BR112019025358A2 - ovo aviário transgênico, ave transgênica, ovo ou progênie aviária, método para detectar um ovo aviário macho, método para produzir um ovo aviário, método para replicar um vírus, vírus produzidos pelo uso de ovo aviário, método para produzir uma composição de vacina, composição da vacina produzida pelo uso do método e método para produzir um ovo aviário transgênico ou uma ave produzida pelo ovo - Google Patents

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Abstract

A presente invenção refere-se a aves transgênicas e os ovos produzidos a partir das mesmas, em que os ovos compreendem uma modificação genética que facilita classificação de gênero in ovo e a modificação genética que aumenta uma característica de produção nos ovos ou nas aves produzidas a partir dos mesmos. A presente invenção também se refere a métodos de identificação do gênero de ovos antes da eclosão e métodos de classificação dos ovos com base no gênero antes da eclosão.

Description

OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, AVE TRANSGÊNICA, OVO OU PROGÊNIE AVIÁRIA, MÉTODO PARA DETECTAR UM OVO AVIÁRIO MACHO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO, MÉTODO PARA REPLICAR UM VÍRUS, VÍRUS PRODUZIDOS PELO USO DE OVO AVIÁRIO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA, COMPOSIÇÃO DA VACINA PRODUZIDA PELO USO DO MÉTODO E MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO OU UMA AVE PRODUZIDA PELO OVO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a aves transgênicas e aos ovos produzidos das mesmas em que os ovos compreendem uma modificação genética que facilita classificação por gênero in ovo e uma modificação genética que aumenta uma característica de produção nos ovos ou nas aves produzidas a partir dos mesmos. A presente invenção também se refere a métodos para identificar o gênero de ovos antes da eclosão e métodos de classificação dos ovos com base em gênero antes da eclosão.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A genética tem desempenhado um papel importante na domesticação de aves e tem contribuído para o alto desempenho dos dois principais tipos de aves comerciais; frangos de carne e poedeiras, usados para gerar carne e ovos respectivamente. A diferença dramática no metabolismo dessas duas linhagens significa que as aves macho geradas na indústria de postura de ovos não são comercialmente viáveis para crescer para a carne, na maioria dos ambientes comerciais. Como resultado, os machos são identificados após a eclosão, por sexagem manual ou identificação de cores das penas, e imediatamente sacrificados, com uma recuperação de valor baixa de nutrientes de suas carcaças. Essa prática apresenta uma questão ética importante e crescente que afeta a indústria de postura de ovos e incorre em custos e perdas de valor de produção para os agricultores. Note-se também que os Produtores de Ovos Unidos nos EUA anunciaram recentemente sua meta de remover a prática do abate de machos até 2020. É provável que outros países sigam esse exemplo.
[003] A capacidade de detectar e remover pintos machos antes da eclosão seria um grande passo à frente para as indústrias de postura de ovos e relacionadas. A prática atual de abate de pintos machos após a eclosão cria um grande dilema ético para muitos países. A eclosão e o crescimento de pintos de postura machos não é uma opção sustentável para os agricultores. A identificação de ovos machos antes da eclosão permitiria que os mesmos fossem separados dos ovos fêmeas e usados em um processo de produção diferente, como a produção de vacinas, que pode usar ovos como biorreatores para produzir vírus necessários para a produção de vacinas, reduzindo assim o desperdício no sistema.
[004] Vários métodos estão sendo desenvolvidos para a sexagem in ovo e têm como base a medição hormonal (Weissmann et al., 2013), análise de DNA (Porat et al., 2011) e, mais recentemente, na espectroscopia Raman (Galli et al., 2016). Os testes de DNA e hormônios exigem amostragem e processamento, que são demorados e caros, e não são ideais para a adoção pela indústria. A espectroscopia Raman é um grande avanço, no entanto, envolve a criação de um grande orifício na casca do ovo para análise sem contato, que requer, em seguida, vedação com fita adesiva. Com todos esses métodos, não é possível triar os ovos no ponto de postura e antes da incubação. Um método de sexagem in ovo que pudesse fazer isso seria mais desejável para a indústria e mais prontamente integrado às práticas industriais existentes. É neste contexto que os presentes inventores desenvolveram uma abordagem genética para triar embriões no ponto de postura, para permitir a remoção de ovos machos antes da eclosão para uso em processos de produção alternativos.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[005] Em um aspecto, a presente invenção fornece um ovo aviário transgênico que compreende:
[006] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável no ovo; e
[007] ii) uma segunda modificação genética que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética.
[008] Em uma modalidade preferencial, a segunda modificação genética é no mesmo cromossomo Z que a primeira modificação genética.
[009] Em uma modalidade, as modificações genéticas são herdadas maternalmente.
[0010] Em uma modalidade, o ovo é macho. Em uma modalidade alternativa, o ovo é fêmea.
[0011] Em uma modalidade, a primeira modificação genética e a segunda modificação genética são a mesma modificação genética. Por exemplo, a primeira modificação genética pode ser um transgene que é inserido em um gene endógeno, que resulta no gene não codificar mais uma proteína funcional tal como os genes de interferon I e II no cromossomo Z. Nesse exemplo, o gene endógeno rompido é a segunda modificação genética.
