EP3164484A1 - Gewebemodell und verfahren zur herstellung hiervon sowie dessen verwendung - Google Patents

Gewebemodell und verfahren zur herstellung hiervon sowie dessen verwendung

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EP3164484A1
EP3164484A1 EP15747391.9A EP15747391A EP3164484A1 EP 3164484 A1 EP3164484 A1 EP 3164484A1 EP 15747391 A EP15747391 A EP 15747391A EP 3164484 A1 EP3164484 A1 EP 3164484A1
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EP
European Patent Office
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cells
tissue
tumor
tissue model
model
Prior art date
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Pending
Application number
EP15747391.9A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas BLAESER
Benjamin THEEK
Twan LAMMERS
Fabian Kiessling
Horst Fischer
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Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Original Assignee
Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
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Filing date
Publication date
Application filed by Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH filed Critical Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/76—Agarose, agar-agar

Definitions

  • the present application is directed to a method of making a tissue model having utility structures.
  • the application is directed to these tissue models thus obtainable as well as their use as models for tissue genesis, in particular tumorigenesis, including angiogenesis and the tissue model.
  • a method for testing and identifying drug candidates including treatment strategies is provided.
  • a first A step towards a 3D tumor model was made with the study of statically cultured cell-loaded microparticles, eg, Horning JL, et al. Mol. Pharm. 2008 5: 849-62.
  • statically cultured cell-loaded microparticles eg, Horning JL, et al. Mol. Pharm. 2008 5: 849-62.
  • microengineering eg photolithography
  • microfluidics more complex hybrid systems of synthetic microchannels, membranes and cells embedded in biomaterials could be developed in the following years Huh, D. et al., 201 1, Trends Cell Biol. 21: 745-54.
  • Systems prepared in this way are already being used to study angiogenesis and tumor cell extravasation, eg, described in Zheng, Y., et al., Proc. Natl. Acad.
  • Bioprinting is a special tissue engineering process that uses the principle of generative manufacturing techniques - also known as rapid prototyping - to generate three-dimensional living tissue.
  • bioprinting uses cell-loaded hydrogels as a building material. According to a 3D model, this layer is applied layer by layer. Hydrogels mimic the extracellular matrix of natural tissue, providing a cell-friendly environment for 3D tissue engineering, see e.g. Lee, K.Y., Chem Ref 2001; 101: 1869-80.
  • hydrogels are easy to handle and dispense.
  • the gel solidifies, so that successive layers can be applied successively.
  • parameters such as the gel concentration, the crosslinker concentration, the pH value and the temperature Elasticity and polymerization time and polymerization rate can be adjusted.
  • Bioprinting can be used to construct complex 3D tissue constructs of different materials with different cell types, as described in various ways in the literature, eg Shuurman W., et al., Biofabrication 201 1; 3: 021001.
  • tumor angiogenesis models in particular to improve the production methods thereof, in order to provide corresponding tissue models for screening methods.
  • These models should be suitable for examining tumor growth, tumor angiogenesis and tumor therapy effects.
  • Both the tumor or the tissue structure and the supply structure should consist of essentially naturally obtained materials, preferably biological material, such as corresponding hydrogels and cells.
  • biological material such as corresponding hydrogels and cells.
  • the individualization of the tissue model should be possible in the present case.
  • the present invention provides a method of making a tissue model having utility structures.
  • This method comprises the steps of: a) applying a living cell composition to or around a preformed first structure to form a coating on and optionally completely encasing it around the preformed first structure, the composition being suitable as a coating Train supply structure; b) optionally embedding this coated first structure and / or cultivating the coated structure to form the utility structure;
  • the present invention further includes corresponding tissue models and the use of these tissue models for the analysis of tissue genesis, in particular tumorigenesis, including aniogenesis.
  • the use of the tumor tissue model to test a possible therapy with a predetermined therapy or to stratify a selected therapy to treat the tumor as reflected by the tissue model is suitable.
  • the application is directed to methods for testing and identifying potential drug candidates using the tissue model of the present invention to identify those potential drug candidates that exhibit a pharmacological effect on the tissue model.
  • These potential drug candidates are, in particular, those which, in the tissue model, exhibit cytotoxic, cytostatic, tumor-affecting, ie in particular anti-angiogenic and anti-inflammatory properties.
  • the inventors were able to successfully generate three-dimensional biomimetic tumor angiogenesis models, also referred to as 3D-TAM, with the aid of a 3D bio-printer.
  • 3D-TAM three-dimensional biomimetic tumor angiogenesis models
  • both the supply structure of the tissue model and the tissue structure of the tissue model are determined Fabric model produced.
  • the following invention relates to an artificially constructed tissue structure, such as a tumor, which is seated on a supply structure, usually a supply vessel, and which can be appropriately cultured and supplied via this supply structure.
  • Angiogenesis is thereby induced in the tissue structure, such as the tumor, so that angiogenesis takes place on the basis of the tissue structure, such as the tumor, in order to enable the tissue structure / tumor to be connected to the supply structure during cultivation and thus to improve the supply ,
  • This tissue model with supply structure allows a reduction in the number of experimental animals, since this model can be used after the normal cell culture but before first / ' nv / Vo experiments in the animal, for example, to test potential drug candidates.
  • the tissue model which can be produced according to the invention is also suitable for developing a strategy of tumor therapy tailored individually to the patient with the aid of preliminary investigations carried out in vitro.
  • the tumor cells for the tissue model and possibly also the cells necessary for the supply structure are isolated from the individual.
  • the tissue structure having the supply structure is generated in order to test possible forms of therapy on this tissue model and thus to determine the most effective form of therapy for the treatment of the individual.
  • the biomimetic tissue model according to the invention is characterized in that both the structure and the composition of the supply structure and the structure and composition of the tissue structure and thus of the entire tissue model can be individually designed on account of the synthetic production process. That is to say, by using the 3D bioprinting technology according to the invention, the tumor compositions can be distinguished in their type and variety of printed cells as well as the structure and composition of the tumor cells. composition of the supply structure. Furthermore, by the individual supply of the tissue model on the supply structure, for example, a comprehensive and individual testing in relation to a therapy is possible.
  • FIG. 1 shows schematically the various steps of the method according to the invention.
  • the first structure is provided on a carrier.
  • the composition having living cells is applied to this first structure in accordance with the invention in order to form a supply structure as a coating.
  • FIG. 1C shows the tissue model according to the invention with the supply structure and the tissue structure constructed thereon.
  • FIG. 1 D shows a section through the fabric model according to the invention.
  • the inner channel of the supply structure referred to herein as a flow channel, allows a passage of fluids.
  • the delivery channel has a two-layered structure, an inner layer with endothelial cells and an outer layer with fibroblasts to correspond to a vascular vessel.
  • FIG. 1E shows the tissue model according to the invention as an artificial tumor with a supply structure, the vessel canal, embedded in an embedding compound.
  • the vessel channel is connected for the passage of fluids, with connections to a medium flow. Thereby, e.g. to be examined molecules are entered with the medium in the tissue model.
  • the present invention is directed to a method of making a tissue model having utility structures, comprising the steps of: a) applying a living cell composition to or about a preformed first structure to form a coating on and optionally completely encasing it around the preformed first structure, the composition being adapted to form a coating as a supply structure;
  • step d) optionally embedding the tissue model obtained in step c).
  • the method according to the invention is characterized in that, in a first step, the supply structure is produced, usually with a 3D bioprinting method that can be done by printing, spraying or extruding.
  • a coating is applied to a preformed first structure.
  • This coating contains living cells to form the supply structure. If desired, this coating may represent a complete sheathing, so that a supply vessel-like structure is obtained.
  • the resulting coated first structure may then be embedded in a suitable medium. Suitable media are discussed below.
  • This coated first structure may either be embedded or further cultured in culture medium to form the supply structure, e.g. in the form of a supply vessel.
  • the living cell composition for coating the preformed first structure is one which comprises cells and is suitable for use Formation of vessel-forming cells is.
  • this composition includes endothelial cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells or progenitor cells thereof.
  • precursor cells includes multipotent cells as well as direct progenitor cells of the above-mentioned endothelial cells, fibroblasts and / or smooth muscle cells.
  • multipotent cells refers to those cells that can still differentiate into two or more cell types: multipotent cells include, for example, totipotent and pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells, precursor cells include endothelial cell direct progenitor cells, fibroblasts or smooth Muscle cells, including human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), in one embodiment, human embryonic stem cells are excluded.
  • multipotent cells include, for example, totipotent and pluripotent stem cells, induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells, precursor cells include endothelial cell direct progenitor cells, fibroblasts or smooth Muscle cells, including human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), in one embodiment, human embryonic stem cells are excluded.
  • UAVECs human umbilical vein endothelial cells
  • the application to the preformed first structure can take place in one or more steps or layers.
  • the goal is the formation of the supply structure, such as a vascular structure.
  • the inner layer is an endothelial cell layer, while the outer layer is formed by fibroblasts.
  • a composition having endothelial cells or progenitor cells thereof is applied to the preformed first structure in a first step, and a composition comprising fibroblasts or precursor cells in a further step.
  • these cell types can also be applied in one step.
  • the preformed first structure is in one embodiment a removable support material. In another embodiment, this preformed structure may be a solid structure. In yet another embodiment, this preformed first structure is formed on a surface. This is done with a removable material, eg biomaterials such as polyethylene glycol, Gelatin, fats and waxes or other easily removable materials.
  • This preformed first structure also referred to herein as a channel core, is formed on a surface, for example by a printing process. This structure is one that can be removed at a later time, eg, by dissolution, rinsing, etc.
  • the first structure is elongated.
  • the first structure may further be branched.
