JP5688373B2 - α−ガラクトースエピトープを発現するトランスジェニック鳥類、ウイルス及びワクチン - Google Patents
α−ガラクトースエピトープを発現するトランスジェニック鳥類、ウイルス及びワクチン Download PDFInfo
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Description
[1]
α-ガラクトースエピトープ(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R:以下α-Gal)を発現し得るトランスジェニック鳥類。
[2]
鳥類がニワトリである[1]に記載のトランスジェニック鳥類。
[3]
G0または後代である、[1]または[2]に記載のトランスジェニック鳥類。
[4]
α1,3-ガラクトース転移酵素(α1,3-GT)遺伝子を発現し得る状態で含む、α1,3-GT遺伝子導入用ベクターを鳥類に導入して、[1]〜[3]のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類を得る、トランスジェニック鳥類の作製方法。
[5]
α1,3-GT遺伝子導入用ベクターがレンチウイルスベクターである[4]に記載のトランスジェニック鳥類の作製方法。
[6]
α1,3-GT遺伝子がマウス、ブタまたはウシ由来である、[4]または[5]に記載のトランスジェニック鳥類の作製方法。
[7]
[1]〜[3]のいずれかに記載のトランスジェニック鳥類から得られる生体試料。
[8]
生体試料がトランスジェニック鳥類の産んだ卵である[7]に記載の生体試料。
[9]
トランスジェニック鳥類の産んだ卵が受精卵または発育鳥類卵である[8]に記載の生体試料。
[10]
[7]〜[9]のいずれかに記載の生体試料にウイルスを接種し、ウイルスを接種した生体試料を育成し、育成した生体試料からα-Galを発現するウイルスを得ることを含む、α-Gal発現ウイルスの作製方法。
[11]
前記ウイルスがインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、エイズウイルス、ニューカッスル病ウイルス、またはマレック病ウイルスである[10]に記載のα-Gal発現ウイルスの
作製方法。
[12]
[10]または[11]に記載の方法で、α-Galを発現するウイルスを作製し、得られたウイルスからワクチンを作製する、ワクチンの作製方法。
本発明は、α-ガラクトースエピトープ(Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R:以下α-Gal)を発現し得るトランスジェニック鳥類に関する。
本発明は、α-Gal(α-ガラクトースエピトープ)を発現するウイルス(α-Gal発現ウイルス)の作製方法を包含する。
本発明は、上記本発明の作製方法で得たα-Gal発現ウイルスを用いて、ワクチンを作製する方法を包含する。
以下の実施例で用いた試験方法について記載する。
(1) Griffonia Simplicifolia lectin I-Isolectin B4(GS-IB4)を用いたフローサイトメトリー
細胞上に発現するα-Galをfluorescein isothiocyanate (FITC) 標識GS-IB4(Vector Laboratories Inc.) を用いて4℃で30分間染色した後に洗浄し、FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences) にて解析した。
ウイルスに発現するα-Galを調べるためのWestern blottingは以下のように行った。ウイルスのタンパクを2-mercaptoethanolの存在下でSodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) により分離した後、polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Bio-Rad) に転写し、1%Alkali-soluble Casein (Novagen) を用いてブロッキングを行った。その後、HRP標識GS-IB4 (Sigma-Aldrich)と室温で1時間反応させ、反応後のPVDF membraneをECL Western blotting analysis system (Amersham Biosciences)によって発光させ、LAS-3000 (FujiFilm)を用いて解析した。
α1,3-ガラクトース転移酵素(α1,3-GT)遺伝子導入用ベクター作製法
レンチウイルスベクターの作製に必要なSINベクターコンストラクト、ウイルスベクターのエンベロープとなるVSV-G遺伝子とrev遺伝子が挿入されたコンストラクトおよびgag-pol遺伝子を組み込んだパッケージングコンストラクトは、理化学研究所から購入した。SINベクターコンストラクトのEF-1αプロモーターの下流にブタのα1,3-ガラクトース転移酵素(α1,3-GT)遺伝子を連結したプラスミドを構築した。VSV-G遺伝子とrev遺伝子が挿入されたコンストラクト(10μg)、パッケージングコンストラクト(10μg)および構築したSINベクタープラスミド(17μg)を共にリン酸カルシウム法を用いて、あらかじめ直径10cmのPoly-L-Lysine処理したシャーレ上でサブコンフルエント状態まで培養していた293T細胞へ組み込み、37℃、3% CO2インキュベーターで16時間培養した。培養上清を除去した後、新しいDMEM培地10 mlと置換し、37℃、10% CO2インキュベーターで48時間培養することによりレンチウイルスベクターを産生させた。ウイルスを含む培養液を回収し、0.45μmフィルターを通じして浮遊細胞を除去した後、超遠心機を用いて50000g、2時間遠心することによりレンチウイルスを濃縮した。上清を除去した後、10μlのHBSS溶液に溶解することにより遺伝子導入用のα1,3-GT遺伝子のレンチウイルスベクターを作製した。