[0012] Em uma modalidade, o marcador é detectável sem perturbar a integridade da casca do ovo.
[0013] Em uma modalidade, o marcador é detectável dentro de um dia, ou dois dias, do ponto de postura sem perturbar a integridade da casca do ovo.
[0014] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína fluorescente, uma proteína luminescente, uma proteína auditiva (proteína vibratória), uma proteína sônica, um marcador metabólico ou uma proteína quelante seletiva.
[0015] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína fluorescente. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é selecionada dentre, porém, sem limitação, Proteína fluorescente verde (GFP), Proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP), Emerald, Superfolder GFP, Verde Azami, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, mNeonGreen, mUKG, AcGFP, ZsGreen, Cloverm Sapphire, T-Sapphire, Proteína fluorescente azul aprimorada (EBFP), EBFP2, Azurite, TagBFP, mTagBFP, mKalama1, proteína fluorescente ciano (CFP), mCFP, proteína fluorescente ciano aprimorada (ECFP), mECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1 (Teal), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP), superproteína fluorescente amarela (SYFP), Topaz, Venus, Citrine, mCitrine, YPet, TagYFP, TurboYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato- Tandem, Proteína fluorescente vermelha (RFP), TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, proteína fluorescente Tag ref (RFP), TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine, mKeima-Red, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mKate2, mKate (TagFP635),
HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, mNeptune, NirFP, Sirius, TagRFP657, AQ143, Kaede, KikGR1, PX- CFP2, mEos2, IrisFP, mEOS3.2, PSmOrange, PAGFP, Dronpa, Aloficocianina, GFPuv, R-fitoeritrina (RPE), Clorofila Peridinina (PerCP), P3, Katusha, B-fitoeritrina (BPE), mKO, J- Red. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é RFP. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é GFP.
[0016] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína luminescente. Em uma modalidade, a proteína luminescente é selecionada dentre aequorina ou luciferase.
[0017] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda modificações genéticas são o resultado de uma inserção, substituição ou exclusão. Em uma modalidade, a inserção é a inserção de um transgene.
[0018] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda modificações genéticas são transgenes.
[0019] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda modificações genéticas estão em um construto genético exógeno único.
[0020] Em uma modalidade, a primeira e/ou a segunda modificações genéticas são introduzidas com uma nuclease programável.
[0021] Em uma modalidade, a característica de produção é selecionada dentre, porém, sem limitação, produção de vírus, produção de proteína recombinante, massa muscular, conteúdo nutricional e fertilidade.
[0022] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética reduz a expressão de um gene e/ou proteína antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética em que o ovo é capaz de produzir mais vírus do que o ovo isogênico.
[0023] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é selecionado dentre, porém, sem limitação, IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB e XPO1.
[0024] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é selecionado dentre, porém, sem limitação, IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, BACE2, UBA5, ZFPM2, TRIM50, DDI2, NPR2, CAPN13, DNASE1L2, PHF21A, PCGF5, IFNLR1, IFIH1, IL-1RA, LAMP1, EFR3A, ABI1, GADL1, PLVAP, CYYR1, ASAP1, NXF1, NSUN6, ANGPTL7, SIL1, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, CBLN4, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GCOM1, GTPBP4, IFT43, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SMYD2, XPO1 e ZKSCAN7.
[0025] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é selecionado dentre IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ e IFNλ.
[0026] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNAR1. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IL-6. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é MDA5. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é CNOT4. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNα. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNβ. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNγ. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNλ.
[0027] Em uma modalidade, a segunda modificação genética é uma exclusão, substituição ou uma inserção no gene antiviral ou uma região reguladora do mesmo.
[0028] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética modifica a glicosilação no ovo aviário em que o vírus produzido pelo ovo tem imunogenicidade aumentada em comparação com o vírus produzido pelo ovo isogênico.
[0029] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética modifica a sialilação no ovo aviário, em que o vírus produzido pelo ovo tem imunogenicidade aumentada em comparação com o vírus produzido pelo ovo isogênico.
[0030] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética aumenta ácido siálico ligado a α-2,6 (α-2,6-sialiação) no ovo aviário em que o vírus produzido pelo ovo tem imunogenicidade aumentada em comparação com o vírus produzido pelo ovo isogênico.
[0031] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética aumenta a expressão do gene e/ou proteína SIAT1 no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética e em que o vírus produzido pelo ovo tem imunogenicidade aumentada em comparação com o vírus produzido pelo ovo isogênico.
[0032] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética aumenta a quantidade de ácido siálico ligado a α-2,6 e diminui a quantidade de ácido siálico ligado a α-2,3 no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética, e em que o vírus produzido pelo ovo tem imunogenicidade aumentada em comparação com o vírus produzido pelo ovo isogênico.
[0033] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de vírus e a segunda modificação genética aumenta a expressão de uma proteína antimicrobiana no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética e em que o ovo é capaz de produzir mais vírus do que o ovo isogênico. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana é ovotransferrina. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana é uma beta-defensina microbiana.
