 seconds for a total of 12 times, while changing the load application position every 30° along the outer periphery of the dish. After that, the cell survival rate and cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 1.
  • Example 7 cell information was not measured, and the start time t2 was changed as shown in Table 3. Otherwise, the cell survival rate and cell detachment efficiency were evaluated in the same manner as in Example 7.
  • Table 3 shows the results of the survival rate and cell detachment efficiency of detached cells in Example 7 and Comparative Examples 10 to 13.
  • Embodiments of the present invention may also be realized by a computer of a system or apparatus (e.g., an application specific integrated circuit (ASIC)) that reads and executes computer executable instructions (e.g., one or more programs) recorded on a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by a computer of a system or apparatus that includes one or more circuits that perform one or more functions of the above-described embodiments, and by a method performed by the computer of the system or apparatus, e.g., by reading and executing computer executable instructions from a storage medium to perform one or more functions of the above-described embodiments, and/or by controlling one or more circuits to perform one or more functions of the above-described embodiments.
  • ASIC application specific integrated circuit
  • the computer may include one or more processors (e.g., a central processing unit (CPU), a microprocessor unit (MPU)) and may include a separate computer or a network of separate processors to read and execute the computer executable instructions.
  • the computer executable instructions may be provided to the computer, e.g., from a network or a storage medium.
  • the storage medium may include, for example, one or more of a hard disk, a random access memory (RAM), a read-only memory (ROM), a storage device of a distributed computing system, an optical disk (such as a compact disk (CD), a digital versatile disk (DVD), a Blu-ray disk (BD)), a flash memory device, a memory card, and the like.
  • a cell detachment method for detaching cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel comprising the steps of: an adhesion strength reducing step of reducing the adhesive strength of the cells while the cells remain attached to the cell culture vessel by applying a stimulus to the cells; a measuring step of measuring the cells and acquiring cell information at at least two times; A detachment step of detaching the cells from the culture surface; and A cell detachment method characterized by including a determination step of determining, based on the cell information, a time t2 that is later than time t1 and at which the detachment step is to be started, when the later of the at least two times is time t1.
  • Method 2 The cell detachment method described in Method 1, characterized in that the cell detachment method includes an incubation step of contacting the cells with a cell detachment solution and incubating the cells.
  • Method 3 The cell detachment method described in Method 1 or 2, wherein the time t1 is a time that is 30 seconds to 15 minutes from the start time t0 of the adhesion reduction step.
  • Method 4 A cell detachment method described in any one of Methods 1 to 3, characterized in that in the measurement process, the interval between at least two of the times at which the cell information is acquired is greater than or equal to 1 second and less than or equal to 1 minute.
  • Method 5 A cell detachment method described in any one of methods 1 to 4, characterized in that the start time t0 of the adhesion reduction process, the time t1, and the time t2 satisfy the relationship (t2-t0)/(t1-t0) ⁇ 1.1.
  • Method 6 The cell detachment method according to any one of Methods 1 to 5, wherein the detachment step includes a step of applying ultrasonic vibration to the cells.
  • Method 7 The cell detachment method according to any one of methods 1 to 6, characterized in that the determination step obtains an approximation curve based on the cell information and the time at which the cell information was acquired, and determines the time t2 based on the approximation curve.
  • Method 8 The cell detachment method described in Method 7, characterized in that the determination step determines as time t2 the time at which the cell information calculated based on the approximation curve is equal to a predetermined threshold value for the cell information.
  • the determining step performs curve fitting using the following formula as the approximation curve,
  • the cell detachment method described in method 7 is characterized in that t is the time t at which the cell information is acquired when the start time of the adhesion reduction process is set to 0, f(t) is the cell information acquired at time t, A is set to be 0.3 or more and 2 or less, and the time A ⁇ , which is A times ⁇ , is determined as the time t2.
  • the determining step performs curve fitting using the following formula as the approximation curve,
  • t is the time t when the cell information is acquired when the start time of the adhesive force reduction process is 0
  • f(t) is the cell information acquired at time t
  • B is set to be 0.3 or more and 0.9 or less
  • the time when f(t) is equal to C0 + C1 ⁇ B is determined as the time t2.
  • Method 11 The cell detachment method according to any one of Methods 1 to 10, wherein the determination step determines a time t3 at which the detachment step is to be terminated.
  • Method 12 The cell detachment method according to any one of methods 1 to 11, characterized in that the cell information is at least any one of the area of the cell, the rate of change in the area of the cell, the brightness value of the cell, the area ratio of the image having a brightness value greater than a threshold, and the brightness value of the image, all measured from an image of the cell.
  • Method 13 13 The cell detachment method according to any one of methods 1 to 12, wherein the measurement step is performed after the start of the adhesion reduction step.
  • Method 14 A cell detachment method described in any one of Methods 1 to 13, characterized in that the approximation curve is an approximation curve between the time elapsed after the start of the adhesion reduction process and the brightness value of the cells.
  • Method 15 A cell detachment method described in any one of Methods 1 to 13, characterized in that the approximation curve is an approximation curve between the time elapsed after the start of the adhesion reduction process and the area of the cells.
  • a cell detachment method for detaching cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel comprising the steps of: an adhesion strength reducing step of reducing the adhesive strength of the cells while the cells remain attached to the cell culture vessel by applying a stimulus to the cells; a measuring step of measuring the cells and acquiring time-series data relating to the cells; A detachment step of detaching the cells from the culture surface; and A cell detachment method comprising the step of predicting the time to start the detachment step based on the time series data.
  • the time series data includes cellular information measured at at least two times and the times at which the cellular information was measured, The cell detachment method described in Method 16, wherein the cell information is at least one of the brightness value of the cell and the area of the cell.
  • a cell detachment system for detaching cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel comprising: an adhesion reducing portion that reduces the adhesive force of the cells while the cells remain attached to the cell culture vessel by applying a stimulus to the cells; a measuring unit that measures the cells and acquires cell information at at least two times; A detachment unit that detaches the cells from the culture surface; and A cell detachment system characterized by having a decision unit that decides, based on the cell information, a time t2 that is later than time t1 and at which a detachment process for detaching the cells from the culture surface is started, when the later of the at least two times is time t1.
  • a cell detachment system for detaching cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel comprising: an adhesion reducing portion that reduces the adhesive force of the cells while the cells remain attached to the cell culture vessel by applying a stimulus to the cells; a measurement unit that measures the cells and acquires time-series data relating to the cells; A detachment unit that detaches the cells from the culture surface; and A cell detachment system comprising: a prediction unit that predicts a time to start a detachment process for detaching the cells from the culture surface based on the time series data.
  • An information processing device for controlling a cell detachment device that detaches cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel, a measuring unit that acquires cell information of the cells whose adhesive force to the culture surface has been reduced by applying a stimulus at at least two times; and
  • the information processing device is characterized in that it includes a decision unit that decides, based on the cell information, a time t2 that is later than time t1 and at which a detachment process for detaching the cells from the culture surface is started, when the later of the at least two times is time t1.
  • An information processing device for controlling a cell detachment device that detaches cells adhered to a culture surface of a cell culture vessel, a measuring unit that acquires time-series data on the cells whose adhesive force to the culture surface has been reduced by applying a stimulus at at least two times; and An information processing device comprising: a prediction unit that predicts a time to start a detachment step of detaching the cells from the culture surface based on the time-series data.