α-Galを発現するトランスジェニックニワトリ(G1) 作製法
トランスジェニックニワトリの作製法は、特許文献4に記載の方法に基づいて実施した。詳細は以下の通りである。
また、性成熟に達した雄のG1であるID293,ID333およびID466の精子に対して同レクチンを利用した染色法により染色した結果、ID293およびID466の精子はレクチン染色されており、α-Galが発現していることが示された(図4参照)。ID333の精子はレクチン染色されなかった。以上の結果を総合すると、ID293,ID466,ID475,ID4964においてα-Galが発現していることが示された。
(注2)ウイルス力価が1.0x109/mlまたは1.7x109/mlのベクターを利用。表1においてID0004, ID0005が、力価1.0 x109/mlのウイルス、その他は力価1.7 x109/mlのウイルスを注入して作製した。
α-Galを発現するトランスジェニックニワトリ(G2) 作製法
1.実施例1で得られた血球または精子にα-Galを発現するトランスジェニックニワトリ(G1)4羽中3羽(ID293(雄), ID466(雄),ID4964(雌))が性成熟に達した。この3羽について遺伝子導入操作を行っていない非トランスジェニックニワトリ(白色レグホン種)との交配試験を行った。孵化した産子については採取した血液よりDNAを抽出し、実施例2と同様のPCR法によりα1,3-GT遺伝子が組込まれている第二世代のトランスジェニックニワトリ(G2)を検索した。α1,3-GT遺伝子が組込まれたことが確認された個体については、実施例2と同様のレクチンを利用した血球凝集反応を利用して血球にα-Galを発現するトランスジェニックニワトリ(G2)を検索した。その結果、表2に示すとおりα1,3-GT遺伝子が組込まれたトランスジェニックニワトリ(G2)は、ID4964から44羽得られた。ID293およびID466からは受精卵が得られなかった。レクチンを用いた血球凝集反応の結果、ID4964から得られた44羽のG2中43羽(97.7%)が血球にα-Galを発現すると判定した。
α-Galを発現するインフルエンザウイルス作製法
1. 実施例3において、α-Gal発現トランスジェニック雌ニワトリ(ID 4964)(G1)と非遺伝子導入雄との交配で得られた受精卵(G2)のうち5個を孵卵してウイルス感染実験に用いた。受精卵(G2)は、人工的に37℃〜39℃、湿度60%で30分毎に90°転卵させる方法により培養することにより胚発生を開始し、発育鶏卵とした。10〜11日齢に達した発育鶏卵4964E1〜E 5の漿尿膜腔内へH9N2ウイルスを接種し、その3〜4日後に各卵から漿尿液を回収した。得られた漿尿液について赤血球凝集(HA)試験を行ったところ、いずれの漿尿液も2048〜4096倍のHA力価を示し、同ウイルスを接種した正常卵におけるHA力価と同等であった(表4)。
1. α-Gal発現の発育鶏卵から産生されるインフルエンザウイルスの増殖性は正常卵のものと同等であるという知見により、α-Gal発現発育鶏卵を用いたα-Gal発現ワクチンの大量生産化が期待出来る。
2. α-Gal発現発育鶏卵から作製されたα-Gal発現ワクチンは、抗α-Gal抗体を保有する人や家禽等にとって、従来のワクチンよりも効果が増強されたインフルエンザワクチンとなることが期待される。
3. α-Gal発現ワクチンはインフルエンザのみならず、鶏胚を用いて作製するその他のワクチンにも応用可能であると考えられる。
Claims (5)
- α1,3−ガラクトース転移酵素(α1,3−GT)遺伝子を発現し得る状態で含むレンチウイルスベクターを鶏2.5日胚に注入して得られたトランスジェニック操作胚を培養し孵化させることを含む方法で、α−ガラクトースエピトープ(Galα1−3Galβ1−4GlcNAc−R:以下α−Gal)を発現し得るトランスジェニック鶏を得ること、
トランスジェニック鶏が産んだ卵にウイルスを接種し、ウイルスを接種した卵を育成し、育成した卵からα−Galを発現するウイルスを得ることを含む、α−Gal発現ウイルスの作製方法。 - 前記ウイルスがインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、エイズウイルス、ニューカッスル病ウイルス、またはマレック病ウイルスである請求項10に記載のα−Gal発現ウイルスの作製方法。
- 請求項10または11に記載の方法で、α−Galを発現するウイルスを作製し、得られたウイルスからワクチンを作製する、ワクチンの作製方法。
- α1,3−GT遺伝子がマウス、ブタまたはウシ由来である、請求項10に記載の作製方法。
- トランスジェニック鶏の産んだ卵が受精卵または発育鶏卵である請求項10に記載の作製方法。
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