[0034] Em uma modalidade, a característica de produção é produção de proteína recombinante e a segunda modificação genética resulta em expressão de uma proteína recombinante no ovo. Em uma modalidade, a proteína recombinante é uma proteína terapêutica.
[0035] Em uma modalidade, a modificação genética é a inserção de um transgene que codifica uma proteína fluorescente no cromossomo Z da ave, em que a inserção modifica a expressão de um gene e/ou proteína que modifica uma característica de produção em um ovo e/ou ave produzida pela ave.
[0036] Em uma modalidade, a ave é uma galinha.
[0037] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma ave transgênica que compreende:
[0038] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo produzido pela ave; e
[0039] ii) uma segunda modificação genética que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética.
[0040] Em uma modalidade preferencial, a segunda modificação genética é no mesmo cromossomo Z que a primeira modificação genética.
[0041] Em uma modalidade, a ave é fêmea.
[0042] Em uma modalidade, a ave é macho.
[0043] Em uma modalidade, a ave macho transgênica é heterozigoto para as modificações genéticas. Tais aves podem ser cruzadas com uma ave fêmea transgênica que tenha as mesmas modificações genéticas no cromossomo Z que o macho para produzir um macho avô para uso em um processo reprodutivo da invenção (consultar a Figura 2).
[0044] Em outra modalidade, a ave macho transgênica é homozigoto para as modificações genéticas. Tais aves podem ser cruzadas com uma ave fêmea não transgênica para produzir uma fêmea progenitora para uso em um processo reprodutivo da invenção (consultar a Figura 2).
[0045] Como a pessoa versada estaria ciente, uma ave fêmea transgênica da invenção pode ter qualquer uma das características descritas acima definidas para uma ave macho transgênica da invenção.
[0046] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um ovo ou progênie aviária produzida pela ave transgênica como descrito no presente documento.
[0047] Em uma modalidade, o ovo aviário é um ovo macho que tem produção de vírus aumentada em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética.
[0048] Em uma modalidade alternativa, o ovo aviário é um ovo macho que é modificado para produzir um vírus menos adaptado ao ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética. Em uma modalidade, a segunda modificação genética resulta em expressão aumentada do gene e/ou proteína SIAT no ovo macho. Em uma modalidade, a segunda modificação genética resulta em aumento de ácido siálico α-2,6 no ovo macho. Em uma modalidade, a segunda modificação genética resulta em diminuição de ácido siálico α- 2,3 no ovo macho.
[0049] Em uma modalidade adicional, o ovo produz uma proteína terapêutica recombinante.
[0050] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para detectar um ovo aviário macho, sendo que o método compreende:
[0051] i) obter um ovo aviário produzido por cruzamento de uma ave fêmea transgênica da invenção com uma ave macho que carece da primeira modificação genética, e
[0052] ii) triar o ovo pelo marcador,
[0053] em que o ovo é macho se tiver o marcador.
[0054] Em uma modalidade, o macho na etapa i) não é transgênico.
[0055] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína fluorescente ou proteína auditiva.
[0056] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína fluorescente e o marcador é triado através de exposição do ovo a um primeiro comprimento de onda de luz e avaliação da fluorescência em um segundo comprimento de onda de luz.
[0057] Em uma modalidade, o método é usado para classificação por gênero de alto volume de ovos aviários. Em uma modalidade, os ovos machos são selecionados e usados para a produção de vírus ou produção de proteínas terapêuticas. Em uma modalidade, os ovos fêmeas são selecionados para a produção de ovos (para alimentação) e/ou produção de carne. Em uma modalidade, os ovos fêmeas não são transgênicos.
[0058] Em uma modalidade, o método é automatizado.
[0059] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para classificação por gênero de ovos aviários, sendo que o método compreende:
[0060] i) obter um ovo aviário produzido por cruzamento de uma ave fêmea como descrito no presente documento com uma ave macho,
[0061] ii) triar o ovo pelo marcador, e
[0062] iii) separar os ovos machos dos ovos fêmeas,
[0063] em que o ovo é macho se tiver o marcador e o ovo é fêmea se carecer do marcador.
[0064] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece um método para produzir um ovo aviário, sendo que o método compreende cruzar uma ave fêmea como descrito no presente documento com uma ave macho. Em uma modalidade, a ave macho não compreende a primeira modificação genética e a segunda modificação genética como descrito no presente documento. Em uma modalidade, os ovos fêmeas produzidos pelo cruzamento não compreendem a primeira modificação genética e a segunda modificação genética como descrito no presente documento.
[0065] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir alimentos, sendo que o método compreende:
[0066] (i) obter uma ave por cruzamento de uma ave fêmea com uma ave macho, em que pelo menos uma das aves é uma ave da invenção, e
[0067] (ii) colheita de carne e/ou ovos da ave.
[0068] Em uma modalidade, a fêmea é uma ave da invenção.
[0069] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para replicar um vírus, sendo que o método compreende;
[0070] 1) obter um ovo aviário como descrito no presente documento,
[0071] 2) inocular o ovo com o vírus, e
[0072] 3) incubar o ovo por um período predeterminado de tempo para replicar o vírus.