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Abstract

細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、少なくとも２つの時刻において、細胞を計測し細胞情報を取得する計測工程、細胞を培養面から剥離する剥離工程、および、少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、剥離工程を開始する時刻ｔ２を、細胞情報に基づいて決定する決定工程を含むことを特徴とする。

Description

細胞剥離方法、細胞剥離システム及び情報処理装置
　本発明は、細胞剥離方法、細胞剥離システム及び情報処理装置に関する。
　近年、医薬品開発においては、従来の低分子医薬品や抗体医薬品から、細胞そのものを医薬品として活用した細胞医薬、組織や臓器の再生を目指す再生医療へと大きなパラダイムシフトが起こっている。この細胞医薬・再生医療においては、大量の細胞が必要であり、特に、生体組織の多くを占める接着性細胞を効率的かつ安定的に供給することが求められている。
　接着性細胞の培養においては、ポリスチレンディッシュのような培養基材上での細胞の培養、基材からの細胞の剥離、細胞の回収及び洗浄の各工程を経て、目的とする細胞を取得する。細胞をさらに増やしたい際には、取得した細胞の一部をまた新たな基材に移して培養する、いわゆる継代操作を行なう。この一連の工程の中でも、基材から細胞を剥離する剥離工程に関して、細胞を効率的かつ安定的に供給するための検討が行われている。
　特許文献１には、剥離細胞選別装置において、剥離開始前と剥離処理時の個々の接着性細胞の投影面積の比を算出し、予め定めておいた閾値と比較することにより、基材から細胞が剥離したか否かを判定する内容が記載されている。
　特許文献２には、細胞剥離判定装置において、細胞を撮影したデータに基づき輝度情報と所定輝度レベルを比較し、細胞が剥離したか否かを判定する内容が記載されている。
　特許文献３には、細胞増殖能評価装置において、剥離剤投入後の個々の接着依存性細胞を繰り返し撮影し、細胞の投影面積の時間変化を基に細胞増殖能に関するデータを表示する内容が記載されている。
特開２００３－２３５５４０号公報 国際公開第２００７／１３６０７３号 特開２００４－３４４０４９号公報
　特許文献１～３に記載の技術では、細胞情報を計測することにより、剥離動作の終了判定や細胞増殖能評価を行っている開示がある。一方で、特許文献１～３は、剥離動作の開始時刻を決定する方法については開示していない。本発明者らは、細胞の接着力は細胞種や培養条件等の条件によって異なることに着目した。本発明者らは、鋭意検討の結果、剥離対象の細胞の状態に合った適切な時刻に開始時刻が設定されず剥離動作が行われる場合に、剥離工程によって得られる細胞の生存率及び剥離効率が低下する場合があることを見出した。
　本発明は、細胞の生存率及び剥離効率が高い細胞剥離方法を提供することを目的とする。
　本明細書に開示される細胞剥離方法は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、少なくとも２つの時刻において、細胞を計測し細胞情報を取得する計測工程、細胞を培養面から剥離する剥離工程、および、少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、剥離工程を開始する時刻ｔ２を、細胞情報に基づいて決定する決定工程を含むことを特徴とする。
　本明細書に開示される細胞剥離方法は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、細胞を計測し、細胞に関する時系列データを取得する計測工程、細胞を培養面から剥離する剥離工程、および、時系列データに基づいて、剥離工程を開始する時刻を予測する予測工程を含むことを特徴とする。
　本明細書に開示される細胞剥離システムは、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下部、少なくとも２つの時刻において、細胞を計測し細胞情報を取得する計測部、細胞を培養面から剥離する剥離部、および、少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、細胞を培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、細胞情報に基づいて決定する決定部を有することを特徴とする。
　本明細書に開示される細胞剥離システムは、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下部、細胞を計測し、細胞に関する時系列データを取得する計測部、細胞を培養面から剥離する剥離部、および、時系列データに基づいて、細胞を培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする。
　本明細書に開示される情報処理装置は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで培養面との接着力を低下させた細胞の細胞情報を取得する計測部、および、少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、細胞を培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、細胞情報に基づいて決定する決定部を含むことを特徴とする。
　本明細書に開示される情報処理装置は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで培養面との接着力を低下させた細胞に関する時系列データを取得する計測部、および、時系列データに基づいて、細胞を培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする。
　本発明によれば、細胞の生存率及び剥離効率が高い細胞剥離方法を提供することができる。
本発明の実施形態に係るプログラムを実行可能な情報処理システムの構成を示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の模式図である。 本発明の実施形態において細胞情報としてハロ領域の面積率を計測する例を示す図である。 本発明の実施例１の細胞情報の計測結果と曲線あてはめの結果を示す図である。 本発明の実施例４の細胞情報の計測結果と曲線あてはめの結果を示す図である。 本発明の実施例５の細胞情報の計測結果と曲線あてはめの結果を示す図である。 本発明の実施例６の細胞情報の計測結果と曲線あてはめの結果を示す図である。 本発明の実施例７のせん断応力付与機構を示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離方法のフローチャートを示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離方法のフローチャートを示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞剥離システムの構成を示す図である。
　以下、好適な実施の形態を挙げて、本発明を詳細に説明する。
　本明細書に開示される細胞剥離方法は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、少なくとも２つの時刻において、細胞を計測し細胞情報を取得する計測工程、細胞を培養面から剥離する剥離工程、および細胞の情報が計測される少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、剥離工程を開始する時刻ｔ２を、細胞情報に基づいて決定する決定工程を含むことを特徴とする。
　また、本明細書に開示される細胞剥離方法は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、細胞に刺激を与えることで、細胞が細胞培養容器に接着したまま細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、細胞を計測し、細胞に関する時系列データを取得する計測工程、細胞を培養面から剥離する剥離工程、および、時系列データに基づいて、剥離工程を開始する時刻を予測する予測工程を含むことを特徴とする。
　本発明者らが剥離工程について鋭意検討した結果、細胞の接着力が十分に低下する前に剥離動作を開始すると、細胞剥離効率の低下、細胞生存率の低下を招くという課題があることが分かった。また、細胞の接着力を低下させる工程を長時間行うと、細胞が培養環境とは異なる環境に長時間置かれるために細胞生存率が低下する課題があることが分かった。以上より、本発明者らは、剥離工程において細胞の適切な剥離開始時刻が存在することを見出した。
　また、本発明者らは、細胞情報を少なくとも２つの時刻に計測し、細胞情報が計測される時刻より後の剥離動作の開始時刻を細胞情報に基づいて決定することで、剥離動作の開始時刻までの動作予備時間を設けることができることを見出した。本発明者らは、動作予備時間があることで、装置設計の自由度が高い細胞剥離方法を提供できることを見出した。例えば、細胞剥離システムとして、細胞情報の計測を行う計測装置と剥離動作を行う剥離装置とを別個に設置し、動作予備時間の間に計測装置から剥離装置へと培養容器を移動する構成でもよい。また、動作予備時間を設けることで、剥離動作を行う装置、例えば、超音波照射装置が動作を開始するための準備をすることができるため、剥離動作を適切なタイミングで行うことができる。
　本発明者らは、上記検討結果から、細胞の剥離工程において、細胞情報を計測する時刻より後の剥離動作の開始時刻を決定する方法を提供することで、細胞の生存率及び剥離効率が高い細胞剥離方法を提供できることを見出した。
　（細胞培養容器）
　本実施形態における基材は、細胞培養に用いられる細胞培養容器のことを意味する。細胞培養容器は、細胞接着性の培養容器であれば特に制限はない。細胞培養容器として、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マルチウェルプレート、マルチプレート、シャーレ、培養バック、ボトルなどが挙げられる。
　本実施形態における細胞培養容器の材質は、化学的に安定であり、所望の細胞を培養可能な材質であればよい。細胞培養容器の材質は、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリウレタン、ポリウレア、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリ（メタ）アクリル酸誘導体、ポリアクリロニトリル、ポリ（メタ）アクリルアミド、ポリ（メタ）アクリルアミド誘導体、ポリスルホン、セルロース、セルロース誘導体、ポリシリコーン、ポリメチルペンテン、ガラス、及び金属からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。細胞培養容器の材質は、この中でもポリスチレンが好ましい。
　（細胞）