  • the resulting utility structure can be further functionalized. This includes in the interior and exterior of the supply structure, an introduction of other cells but also an inner or outer coating with functional ingredients.
  • This preformed first structure is then coated with the living cell composition, e.g. with a printing process by printing, spraying or extruding.
  • the composition is one which, at the time of application, is a liquid-viscous composition and which is then e.g. cured by polymerization.
  • Materials suitable for this purpose are known hydrogels including alginate, agarose, hyaluronan, fibrinogen, extracellular matrix components, gelatin, collagen, peptide hydrogels, etc. In one embodiment, these are natural materials, in another embodiment synthetic materials.
  • the gels may be hydrophilic or hydrophobic gels. Suitable hydrogels include those derived from collagen, hyaluronate, fibrin, alginate, agarose, hydrolyzates, and combinations thereof. Other suitable hydrogels which are not of the natural origin but are obtained synthetically include those derived from polyacrylic acid and derivatives thereof, polyethylene oxides and copolymers thereof, polyvinyl alcohols, polylactic acid, etc.
  • the materials used are biomaterials.
  • a dissolvable or removable material is used, which in particular has non-cytotoxic properties or can be removed under non-cytotoxic conditions. Suitable for this were gelatin and polyethylene glycols.
  • Hydrogels which are particularly suitable for the living cell compositions include alginate, agarose, chitosan, fibrinogen, collagen, etc., such as a combination of agarose and gelatin.
  • the gel is selected from hydrogel, novogel TM, agarose, alginate, gelatin, Matrigel TM, hyaluronan, poloxamer, peptide hydrogels, polyethylene glycol, silicone gels, polylactic acid gels, or combinations thereof.
  • the hydrogel is a thermo-reversible gel, i.e., it is not liquid at room temperature, but has a gel-forming temperature at> 25 degrees, such as> 30 degrees, such as> 35 degrees, e.g. > 40 degrees.
  • the present preformed first structure with coating, for example formed in a plurality of layers, suitable for forming the supply structure is embedded in one embodiment of the invention.
  • a suitable embedding medium possible embedding media, such as those used in 3D bioprinting, can be used.
  • this includes compositions consisting of agarose, gelatin, polyacrylamide, polyacrylic acid and their derivatives, Polyethylene oxide and its co-polymers, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes, polypeptides, polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate, silicones, as well as chemically, biologically or physically modified variants of said materials.
  • Suitable compositions include combinations of agarose and gelatin.
  • this structure is then cultured for a predetermined period of time to facilitate the formation of the supply structure, e.g. to allow the formation of vascular vascular structures.
  • Such cultivation takes place under known conditions.
  • the duration of such cultivation is at least one week, e.g. a maximum of two weeks, to form the supply structure to obtain a vascular vessel similar to a blood vessel.
  • This supply structure has an inner channel and is usually elongated. If appropriate, the structure can be branched.
  • the method according to the invention further comprises applying a suspension containing living cells to the coating or the postculturing of the present supply structure.
  • the cell suspension after further cultivation, forms a tissue structure on the coating or supply structure to obtain a tissue model.
  • the cells are already suspended in the gel to be applied.
  • the gel can first be applied to the coating or the formed supply structure and then the cells are introduced site-specifically, for example injected. In one embodiment, these steps may also be combined. That is, additional cells, such as tumor cells, are introduced into the present tissue structure of gel and cells.
  • tissue model is understood here to mean: a synthetically produced, cell-containing 3D tissue with at least two partial structures. tures, supply structure and tissue structure.
  • supply structure is understood in the present case as follows: A synthetically produced, cell-containing 3D cell structure having an inner region which can form a cavity and has no cells, this inner region having a first access and at least one second access, wherein These fluid additions can be delivered and removed, and an outer region with cells that form a cell structure, such as a cell structure similar to a vascular cell structure
  • the supply structure is typically elongate and may be branched.
  • tissue structure as used herein means: a synthetically produced 3D cell structure which has cells at least in some regions, for example present in the entire structure
  • the tissue structure is one that comprises tumor cells in one embodiment and cells such as progenitor cells
  • vessels forming blood vessel-like structures can be applied directly to the living cell-containing suspension applied to the coating or the supply structure according to the invention
  • a bioresorbable separation layer may be present between the suspension to form the fabric structure and the coating or utility structure, such a release layer may be one based on polylactide, polycaprolactone, or other gels finally the gel for embedding the coated first structure.
  • Such a spacing can then be useful in order to prevent premature proliferation of the cells present in the tissue structure or the suspension into the supply structure and thus possibly to prevent clogging thereof.
  • the supply structure is already completely formed, for example in the form of a vascular vessel, then the suspension containing living cells can be applied directly to this supply structure.
  • the living cells contained in the suspension have tumor cells in one embodiment.
  • these tumor cells are applied to the supply structure as tumor tissue structures.
  • These tumor cells are living tumor cells, eg primary tumor cells isolated from an individual whose therapy is to be stratified or in which the therapy form is to be determined on the basis of this tissue model.
  • This suspension may further comprise other types of cells, in particular fibroblasts or endothelial cells but also smooth muscle cells. These cells are suitable for neovascularization (angiogenesis).
  • neovascularization can take place both within the tissue structure and between tissue structure and supply channel. By the latter, a connection of the optionally formed in the fabric structure vessels to the supply channel can be ensured.
  • the tissue structures may be formed such that the entire tissue structure is formed with the same cell suspension.
  • the tissue structure can be formed using more than one suspension of different composition. This makes it possible to form structured fabric structures, e.g. those in which in certain areas only tumor cells are present or in which in certain areas other cell types, such as fibroblasts, smooth muscle cells or endothelial cells are present to represent different tissue structures.
  • the suspension is one which comprises a medium suitable for 3D printing.
  • This medium is one such as the above-mentioned medium for printing or coating the first structure.
  • this medium is a gel of the type mentioned above.
  • a hydrogel is used, such as collagen, fibrinogen, alginate, hyaluronan, gelatin, agarose, chitosan, Matrigel TM, hydrogels based on heparin and elastin, polyacrylic acid and its Derivatives, polyethylene oxide and its co-polymers, polyvinyl alcohol, polyphosphazenes and polypeptides, including chemically, biologically or physically modified forms of said hydrogels.
  • Suitable gels include a combination of agarose and gelatin.
  • the tissue model is a tumor tissue model with a tissue structure containing tumor cells, wherein the suspension containing living cell is one containing tumor cells, such as primary tumor cells.
  • the suspension contains live tumor cells and stromal cells such as endothelial cells, fibroblasts, myofibroblasts, immune cells including macrophages and leukocytes. These are, in particular, primary cells, including stem cells and progenitor cells (progenitor cells) of these cell types.
  • the suspension is in the form of a hydrogel or a biocompatible polymer.
  • Suitable embedding media are the abovementioned media, namely gels, such as agarose, gelatin, polyacrylamide, polyacrylic acid and its derivatives, polyethylene oxide and its co-polymers, polyvinyl alcohols, polyphosphazenes, polypeptides, polydimethylsiloxane, polymethyl methacrylate, silicones, and also chemically, biologically or physically Modified variants of the materials mentioned, are used.
  • the tissue model can be used in culture media as are well known to those skilled in the art.
  • the investment material or the embedding medium these terms are used interchangeably herein, is one that is cytocompatible.
  • cytocompatible means that the embedding medium or the embedding mass exhibits cell and tissue compatibility.
  • bioprinting refers to the application of cell-loaded hydrogels. These hydrogels mimic the extracellular matrix of natural tissue and thus provide a cell-friendly environment for the present manufacturing process.
  • the hydrogels can be handled appropriately well and by induction, e.g. chemically, thermally or by light, solidify by polymerization.
  • the application can be done by means of printing, spraying or extrusion. In one embodiment, the application is carried out by printing e.g. through a 3D printer.
  • the preformed material forming the first structure may be removed after coating and, if necessary, forming the supply structure.
  • this first structure is removed, for example by dissolving it.
  • a suitable gel is a combination of agarose and gelatin. By appropriate thermal or chemical conditions, these gels can then be dissolved so that a channel is formed internally in the supply structure. Through this channel can then the necessary, the supply of Be fed to tissue models serving food etc.
  • the supply structure can be used to supply the potential active substance candidates to be tested as well as chemical substances, biochemical / biological factors (eg cytokines, hormones, growth factors) or other cell types (eg macrophages) in order to test their effects on the tissue model.
  • biochemical / biological factors eg cytokines, hormones, growth factors
  • cell types eg macrophages
  • the carrier on which the first structure is applied or which is integrated in the first structure can be designed such that it can be tempered, e.g. can be cooled or heated. This makes it possible to remove the materials forming the first structure after coating and curing. In the case of PEG or gelatin, heating to 37 ° C may result in liquefaction thereof while the coating-forming gel remains in its shape after cure and thus a channel is formed in that supply structure which provides for both the cells in the supply structure as well as in the tissue structure.
  • the method according to the invention is based on the idea of providing an improved tissue model by sequentially forming the structures.
  • the present invention is directed to a fabric model so available.
  • the fabric model obtainable in accordance with the invention is characterized in that it has a supply structure and a fabric structure. Due to the supply structure, a complete supply is possible.
  • the supply structure supplies both the cells of the supply structure and the cells of the tissue structure.
  • the angiogenesis in the tissue structure / tumor and thus the connection of this tissue structure / tumor is promoted to the supply structure.
  • different conditions can be simulated. In this way, hypoxic environments can be provided in the appropriate atmosphere.
  • About the supply structure and connected to supply vessels can a long-term cultivation of the tissue model done.
  • additives can be supplied to the tissue model at temporally limited times, for example potential drug candidates, in order to test their effect on the tissue model.