[0073] Em uma modalidade, a segunda modificação genética reduz a expressão de um gene antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética
[0074] Em uma modalidade, o método como descrito no presente documento compreende adicionalmente colher o vírus replicado ou partículas do mesmo do ovo.
[0075] Em uma modalidade, a colheita compreende obter o fluido alantoico do ovo.
[0076] Também é fornecido um vírus produzido com o uso do ovo aviário como descrito no presente documento, e/ou com o uso do método como descrito no presente documento.
[0077] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir uma composição de vacina, sendo que o método compreende;
[0078] 1) replicar um vírus com o uso do método como descrito no presente documento,
[0079] 2) colher o vírus replicado ou partículas do mesmo do ovo, e
[0080] 3) preparar uma composição de vacina a partir do vírus colhido.
[0081] Em uma modalidade, a etapa 2) ou a etapa 3) compreende inativar o vírus.
[0082] Em uma modalidade, o vírus é um vírus animal. Em uma modalidade, o animal é um ser humano, galinha, porco, peixe, ovelha ou vaca. Em uma modalidade, o animal é um ser humano.
[0083] Em uma modalidade, o vírus está em uma família selecionada dentre, porém, sem limitação, Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Paramyxoviridae, Flaviviridae e Coronaviridae.
[0084] Em uma modalidade, o vírus é selecionado dentre, porém, sem limitação, vírus Influenza, Vírus da cinomose canina, Vírus do sarampo, Reovírus, Vírus da encefalite equina oriental, Vírus da parainfluenza canina, Vírus da raiva, vírus Fowlpox, Vírus da encefalite equina ocidental, vírus Mups, Encefalomielite equina, Vírus da rubéola, Vírus da síndrome da queda de postura, Vírus oncolíticos aviários, vírus da doença de Newcastle, Vírus da parainfluenza bovina, Vírus da varíola, Doença infecciosa bursal, Vírus bovino da doença de Ibaraki, Poxvírus recombinante, Adenovírus aviário tipo I, II ou III, Vírus da encefalite suína japonesa, Vírus da febre amarela, Vírus do Herpes, Vírus Sindbis, Vírus da bronquite por infecções, Vírus da floresta Semliki, Vírus da encefalomielite, Vírus da EEV venezuelana, Vírus da anemia de galinha, Vírus da doença de Marek, Parvovírus, Vírus da febre aftosa, Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, Vírus da peste suína clássica, Vírus da febre catarral ovina, vírus Kabane, Vírus da anemia infecciosa do salmão, Vírus da necrose hematopoiética infecciosa, Vírus da septicemia hemorrágica viral e Vírus da necrose pancreática infecciosa. Em uma modalidade, o vírus é o vírus Influenza.
[0085] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma composição de vacina produzida com o uso do método como descrito no presente documento.
[0086] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um ovo aviário transgênico, ou uma ave produzida pelo ovo, sendo que o ovo ou ave compreende
[0087] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e
[0088] ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou aviário que carece da segunda modificação genética,
[0089] sendo que o método compreende cruzar uma ave macho que é heterozigoto para as modificações genéticas com uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z para produzir um ovo ou ave macho do mesmo que é homozigoto para as modificações genéticas.
[0090] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um ovo aviário transgênico, ou ave produzida pelo ovo, sendo que o ovo ou ave compreende
[0091] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e
[0092] ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou aviário que carece da segunda modificação genética,
[0093] sendo que o método compreende cruzar uma ave macho que é homozigoto para as modificações genéticas com uma ave fêmea que carece das modificações genéticas para produzir um ovo ou ave fêmea do mesmo que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z.
[0094] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um ovo aviário transgênico, ou ave produzida pelo ovo, sendo que o ovo ou ave compreende
[0095] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e
[0096] ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou aviário que carece da segunda modificação genética,
[0097] sendo que o método compreende cruzar uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z com uma ave macho que carece das modificações genéticas para produzir um ovo ou ave macho do mesmo que é heterozigoto para as modificações genéticas, em que um ovo ou ave fêmea do mesmo produzida do cruzamento carece das modificações genéticas.
[0098] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir um ovo aviário transgênico, ou ave produzida pelo ovo, sendo que o ovo ou ave compreende
[0099] i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e
[00100] ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou aviário que carece da segunda modificação genética,
[00101] 1) cruzar uma ave macho que é heterozigoto para as modificações genéticas com uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z para produzir uma ave macho que é heterozigoto para as modificações genéticas,
[00102] 2) cruzar a ave macho produzida pela etapa 1) com uma ave fêmea que carece das modificações genéticas para produzir uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z, e
[00103] 3) cruzar a ave fêmea produzida pela etapa 2) com uma ave macho que carece das modificações genéticas para produzir um ovo ou ave macho do mesmo que é heterozigoto para as modificações genéticas, em que um ovo ou ave fêmea do mesmo produzida do cruzamento carece das modificações genéticas.