　本実施形態における細胞としては、インビトロで培養基材に接着培養可能なものであれば特に限定されるものではない。例えばチャイニーズハムスター卵巣由来ＣＨＯ細胞やマウス結合組織Ｌ９２９細胞、マウス骨格筋筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）、ヒト胎児肺由来正常二倍体線維芽細胞（ＴＩＧ－３細胞）、ヒト胎児腎臓由来細胞（ＨＥＫ２９３細胞）、ヒト肺胞基底上皮腺癌由来Ａ５４９細胞やヒト子宮頸癌由来ＨｅＬａ細胞等の種々の培養細胞株に加え、例えば生体内の各組織、臓器を構成する上皮細胞や内皮細胞、収縮性を示す骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、神経系を構成するニューロン細胞、グリア細胞、繊維芽細胞、生体の代謝に関与する肝実質細胞、肝非実質細胞や脂肪細胞、分化能を有する細胞として、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等の各種幹細胞、又は各組織の前駆細胞、さらにはそれらから分化誘導した細胞等が挙げられる。本実施形態に係る細胞剥離方法は、これらの中でも細胞間の結合が強い細胞や、細胞培養容器の培養面への接着力が高い細胞において好適である。細胞の大量培養のニーズから、例えば、タンパク質生産用に用いられるＣＨＯ細胞や、細胞治療で利用可能な間葉系幹細胞などに対して特に好適である。また、本実施形態における細胞として、シート状に培養した細胞シートであってもよい。
　（培地）
　培地の種類に特に制限はなく、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ　Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ　ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ‘ｓ培地、ＳｔｅｍＳｐａｎ　Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　Ｋｉｔ（プロモセル社製）、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（プロモセル社製）、ＭＳＣＧＭ　Ｂｕｌｌｅｔ　Ｋｉｔ（ロンザ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）などが挙げられる。
　これらの中から、それぞれの細胞の培養に適した培地を用いるのが好ましい。
　（血清）
　上記の培地には、血清や抗生物質を添加してもよい。血清の例としては、牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ：ＦＢＳ）、児牛血清、成牛血清、ウマ血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ブタ血清、ニワトリ血清、ウサギ血清、ヒト血清が使用されるが、入手の容易さから一般的にＦＢＳがよく用いられる。また、未処理又は未精製の血清をいずれも含まず、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する無血清培地であってもよい。
　（抗生物質）
　培地に添加される抗生物質の例としては、ペニシリン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、テトラサイクリン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、カナマイシン、アクチノマイシンＤ、アンホテリシンＢなどが挙げられる。
　（細胞の培養条件）
　細胞の培養条件は、培養する細胞に従って適宜選択し得る。一般的には、ディッシュ内に適切な培地を添加し、そこに１．０×１０１～５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２程度の細胞を播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養する。この際、基材中の細胞占有面積率が７～８割程度、いわゆるサブコンフルエントの状態になるまで培養するのが好ましい。
　（細胞剥離方法）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離方法は、細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法である。本実施形態の細胞剥離方法のフローチャートを図９に示す。細胞剥離方法は、細胞の接着力を低下させる接着力低下工程Ｓ１０１、細胞情報を取得する計測工程Ｓ１０２、剥離工程を開始する時刻ｔ２を決定する決定工程Ｓ１０３、細胞を培養面から剥離する剥離工程Ｓ１０４を含む。
　また、本発明の実施形態に係る細胞剥離方法の別の一例のフローチャートを図１０に示す。細胞剥離方法の別の一例は、細胞を細胞に接触させインキュベートするインキュベート工程Ｓ２０１、細胞の画像の平均輝度値の時間変化を計測する計測工程Ｓ２０２を含む。細胞剥離方法の別の一例は、さらに、平均輝度値と時刻から近似曲線を取得する工程Ｓ２０３、剥離工程の開始時刻を決定する決定工程Ｓ２０４、超音波振動により細胞を剥離する剥離工程Ｓ２０５を含む。
　以下、各工程について、説明する。
　（接着力低下工程）
　本発明の実施形態に係る接着力低下工程は、細胞に刺激を与えることで、細胞が基材に接着した状態のまま、細胞の接着力を低下させる工程である。細胞の接着力を低下させる具体的な手段としては、細胞剥離液などの化学刺激、タッピング、流動などの力学刺激、光や電気、磁気などの電磁気刺激、加温や冷却などの熱刺激などが挙げられ、複数手段を組み合わせてもよい。
　上記手段のうち、剥離後の細胞の品質の観点から、細胞剥離液による化学刺激が好ましく、その中でもタンパク質分解酵素を実質的に含まない細胞剥離液による化学刺激が特に好ましい。
　ここで、タンパク質分解酵素とは、細胞の一部を分解し、細胞を基材から剥離しやすくするものである。タンパク質分解酵素として、例えば、トリプシン、アキュターゼ、コラゲナーゼ、天然プロテアーゼ、キモトリプシン、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、もしくはそれらの組み換え体などが挙げられる。また、タンパク質分解酵素を実質的に含まないとは、細胞剥離液の全質量に対するタンパク質分解酵素の量は０．０００５質量％以下であるという意味である。
　細胞が培養容器に接着した状態について、培養容器を揺らしながら細胞を観察し、細胞が動かないことによって培養容器に接着しているかどうかを判定できる。また、細胞の接着力を低下させる工程において、細胞分裂前後の細胞のような接着力の弱い一部の細胞が剥離してもよい。
　（細胞剥離液）
　細胞剥離液は、細胞の接着力を低下させるために用いる溶液である。
　細胞剥離液のｐＨは中性領域であることが好ましい。ここで、中性領域とは、ｐＨ６以上ｐＨ８以下であるとする。中性領域は細胞培養に適しており、細胞の生存率を安定的に高く保つことができるためである。ｐＨは塩酸や水酸化ナトリウム等で適宜調整可能である。また、ｐＨを安定的に保つために各種緩衝液が好適に用いられる。
　細胞剥離液の粘度は１．８０ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。細胞剥離液の粘度はポリマーや糖類の添加などによって適宜調整可能である。
　細胞剥離液として、金属イオンキレート剤（以後、キレート剤と呼ぶことがある）を含む溶液が、特に好ましい。キレート剤を含む細胞剥離液を用いることによって、細胞の接着力を効果的に低下させることが出来るからである。
　キレート剤は、特に限定されない。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（以後、ＥＤＴＡと呼ぶことがある）、エチレンジアミン、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ニトリロトリ酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、イミノ二酢酸、ジヒドロキシエチルグリシン、ジカルボキシメチルグルタミン酸、エチレンジアミンジコハク酸、エチドロン酸、クエン酸、グルコン酸、及び、ホスホノブタン三酢酸からなる群から選択される少なくとも一種を挙げることができる。この中でも二価の陽イオンとキレートを形成するキレート剤が好ましく、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋とキレートを形成するキレート剤が特に好ましく、エチレンジアミン四酢酸が最も好ましい。
　キレート剤としてエチレンジアミン四酢酸を用いた場合、細胞剥離液のｐＨは７．０以上８．０以下であることが好ましい。これは細胞生存率を高く保つことができる中性領域の中でも高めのｐＨであることにより、エチレンジアミン四酢酸のキレート能を高めることができ、細胞の接着力の低下効率をより高くすることが可能であるためである。なおキレート剤は単独で用いても、或いは２種類以上を複合して用いてもよい。
　キレート剤の含有量としては０．０１ｍＭ以上５．０ｍＭ以下であることが好ましい。この範囲であることにより、キレート効果を確実に得ることができ、過剰なキレート剤の存在による細胞の増殖能等の低下を低減することができる。
　細胞剥離液は、ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーを含んでいてもよい。ポリアルキレングリコール構造を含む親水性ポリマーの例として、ポリエチレングリコールがあげられる。親水性ポリマーは、ゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより測定されるピーク分子量Ｍｐが８００以上５００００以下であることが好ましく、１２００以上２００００以下であることがさらに好ましい。これは、ポリマーの細胞への影響が少なく、かつ、ポリマーによる増粘効果を低減できるためである。
　（緩衝液）
　細胞剥離液に用いられる緩衝液は、中性領域を保つことができれば制限なく使用できる。例えば、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液等のＴｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸－リン酸緩衝液、グリシルグリシン－水酸化ナトリウム緩衝液、Ｂｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、ＧＴＡ緩衝液等が挙げられる。この中でも、生体内の環境に近いリン酸緩衝液が好ましく、このリン酸緩衝液に、細胞内液と等張になるよう調整したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がより好適に用いられる。
　本発明の実施形態における接着力低下工程において、細胞剥離液による化学刺激を用いる、すなわち、細胞を細胞剥離液に接触させインキュベートするインキュベート工程を設ける場合、インキュベート工程は下記の工程を含むことが好ましい。
［１－１］細胞が基材に接着した状態のまま、細胞剥離液と接触する工程。
［１－２］インキュベートする工程。
　（［１－１］工程）
　［１－１］工程は、細胞培養に用いられる増殖培地を細胞剥離液に交換する工程である。［１－１］工程の前後で細胞を緩衝液で洗浄しても良い。例えば、培養している細胞を細胞培養容器から剥離したいときに、まず増殖培地を除去し細胞剥離液を添加する前に、細胞が細胞培養容器に接着した状態のまま、緩衝液で洗浄することで、細胞剥離液の効果が増加する場合がある。これは、増殖用の培地の中には、細胞の接着力低下を阻害する血清などの因子が含まれることが一般的であるからである。
　（［１－２］工程）
　［１－２］工程のインキュベートとは、温度を調整する工程、湿度を調整する工程、及び空気組成を調整する工程の少なくともいずれかを含む工程を行うことを指す。温度を調整する工程とは、例えば、細胞培養容器の周辺が３７℃前後であるようにヒータを制御する工程である。湿度を調整する工程とは、例えば、培地が乾燥しないように加湿バットを設置することで湿度を９０％以上に調整する工程である。空気組成を調整する工程とは、例えば、培地の酸化を防ぐためにＣＯ２分圧が５％前後になるようＣＯ２を供給する工程である。
　インキュベート時間は、一例としては、例えば３０秒～２０分の範囲であるが、特に限られない。インキュベート温度は、特に限定はないが、細胞生存率を維持する観点からは、１０℃～４０℃が好ましく、特に３０℃～４０℃であれば、細胞の生育の最適な温度であり、好ましい。