  • various physical or chemical as well as cellular parameters can be altered on this tissue model. These include parameters such as pH values, CO2 level, pressure, flow rate and temperature, but also the provision of additives such as growth factors and cytokines as well as cells, etc.
  • the tissue model according to the invention can be used in a variety of ways. As stated, studies on the influence of potential drug candidates on the tissue model can be performed. The tissue model can show both tissue structures of healthy origin and tissue structures with tumor cells or other cells to be treated. The tissue model thus allows the assessment of an effect of these potential drug candidates on healthy and altered tissue. It allows a systematic analysis of the various parameters.
  • a reproducible model can be provided, which can be used, for example, in the pharmaceutical industry, for example as an intermediate step between the investigation of potential drug candidates in the cell culture and the subsequent in vivo animal experiments. This significantly reduces the number of animal experiments.
  • the tissue model according to the invention can be used as a model for tissue genesis, in particular tumorigenesis.
  • angiogenesis can be induced and examined in tissue.
  • the tumor tissue model is used for testing in a therapy of a predetermined form of therapy or for stratifying the therapy for treating a tumor.
  • the tissue model is thereby established from cells of the individual to be treated in order subsequently to test the therapeutic options in vitro.
  • This has the advantage that the already weakened patient Only the optimal form of therapy for him, instead of having to be consulted beforehand to test a range of therapies, including their side effects.
  • Both anti-angiogenesis and antiinflammatory as well as cytostatic and cytotoxic effects can be investigated on the tissue model.
  • this tissue model can be constructed according to individual requirements, for example, the tissue structure can show different areas with different compositions of cells and cell types. The same applies to the supply structure.
  • tissue model is the possibility of studying angiogenesis, tissue genesis and tumor therapy effects with the aid of imaging methods.
  • imaging techniques include US (ultrasound), MRI, CT, PET, single photon emission computed tomography, optical imaging including microscopy.
  • different contrast agents may be administered via the delivery structure, such as e.g. CT contrast agents, DS microbubbles, etc.
  • the contrast agents can be used to better visualize and contrast the 3D TAM model, the vascular structure in the 3D TAM model, and to detect and localize specific cell types within the 3D TAM model.
  • the 3D-TAM model can also be used to develop, study and establish new contrast agents for the aforementioned imaging techniques.
  • the present invention relates to methods for testing potential drug candidates.
  • the method according to the invention comprises the step of providing a tissue model according to the invention and introducing the drug candidates via the supply structure into the tissue structure and analyzing the effect of the drug candidates on the tissue model, wherein a drug candidate is identified as a potential drug, if this shows a desired effect on the tissue model ,
  • this process is one wherein the potential drug candidates are those which have a cytostatic, cytotoxic on tumor cells or cells which contribute to the supply of the tumor, including endothelial cells, fibroblasts and smooth muscle cells, antiangiogenes and / or show anti-inflammatory effect.
  • the method comprises the steps of providing a tissue model of the invention containing tumor cells, introducing the potential drug candidates via the supply structure into the tumor cell-containing tissue structure, and analyzing the effect of the potential drug candidates on the tissue model, identifying a potential drug as they reduce tumor growth, such as Tumor growth stopping effect or tumor growth-reducing effect, an anti-angiogenic or an anti-inflammatory effect.
  • the preformed first structure On a support surface, e.g. a culture dish, a glass surface, a base layer (e.g., agarose) similar to the later potting material, or the surface of the bioreactor vessel, the preformed first structure is formed.
  • This forming can be done by printing or extrusion.
  • a gelatin solution with a heated to about 37 ° C printhead applied.
  • polyethylene glycol (PEG) is used as biomaterial. 2. Applying a coating to a preformed first structure
  • a first structure of gelatin or PEG is labeled with a living cell. len mixed, hydrogel-based coating, in this case alginate, applied.
  • a suspension consisting of alginate eg 2% by weight, sodium salt of alginic acid from brown algae, Sigma
  • fibroblasts or HUVECs is applied to the preformed first structure at room temperature using a 3D printer and then by spraying a crosslinking solution consisting of calcium chloride (30 mg / ml) solidified.
  • a preformed first structure is made of gelatin or polyethylene glycol as described above.
  • a composition of alginate (2% by weight, sodium salt of alginic acid from the brown algae, Sigma) with endothelial cells is applied as the first layer to this structure (10 million cells per milliliter).
  • a second composition containing fibroblasts (10 million cells per milliliter) is optionally applied as an outer layer.
  • the resulting coated structure is embedded in agarose (3% by weight).
  • PEG can be easily removed from the cured coating with the help of water.
  • the gelatin is purified by heating e.g. liquefied to 37 ° C and e.g. sucked off with the help of a syringe.
  • the cell-loaded alginate coating is retained and forms a stable channel wall.
  • the tumor tissue can be introduced into the 3D-TAM model in three different ways.
  • homogeneous, densely grown endothelial layer has been formed, optionally with an additional layer containing fibroblasts, tumor cells are centrally injected by means of a syringe integrated in the SD printer and a few 100 ⁇ m are injected into the embedding compound above the supply channel.
  • the supply channel is manufactured as described (pt. 1 -2). On the
  • the tumor tissue in the form of a tumor cell-containing hydrogel suspension is printed on the separating layer, for example tumor cells in Matrigel. Possibly.
  • the tumor tissue can be structured with other cell types and other hydrogels.
  • the construct thus prepared is further processed and cultured as described in pt. 3-5.
  • the separation layer in this case prevents the proliferation of the tumor cells in the direction of the supply channel during the first weeks of cultivation.
  • the separating layer is to be designed so that it has only dissolved when the endothelial layer in the wall of the channel is fully developed. After dissolving the separating layer, the tumor tissue is granted access to the supply channel and a connection by means of a new blood vessels.
  • the production of the supply channel, the embedding and the cultivation are carried out as described (pt. 1 -4).
  • the construct is removed from the culture and the investment is removed to within a few hundred microns above the supply channel (e.g., scalpel cutting).
  • the tumor tissue in the form of a tumor cell-containing hydrogel suspension is printed, e.g. Tumor cells in Matrigel. Possibly.
  • the tumor tissue can be structured with other cell types and other hydrogels. Subsequently, the entire construct is embedded again and further cultivated.

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Abstract

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Versorgungsstrukturen aufweisenden Gewebemodells. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf diese Weise so erhältliche Gewebemodelle sowie deren Verwendung als Modelle zur Gewebegenese insbesondere Tumorgenese einschließlich Angiogenese in dem Gewebemodell. Schließlich wird ein Verfahren zum Testen und Identifizieren von Wirkstoffkandidaten einschließlich Behandlungsstrategien bereitgestellt.

Description

Gewebemodell und Verfahren zur Herstellung hiervon sowie dessen Verwendung In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Versorgungsstrukturen aufweisenden Gewebemodells. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf diese so erhältlichen Gewebemodelle sowie deren Verwendung als Modelle zur Gewebegenese insbesondere Tumorgenese, einschließlich Angiogenese und dem Gewebemodell . Schließlich wird ein Verfahren zum Testen und Identifizieren von Wirkstoffkandidaten einschließlich Behandlungsstrategien bereitgestellt.
Stand der Technik Zur Entwicklung neuer Wirkstoffe z.B. auf dem Gebiet der Tumorbehandlung werden potentielle pharmakologische Substanzen über einem mehrstufigen Pro- zess zunächst in der Zellkultur und bei erfolgsversprechenden Ergebnissen in vivo in Tierversuchen untersucht. Es stellt sich immer wieder heraus, dass die Ergebnisse von /n-V7fro-Versuchen jedoch nicht ohne weiteres auf In-Vivo- Versuche übertragbar sind, es scheitern viele potentielle Wirkstoffe in diesen Versuchsphasen. Ein effektiveres /n-V7fro-Screening insbesondere ein in Bezug auf die späteren /n-V/Vo-Versuche erfolgreiches /n-V7fro-Screenen ist wünschenswert, um den Aufwand zur Entwicklung aktiver Wirkstoffe und gleichzeitig die Versuchstierzahlen zu reduzieren. Mit dem Ziel, eine verbesserte Screening- Plattform zwischen Zellkultur und Tierversuch zu etablieren, werden derzeit unterschiedliche 3D-/n-v/'fro-Tissue-Engineering (TE) Konzepte verfolgt. Ein erster Schritt auf dem Weg zu einem 3D-Tumormodell wurde mit der Untersuchung statisch kultivierter, mit Zellen beladener Mikropartikel gemacht, z.B. Horning J.L., et al. Mol. Pharm. 2008 5:849 - 62. Unter Zuhilfenahme wichtiger Schlüsseltechnologien, wie dem Microengineering (z.B. Photolithographie) und der Mikrofluidik konnten in den folgenden Jahren komplexere Hybridsysteme aus synthetischen Mikrokanalen, Membranen und in Biomaterialien eingebetteter Zellen entwickelt werden, beispielhaft seien hier genannt Huh, D. et al., 201 1 , Trends Cell Biol. 21 :745 - 54. Auf diese Weise hergestellte Systeme werden bereits zur Untersuchung von Angionese und Tumorzellextravasion genutzt, z.B. beschrieben in Zheng, Y., et al., Proc. Natl . Acad. Sei USA, 2012; 109: 934 - 7 oder Jeon, J.S. et al. Plos 1 2013; 8: e5691 0. Es ist ebenfalls bereits gelungen ein auf ausschließlich biologischem Material basierendes, mikrofluidisches TE- Modell zu entwickeln, Sekine, Het al. Nat Commun 2013, 4:1 399. Dabei wird ein mit einer Arterie verbundenes Kapillargewebe aus einem Spendertier als vasku- läres Bett zur dynamischen Kultivierung von in vitro expandierten Zellen genutzt.