[00104] Em uma modalidade, o método dos métodos como descritos no presente documento, as aves fêmeas produzidas pelo método são usadas para a indústria de ovos e os ovos machos produzidos pelo método são usados na indústria de vacinas.
[00105] As etapas, características, integralidades, composições e/ou compostos revelados no presente documento ou indicados no relatório descritivo desse pedido individual ou coletivamente, e toda e qualquer combinação de duas ou mais das ditas etapas ou características.
[00106] Qualquer modalidade no presente documento deve ser tomada para aplicar, após as devidas alterações, a qualquer outra modalidade a menos que indicado especificamente de outra forma. Por exemplo, como a pessoa versada entenderia, exemplos de genes antivirais descritos acima para o ovo aviário transgênico da invenção se aplicam igualmente aos métodos da invenção.
[00107] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas no presente documento, as quais se destinam apenas ao propósito de exemplificação. Produtos, composições e métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da invenção, como descrito no presente documento.
[00108] Em todo esse relatório descritivo, a menos que indicado especificamente de outra forma ou que o contexto exija de outra forma, deve-se fazer referência a uma única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria para abranger uma e uma pluralidade (isto é, uma ou mais) daquelas etapas, composições de matéria, grupos de etapas ou grupo de composições de matéria.
[00109] A invenção é descrita doravante por meio dos Exemplos não limitantes a seguir e com referência às figuras anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS
[00110] Figura 1. Visão geral: eclosão seletivamente de pintos fêmeas. A determinação do sexo em galinhas é definida pela presença de dois cromossomos sexuais, Z e W. Os machos portam duas cópias do cromossomo Z (ZZ) e as fêmeas portam um cromossomo Z e um W (ZW). A cópia única do cromossomo Z portada pela ave fêmea é passada sempre apenas para a descendência masculina e é passada para TODA a descendência masculina. A descendência feminina pode derivar seu cromossomo Z apenas de um galo reprodutor não modificado. Um marcador no cromossomo z, tal como uma proteína fluorescente como GFP ou RFP, é usado para remover todos os machos do sistema de produção de postura de ovos no estágio inicial, ou seja, antes da incubação e antes da eclosão. Portanto, todos os filhotes que entram no sistema de produção serão fêmeas e completamente livres do cromossomo Z marcado. Os ovos masculinos podem ser desviados para usos alternativos, como a produção de vírus.
[00111] Figura 2: Mostra a estrutura de criação da indústria de postura de ovos e como as modificações da presente invenção podem ser incorporadas nas linhas de criação de frangos de carne e poedeiras. A linha superior de galinhas representa as linhas de linhagem dos bisavós. A segunda linha superior de galinhas representa as linhas dos avós. A terceira linha superior de galinhas representa as linhas dos progenitores. A linha inferior representa os ovos de poedeiras comerciais e machos produzidos durante a produção de poedeiras comerciais a partir das linhas parentais. Pode-se observar que na indústria comercial uma modificação genética no cromossomo z, como uma modificação que resulta na expressão de uma proteína fluorescente (FP) e/ou uma modificação que afeta uma característica de produção, presente nos bisavós (ZFPZ e ZFPW) podem ser passadas para a linha de avós machos (ZFPZFP) que podem ser passadas para fêmeas nas linhas de progenitores (ZFPW) em que as mesmas são passadas para ovo macho produzido pelo cruzamento da progenitora fêmea modificada (ZFPW) com um macho não modificado, enquanto que as fêmeas produzidas por esse cruzamento carecerão da modificação.
[00112] Figura 3. Produção de galinhas transgênicas por meio de transfecção direta in vivo de células germinativas primordiais (PGCs). A. Injeção direta de lipofectamina e construções de DNA (que podem incluir um gene marcador como GFP) no sistema circulatório dos embriões do dia 2 (estágio 14 HH) para atingir PGCs à medida que migram para as gônadas em desenvolvimento. B. Refazer a vedação dos ovos e incubar. C. Embriões são incubados até a eclosão e machos são mantidos até atingirem a maturidade sexual. D. sêmen é coletado e triado quanto à presença do transgene através de qPCR. E. Machos com altos níveis de esperma transgênico são reproduzidos em galinhas e os filhotes são triados visualmente quanto à presença do gene marcador.
[00113] Figura 4. Análise dos locais de inserção de Tol2 em galinhas transgênicas da linha germinativa. A. Caracterização da região do genoma em que as inserções ocorreram. B. Distribuição cromossômica dos locais de inserção.
[00114] Figura 5. Detecção de fluorescência de GFP em vários estágios do desenvolvimento embrionário. Detecção de fluorescência nos dias 2,5, 10 e 18 de embriogênese usando uma fonte de luz de detecção de GFP com um filtro para detectar fluorescência.
[00115] Figura 6. Atividade antiviral de galinha recombinante (rch) IFNα, IFNβ, IFNγ e IFNλ em um ensaio de neutralização de vírus. Um aumento na viabilidade celular equivale a um aumento na DO. Valores de absorvância são as médias ± SE, duplicadas de dois experimentos independentes. Células isoladas e células + controle de vírus são mostrados como as médias de 24 poços.