　（計測工程）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離方法における計測工程は、細胞培養容器に接着した状態の細胞の細胞情報を取得する工程である。なお、計測工程（細胞情報の取得）は、細胞の接着力を低下させる工程を行う前の時点でも実施されてもよい。細胞情報の取得は、少なくとも２つの時刻で行われればよい。また、細胞情報の取得は、一定の間隔で複数回行われてもよい。細胞情報が取得される２つの時刻のうち、後の時刻を時刻ｔ１とする。後述される、剥離工程を開始する時刻ｔ２は、時刻ｔ１よりも後の時刻である。
　また、計測工程において、細胞に関する時系列データを取得する構成であってもよい。時系列データとは、少なくとも２つの時刻で計測された細胞情報と、細胞情報が計測された時刻とを指す。
　細胞情報を取得する時点の数は、好ましくは２以上１００００以下、より好ましくは３以上１０００以下、さらに好ましくは５以上３００以下が望ましい。細胞情報を取得する時点の数が２以上であることで、精度よく剥離工程の開始時刻を決定することができる。なお、細胞情報を実際に取得した時点の細胞情報に加え、例えば、接着力低下工程の開始時刻の細胞情報として予め同条件で求めた細胞情報を用いてもよい。細胞情報を取得する時点の数が１００００以下であることで、剥離工程の開始時刻を決定する処理時間を短くすることができる。
　計測工程において計測する細胞情報の例としては、細胞の面積や、位相差顕微鏡画像（位相差画像とも呼ぶ）におけるハロ領域の面積、位相差画像における輝度値、斜入射照明により細胞培養容器の細胞培養面を観察した際の輝度値などがあげられる。
　細胞の面積の例としては、例えば、接着している細胞の位相差画像を取得し、画像処理によって、細胞一つの専有面積を計測することで、細胞の面積を数値化することができる。
　接着している細胞は位相差画像で見ると面積が大きく写る一方、接着力が低下している細胞は表面張力により球形に近い形をとるため、位相差画像で見ると細胞の面積が小さく写ることが知られている。この現象を利用して、位相差画像上の細胞の面積を数値化し、その変化を観察する。
　別の細胞情報として、位相差画像における輝度値あるいはハロ領域の面積があげられる。
　細胞が接着した状態の位相差画像においては全体的に小さい位相差（細胞が平たい状態）の領域しか検出されない。一方、細胞の接着が弱くなり、細胞が培養面から浮き上がった周囲では位相差が大きくなり、他の領域に比べて画像輝度値が高くなるハロ領域がみられることが知られている。すなわち、細胞の接着が弱くなれば、ハロ領域の面積が増える。
　また別の細胞情報として、斜入射照明により細胞培養容器の細胞培養面を観察した際の輝度値があげられる。接着力が低下している細胞は、仮足が縮み、細胞培養容器との微視的な接着面が減少するため、細胞培養容器と細胞との界面で光が散乱しやすくなる。よって、散乱光の比率が高くなる斜入射照明を用いて観察すると、細胞の接着力が低下すれば、細胞培養容器の細胞培養面の輝度値が高くなる。
　本実施形態において、細胞情報として様々なパラメーターを採用することができる。細胞情報は、例えば、個々の細胞の面積、個々の細胞のサイズ、個々の細胞の真円度、個々の細胞の光透過度、細胞集団の占有面積、細胞画像の輝度値、細胞が存在していない領域の面積、ハロ領域の面積、ハロに基づく画像の輝度値、及び、斜入射照明で細胞培養容器の細胞培養面を観察した画像の輝度値からなる群から選択される少なくとも一種であってもよい。
　本実施形態において、細胞情報は、様々な方法で計測できる。例えば、位相差顕微鏡を用いて細胞の位相差画像を取得し、この画像を解析することで、様々な上記細胞情報を計測することが可能になる。また、細胞培養容器の細胞培養面に対して斜入射で照明する照明手段と、培養面に対して鉛直方向に配置される観察手段によって培養面の輝度値を計測することができる。なお、照明手段と観察手段の位置は培養面での散乱光を受光しやすい配置であれば、細胞培養容器を挟んで対向する位置に配置してもよいし、同じ向きに配置してもよい。
　前記細胞情報としては、細胞に関する輝度情報であることが好ましく、細胞画像の輝度情報であることがより好ましい。前記輝度情報は、斜入射照明により観察される培養面の輝度情報であることが好ましい。前記斜入射照明としては、輝度のムラを減らす観点から、リング照明であることが好ましい。また、前記輝度情報は、培養面の平均輝度値、または輝度値が閾値を超える培養面の面積であることが好ましい。
　前記細胞情報を計測する観察手段は、１ｃｍ２以上の視野を有することが好ましい。１ｃｍ２以上の視野を有することで、細胞の接着力低下について、細胞のミクロな培養状態の偏りに左右されず、マクロに評価することができる。
　（細胞情報として細胞の面積を計測する例）
　増殖培地を細胞剥離液に交換した直後から、経時的に細胞の位相差画像を取得した。特定の細胞をマーキングし、この細胞の面積を画像処理ソフトで定量した。
　このように求めた細胞面積は、細胞の細胞培養容器との接着が弱くなるにつれて、経時的に小さくなっていく。例えば、２３７平方マイクロメートルであった細胞面積が、１０分間のインキュベートで１１３平方マイクロメートルまで低下した。
　（細胞情報として細胞の面積の変化率を計測する例）
　増殖培地を細胞剥離液に交換した直後から、経時的に細胞の位相差画像を取得した。特定の細胞をマーキングし、この細胞の面積を画像処理ソフトで定量した。細胞が細胞剥離液と接触した直後（インキュベート時間ゼロ）の細胞の面積をＡ１とする。細胞剥離液中でのインキュベート時間ｔの細胞の面積をＡ２とする。細胞の面積の変化率を以下の式（１）で求めた。
（Ａ１－Ａ２）／Ａ１・・・（１）
　このように求めた細胞面積の変化率は、細胞の基材との接着が弱くなるにつれて、経時的に大きくなっていく。例えば、インキュベート１分間では、０．１５であったが、インキュベート５分間では、０．５まで増加した。
　（細胞情報としてハロ領域の面積率を計測する例）
　増殖培地を細胞剥離液に交換した直後から、経時的に細胞の位相差画像を取得した。これらの細胞の位相差画像を画像処理ソフトで、二値化、閾値設定、エリア測定を行うことで、ハロ領域の面積率を計測した。ここで、画像上のある輝度値を閾値として、閾値以上の明るさを持つ領域をハロ領域と定義して、画像全体の面積に占めるハロ領域の面積を求めた。
　このように求めたハロ領域の面積率は、細胞の基材との接着が弱くなるにつれて、経時的に大きくなっていく。取得した位相差顕微鏡画像と二値化後の画像の例を図３に示す。二値化後の画像において、ハロ領域は黒で表している。例えば、細胞剥離液中でのインキュベート時間３０秒の位相差画像のハロ領域面積率は２．８％であり、細胞剥離液中でのインキュベート時間５分の位相差画像のハロ領域面積率は４９．９％まで増加した。
　（細胞情報として位相差画像の輝度値を計測する例）
　増殖培地を細胞剥離液に交換した直後から、経時的に細胞の位相差画像を取得した。これらの細胞の位相差画像の輝度値を画像処理ソフトで計測した。
　このように求めた位相差画像の輝度値は、細胞の基材との接着が弱くなるにつれて、ハロ領域が増えるために、経時的に大きくなっていく。例えば、細胞剥離液中でのインキュベート時間３０秒の位相差画像の輝度値は７．２であり、細胞剥離液中でのインキュベート時間５分の位相差画像の輝度値は１２７．２まで増加した。
　（細胞情報として斜入射照明観察像の輝度値を計測する例）
　増殖培地を細胞剥離液に交換した直後から、経時的に斜入射により照明した細胞培養面の観察像を取得した。細胞培養容器の細胞培養面全体の輝度値を画像処理ソフトで計測した。
　このように求めた斜入射照明で観察される細胞培養面の輝度値は、細胞の細胞培養容器との接着が弱くなるにつれて、散乱光強度が増していくため、経時的に大きくなっていく。例えば、細胞剥離液中でのインキュベート時間が３０秒である時点における、細胞培養容器の培養面全体の輝度の平均値は９６．２であった。細胞剥離液中でのインキュベート時間が５分である時点における、細胞培養容器の培養面全体の輝度の平均値は１０８．０まで増加した。
　（決定工程）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離方法における決定工程は、少なくとも２つの時刻において計測された細胞の情報に基づいて、細胞の情報が計測された時刻より後の、剥離動作を開始する時刻を決定する工程である。また、本発明の実施形態に係る細胞剥離方法は、細胞に関する時系列データに基づいて、剥離工程を開始する時刻を予測する予測工程を含んでもよい。ここでの時刻とは１３時３０分のような絶対的な時刻であってもよい。また、決定される開始時刻は、インキュベート工程を開始する時刻、細胞情報の取得を開始した時刻、または開始時刻を決定する時点のいずれかを起点として、起点から３０秒後のような相対的な時刻を用いてもよい。
　細胞の情報を計測する間隔は、１秒以上１分以下であることが好ましい。すなわち、細胞情報が取得される時刻のうち、少なくとも２つの時刻どうしの間隔は１秒以上１分以下であることが望ましい。この範囲の間隔で細胞の情報を計測することで、剥離動作の開始時刻ｔ２を精度よく決定できる。また、計測間隔は、等間隔でも非等間隔でもよい。
　前記細胞情報を計測する時刻ｔ１は、インキュベート開始時刻（接着力低下工程の開始時刻）ｔ０から、１時間以下の時刻が好ましく、特にｔ０から１５分以下の時刻であることが好ましい。前記細胞情報を計測する時刻ｔ１は、インキュベート開始時刻（接着力低下工程の開始時刻）ｔ０から、１０秒以上の時刻が好ましく、特にｔ０から３０秒以上の時刻であることが好ましい。時刻ｔ１がこの範囲にあることで、細胞の生存率が低下することを低減できる。
　前記ｔ０、ｔ１およびｔ２は、（ｔ２－ｔ０）／（ｔ１－ｔ０）≧１．１の関係を満たすことが好ましい。ｔ０とは、接着力低下工程の開始時刻である。ｔ１とｔ２がこの関係を満たすことで、剥離開始時刻までの動作予備時間を十分に確保することができる。
　また、決定工程において、剥離動作の終了時刻ｔ３を決定する工程を含んでもよい。ｔ３の決定方法については、特に限定はないが、例えば、細胞情報の時系列データを元に曲線あてはめによって得られる値の定数倍によって決定する方法などが挙げられる。
　（曲線あてはめ）
　決定工程において、細胞情報及び細胞情報が取得された時刻に基づいて近似曲線を取得し、近似曲線に基づいて時刻ｔ２を決定することが好ましい。さらに決定方法において、曲線あてはめを用いて近似曲線を取得することが好ましい。曲線あてはめに用いる近似曲線を示す関数としては、特に限定はなく、用いる細胞種や細胞情報、細胞の接着力を低下させる手段や条件に応じて、適切な関数を用いる。一例として、以下の式（２－１）～（２－９）で表される関数を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000010
　ｆ（ｔ）＝Ｃ０＋Ｃ１ｔ＋Ｃ２ｔ２＋Ｃ３ｔ３＋Ｃ４ｔ４・・・（２－９）
　ここで、ｔは細胞の接着力を低下させる工程を開始した時刻を０としたときの細胞情報を計測した時刻を表し、ｆ（ｔ）は時刻ｔにおいて計測した細胞情報を表す。
　式（２－１）～（２－９）中のｔ以外のパラメーターの値は、事前に決めておいてもよいし、細胞情報の時系列データを元に決めてもよいが、細胞情報の時系列データの曲線あてはめによって決定するフィッティングパラメーターを少なくとも１つ有する。一例として、式（２－１）において、Ｃ０、Ｃ１、τ、βのすべてをフィッティングパラメーターとしてもよいし、Ｃ０は時刻０における細胞情報とし、βは事前に決めておき、Ｃ１、τをフィッティングパラメーターとしてもよい。