Bioprinting ist ein spezielles Tissue-Engineering-Verfahren, das sich dem Prinzip der generativen Fertigungsverfahren - auch als Rapid-Prototyping bekannt - bedient, um dreidimensionale lebende Gewebe zu generieren. Im Gegensatz zu industriell angewandten generativen Fertigungsverfahren, wie z.B. der Stereoli- tographie, dem selektiven Laserschmelzen oder dem Fused Deposition Mode- ling, werden beim Bioprinting mit Zellen beladene Hydrogele als Baumaterial verwendet. Gemäß eines 3D-Modells wird diese Schicht für Schicht aufgetragen. Hydrogele ahmen die extrazelluläre Matrix natürlichen Gewebes nach und bieten so eine zellfreundliche Umgebung für das 3D-Tissue-Engineering, siehe z.B. Lee, K.Y., Chem Ref 2001 ; 101 : 1869 - 80.
In nichtpolymerisierter Form lassen sich Hydrogele gut handhaben und dispensieren. Durch eine chemische, thermische oder durch Licht induzierte Polymeri- sation verfestigt sich das Gel, so dass nachfolgende Schichten sukzessiv aufgetragen werden können. Über verschiedene Parameter, wie der Gel- Konzentration, der Vernetzer-Konzentration, dem pH-Wert und der Temperatur können Elastizität und Polymerisations-Zeitpunkt sowie Polymerisations- Geschwindigkeit eingestellt werden. Mit Hilfe des Bioprintings lassen sich komplexe 3D-Gewebe Konstrukte aus unterschiedlichen Materialien mit verschiedenen Zelltypen aufbauen, wie vielfältig in der Literatur beschrieben, z.B. Shuurman W., et al ., Biofabrication 201 1 ; 3:021001 .
Viele Verfahren zur Ausbildung von Modellen zur Angiogenese beschreiben Methoden, bei denen die verschiedenen Zellarten gleichzeitig in die Matrix eingebracht werden.
Allerdings gilt es solche dreidimensionalen Tumorangiogenesemodelle zu verbessern, insbesondere die Herstellungsverfahren hiervon zu verbessern, um entsprechende Gewebemodelle für Screening-Verfahren bereitzustellen. Hierbei sollen diese Modelle geeignet sein, das Tumorwachstum, die Tumorangiogene- se, sowie Tumortherapieeffekte zu untersuchen. Dabei sollen sowohl der Tumor bzw. die Gewebestruktur als auch die Versorgungsstruktur aus im Wesentlichen natürlich gewonnenen Materialien bestehen, vorzugsweise biologischen Material, wie entsprechende Hydrogele und Zellen. Im Gegensatz zum bisherigen Stand der Technik soll vorliegend die Individualisierung des Gewebemodells möglich sein.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Versor- gungsstrukturen aufweisenden Gewebemodells bereit. Dieses Verfahren um- fasst die Schritte: a) Aufbringen einer lebende Zellen aufweisenden Zusammensetzung auf oder um eine vorgeformte erste Struktur zur Ausbildung einer Beschich- tung auf und gegebenenfalls vollständigen Ummantelung hiervon um die vorgeformte erste Struktur, wobei die Zusammensetzung geeignet ist, als Beschichtung eine Versorgungsstruktur auszubilden; b) Gegebenenfalls Einbetten dieser beschichteten ersten Struktur und/oder Kultivierung der beschichteten Struktur zur Ausbildung der Versorgungsstruktur;
c) Aufbringen einer lebende Zelle enthaltenden Suspension auf die im vor- herigen Schritt erhaltene Beschichtung oder auf die Versorgungsstruktur, zur Ausbildung einer Gewebestruktur auf der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur und zum Erhalt eines Gewebemodells;
d) gegebenenfalls Einbetten des im Schritt c) erhaltenen Gewebemodells. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin entsprechende Gewebemodelle sowie die Verwendung dieser Gewebemodelle zur Analyse der Gewebegenese, insbesondere der Tumorgenese, einschließlich der Aniogenese. Zusätzlich ist die Verwendung des Tumorgewebemodells zum Testen einer möglichen Therapie mit einer vorbestimmten Therapieform oder zur Stratifizierung einer ausge- wählten Therapie zur Behandlung des Tumors, wie er durch das Gewebemodell widergespiegelt wird, geeignet.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf Verfahren zum Testen und Identifizieren von potentiellen Wirkstoffkandidaten unter Verwendung des erfindungsgemäßen Gewebemodells, um solche potentielle Wirkstoffkandidaten zu identifizieren, die eine pharmakologische Wirkung auf das Gewebemodell zeigen.
Diese potentiellen Wirkstoffkandidaten sind insbesondere solche, die im Gewe- bemodell zytotoxische, zytostatische, die Versorgung des Tumors beeinträchtigende, also insbesondere anti-angionese und anti-inflammatorische Eigenschaften, aufzeigen.
Die Erfinder konnten erfolgreich mit Hilfe eines 3D-Biodruckers dreidimensionale biomimetische Tumorangiogenesemodelle, im Folgenden auch als 3D-TAM bezeichnet, generieren. Dabei wird mit Hilfe des 3D-Bioprinting-Verfahrens sowohl die Versorgungsstruktur des Gewebemodells als auch die Gewebestruktur des Gewebemodells hergestellt. Die folgende Erfindung betrifft somit in einer Ausführungsform eine künstlich aufgebaute, auf einer Versorgungsstruktur, üblicherweise ein Versorgungsgefäß, sitzende Gewebestruktur, wie einen Tumor, der entsprechend kultiviert und über diese Versorgungsstruktur versorgt werden kann. Dabei wird in der Gewebestruktur, wie dem Tumor, die Angiogenese induziert, sodass ausgehend von der Gewebestruktur, wie dem Tumor, die Angiogenese erfolgt, um den Anschluss der Gewebestruktur/des Tumors an die Versorgungstruktur während der Kultivierung zu ermöglichen und damit die Versorgung zu verbessern .
Dieses Gewebemodell mit Versorgungsstruktur erlaubt eine Reduktion der Anzahl von Versuchstieren, da dieses Modell nach der normalen Zellkultur aber vor ersten /'n-v/Vo-Versuchen im Tier genutzt werden kann, um z.B. potentielle Wirkstoffkandidaten zu testen.
Das erfindungsgemäß herstellbare Gewebemodell ist aber auch geeignet, um mit Hilfe von in vitro durchgeführten Vorabuntersuchungen eine individuell auf den Patienten abgestimmte Strategie der Tumortherapie zu entwickeln . Hierbei werden die Tumorzellen für das Gewebemodell und gegebenenfalls auch die zur Versorgungsstruktur notwendigen Zellen von dem Individuum isoliert. Anschließend wird mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens das Versorgungsstruktur aufweisende Gewebemodell generiert, um an diesem Gewebemodell mögliche Therapieformen zu testen und so die effektivste Therapieform für die Behandlung des Individuums zu bestimmen .
Das erfindungsgemäße biomimetische Gewebemodell zeichnet sich dadurch aus, dass aufgrund des synthetischen Herstellungsverfahrens sowohl der Aufbau und die Zusammensetzung der Versorgungsstruktur als auch der Aufbau und die Zusammensetzung der Gewebestruktur und somit des gesamten Gewe- bemodells individuell gestaltbar sind. D.h. durch die Anwendung der erfindungsgemäßen 3D-Bioprintingtechnologie können die Tumorzusammensetzungen in ihrer Art und Vielfalt der gedruckten Zellen als auch die Struktur und Zusam- mensetzung der Versorgungsstruktur individuell eingestellt werden. Weiterhin ist z.B. durch die individuelle Versorgung des Gewebemodells über die Versorgungsstruktur eine umfangreiche und individuelle Testung in Bezug auf die eine Therapie möglich.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Figur 1 zeigt schematisch die verschiedenen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens. In der Figur 1 A wird die erste Struktur auf einem Träger bereitge- stellt. Auf diese erste Struktur wird dann, wie in der Figur 1 B dargestellt, erfindungsgemäß die lebende Zellen aufweisende Zusammensetzung aufgebracht, um als Beschichtung eine Versorgungsstruktur auszubilden. Figur 1 C zeigt das erfindungsgemäße Gewebemodell mit der Versorgungstruktur und der darauf aufgebauten Gewebestruktur. Die Figur 1 D zeigt einen Schnitt durch das erfin- dungsgemäße Gewebemodell . Der innere Kanal der Versorgungsstruktur, vorliegend als Strömungskanal bezeichnet, erlaubt ein Durchleiten von Fluiden. Der Versorgungskanal weist eine zweischichtige Struktur auf, eine innere Schicht mit Endothelzellen und eine äußere Schicht mit Fibroblasten, um einen vaskulärem Gefäß zu entsprechen. Das Tumorgewebe einer Hydrogelzell-Suspension mit Tumorzellen und Fibroblasten weist gedruckte Strukturen mit Endothelzellen auf, um die Angiogenese dieser Strukturen zu untersuchen. Die Figur 1 E zeigt das erfindungsgemäße Gewebemodell als künstlichen Tumor mit Versorgungsstruktur, dem Gefäßkanal, eingebettet in einer Einbettmasse. Der Gefäßkanal ist zum Durchleiten von Fluiden, mit Anschlüssen an einem Medium-Fluss ange- schlössen. Dabei können z.B. zu untersuchende Moleküle mit dem Medium in das Gewebemodell eingetragen werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Versorgungsstrukturen aufweisenden Gewebemodells mit den Schritten: a) Aufbringen einer lebende Zellen aufweisenden Zusammensetzung auf oder um eine vorgeformte erste Struktur zur Ausbildung einer Beschichtung auf und gegebenenfalls vollständigen Ummantelung hiervon um die vorgeformte erste Struktur, wobei die Zusammensetzung geeignet ist, als Beschichtung eine Versorgungsstruktur auszubilden;
b) Gegebenenfalls Einbetten dieser beschichteten ersten Struktur und/oder Kultivierung der beschichteten Struktur zur Ausbildung der Versorgungsstruktur;
c) Aufbringen einer lebende Zelle enthaltenden Suspension auf die im vorherigen Schritt erhaltene Beschichtung oder der Versorgungsstruktur, zur Ausbildung einer Gewebestruktur auf der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur und zum Erhalt eines Gewebemodells;
d) gegebenenfalls Einbetten des im Schritt c) erhaltenen Gewebemodells.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass in einem ersten Schritt die Versorgungsstruktur hergestellt wird, üblicherweise mit einem 3D- Bioprintingverfahren, das durch drucken, sprühen oder extrudieren erfolgen kann. In diesem ersten Schritt wird auf einer vorgeformten ersten Struktur eine Beschichtung aufgebracht. Diese Beschichtung beinhaltet lebende Zellen zur Ausbildung der Versorgungsstruktur. Diese Beschichtung kann gegebenenfalls eine vollständige Ummantelung darstellen, so dass eine Versorgungsgefäß- ähnliche Struktur erhalten wird. Die so erhaltene, beschichtete erste Struktur kann anschließend in einem geeigneten Medium eingebettet werden. Geeignete Medien werden weiter unten ausgeführt. Diese beschichtete erste Struktur kann entweder eingebettet oder in Kultivierungsmedium weiter kultiviert werden, um die Versorgungsstruktur auszubilden, z.B. in Form eines Versorgungsgefäßes.