[00116] Figura 7. A. Análise ELISA indireta revela que os soros anti-IFNs purificados (IFNα, IFNβ, IFNγ e IFNλ) reconhecem proteína homóloga. O gráfico mostra que o antissoro anti-chIFN policlonal precipitado com sulfato de amônio detecta proteínas homólogas em ELISA. O OD é uma medida dos níveis de anticorpos. Valores de absorvância mostrados são as médias ± SE, duplicadas de dois experimentos independentes. B. Anticorpos anti-chIFN-α não parecem aumentar o título de vírus in ovo. Anticorpos anti-chIFN-α coinoculados com o vírus da vacina da gripe (PR8 ou NIBRG14) in ovo não aumentam o título de hemaglutinação (HA) medido pelo ensaio de hemaglutinação (HA). O gráfico de barras representa a média de quatro experimentos ± SE. C. Anticorpos anti-chIFN-β não parecem aumentar o título de vírus in ovo. A coadministração de anticorpos anti-chIFN-β purificados e vírus da vacina da gripe (PR8 ou NIBRG14) não afeta os títulos de HA do vírus in ovo determinados pelo ensaio de HA. O gráfico de barras representa a média de até três experimentos ± SE.
[00117] Figura 8. A. Anticorpos anti-chIFN-X aumentam o título do vírus in ovo. A inoculação de anticorpos anti-chIFN-λ purificados e vírus da vacina da gripe (PR8 ou NIBRG14) resulta em um aumento do título de HA in ovo medido pelo ensaio de HA. O gráfico de barras representa as médias de até sete experimentos ± SE. A significância estatística é representada como um asterisco (*) p<0,05, dois asteriscos (**) p<0,005 e três asteriscos (***) representam p=0,0001. B. Anticorpos anti-chIFN-γ aumentam o título do vírus in ovo. A coadministração de anticorpos anti-chIFN-γ e vírus da vacina da gripe (PR8 ou NIBRG14) resulta em um aumento no título de HA do vírus in ovo medido pelo ensaio de HA. O gráfico de barras representa a média de 2 experimentos ± SE. A significância estatística é representada como um asterisco (*) p<0,05. C. Anticorpos anti-chIL-6 aumentam o título do vírus in ovo. O efeito de injetar tanto anticorpos anti-chIL-6 purificados quanto vírus da vacina da gripe (PR8 ou NIBRG14) in ovo resulta em um aumento no título do vírus HA medido pelo ensaio de HA. O gráfico de barras representa a média de até cinco experimentos ± SE. A significância estatística é representada como um asterisco (*) p<0,05, dois asteriscos (**) p<0,005.
[00118] Figura 9. Triagem e identificação de genes antivirais para produção de vacinas contra influenza aviária. A. Viabilidade de células DF-1 transfectadas com um siRNA de controle negativo (siNT1) ou com siRNAs direcionados aos 21 genes hospedeiros candidatos. Viabilidade foi medida 72 h após a transfecção, no momento da infecção pelo vírus. B. Títulos de influenza A/WSN cultivados na linha celular imortalizada de fibroblastos de galinha, DF-1, em células de controle (siNT1) ou em células transfectadas com siRNAs para silenciar a expressão de 21 genes hospedeiros. Foi observado um aumento significativo nos títulos virais medidos como TCDI50 após redução da expressão (KD) com o uso de siRNA, com IFNRA1 mostra o maior aumento no título viral. C. A coloração imune de partículas virais em células DF1 mostra um aumento significativo no crescimento do vírus após inibição da expressão de IFNAR1 por siRNA.
[00119] Figura 10. Regulação decrescente de siRNA da expressão gênica do hospedeiro aumenta o crescimento de vírus in vitro. Células DF-1 foram transfectadas com um siRNA de controle negativo (siNT1) ou siRNAs direcionados a CNOT4, IFNAR ou MDA5, como 4 siRNAs duplos agrupados (smartpool) ou como siRNA individuais duplos. *p<0,05 em comparação com níveis de mRNA em células transfectadas com siNT1. Os níveis de mRNA foram quantificados com o uso de sondas Taqman 72 h após a transfecção por PCR quantitativo em tempo real. Cada um dos complexos de siRNA foi avaliado individualmente quanto à sua capacidade de KD do gene alvo (mostrado à esquerda) e aumento de títulos virais (mostrado à direita). Células foram infectadas com o vírus influenza A/WSN (MOI 0.1) por 48 h. Os níveis de vírus no sobrenadante de célula foram quantificados por ensaios de TCID50. *p<0,05 em comparação com os níveis de vírus em células transfectadas com siNT1.
[00120] Figura 11. TCID50 de WSN de ovos. A. TCID50 de WSN de ovos após regulação decrescente por siRNA entregue com o uso dos valores ABA-21/117Q são fornecidos como uma única repetição. B. TCID50 de WSN de ovos após regulação decrescente por siRNA entregue com o uso de ABA-21/117Q. Valores são dados como Média+2 DP.