　曲線あてはめに用いる細胞情報は、時刻ｔ１までに計測した細胞情報を用いるが、細胞情報を計測した時刻のうち適宜時刻を間引いた細胞情報を使用してもよく、計測を行ったすべての時刻の細胞情報を用いてもよい。また、曲線あてはめを行う前に、細胞情報の時系列データに対してフィルター処理などの平滑化処理を行ってもよい。
　曲線あてはめによってフィッティングパラメーターの値を決定する方法として、特に限定はないが、最小二乗法や最小絶対値法などが挙げられる。
　（開始時刻ｔ２の決定）
　前記曲線あてはめによって、細胞情報の時系列データをフィッティングしたのち、剥離動作を開始する時刻ｔ２を決定する。時刻ｔ２は、計測工程が行われる時刻ｔ１よりも後の時刻である。時刻ｔ２の決定方法に特に限定はないが、一例として、細胞情報として斜入射照明観察像の輝度の平均値を用い、曲線あてはめに用いる関数を式（２－１）で表される関数においてβ＝１とした場合で説明する。
　（開始時刻ｔ２の決定例１）
　細胞の種類や培養条件、剥離動作に応じて、予め、剥離動作を開始する輝度の閾値Ｔｈ１を設けておく。時刻ｔ１まで輝度の平均値を計測し、曲線あてはめによって求めた式（２－１）の関数の曲線がＴｈ１に達する時刻を算出し、この時刻を開始時刻ｔ２とする。
　（開始時刻ｔ２の決定例２）
　時刻ｔ１まで輝度の平均値を計測し、曲線あてはめによって式（２－１）のフィッティングパラメーターＣ０、Ｃ１、τの値を算出したのち、τのＡ倍の時刻Ａτを開始時刻ｔ２とする。ここで、Ａは細胞の種類や培養条件、剥離動作に応じて、予め設けておく。Ａは０．３以上２以下であることが好ましく、０．５以上１以下であることが特に好ましい。
　（開始時刻ｔ２の決定例３）
　時刻ｔ１まで輝度の平均値を計測し、曲線あてはめによって求めた式（２－１）の関数の曲線がＣ０＋Ｃ１×Ｂに達する時刻を算出し、この時刻を開始時刻ｔ２とする。ここで、Ｂは細胞の種類や培養条件、剥離動作に応じて予め設けておき、Ｂは１未満の正の値である。Ｂは０．３以上０．９以下であることが好ましく、０．４以上０．７以下であることが特に好ましい。
　（剥離動作）
　決定工程で決定した時刻ｔ２に開始する剥離動作としては、超音波による振動やタッピングによる振動、培養液や細胞剥離液への対流などが挙げられ、複数の手段を組み合わせてもよい。培養液や細胞剥離液への対流を生じさせる方法としては、ピペッティングやポンプ、撹拌翼を用いる等が挙げられる。剥離動作として、剥離後の細胞の品質の観点から、超音波による振動を用いることが好ましい。
　（超音波による振動）
　超音波による振動として、国際公開第２０１６－０４７３６８号に記載されているように、１０ｋＨｚないし１ＭＨｚ程度の周波数をもつ振動を例示できる。振動発生手段は、細胞に超音波による振動を与えることができる手段であれば、特に制限なく用いることができる。一例として特開２００８－９２８５７号公報に記載されているように、チタン酸ジルコン酸鉛（ＰＺＴ）等の超音波発振子を挙げることができる。
　ここで、特開２００６－３１４２０４号公報に記載されているように、培地が充填されて密閉された培養容器の外面に振動子を直接当接させて、培養容器に振動を与えることができる。他には、国際公開第２０１６－０４７３６８号に記載されているように、超音波出射手段を直接容器に接触させるのではなく、超音波出射手段と処理対象領域との間に超音波伝達物質を介在させて、剥離対象である細胞に超音波を入射させることもできる。
　超音波による振動を与える時間としては特に限定はないが、細胞を効果的に剥離し、細胞の生存率も高める観点からは、例えば１秒～１時間、好ましくは５秒～３０分、さらに好ましくは１０秒～１５分である。
　超音波による振動を与える環境温度としては特に限定はないが、細胞生存率を維持する観点からは、２０℃～４０℃が好ましく、特に３０．０℃以上３７．５℃以下であることが好ましい。これにより、細胞剥離時の温度が培養時の温度と近く、細胞への温度変化による影響を少なくでき、生存率を高く保つことができるためである。
　（細胞剥離後の処理）
　剥離動作により剥離した細胞は、新しい基材、ディッシュ、フラスコ等の培養容器に播種されても良いし、細胞の標識などの工程に進めても良い。また、細胞数や細胞生存率の測定のためのサンプルとしても良い。さらに、得られた細胞が会合して細胞塊の状態となる場合では、適宜、細胞の単一化処理を行っても良い。
　（情報処理システムの構成）
　図１は、本発明の実施形態に係るプログラムを実行可能な情報処理システム１１０のハードウェア構成例を示すブロック図である。
　情報処理システム１１０は、コンピュータの機能を有する。例えば、情報処理システム１１０は、デスクトップＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ラップトップＰＣ、タブレットＰＣ、スマートフォン等と一体に構成されていてもよい。
　情報処理システム１１０は、演算および記憶を行うコンピュータとしての機能を実現する。情報処理システム１１０は、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｕｎｉｔ）１１０１、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｃｅｓｓ　Ｍｅｍｏｒｙ）１１０２、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ　Ｏｎｌｙ　Ｍｅｍｏｒｙ）１１０３およびＨＤＤ（Ｈａｒｄ　Ｄｉｓｋ　Ｄｒｉｖｅ）１１０４を備える。また、情報処理システム１１０は、通信Ｉ／Ｆ（インターフェース）１１０５、表示装置１１０６、および入力装置１１０７を備える。ＣＰＵ１１０１、ＲＡＭ１１０２、ＲＯＭ１１０３、ＨＤＤ１１０４、通信Ｉ／Ｆ１１０５、表示装置１１０６、および入力装置１１０７は、バス１１１０を介して相互に接続される。なお、表示装置１１０６および入力装置１１０７は、これらの装置を駆動するための不図示の駆動装置を介してバス１１１０に接続されてもよい。
　図１では、情報処理システム１１０を構成する各部が一体の装置として図示されているが、これらの機能の一部は外付け装置により構成されていてもよい。例えば、表示装置１１０６および入力装置１１０７は、ＣＰＵ１１０１等を含むコンピュータの機能を構成する部分とは別の外付け装置であってもよい。
　ＣＰＵ１１０１は、ＲＡＭ１１０２、ＨＤＤ１１０４等に記憶されたプログラムに従って所定の動作を行うとともに、情報処理システム１１０の各部を制御する機能をも有する。ＲＡＭ１１０２は、揮発性記憶媒体から構成され、ＣＰＵ１１０１の動作に必要な一時的なメモリ領域を提供する。ＲＯＭ１１０３は、不揮発性記憶媒体から構成され、情報処理システム１１０の動作に用いられるプログラム等の必要な情報を記憶する。ＨＤＤ１１０４は、不揮発性記憶媒体から構成され、個別独立分離区画の数や位置に関する情報、蛍光強度等の記憶を行う記憶装置である。
　通信Ｉ／Ｆ１１０５は、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、４Ｇ等の規格に基づく通信インターフェースであり、他の装置との通信を行うためのモジュールである。表示装置１１０６は、液晶ディスプレイ、ＯＬＥＤ（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｌｉｇｈｔ　Ｅｍｉｔｔｉｎｇ　Ｄｉｏｄｅ）ディスプレイ等であって、動画、静止画、文字等の表示に用いられる。入力装置１１０７は、ボタン、タッチパネル、キーボード、ポインティングデバイス等であって、利用者が情報処理システム１１０を操作するために用いられる。表示装置１１０６および入力装置１１０７は、タッチパネルとして一体に形成されていてもよい。
　なお、図１に示されているハードウェア構成は例示であり、これら以外の装置が追加されていてもよく、一部の装置が設けられていなくてもよい。また、一部の装置が同様の機能を有する別の装置に置換されていてもよい。さらに、一部の機能がネットワークを介して他の装置により提供されてもよく、本実施形態を構成する機能が複数の装置に分散されて実現されるものであってもよい。例えば、ＨＤＤ１１０４は、フラッシュメモリ等の半導体素子を用いたＳＳＤ（Ｓｏｌｉｄ　Ｓｔａｔｅ　Ｄｒｉｖｅ）に置換されていてもよく、クラウドストレージに置換されていてもよい。
　（細胞剥離システム）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離システムは、細胞の接着力を低下させる接着力低下部２０１、少なくとも２つの時刻において細胞を計測し細胞情報を取得する計測部２０２、細胞を細胞培養容器の培養面から剥離する剥離部２０４、及び、細胞を剥離する工程を開始する時刻を細胞情報に基づいて決定する決定部２０３を備える。図１１は、細胞剥離システムの概略図である。細胞剥離システム２００は、後述する細胞剥離装置であってもよい。また、細胞剥離システム２００は複数の装置によって構成され、これらの装置によって細胞剥離システム２００の機能が実現されてもよい。
　（細胞剥離装置）
　本発明の実施形態に係る細胞剥離装置の一例は、細胞培養容器の培養面上で培養された細胞を剥離する細胞剥離装置である。また、細胞剥離装置は、細胞が細胞培養容器に接着した状態のまま、細胞剥離液に接触させる培地交換部と、細胞の細胞情報を取得・計測するための細胞情報取得部、超音波照射タイミングを判断する超音波照射判断部と、前記細胞に対して超音波による振動を与えるための超音波照射部と、を有する細胞剥離装置である。
　本発明の実施形態に係る細胞剥離装置１００の構成の一例について、図２の概念図を用いて説明する。図２の構成要素は、１００：細胞剥離装置、１Ｓ：超音波照射部、４０：培養容器移動制御部、４１：アンプ、４２：ファンクションジェネレーター、４３：細胞情報取得部（細胞情報解析部を含むことがある）、４４：細胞培養容器、４５：ピペッティング部、４６：ピペッター移動制御部、４７：廃液回収部、４８：剥離細胞回収部（細胞培養容器）、４９：剥離細胞回収部（チューブ）、５０：洗浄用培地、５１：培養用培地、５２：細胞剥離液、５３：液体輸送制御部、５４：超音波照射判断部（細胞情報解析部を含むことがある）。また、Ｐ４：細胞情報取得時の培養容器の位置、Ｐ５：細胞剥離時の培養容器の位置（超音波照射部にセットされる）、Ｐ６：細胞剥離液の添加、培地交換または細胞回収時の培養容器の位置、Ｐ７：剥離細胞を新しい培養容器に播種する時の新しい培養容器の位置、Ｐ８：細胞剥離液の添加、培地交換または細胞回収時のピペッターの位置、Ｐ９：培地または細胞懸濁液の廃棄時のピペッターの位置、Ｐ１０：細胞懸濁液をディッシュに播種する時のピペッターの位置、Ｐ１１：細胞懸濁液をチューブに回収する時のピペッターの位置である。
　培養容器移動制御部４０は、培養容器４４を保持ならびに移動させるユニットである。
　培養容器移動制御部４０は、細胞剥離環境の温度や湿度を制御する保温器を備えていても良く３７℃に保温できる加温ユニットや加湿ユニットが例示される。培養容器４４の移動のために、例えば、ＸＹＺ電動ステージが用いられる。または、培養容器４４をホールドして移動させるためのロボットアームであってもよい。培養容器移動制御部４０は、培養容器４４を、位置Ｐ４、位置Ｐ５、および位置Ｐ６の間で水平移動させる。位置Ｐ４では、細胞情報取得部４３により、培養容器４４内で培養された細胞情報、例えば位相差画像を取得することができる。位置Ｐ５では、培養容器４４内に対して、超音波照射部１Ｓによる超音波の照射が行われる。また、位置Ｐ６では、ピペッティング部４５により培養容器４４内の溶液が回収、あるいは各種の溶液（培地と呼ぶことがある）が培養容器４４に添加される。ピペッティング部４５には、培地を自動あるいは手動で排出あるいは吸引する機構を設けていても良い。ピペッティング部４５は、液体を輸送できるものであれば構成に制限はなく、例えばチューブポンプであってもよい。またピペッティング部は複数備えていても良く、培地の種類や役割に応じて、独立させておいても良い。
　超音波を用いた細胞剥離のプロセスの例でさらに説明する。