Die lebende Zellen aufweisende Zusammensetzung zur Beschichtung der vorgeformten ersten Struktur ist dabei eine, die Zellen umfasst und geeignet zur Aus- bildung von Gefäß ausbildenden Zellen ist. Diese Zusammensetzung beinhaltet dabei insbesondere Endothelzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen oder Vorläuferzellen hiervon. Unter dem Ausdruck Vorläuferzellen fallen multipotente Zellen wie auch direkte Vorläuferzellen der oben genannten Endothelzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen.
Der Ausdruck„multipotente Zellen" bezieht sich hierbei auf solche Zellen, die noch in zwei oder mehrere Zellarten differenzieren können. Multipotente Zellen schließen z.B. totipotente und pluripotente Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen und embryonale Stammzellen ein. Vorläuferzellen schließen direkte Vorläuferzellen der Endothelzellen, Fibroblasten oder glatte Muskelzellen ein, einschließlich HUVECs (Human umbilical vein endothelial cells). In einer Aus- führungsform sind humane embryonale Stammzellen ausgenommen.
Das Aufbringen auf die vorgeformte erste Struktur kann dabei in einem oder mehreren Schritten bzw. Schichten erfolgen. Ziel ist die Ausbildung der Versorgungsstruktur, wie einer vaskulären Struktur. In den vaskulären Strukturen ist üblicherweise die innenliegende Schicht eine Endothelzellschicht, während die äußere Schicht durch Fibroblasten ausgebildet wird. In einer Ausführungsform wird daher in einem ersten Schritt auf die vorgeformte erste Struktur eine Zusammensetzung mit Endothelzellen oder Vorläuferzellen hiervon aufgebracht und in einem weiteren Schritt eine Zusammensetzung mit Fibroblasten oder Vor- läuferzellen. Alternativ können diese Zellarten auch in einem Schritt aufgebracht werden.
Die vorgeformte erste Struktur ist dabei in einer Ausführungsform ein entfernbares Stützmaterial. In einer anderen Ausführungsform kann diese vorgeformte Struktur eine solide Struktur sein . In einer wieder anderen Ausführungsform wird diese vorgeformte erste Struktur, auf einer Oberfläche ausgeformt. Dieses erfolgt mit einem entfernbaren Material, z.B. Biomaterialien wie Polyethylenglykol, Gelatine, Fette und Wachse oder anderen leicht entfernbaren Materialien. Diese vorgeformte erste Struktur, vorliegend auch als Kanalkern bezeichnet, wird auf einer Oberfläche z.B. mit einem Druckverfahren geformt. Diese Struktur ist eine, die zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden kann, z.B. durch Auflösen, Ausspülen usw. Typischerweise ist die erste Struktur länglich ausgebildet. Die erste Struktur kann weiterhin verzweigt ausgebildet sein.
In einer Ausführungsform kann weiterhin nach dem Entfernen der vorgeformten ersten Struktur die erhaltene Versorgungsstruktur weiter funktionalisiert werden. Dieses schließt im Inneren und Äußeren der Versorgungsstruktur ein Einbringen von weiteren Zellen aber auch eine innere oder äußere Beschichtung mit funktionalen Bestandteilen ein.
Diese vorgeformte erste Struktur wird dann mit der lebenden Zellen aufweisende Zusammensetzung beschichtet, z.B. mit einem Druckverfahren durch Drucken, Sprühen oder Extrudieren. Die Zusammensetzung ist dabei eine solche, die zum Zeitpunkt des Aufbringens eine flüssig-viskose Zusammensetzung ist und die dann z.B. durch Polymerisation aushärtet. Hierfür geeignete Materialien sind bekannte Hydrogele einschließlich Alginat, Agarose, Hyaluronan, Fibrinogen, extrazelluläre Matrix Komponenten, Gelatine, Kollagen, Peptid-Hydrogele usw. Hierbei handelt es sich in einer Ausführungsform um natürliche Materialien in einer anderen Ausführungsform um synthetische Materialien. Die Gele können dabei hydrophile oder hydrophobe Gele sein. Geeignete Hydrogele schließen ein solche, die von Kollagen, Hyaluronat, Fibrin, Alginat, Agarose, Hydrolysaten und Kombination hiervon stammen. Andere geeignete Hydrogele, die nicht wie die vorgenannten natürlichen Ursprungs sind, sondern synthetisch erhalten werden, schließen ein solche die von Polyacrylsäure und Derivaten hiervon stammen, Polyethylenoxide und Kopolymere hiervon, Polyvinylalkohole, Polymilch- säure usw. Geeignete Hydrogele umfassen:
Natürlicher Hydrogele:
Kollagen, Fibrinogen, Alginat, Hyaluronan, Gelatine, Agarose, Chitosan, Matri- gel®, Hydrogele auf Basis von Heparin und Elastin, einschließlich chemisch, biologisch oder physikalisch modifizierter Formen der genannten Hydrogele.
Synthetische Hydrogele:
Polyacrylsäure und dessen Derivate, Polyethylenoxid und dessen Co-Polymere, Polyvinylalkohol, Polyphosphazene und Polypeptide, einschließlich chemisch, biologisch oder physikalisch modifizierter Formen der genannten Hydrogele. In einer Ausführungsform sind die eingesetzten Materialien Biomaterialien. Für die erste Struktur, die einen Kanalkern ausbildet, wird ein auflösbares bzw. entfern- bares Material eingesetzt, dass insbesondere nicht zytotoxische Eigenschaften aufweist bzw. unter nicht-zytotoxischen Bedingungen entfernt werden kann . Geeignet hierfür zeigten sich Gelatine und Polyethylenglykole. Für die lebende Zellen aufweisenden Zusammensetzungen zeigen sich insbesondere Hydrogele als geeignet einschließlich Alginat, Agarose, Chitosan, Fibrinogen, Kollagen usw, wie eine Kombination von Agarose und Gelatine.
In verschiedenen spezifischen Ausführungsformen ist das Gel ausgewählt aus Hydrogel, Novogel™, Agarose, Alginat, Gelatine, Matrigel™, Hyaluronan, Polo- xamer, Peptidhydrogele, Polyethylenglykol, Silikongele, Polymilchsäuregele o- der Kombinationen hiervon.
In einigen Ausführungen ist das Hydrogel dabei ein thermoreversibles Gel, d.h., dass es bei Raumtemperatur nicht flüssig vorliegt, sondern eine gelbildende Temperatur bei > 25 Grad, wie > 30 Grad, wie > 35 Grad, z.B. > 40 Grad auf- zeigt.
Die so vorliegende vorgeformte erste Struktur mit Beschichtung z.B. ausgebildet in mehreren Schichten, geeignet zur Ausbildung der Versorgungsstruktur wird in einer Ausführungsform der Erfindung eingebettet. Als geeignetes Einbettmedium können mögliche Einbettmedien, wie sie im 3D-Bioprinting eingesetzt werden, verwendet werden. Dieses schließt insbesondere Zusammensetzungen bestehend aus Agarose, Gelatine, Polyacrylamid, Polyacrylsäure und deren Derivate, Polyethylenoxid und dessen Co-Polymere, Polyvinylalkohole, Polyphosphazene, Polypeptide, Polydimethylsiloxan, Polymethylmethacrylat, Silikone, sowie chemisch, biologisch oder physikalisch modifizierte Varianten der genannten Materialien ein. Geeignete Zusammensetzungen schließen Kombinationen von Aga- rose und Gelatine ein.
In einer Ausführungsform wird diese so ggf. eingebettete Struktur dann für einen vorbestimmten Zeitraum kultiviert, um die Ausbildung der Versorgungsstruktur, z.B. die Ausbildung von vaskulären Gefäßstrukturen, zu erlauben. Eine solche Kultivierung findet unter bekannten Bedingungen statt. Z.B. ist die Dauer einer solchen Kultivierung mindestens eine Woche, wie z.B. maximal zwei Wochen, zur Ausbildung der Versorgungsstruktur, um ein vaskuläres Gefäß ähnlich einem Blutgefäß zu erhalten. Diese Versorgungsstruktur weist einen innenliegenden Kanal auf und ist üblicherweise länglich ausgebildet. Die Struktur kann ge- gebenenfalls verzweigt ausgebildet sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiterhin das Aufbringen einer lebende Zellen enthaltenen Suspension auf die Beschichtung oder die Nachkultivierung der vorliegenden Versorgungsstruktur. Die Zellsuspension bildet nach weiterer Kultivierung eine Gewebestruktur auf der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur aus, um somit ein Gewebemodell zu erhalten.