[00121] Figura 12. TCID50 de WSN de ovos. A. TCID50 de cepa de vacina PR8 de ovos após regulação decrescente por siRNA entregue com o uso de ABA-21/117Q. Valores são dados como Média+2 DP. B. Correlação entre título de TCID50 e redução da expressão de IFNAR1. C. valores máximos de HA e TCID50 obtidos por regulação decrescente por siRNA entregue com o uso de ABA-21/117Q correspondem a um aumento de 3 log em comparação com o controle. shIFNAR1 aumenta o crescimento de influenza nos ovos. D. Expressão de shIFNAR1 e os níveis de RNA de influenza foram medidos no coração dos embriões do dia 12 após a injeção de RCAS-shIFNA1 no dia 0 e infecção com influenza (cepa PR8) no dia 10 da embriogênese. Os valores brutos de CT da PCR em tempo real mostram uma correlação entre a expressão de shIFNAR1 e os níveis de RNA de influenza. Quanto maior a expressão de shIFNAR1 e RNA de influenza é indicada por um valor inferior de CT (N=6).
[00122] Figura 13. Geração de linhas celulares KO DF-1 IFNAR1. Após a transfecção, as células das linhas celulares parentais apresentaram um amplicon alternativo durante a triagem por PCR em cerca de 30% dos alelos. A. A exclusão foi confirmada por sequenciação. Células foram classificadas para obter clones únicos que apresentam: bialélico (A136 e A142) monoalélico (A13) ou nenhuma exclusão aparente (A143) quando comparados com o Tipo Selvagem (WT). B. A expressão do gene IFNAR1A foi avaliada por qPCR. Resultados expressos como a média do valor de ΔΔct +/- 2 desvio padrão (DP) em relação às partículas virais WSN de controle produzidas nas linhas celulares KO. Pfu e TCID50 foram estabelecidos após a infecção das células MDCK com o crescimento de H1N1 A/WSN/1933 nas diferentes linhas celulares como um indicativo de rendimento total de vírus. C. Gene KO a 0 e 48 h. D. Partículas virais WSN produzidas nas linhas celulares KO. Pfu e TCID50 foram estabelecidos após a infecção das células MDCK com o crescimento de H1N1 A/WSN/1933 nas diferentes linhas celulares como um indicativo de rendimento total de vírus.
[00123] Figura 14. Triagem e identificação de genes antivirais contra o vírus Hendra.
[00124] Replicação do vírus Hendra na linha celular humana imortalizada HeLa, em células de controle (siNT1) ou em células transfectadas com siRNAs para silenciar a expressão listada. Foi observado um aumento significativo na replicação viral com o uso do siRNA. LAMP1 mostrou o maior aumento em título viral.
[00125] Figura 15. Atividade antimicrobiana de ovos aviários que superexpressam a ovotransferrina. A superexpressão da ovotransferrina aumenta as propriedades antimicrobianas da clara do ovo, como mostrado pelo crescimento diminuído de Salmonella Kiambu na superexpressão de ovotransferrina da clara de ovo em comparação com os controles.
[00126] Figura 16. A expressão do gene SIAT1 muda a conformação dos resíduos de ácido siálico de α-2,3 para α- 2,6. Células DF1 de fibroblastos de frango foram transfectadas com plasmídeos transposon para conduzir a expressão de A. um gene marcador de eGFP ou B. tanto um gene marcador de eGFP quanto SIAT1, seguido por classificação para populações positivas para eGFP. As células foram coradas com lectinas marcadas com fluorescência, específicas para resíduos de ácido siálico α-2,3 ou α-2,6. Todas as células DF1 coraram positivamente para resíduos α-2,3, no entanto, apenas as células transfectadas com o gene SIAT1 foram positivas para a coloração α-2,6. Os painéis mostram células DF1 com ampliação de 20X, da esquerda para a direita sob campo brilhante, excitação por fluorescência vermelha (RFP) e excitação por fluorescência verde (GFP). Os histogramas de fluorescência da análise FACS de DF1s corados para resíduos α-2,6 C. mostraram uma coloração mais forte para DF1s transfectados com o SIAT1 e o gene marcador, em comparação com DF1s transfectados apenas com o gene marcador.
CHAVE PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[00127] SEQ ID NO: 1: sequência de nucleotídeos senso si-BACE2-1.
[00128] SEQ ID NO: 2: sequência de nucleotídeos antissenso si-BACE2-1.
[00129] SEQ ID NO: 3: sequência de nucleotídeos senso si-BACE2-2.
[00130] SEQ ID NO: 4: sequência de nucleotídeos antissenso si-BACE2-2.
[00131] SEQ ID NO: 5: sequência de nucleotídeos senso si-BACE2-3.
[00132] SEQ ID NO: 6: sequência de nucleotídeos antissenso si-BACE2-3.
[00133] SEQ ID NO: 7: sequência de nucleotídeos senso si-BACE2-4.
[00134] SEQ ID NO: 8: sequência de nucleotídeos antissenso si-BACE2-4.
[00135] SEQ ID NO: 9: sequência de nucleotídeos senso si-GNAZ-1.
[00136] SEQ ID NO: 10: sequência de nucleotídeos antissenso si-GNAZ-1.