　培養容器４４で細胞を培養し、細胞を剥離したいタイミングとなった際、培養容器４４を位置Ｐ６に配置する。適宜、培養容器移動制御部４０を用いて、培養容器４４を位置Ｐ４に配置して、細胞情報取得部４３で細胞の様子を観察することが出来る。位置Ｐ６に配置された培養容器４４には、細胞が容器に接着している。まず、培地を除去して細胞剥離液に交換する必要がある。そのため、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養容器４４内の培地を回収する。回収した培地は、位置Ｐ９において、廃液回収部４７に捨てられる。各種の培地は、洗浄用培地５０、培養用培地５１、細胞剥離液５２にストックされており、液体輸送制御部５３により、ピペッティング部４５に輸送される。ピペッティング部は上下方向に動くことで、培養容器４４へアクセスすることが可能である。適宜、培養容器４４のフタの開閉システムを有していても良い。培地を除去した後、適宜、容器に接着している細胞を洗浄することもできる。位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養容器４４内に、洗浄用培地５０を、液体輸送制御部５３により、ピペッティング部４５に輸送して、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養容器４４内に洗浄用培地５０を添加する。上記の培地除去方法と同様にして洗浄用培地５０を除去した後、細胞剥離液５２を液体輸送制御部５３によりピペッティング部４５に輸送して、位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養容器４４内に細胞剥離液５２を添加する。
　次に、培養容器移動制御部４０は、培養容器４４を、位置Ｐ４に移動させる。ここで、細胞情報取得部４３で細胞情報を取得しながら、細胞剥離液中で細胞をインキュベートする。インキュベート中を通して、細胞情報取得部４３で細胞情報を取得し、得られた細胞情報を解析し、細胞情報の時系列データを元に曲線あてはめによって剥離動作の開始時刻を決定する。決定は、超音波照射判断部５４で行われる。その後、培養容器移動制御部４０に培養容器４４の移動を指示し、超音波照射部１Ｓ、ファンクションジェネレーター４２、アンプ４１をアクティブにする指示を送信する。
　次に、培養容器移動制御部４０は、培養容器４４を、位置Ｐ５に移動させる。ここで、培養容器４４は、超音波照射部１Ｓにセットされる。超音波剥離ユニットと、その超音波剥離ユニットに任意の周波数、電圧等を入力するファンクションジェネレーター４２とアンプ４１を組み合わせた形態が例示される。決定された開始時刻において、培養容器４４に超音波照射部１Ｓから、超音波が照射され、培養容器４４に接着している細胞を剥離させる。適宜、培養容器４４を、位置Ｐ４に移動させて、細胞情報取得部４３を用いて、細胞の剥離状態をモニターしても良い。
　細胞の剥離が終了したあと、培養容器移動制御部４０は、培養容器４４を、位置Ｐ６に移動させる。位置Ｐ６で、ピペッティング部４５により培養容器４４内の剥離細胞を含む細胞剥離液を回収する。回収した剥離細胞を含む細胞剥離液は、位置Ｐ１０において、剥離細胞回収部４８、例えば、位置Ｐ７に設置した新しい細胞培養容器に播種する。あるいは、位置Ｐ１１において、剥離細胞回収部であるチューブ４９に回収する。これらの回収された細胞は、その後の、細胞培養や細胞計測、細胞標識などのアッセイに用いられる。
　本発明の実施形態に係る細胞剥離装置は、上記の細胞剥離プロセスを制御する制御部をさらに有していても良い。制御部は、細胞剥離装置１００内の各部を動作制御するための手段である。例えば、制御部は、ＣＰＵ等の演算処理部、ＲＡＭ等のメモリ、およびハードディスクドライブ等の記憶部を有するコンピュータにより構成されていても良い。
　制御部には操作部も含んでいても良い。操作部は、表示部および入力部などを有していてもよい。表示部は、制御部から出力される画像データや、細胞剥離装置１００の動作に関わる種々の情報を表示できる。表示部には、例えば、液晶ディスプレイが用いられる。入力部は、ユーザからの種々の指示入力を受け付ける。入力部には、例えば、キーボードやマウスが用いられる。表示部の機能および入力部の機能の双方が、タッチパネルディスプレイ等の単一のユニットであってもよい。
　（実施例）
　以下、実施例、比較例をもって本発明をさらに詳細に説明するが、これは本発明を何ら限定するものではない。
　［実施例１］
　（細胞の基材上の培養）
　ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｈａｍｓｔｅｒ　Ｏｖａｒｙ）細胞をΦ３５ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＨａｍ’ｓ　Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、細胞剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、ディッシュ内に添加した。次に、斜入射照明によりディッシュの細胞培養面の観察像を取得し、画像処理ソフトによりディッシュの細胞培養面全体の平均輝度値を計測した。このときの画像の視野面積は５０ｃｍ２であった。計測は、細胞剥離液をディッシュ内に添加した直後から開始し、３７℃の恒温器内でインキュベートしながら行った。また、計測は５秒間隔で行い、２．５分間行った。
　計測により得られた平均輝度値の時間変化を図４に示す。この時系列データに対して式（２－１）で表される関数を用いて曲線あてはめを行った。ここで、βの値は１として、フィッティングパラメーターＣ０、Ｃ１、τの値を最小二乗法により決定した。得られたＣ０、Ｃ１、τの値は、それぞれ、６２．９、３０．４、４．４であった。曲線あてはめによって得られた曲線を図４に示す。平均輝度値が７７．５に到達する時刻を剥離動作の開始時刻ｔ２と予め定めておき、曲線あてはめによって得られた曲線から開始時刻ｔ２を算出したところ、ｔ２＝２．９分であった。
　細胞情報の計測後、超音波剥離装置にディッシュをセットし、環境温度３７℃において時刻ｔ２から３分間スイープ振動（周波数２９．５－３４．５ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧１００Ｖ）して、細胞を剥離させた。
　剥離した細胞を回収した後、血球計算盤を用いて細胞数の測定及びトリパンブルー染色による生死判別法を用いて生存率の算出を行った。はじめに、剥離した細胞の懸濁液と０．４％トリパンブルー溶液を１：１で混合し、懸濁液に含まれる死細胞を染色した。続いて、懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、血球計算盤のグリッド上にある生細胞および死細胞の数を顕微鏡観察によりカウントした。細胞剥離装置の振動によって剥離された細胞において、カウントされた生細胞数の全細胞数に対する割合を算出し、生存率とした。
　また、超音波剥離後のディッシュに対して、セルスクレーパーを用いて超音波で剥離できなかった細胞も全て剥離した。剥離した細胞の懸濁液を血球計算盤（ＮａｎｏＥｎｔｅｋ製、ＤＨＣ－Ｎ０１）に注入し、顕微鏡観察することによって、剥離された細胞の数を測定した。超音波で剥離した全細胞数とその後セルスクレーパーで剥離した細胞数を合わせて総剥離細胞数とし、総剥離細胞数に対する超音波での剥離細胞数の割合を剥離効率と定義し、算出した。剥離した細胞の生存率と細胞の剥離効率について、それぞれ９５％以上で本発明の効果が得られていると判断した。
　［実施例２］
　剥離動作の開始時刻ｔ２を、τの０．７倍とした以外は、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。このときの剥離動作の開始時刻ｔ２は３．１分であった。
　［実施例３］
　剥離動作の開始時刻ｔ２を、平均輝度値がＣ０＋Ｃ１×０．５に達する時刻とした以外は、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。このときの剥離動作の開始時刻ｔ２は３．０分であった。
　［実施例４］
　実施例１と同様にして、細胞の培養を行った。
　ディッシュ内の培地を除去し、細胞剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、ディッシュ内に添加した。次に、ディッシュを位相差顕微鏡のステージ上にセットして、位相差画像を取得し、画像処理ソフトにより位相差画像の平均輝度値を計測した。このときの画像の視野面積は６ｍｍ２であった。計測は、細胞剥離液をディッシュ内に添加した直後から開始し、３７℃の恒温器内でインキュベートしながら行った。また、計測は１５秒間隔で行い、２．５分間行った。
　計測により得られた平均輝度値の時間変化を図５に示す。この時系列データに対して式（２－１）で表される関数を用いて曲線あてはめを行った。ここで、フィッティングパラメーターＣ０、Ｃ１、τ、βの値を最小二乗法により決定した。得られたＣ０、Ｃ１、τ、βの値は、それぞれ、１９．５、９０．４、１．６、１．８であった。曲線あてはめによって得られた曲線を図５に示す。平均輝度値が１０５に到達する時刻を剥離動作の開始時刻ｔ２と予め定めておき、曲線あてはめによって得られた曲線から開始時刻ｔ２を算出したところ、ｔ２＝２．８分であった。
　細胞情報の計測後、超音波剥離装置にディッシュをセットし、環境温度３７℃において時刻ｔ２から３分間スイープ振動（周波数２９．５－３４．５ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧１００Ｖ）した。その後、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　［実施例５］
　実施例１と同様にして、細胞の培養を行った。
　ディッシュ内の培地を除去し、細胞剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、ディッシュ内に添加した。次に、ディッシュを位相差顕微鏡のステージ上にセットして、位相差画像を取得し、位相差画像から画像処理ソフトを用いて複数の細胞に対して細胞面積を計測した。このときの画像の視野面積は６ｍｍ２であった。計測は、細胞剥離液をディッシュ内に添加した直後から開始し、３７℃の恒温器内でインキュベートしながら行った。また、計測は１５秒間隔で行い、２分間行った。計測した複数細胞の細胞面積を平均化し、この細胞剥離液と接触した直後（インキュベート時間ゼロ）の細胞の面積をＡ１とした。
　その後、インキュベート時間ｔの細胞の面積をＡ２とし、細胞面積の変化率Ｘを以下の式（３）で求めた。
　Ｘ＝（Ａ１－Ａ２）／Ａ１・・・（３）
　計測により得られた細胞面積の変化率の時間変化を図６に示す。この時系列データに対して式（２－１）で表される関数を用いて曲線あてはめを行った。ここで、Ｃ０の値は０、βの値は１として、フィッティングパラメーターＣ１、τの値を最小二乗法により決定した。得られたＣ１、τの値は、それぞれ、０．７０、３．５であった。曲線あてはめによって得られた曲線を図６に示す。細胞面積の変化率が０．４に到達する時刻を剥離動作の開始時刻ｔ２と予め定めておき、曲線あてはめによって得られた曲線から開始時刻ｔ２を算出したところ、ｔ２＝２．９分であった。
　細胞情報の計測後、超音波剥離装置にディッシュをセットし、環境温度３７℃において時刻ｔ２から３分間スイープ振動（周波数２９．５－３４．５ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧１００Ｖ）した。その後、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　［比較例１～５］