In einer Ausführungsform liegen dabei die Zellen bereits in dem aufzubringenden Gel suspendiert vor. Alternativ kann erst das Gel auf die Beschichtung oder die ausgebildete Versorgungsstruktur aufgebracht werden und anschließend werden die Zellen ortsspezifisch eingebracht, zum Beispiel injiziert. In einer Ausführungsform können diese Schritte auch kombiniert werden. Das heißt, es werden weitere Zellen, wie Tumorzellen, in die vorliegende Gewebestruktur aus Gel und Zellen eingebracht.
Unter dem Ausdruck„Gewebemodell" wird vorliegend verstanden: Eine synthetisch hergestellte, Zellen enthaltende 3D-Gewebe mit mindestens zwei Teilstruk- turen, der Versorgungsstruktur und der Gewebestruktur.
Unter dem Ausdruck „Versorgungsstruktur" wird vorliegend verstanden: Eine synthetisch hergestellte, Zellen enthaltende 3D-Zellstruktur mit einem inneren Bereich, der einen Hohlraum ausbilden kann und keine Zellen aufweist, wobei dieser innere Bereich einen ersten Zugang und mindestens eine zweiten Zugang aufweist, wobei über diese Zugänge Fluide zu- und abgeführt werden können, und einen außen liegenden Bereich mit Zellen, die eine Zellstruktur ausbilden, wie eine, einer vaskulären Zellstruktur ähnlichen Zellstruktur. Die Versorgungs- struktur ist typischerweise länglich ausgebildet. Sie kann gegebenenfalls verzweigt ausgebildet sein.
Unter dem Ausdruck„Gewebestruktur" wird vorliegend verstanden: Eine synthetisch hergestellte 3D-Zellstruktur, die zumindest bereichsweise Zellen, z.B. in der gesamten Struktur vorliegend, aufweist. Die Gewebestruktur ist eine, die in einer Ausführungsform Tumorzellen umfasst. Sowie Zellen, wie Vorläuferzellen, die im Rahmen der Angiogenese Gefäße, wie blutgefäßartige Strukturen ausbilden. Die lebende Zellen enthaltene Suspension, die erfindungsgemäß auf die Be- schichtung bzw. die Versorgungsstruktur aufgebracht wird, kann dabei direkt auf diese aufgebracht werden. In einer alternativen Form kann die Suspension zur Ausbildung der Gewebestruktur von der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur beabstandet sein. Z.B. kann eine bioresorbierbare Trennschicht zwi- sehen der Suspension zur Ausbildung der Gewebestruktur und der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur vorliegen, eine solche Trennschicht kann z.B. eine sein auf Basis von Polylaktid, Polycaprolacton oder anderen Gelen einschließlich des Gels zum Einbetten der beschichteten ersten Struktur. Eine solche Beabstandung kann dann sinnvoll sein, um ein verfrühtes Wuchern der in der Gewebestruktur bzw. der Suspension vorliegenden Zellen in die Versorgungsstruktur zu verhindern und so ggf. ein Verstopfen dieser zu vermeiden. Sollte die Versorgungsstruktur bereits vollständig ausgebildet sein, z.B. in Form eines vaskulären Gefäßes, so kann die lebende Zellen enthaltende Suspension direkt auf diese Versorgungsstruktur aufgebracht werden . Die in der Suspension enthaltenen lebenden Zellen weisen in einer Ausführungsform Tumorzellen auf. Zur Ausbildung eines Tumorgewebemodells werden diese Tumorzellen als Tumorgewebestrukturen auf die Versorgungsstruktur aufgebracht. Bei diesen Tumorzellen handelt es sich um lebende Tumorzellen, z.B. primäre Tumorzellen isoliert von einem Individuum, dessen Therapie stratifiziert werden soll bzw. bei dem die Therapieform auf Basis dieses Gewebemodells bestimmt werden soll .
Diese Suspension kann weiterhin andere Zellarten aufweisen, insbesondere Fibroblasten oder Endothelzellen aber auch glatte Muskelzellen. Diese Zellen eig- nen sich zur Gefäßneubildung (Angiogenese). Die Gefäßneubildung kann sowohl innerhalb der Gewebestruktur als auch zwischen Gewebestruktur und Versorgungskanal erfolgen. Durch Letzteres kann ein Anschluss der ggf. in der Gewebestruktur ausgebildeten Gefäße an den Versorgungskanal gewährleistet werden.
In einer Ausführungsform können dabei die Gewebestrukturen so ausgebildet werden, dass die ganze Gewebestruktur mit derselben Zell-Suspension ausgebildet wird. Alternativ kann die Gewebestruktur unter Verwendung von mehr als einer Suspension unterschiedlicher Zusammensetzung ausgebildet werden. Dadurch ist es möglich strukturierte Gewebestrukturen auszubilden, z.B. solche in denen in bestimmten Bereichen nur Tumorzellen vorliegen oder solche in denen in bestimmten Bereichen weitere Zellarten, wie Fibroblasten, glatte Muskelzellen oder Endothelzellen vorliegen, um unterschiedliche Gewebestrukturen darzustellen.
Die Suspension ist dabei eine, die ein zum 3D-Drucken geeignetes Medium um- fasst. Dieses Medium ist eines wie dem oben genannten Medium zum Drucken bzw. Beschichten der ersten Struktur. Bei diesem Medium handelt es sich insbesondere um ein Gel der oben genannten Art. Z.B. wird ein Hydrogel verwendet, wie Kollagen, Fibrinogen, Alginat, Hyaluronan, Gelatine, Agarose, Chitosan, Matrigel™, Hydrogele auf Basis von Heparin und Elastin, Polyacrylsäure und dessen Derivate, Polyethylenoxid und dessen Co-Polymere, Polyvinylalkohol, Polyphosphazene und Polypeptide, einschließlich chemisch, biologisch oder physikalisch modifizierter Formen der genannten Hydrogele. Geeignete Gele umfassen eine Kombination von Agarose und Gelatine. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Gewebemodell somit ein Tumorgewebemodell mit einer Tumorzellen enthaltenen Gewebestruktur, wobei die Suspension enthaltend lebende Zelle eine ist, die Tumorzellen, wie primäre Tumorzellen enthält. In einer Ausführungsform enthält die Suspension dabei lebende Tumorzellen und Stromazellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Myofibroblasten, Immunzellen einschließlich Makrophagen und Leukozyten. Hierbei handelt es sich insbesondere um Primärzellen einschließlich Stammzellen und Vorläuferzellen (Progenitorzellen) dieser genannten Zellarten.
Die Suspension ist dabei in Form eines Hydrogels oder eines biokompatiblen Polymers.
Das so erhältliche Gewebemodell mit der Gewebestruktur und der Versorgungs- struktur wird in einer Ausführungsform anschließend eingebettet. Als Einbettmedien können die oben genannten Medien, nämlich Gele, wie Agarose, Gelatine, Polyacrylamid, Polyacrylsäure und deren Derivate, Polyethylenoxid und dessen Co-Polymere, Polyvinylalkohole, Polyphosphazene, Polypeptide, Polydime- thylsiloxan, Polymethylmethacrylat, Silikone, sowie chemisch, biologisch oder physikalisch modifizierte Varianten der genannten Materialien, verwendet werden. Alternativ kann das Gewebemodell in Kulturmedien, wie sie dem Fachmann allgemein bekannt sind, eingesetzt werden. Die Einbettmasse bzw. das Einbettmedium, diese Begriffe werden vorliegend synonym eingesetzt, ist dabei eines das zytokompatibel ist. Unter dem Ausdruck zytokompatibel wird verstanden, dass das Einbettmedium bzw. die Einbettmas- se eine Zell- und Gewebeverträglichkeit aufzeigt.
Das Aufbringen der Suspension mit lebenden Zellen und/oder das Aufbringen der Zusammensetzung mit den lebenden Zellen erfolgt in einer Ausführungsform durch das sogenannte Bioprinting. Unter dem Ausdruck Bioprinting wird das Aufbringen von mit Zellen beladenen Hydrogelen bezeichnet. Diese Hydrogele ahmen dabei die extrazelluläre Matrix natürlichen Gewebes nach und bieten so eine zellfreundliche Umgebung für das vorliegende Herstellungsverfahren. In nicht polymerisierter Form lassen sich die Hydrogele entsprechend gut Handhaben und durch Induktion, z.B. chemisch, thermisch oder durch Licht, durch Po- lymerisation verfestigen.
Das Aufbringen kann dabei mittels Drucken, Sprühen oder Extrudieren erfolgen. In einer Ausführungsform erfolgt dabei das Aufbringen durch Drucken z.B. durch einen 3D-Drucker.
Wie oben angemerkt, kann das die erste Struktur ausbildende vorgeformte Material nach Beschichtung und ggf. Ausbildung der Versorgungsstruktur wieder entfernt werden. Zur Nutzung des Gewebemodells bei dem die Versorgungsstruktur als Versorgungsweg für die im Gewebemodell vorliegenden Zellen dient, wird diese erste Struktur entfernt, z.B. durch Auflösen hiervon. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zum Entfernen z.B. Auflösen dieser ersten Struktur gebildet z.B. aus Gelen bekannt. Diese Gele können Gelatine, Wachse, Fette oder leicht lösliche Polymere, wie z.B. Polyethylenglykol, sein . Ein geeignetes Gel ist eine Kombination von Agarose und Gelatine. Durch entsprechende thermische oder chemische Bedingungen, können diese Gele dann aufgelöst werden, so dass ein Kanal innenliegend in der Versorgungsstruktur ausgebildet wird. Durch diesen Kanal können dann die notwendigen, der Versorgung des Gewebemodells dienenden Nährmittel usw. zugeführt werden. Weiterhin können durch die Versorgungsstruktur die zu testenden potentiellen Wirkstoffkandidaten sowie chemische Substanzen, biochemische/biologische Faktoren (z.B. Zytokine, Hormone, Wachstumsfaktoren) oder weitere Zelltypen (z.B. Makrophagen) zugeführt werden, um deren Wirkungen auf das Gewebemodell zu testen .
Der Träger auf dem die erste Struktur aufgebracht ist oder der in der ersten Struktur integriert ist, kann dabei derart ausgebildet sein, dass er temperierbar ist, z.B. gekühlt werden kann oder erwärmt werden kann. Dadurch ist es mög- lieh, die die erste Struktur ausbildenden Materialien nach Beschichtung und Härtung zu entfernen . Im Falle von PEG oder Gelatine kann ein Erwärmen auf 37 °C zu einem Verflüssigen hiervon führen, während das die Beschichtung ausbildende Gel nach Härtung in seiner Form verbleibt und somit ein Kanal in dieser Versorgungsstruktur ausgebildet wird, die ein Versorgen sowohl der Zellen in der Versorgungsstruktur als auch in der Gewebestruktur erlaubt.
Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem die verschiedenen Zellarten gleichzeitig eingebracht werden, basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf der Idee, durch sequentielles Ausbilden der Strukturen ein verbessertes Gewe- bemodell bereitzustellen.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein so erhältliches Gewebemodell. Das so erfindungsgemäß erhältliche Gewebemodell zeichnet sich dadurch aus, dass es eine Versorgungsstruktur und eine Gewe- bestruktur aufweist. Durch die Versorgungsstruktur ist eine vollständige Versorgung möglich. Durch die Versorgungsstruktur werden sowohl die Zellen der Versorgungsstruktur als auch die Zellen der Gewebestruktur versorgt. Hierzu wird die Angiogenese in der Gewebestruktur/Tumor und somit die Anbindung dieser Gewebestruktur/Tumor an die Versorgungsstruktur gefördert. Je nach Anforde- rung können dabei unterschiedliche Bedingungen simuliert werden. So können in entsprechender Atmosphäre hypoxische Milieus bereitgestellt werden. Über die Versorgungsstruktur und daran angeschlossene Versorgungsgefäße kann eine Langzeitkultivierung des Gewebemodells erfolgen. Dabei können zu zeitlich begrenzten Zeitpunkten Zusatzstoffe dem Gewebemodell zugeführt werden, z.B. potentielle Wirkstoffkandidaten, um deren Wirkung auf das Gewebemodell zu testen. Zusätzlich können verschiedene physikalische oder chemische als auch zelluläre Parameter an diesem Gewebemodell verändert werden. Hierzu zählen Parameter wie pH-Werte, CO2-Niveau, Druck, Flussgeschwindigkeit und Temperatur, aber auch die Bereitstellung von Zusatzstoffen, wie Wachstumsfaktoren und Zytokine sowie ein Durchführen von Zellen usw. Das erfindungsgemäße Gewebemodell ist vielfältig einsetzbar. Wie ausgeführt können Untersuchungen zum Einfluss von potentiellen Wirkstoffkandidaten auf das Gewebemodell durchgeführt werden. Dabei kann das Gewebemodell sowohl Gewebestrukturen gesunden Ursprungs als auch Gewebestrukturen mit Tumorzellen oder anderen zu behandelnde Zellen aufzeigen. Das Gewebemodell erlaubt somit die Beurteilung einer Wirkung dieser potentiellen Wirkstoffkandidaten auf gesundes und verändertes Gewebe. Es erlaubt eine systematische Analyse der verschiedenen Parameter. Dadurch kann ein reproduzierbares Modell bereitgestellt werden, das z.B. in der Pharmaindustrie eingesetzt werden kann z.B. als Zwischenschritt zwischen der Untersuchung von potentiellen Wirkstoffkandidaten in der Zellkultur und den sich anschließenden /n-\//Vo-Tierversuchen. Hierdurch lässt sich die Zahl von Tierversuchen wesentlich reduzieren.
Das erfindungsgemäße Gewebemodell lässt sich als Modell zur Gewebegenese, insbesondere Tumorgenese einsetzen. Insbesondere lässt sich die Angiogenese im Gewebe induzieren und untersuchen.
Eine andere Verwendungsmöglichkeit ist eine in dem das Tumorgewebemodell zur Testung bei einer Therapie einer vorbestimmten Therapieform genutzt wird oder zur Stratifizierung der Therapie zur Behandlung eines Tumors. Hierdurch ist z.B. die Entwicklung einer individualisierten Therapieform eines zu behan- delnden Individuums möglich. Das Gewebemodell wird dabei aus Zellen des zu behandelnden Individuums etabliert, um anschließend die Therapiemöglichkeiten in vitro zu testen. Dies hat den Vorteil, dass der ohnehin geschwächte Pati- ent nur die für ihn optimale Therapieform erfährt, anstatt dass er vorab zum Testen einer Reihe von Therapiemöglichkeiten einschließlich ihrer Nebenwirkungen herangezogen werden muss. An dem Gewebemodell können dabei sowohl anti-Angiogenese als auch antiinflammatorische sowie zytostatische und zytotoxische Effekte untersucht werden. Dabei kann dieses Gewebemodell nach individuellen Anforderungen aufgebaut werden, z.B. kann die Gewebestruktur verschiedene Bereiche mit unterschiedlichen Zusammensetzungen an Zellen und Zellarten aufzeigen. Gleiches gilt für die Versorgungsstruktur.
Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Gewebemodells ist die Möglichkeit der Untersuchung der Angiogenese, Gewebegenese und von Tumortherapieeffekten mit Hilfe von bildgebenden Verfahren. Diese bildgebenden Verfahren schließen ein: US (Ultraschall), MRT, CT, PET, Spect (Single photon emission computed tomography), optische Bildgebungsverfahren einschließlich Mikroskopie. In Abhängigkeit vom jeweiligen Bildgebungsverfahren können dabei über die Versorgungsstruktur unterschiedliche Kontrastmittel verabreicht werden, wie z.B. CT-Kontrastmittel, DS-Microbubbles usw. Die Kontrastmittel können zur Besseren Visualisierung und Kontrastierung des 3D-TAM Modells, der Gefäßstruktur im 3D-TAM Modell sowie zur Detektion und Lokalisierung spezifischer Zelltypen innerhalb des 3D-TAM Modells dienen. Ferner kann das 3D-TAM Modell aber auch zur Entwicklung, Untersuchung und Etablierung neuer Kontrastmittel für oben genannte Bildgebungsverfahren angewandt werden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Testen potentieller Wirkstoffkandidaten. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei den Schritt des Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Gewebemodells und Einbringen der Wirkstoffkandidaten über die Versorgungsstruktur in die Gewebestruktur sowie analysieren der Wirkung der Wirkstoffkandidaten auf das Gewebemodell, wobei ein Wirkstoffkandidat als potentieller Wirkstoff identifiziert wird, wenn dieser eine gewünschte Wirkung auf das Gewebemodell zeigt. In einer Ausführungsform ist dabei dieses Verfahren eines wobei die potentiellen Wirkstoffkandidaten solche sind, die eine zytostatische, zytoxische auf Tumor- zellen oder solche Zellen, die zur Versorgung des Tumors beitragen einschließ- lieh Endothelzellen, Fibroblasten und glatte Muskelzellen, anti-Angiogene und/oder antiinflammatorische Wirkung zeigen. Das Verfahren umfasst die Schritte des Bereitstellens eines erfindungsgemäßen Gewebemodells enthaltend Tumorzellen, Einbringen der potentiellen Wirkstoffkandidaten über die Versorgungsstruktur in die Tumorzellen enthaltene Gewebestruktur und analysieren der Wirkung der potentiellen Wirkstoffkandidaten auf das Gewebemodell, wobei ein potentieller Wirkstoff identifiziert wird, wenn dieser einen Tumorwachstum verringernden, wie Tumorwachstum stoppenden Effekt oder ein Tumorwachstum verkleinernden Effekt, einen anti-angiogenen oder einen anti-inflammatorischen Effekt aufzeigt.
Beispiele:
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein.
1 . Herstellung einer vorbestimmten ersten Struktur
Auf einer Trägeroberfläche, z.B. einer Kulturschale, einer Glasoberfläche, einer dem späteren Einbettmaterial gleichen Grundschicht (z.B. Agarose) oder der Oberfläche des Bioreaktorgefäßes wird die vorgeformte erste Struktur ausgebil- det. Dieses Ausbilden kann durch Drucken oder Extrudieren durchgeführt werden . Vorliegend wird eine Gelatinelösung, mit einem auf etwa 37 °C beheizten Druckkopf, aufgebracht. In einem zweiten Versuch wird Polyethylenglykol (PEG) als Biomaterial verwendet. 2. Aufbringen einer Beschichtung auf eine vorgeformte erste Struktur
A) Auf eine erste Struktur aus Gelatine oder PEG wird eine mit lebenden Zel- len vermischte, Hydrogel basierte Beschichtung, vorliegend Alginat, aufgebracht. Hierzu wird eine Suspension bestehend aus Alginat (z.B. 2 Gew.-%, Natriumsalz der Algininsäure von Braunalgen, Sigma) und Fibroblasten oder HUVECs mit Hilfe eines 3D-Druckers bei Raumtemperatur auf die vorgeformte erste Struktur aufgetragen und anschließend durch Aufsprühen einer Vernetzungslösung bestehend aus Calciumchlorid (30 mg/ml) verfestigt.