　実施例１において、細胞情報の計測を行わず、開始時刻ｔ２を表１に示すように変更した。それ以外は実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　表１に実施例１～実施例５、比較例１～比較例５における剥離した細胞の生存率と細胞の剥離効率の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　［実施例６］
　（細胞の培養）
　マウス骨格筋筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞をΦ３５ポリスチレンディッシュ（コーニング社製）に５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で播種し、３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養した。培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）にＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（シグマアルドリッチ社製）を１０％、ペニシリン－ストレプトマイシン（１００００Ｕ／ｍｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を１％添加したものを用いた。培養は４８時間行ない、位相差顕微鏡で細胞の様子を観察し、細胞接着ならびに増殖を確認した。ディッシュの細胞占有面積率は８割程度であった。
　（細胞の剥離）
　ディッシュ内の培地を除去し、細胞剥離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（－）、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を、ディッシュ内に添加した。次に、斜入射照明によりディッシュの細胞培養面の観察像を取得し、画像処理ソフトによりディッシュの細胞培養面全体の平均輝度値を計測した。このときの画像の視野面積は５０ｃｍ２であった。計測は、細胞剥離液をディッシュ内に添加した直後から開始し、３７℃の恒温器内でインキュベートしながら行った。また、計測は１秒間隔で行い、５分間行った。
　計測により得られた平均輝度値の時間変化を図７に示す。この時系列データに対して式（２－５）で表される関数を用いて曲線あてはめを行った。ここで、フィッティングパラメーターＣ０、Ｃ１、Ｃ２、τの値を最小二乗法により決定した。得られたＣ０、Ｃ１、Ｃ２、τの値は、それぞれ、７８．４、１６．９、１．３４、５．１５であった。曲線あてはめによって得られた曲線を図７に示す。平均輝度値が９０．０に到達する時刻を剥離動作の開始時刻ｔ２と予め定めておき、曲線あてはめによって得られた曲線から開始時刻ｔ２を算出したところ、ｔ２＝６．２分であった。
　細胞情報の計測後、超音波剥離装置にディッシュをセットし、環境温度３７℃において時刻ｔ２から３分間スイープ振動（周波数２９．５－３４．５ｋＨｚ、スイープ周期１ｓ、電圧１００Ｖ）して、細胞を剥離させた。その後、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　［比較例６～９］
　実施例６において、細胞情報の計測を行わず、開始時刻ｔ２を表２に示すように変更した。それ以外は実施例６と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　表２に実施例６、比較例６～比較例９における剥離した細胞の生存率と細胞の剥離効率の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　［実施例７］
　剥離動作の開始時刻ｔ２を、平均輝度値が９２．５に到達する時刻とした以外は、実施例６と同様にして細胞情報の計測までを行った。このときの剥離動作の開始時刻ｔ２は７．３分であった。
　細胞情報の計測後、図８に示すせん断応力付与機構で、１０：ディッシュを、１１：保持機構にセットした。１２：回転機構と１３：衝撃印加機構を使って、ディッシュ外周に５Ｎの荷重を、５秒ごとに計１２回、ディッシュ外周に沿って３０°ごとに荷重印加位置を変更しながら付与した。その後、実施例１と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　［比較例１０～１３］
　実施例７において、細胞情報の計測を行わず、開始時刻ｔ２を表３に示すように変更した。それ以外は実施例７と同様にして細胞の生存率と細胞の剥離効率を評価した。
　表３に実施例７、比較例１０～比較例１３における剥離した細胞の生存率と細胞の剥離効率の結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　本発明の実施形態は、記憶媒体に記録されたコンピュータ実行可能命令（例えば、１つ以上のプログラム）を読み出して実行するシステムまたは装置（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ））のコンピュータによって、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行する１つまたは複数の回路を含むシステムまたは装置のコンピュータによって、および、例えば、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために、記憶媒体からコンピュータ実行可能命令を読み出して実行することによって、および／または、上記実施形態の１つまたは複数の機能を実行するために１つまたは複数の回路を制御することによって、システムまたは装置のコンピュータによって実行される方法によって実現することもできる。コンピュータは、１つ以上のプロセッサ（例えば、中央処理装置（ＣＰＵ）、マイクロ処理装置（ＭＰＵ））を含むことができ、コンピュータ実行可能命令を読み出して実行するために、別個のコンピュータまたは別個のプロセッサのネットワークを含むことができる。コンピュータ実行可能命令は、例えば、ネットワークまたは記憶媒体からコンピュータに提供されてもよい。記憶媒体は、例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、分散コンピューティングシステムの記憶装置、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、フラッシュメモリデバイス、メモリカードなどのうちの１つ以上を含み得る。
　本実施形態の開示は以下の方法及び構成を含む。
　（方法１）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、
　少なくとも２つの時刻において、前記細胞を計測し細胞情報を取得する計測工程、
　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程、および、
　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定工程を含むことを特徴とする細胞剥離方法。
　（方法２）
　前記細胞剥離方法は、前記細胞を細胞剥離液に接触させインキュベートするインキュベート工程を含むことを特徴とする方法１に記載の細胞剥離方法。
　（方法３）
　前記時刻ｔ１は、前記接着力低下工程の開始時刻ｔ０から３０秒以上１５分以下の時刻であることを特徴とする方法１または２に記載の細胞剥離方法。
　（方法４）
　前記計測工程において、前記細胞情報が取得される時刻のうち、少なくとも２つの時刻どうしの間隔は１秒以上１分以下であることを特徴とする方法１乃至３のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法５）
　前記接着力低下工程の開始時刻ｔ０、前記時刻ｔ１および前記時刻ｔ２が、（ｔ２－ｔ０）／（ｔ１－ｔ０）≧１．１の関係を満たすことを特徴とする方法１乃至４のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法６）
　前記剥離工程は、前記細胞に超音波による振動を与える工程を含むことを特徴とする方法１乃至５のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法７）
　前記決定工程は、前記細胞情報及び前記細胞情報が取得された時刻に基づいて近似曲線を取得し、前記近似曲線に基づいて前記時刻ｔ２を決定することを特徴とする方法１乃至６のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法８）
　前記決定工程は、前記近似曲線に基づいて算出される細胞情報と、予め設けられた前記細胞情報の閾値とが等しくなる時刻を、前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする方法７に記載の細胞剥離方法。
　（方法９）
　前記決定工程は、前記近似曲線として下記式を用いて曲線あてはめを行い、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
　ｔを前記接着力低下工程の開始時刻を０としたときの前記細胞情報が取得された時刻ｔとし、ｆ（ｔ）を時刻ｔにおいて取得された細胞情報とし、予め０．３以上２以下であるＡを設け、前記τのＡ倍の時刻Ａτを前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする方法７に記載の細胞剥離方法。
　（方法１０）
　前記決定工程は、前記近似曲線として下記式を用いて曲線あてはめを行い、
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000015
　ｔを前記接着力低下工程の開始時刻を０としたときの前記細胞情報が取得された時刻ｔとし、ｆ（ｔ）を時刻ｔにおいて取得された細胞情報とし、予め０．３以上０．９以下であるＢを設け、ｆ（ｔ）がＣ０＋Ｃ１×Ｂと等しくなる時刻を前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする方法７に記載の細胞剥離方法。
　（方法１１）
　前記決定工程は、前記剥離工程を終了する時刻ｔ３を決定することを特徴とする方法１乃至１０のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法１２）
　前記細胞情報は、前記細胞の画像から計測される、前記細胞の面積、前記細胞の面積の変化率、前記細胞の輝度値、前記画像のうち閾値よりも輝度値が大きい領域の面積率、および、前記画像の輝度値の少なくともいずれかであることを特徴とする方法１乃至１１のいずれか一項に記載の細胞剥離方法。
　（方法１３）
　前記計測工程は、前記接着力低下工程の開始後に行われることを特徴とする方法１乃至１２のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
　（方法１４）
　前記近似曲線は、前記接着力低下工程の開始後に経過した時間と、前記細胞の輝度値との近似曲線であることを特徴とする方法１乃至１３のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
　（方法１５）
　前記近似曲線は、前記接着力低下工程の開始後に経過した時間と、前記細胞の面積との近似曲線であることを特徴とする方法１乃至１３のいずれか１項に記載の細胞剥離方法。
　（方法１６）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、
　前記細胞を計測し、前記細胞に関する時系列データを取得する計測工程、
　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程、および、
　前記時系列データに基づいて、前記剥離工程を開始する時刻を予測する予測工程を含むことを特徴とする細胞剥離方法。
　（方法１７）