B) Eine vorgeformte erste Struktur wird wie oben beschrieben aus Gelatine oder Polyethylenglykol hergestellt.
Mit Hilfe eines 3D-Druckers wird eine Zusammensetzung aus Alginat (2 Gew.-%, Natrimsalz der Alginsäure von der Braunalge, Sigma) mit Endothelzellen als erste Schicht auf diese Struktur aufgebracht (10 Millionen Zellen pro Milliliter). Nach Härten dieser Alginatschicht wird gegebenenfalls eine zweite, Fibroblasten (10 Millionen Zellen pro Milliliter) enthaltene Zusammensetzung als äußere Schicht aufgebracht.
3. Einbetten der beschichteten ersten Struktur
Die so erhaltene, beschichtete Struktur wird in Agarose (3 Gew.-%) eingebettet.
4. Entfernen der ersten Struktur
PEG kann einfach mit Hilfe von Wasser aus der ausgehärteten Beschichtung entfernt werden. Die Gelatine wird durch Erwärmen z.B. auf 37 °C verflüssigt und z.B. mit Hilfe einer Spritze abgesaugt. Während und nach Entfernen des PEGs bzw. der Gelatine bleibt die mit Zellen beladene Alginatbeschichtung erhalten und bildet eine stabile Kanalwandung .
Es zeigte sich, dass die eingebettete, mit Alginat und Zellen beschichtete Hohl- struktur ein Austreten von Flüssigkeit verhindert, so dass durch den so gebildeten Kanal einfach Flüssigkeiten durchgeführt werden können. Nach ca. zweiwöchiger Kultivierung unter üblichen Kultivierungsbedingungen entsteht ein biofunktionales Gewebe, das einem vaskulären Gefäß ähnelt.
5. Einbringen des Tumorgewebes (Fertigstellung des 3D-TAM Modells)
Das Tumorgewebe kann auf drei unterschiedlichen Wegen in das 3D-TAM Modell eingebracht werden.
5.1 Einspritzen von Tumorzellen
Die Herstellung des Versorgungskanals, das Einbetten und die Kultivie- rung erfolgen wie oben beschrieben (Pkt. 1 -4). Nachdem sich eine den
Versorgungskanal verkleidende, homogene, dicht gewachsene Endothel- schicht ausgebildet hat, gegebenenfalls mit einer zusätzlichen, Fibroblasten aufweisenden Schicht, werden Tumorzellen mit Hilfe einer in den SD- Drucker integrierten Spritze mittig, wenige 100 μιτι oberhalb des Versor- gungskanals in die Einbettmasse gespritzt.
5.2 Drucken des Tumors auf den Versorgungskanal
5.2.1 Drucken des Tumors auf eine Trennschicht
Der Versorgungskanal wird wie beschrieben hergestellt (Pkt. 1 -2). Auf den
Versorgungskanal wird eine biodegradierbare Trennschicht aus z.B. Poly- caprolacton aufgetragen. Auf die Trennschicht wird das Tumorgewebe in Form einer Tumorzellen enthaltende Hydrogel Suspension aufgedruckt, z.B. Tumorzellen in Matrigel. Ggf. kann das Tumorgewebe mit weiteren Zelltypen und weiteren Hydrogelen strukturiert werden. Das so hergestellte Konstrukt wird wie in Pkt. 3-5 beschrieben weiter bearbeitet und kultiviert. Die Trennschicht verhindert hierbei das Wuchern der Tumorzellen in Richtung des Versorgungskanals während der ersten Wochen der Kultivierung. Die Trennschicht ist so auszulege, dass sie sich erst dann aufge- löst hat, wenn die Endothelschicht in der Wandung des Kanals voll ausgeprägt ist. Nach Auflösen der Trennschicht wird dem Tumorgewebe der Zugang zum Versorgungskanal gewährt und ein Anschluss mittels Ge- fäßneubildung ermöglicht.
5.2.2 Drucken des Tumors nach vorheriger Kultivierung des Versorgungskanals
Die Herstellung des Versorgungskanals, das Einbetten und die Kultivierung erfolgen wie beschrieben (Pkt. 1 -4). Nachdem sich eine den Versorgungskanal verkleidende, homogene, dicht gewachsene Endothelschicht ausgebildet hat, wird das Konstrukt aus der Kultur entnommen und die Einbettmasse bis wenige hundert Mikrometer oberhalb des Versorgungskanals entfernt (z.B. Abschneiden mit Hilfe eines Skalpells). Auf die Versorgungskanal nahe Oberfläche wird das Tumorgewebe in Form einer Tumorzellen enthaltende Hydrogel Suspension aufgedruckt, z.B. Tumorzellen in Matrigel. Ggf. kann das Tumorgewebe mit weiteren Zelltypen und weiteren Hydrogelen strukturiert werden. Anschließend wird das gesamte Konstrukt erneut eingebettet und weiter kultiviert.

Claims

Patentansprüche:
1 . Verfahren zur Herstellung eines Versorgungsstrukturen aufweisenden Ge- webemodells mit den Schritten:
a) Aufbringen einer lebende Zellen aufweisenden Zusammensetzung auf oder um eine vorgeformte erste Struktur zur Ausbildung einer Beschichtung auf und gegebenenfalls vollständigen Ummantelung hiervon um die vorgeformte erste Struktur, wobei die Zusammensetzung geeignet ist, als Beschichtung eine Versorgungsstruktur auszubilden;
b) gegebenenfalls Einbetten dieser beschichteten ersten Struktur
und/oder Kultivierung der beschichteten Struktur zur Ausbildung der Versorgungsstruktur;
c) Aufbringen einer lebende Zellen enthaltenden Suspension auf die im vorherigen Schritt erhaltene Beschichtung oder der Versorgungsstruktur, zur Ausbildung einer Gewebestruktur auf der Beschichtung oder der Versorgungsstruktur und zum Erhalt eines Gewebemodells;
d) gegebenenfalls Einbetten des im Schritt c) erhaltenen Gewebemodells.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Versorgungsstruktur aus gefäßausbildenden Zellen besteht oder diese beinhaltet, insbesondere wobei diese aus Endothelzellen, Fibroblasten und/oder glatte Muskelzellen besteht oder beinhaltet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Gewebemodell ein Tumorgewebemodell mit einer Tumorzellen enthaltenden Gewebestruktur ist und die Suspension enthaltend lebende Zellen eine ist die lebende Tumorzellen, wie primäre Tumorzellen, enthält.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Suspension lebende Tumorzellen und Stromazellen, wie Endothelzellen, Fibroblasten, Myofibroblasten, Im- munzellen, einschließlich Makrophagen und Leukozyten, und insbesondere Primärzellen, einschließlich Stammzellen und Progenitorzellen, dieser Zellarten enthält.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Suspension in Form eines Hydrogels und/oder eines biokompatiblen Polymers aufgebracht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Aufbringen der Suspension mit lebenden Zellen und/oder das Aufbringen der Zusammensetzung mit lebenden Zellen mittels Drucken, Sprühen oder Extrudieren erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Gewebestruktur im Gewebemodell unterschiedliche Bereiche oder Strukturen aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Versorgungsstruktur und/oder das ausgebildete Gewebemodell mit einer zyto- kompatiblen Einbettmasse fixiert wird.
Gewebemodell erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüch 1 bis 8.
10. Verwendung eines Gewebemodells nach Anspruch 9 als Modell zur Gewebegenese, insbesondere Tumorgenese.
Verwendung eines Gewebemodells nach Anspruch 9, wobei das Gewebemodell ein Tumorgewebemodell ist zur Testung einer Therapie mit einer vorbestimmten Therapieform oder zur Stratifizierung der Therapie zur Behandlung des Tumors.
12. Verwendung eines Gewebemodells nach Anspruch 9 in bildgebenden Verfahren einschließlich US, MRT, CT, PET, SPECT, optischer Bildgebung einschließlich Mikroskopie.
13. Verfahren zum Testen und Identifizieren von Wirkstoffkandidaten umfassend den Schritt:
a) Bereitstellen eines Gewebemodells nach Anspruch 9;
b) Einbringen des Wirkstoffkandidaten über die Versorgungsstruktur in die Gewebestruktur und Analysieren der Wirkung des Wirkstoff kandi- daten auf das Gewebemodell, wobei ein Wirkstoffkandidat als potentieller Wirkstoff identifiziert wird, wenn dieser eine gewünschte Wirkung auf das Gewebemodell zeigt.
14. Verfahren zum Testen und Identifizieren von Wirkstoffkandidaten nach Anspruch 13, wobei diese Wirkstoffkandidaten solche sind, die zytostatisch, zytotoxisch auf Tumorzellen oder solche Zellen, die zur Versorgung des Tumors beitragen, einschließlich Endothelzellen, Fibroblasten und glatte Muskelzellen wirken, die anti-angiogen und/oder anti-inflammatorisch wirken, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines Gewebemodells nach Anspruch 9 enthaltend Tumorzellen;
b) Einbringen der Wirkstoffkandidaten über die Versorgungsstruktur in die Tumorzellen enthaltende Gewebestruktur und Analysieren der Wirkung des Wirkstoffkandidaten auf das Gewebemodell, wobei ein potentieller Wirkstoff identifiziert wird, wenn dieser einen Tumorwachstum verringernden, wie Tumorwachstum stoppenden Effekt oder einen Tumor verkleinernden Effekt, anti-angiogenen oder antiinflammatorischen Effekt aufzeigt.
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