　前記時系列データは、少なくとも２つの時刻で計測された細胞情報と、前記細胞情報が計測された時刻と、であって、
　前記細胞情報は、前記細胞の輝度値と前記細胞の面積との少なくともいずれかであることを特徴とする方法１６に記載の細胞剥離方法。
　（構成１）
　方法１乃至１７のいずれか一項に記載の細胞剥離方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
　（構成２）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、
　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下部、
　少なくとも２つの時刻において、前記細胞を計測し細胞情報を取得する計測部、
　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離部、および、
　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定部を有することを特徴とする細胞剥離システム。
　（構成３）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、
　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下部、
　前記細胞を計測し、前記細胞に関する時系列データを取得する計測部、
　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離部、および、
　前記時系列データに基づいて、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする細胞剥離システム。
　（構成４）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、
　少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで前記培養面との接着力を低下させた前記細胞の細胞情報を取得する計測部、および、
　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定部を含むことを特徴とする情報処理装置。
　（構成５）
　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、
　少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで前記培養面との接着力を低下させた前記細胞に関する時系列データを取得する計測部、および、
　前記時系列データに基づいて、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする情報処理装置。
　本発明は上記実施の形態に制限されるものではなく、本発明の精神及び範囲から離脱することなく、様々な変更及び変形が可能である。従って、本発明の範囲を公にするために、以下の請求項を添付する。
　本願は、２０２２年１１月２９日提出の日本国特許出願特願２０２２－１９００４０を基礎として優先権を主張するものであり、その記載内容の全てを、ここに援用する。

Claims (22)

  1. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、
    　少なくとも２つの時刻において、前記細胞を計測し細胞情報を取得する計測工程、
    　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程、および、
    　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定工程を含むことを特徴とする細胞剥離方法。
  2. 　前記細胞剥離方法は、前記細胞を細胞剥離液に接触させインキュベートするインキュベート工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  3. 　前記時刻ｔ１は、前記接着力低下工程の開始時刻ｔ０から３０秒以上１５分以下の時刻であることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  4. 　前記計測工程において、前記細胞情報が取得される時刻のうち、少なくとも２つの時刻どうしの間隔は１秒以上１分以下であることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  5. 　前記接着力低下工程の開始時刻ｔ０、前記時刻ｔ１および前記時刻ｔ２が、（ｔ２－ｔ０）／（ｔ１－ｔ０）≧１．１の関係を満たすことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  6. 　前記剥離工程は、前記細胞に超音波による振動を与える工程を含むことを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  7. 　前記決定工程は、前記細胞情報及び前記細胞情報が取得された時刻に基づいて近似曲線を取得し、前記近似曲線に基づいて前記時刻ｔ２を決定することを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  8. 　前記決定工程は、前記近似曲線に基づいて算出される細胞情報と、予め設けられた前記細胞情報の閾値とが等しくなる時刻を、前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする請求項７に記載の細胞剥離方法。
  9. 　前記決定工程は、前記近似曲線として下記式を用いて曲線あてはめを行い、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
    　ｔを前記接着力低下工程の開始時刻を０としたときの前記細胞情報が取得された時刻ｔとし、ｆ（ｔ）を時刻ｔにおいて取得された細胞情報とし、予め０．３以上２以下であるＡを設け、前記τのＡ倍の時刻Ａτを前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする請求項７に記載の細胞剥離方法。
  10. 　前記決定工程は、前記近似曲線として下記式を用いて曲線あてはめを行い、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
    　ｔを前記接着力低下工程の開始時刻を０としたときの前記細胞情報が取得された時刻ｔとし、ｆ（ｔ）を時刻ｔにおいて取得された細胞情報とし、予め０．３以上０．９以下であるＢを設け、ｆ（ｔ）がＣ０＋Ｃ１×Ｂと等しくなる時刻を前記時刻ｔ２として決定することを特徴とする請求項７に記載の細胞剥離方法。
  11. 　前記決定工程は、前記剥離工程を終了する時刻ｔ３を決定することを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  12. 　前記細胞情報は、前記細胞の画像から計測される、前記細胞の面積、前記細胞の面積の変化率、前記細胞の輝度値、前記画像のうち閾値よりも輝度値が大きい領域の面積率、および、前記画像の輝度値の少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  13. 　前記計測工程は、前記接着力低下工程の開始後に行われることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  14. 　前記近似曲線は、前記接着力低下工程の開始後に経過した時間と、前記細胞の輝度値との近似曲線であることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  15. 　前記近似曲線は、前記接着力低下工程の開始後に経過した時間と、前記細胞の面積との近似曲線であることを特徴とする請求項１に記載の細胞剥離方法。
  16. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離方法であって、
    　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下工程、
    　前記細胞を計測し、前記細胞に関する時系列データを取得する計測工程、
    　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程、および、
    　前記時系列データに基づいて、前記剥離工程を開始する時刻を予測する予測工程を含むことを特徴とする細胞剥離方法。
  17. 　前記時系列データは、少なくとも２つの時刻で計測された細胞情報と、前記細胞情報が計測された時刻と、であって、
    　前記細胞情報は、前記細胞の輝度値と前記細胞の面積との少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１６に記載の細胞剥離方法。
  18. 　請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の細胞剥離方法をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
  19. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、
    　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下部、
    　少なくとも２つの時刻において、前記細胞を計測し細胞情報を取得する計測部、
    　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離部、および、
    　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定部を有することを特徴とする細胞剥離システム。
  20. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離システムであって、
    　前記細胞に刺激を与えることで、前記細胞が前記細胞培養容器に接着したまま前記細胞の接着力を低下させる接着力低下部、
    　前記細胞を計測し、前記細胞に関する時系列データを取得する計測部、
    　前記細胞を前記培養面から剥離する剥離部、および、
    　前記時系列データに基づいて、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする細胞剥離システム。
  21. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、
    　少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで前記培養面との接着力を低下させた前記細胞の細胞情報を取得する計測部、および、
    　前記少なくとも２つの時刻のうち後の時刻を時刻ｔ１とする場合、時刻ｔ１より後の時刻であって、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻ｔ２を、前記細胞情報に基づいて決定する決定部を含むことを特徴とする情報処理装置。
  22. 　細胞培養容器の培養面上に接着した細胞を剥離する細胞剥離装置を制御する情報処理装置であって、
    　少なくとも２つの時刻において、刺激を与えることで前記培養面との接着力を低下させた前記細胞に関する時系列データを取得する計測部、および、
    　前記時系列データに基づいて、前記細胞を前記培養面から剥離する剥離工程を開始する時刻を予測する予測部を含むことを特徴とする情報処理装置。
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