[00137] SEQ ID NO: 11: sequência de nucleotídeos senso si-GNAZ-2.
[00138] SEQ ID NO: 12: sequência de nucleotídeos antissenso si-GNAZ-2.
[00139] SEQ ID NO: 13: sequência de nucleotídeos senso si-GNAZ-3.
[00140] SEQ ID NO: 14: sequência de nucleotídeos antissenso si-GNAZ-3.
[00141] SEQ ID NO: 15: sequência de nucleotídeos senso si-GNAZ-4.
[00142] SEQ ID NO: 16: sequência de nucleotídeos antissenso si-GNAZ-4.
[00143] SEQ ID NO: 17: sequência de nucleotídeos senso si-UBE1DC1-1.
[00144] SEQ ID NO: 18: sequência de nucleotídeos antissenso si-UBE1DC1-1.
[00145] SEQ ID NO: 19: sequência de nucleotídeos senso si-UBE1DC1-2.
[00146] SEQ ID NO: 20: sequência de nucleotídeos antissenso si-UBE1DC1-2.
[00147] SEQ ID NO: 21: sequência de nucleotídeos senso si-UBE1DC1-3.
[00148] SEQ ID NO: 22: sequência de nucleotídeos antissenso si-UBE1DC1-3.
[00149] SEQ ID NO: 23: sequência de nucleotídeos senso si-UBE1DC1-4.
[00150] SEQ ID NO: 24: sequência de nucleotídeos antissenso si-UBE1DC1-4.
[00151] SEQ ID NO: 25: sequência de nucleotídeos senso si-CDX2-1.
[00152] SEQ ID NO: 26: sequência de nucleotídeos antissenso si-CDX2-1.
[00153] SEQ ID NO: 27: sequência de nucleotídeos senso si-CDX2-2.
[00154] SEQ ID NO: 28: sequência de nucleotídeos antissenso si-CDX2-2.
[00155] SEQ ID NO: 29: sequência de nucleotídeos senso si-CDX2-3.
[00156] SEQ ID NO: 30: sequência de nucleotídeos antissenso si-CDX2-3.
[00157] SEQ ID NO: 31: sequência de nucleotídeos senso si-CDX2-4.
[00158] SEQ ID NO: 32: sequência de nucleotídeos antissenso si-CDX2-4.
[00159] SEQ ID NO: 33: sequência de nucleotídeos senso si-ZFPM2-1.
[00160] SEQ ID NO: 34: sequência de nucleotídeos antissenso si-ZFPM2-1.
[00161] SEQ ID NO: 35: sequência de nucleotídeos senso si-ZFPM2-2.
[00162] SEQ ID NO: 36: sequência de nucleotídeos antissenso si-ZFPM2-2.
[00163] SEQ ID NO: 37: sequência de nucleotídeos senso si-ZFPM2-3.
[00164] SEQ ID NO: 38: sequência de nucleotídeos antissenso si-ZFPM2-3.
[00165] SEQ ID NO: 39: sequência de nucleotídeos senso si-ZFPM2-4.
[00166] SEQ ID NO: 40: sequência de nucleotídeos antissenso si-ZFPM2-4.
[00167] SEQ ID NO: 41: sequência de nucleotídeos senso si-TRIM50-1.
[00168] SEQ ID NO: 42: sequência de nucleotídeos antissenso si-TRIM50-1.
[00169] SEQ ID NO: 43: sequência de nucleotídeos senso si-TRIM50-2.
[00170] SEQ ID NO: 44: sequência de nucleotídeos antissenso si-TRIM50-2.
[00171] SEQ ID NO: 45: sequência de nucleotídeos senso si-TRIM50-3.
[00172] SEQ ID NO: 46: sequência de nucleotídeos antissenso si-TRIM50-3.
[00173] SEQ ID NO: 47: sequência de nucleotídeos senso si-TRIM50-4.
[00174] SEQ ID NO: 48: sequência de nucleotídeos antissenso si-TRIM50-4.
[00175] SEQ ID NO: 49: sequência de nucleotídeos senso si-DDI2-1.
[00176] SEQ ID NO: 50: sequência de nucleotídeos antissenso si-DDI2-1.
[00177] SEQ ID NO: 51: sequência de nucleotídeos senso si-DDI2-2.
[00178] SEQ ID NO: 52: sequência de nucleotídeos antissenso si-DDI2-2.
[00179] SEQ ID NO: 53: sequência de nucleotídeos senso si-DDI2-3.
[00180] SEQ ID NO: 54: sequência de nucleotídeos antissenso si-DDI2-3.
[00181] SEQ ID NO: 55: sequência de nucleotídeos senso si-DDI2-4.
[00182] SEQ ID NO: 56: sequência de nucleotídeos antissenso si-DDI2-4.
[00183] SEQ ID NO: 57: sequência de nucleotídeos senso si-LOC100859339-1.
[00184] SEQ ID NO: 58: sequência de nucleotídeos antissenso si-LOC100859339-1.
[00185] SEQ ID NO: 59: sequência de nucleotídeos senso si-LOC100859339-2.
[00186] SEQ ID NO: 60: sequência de nucleotídeos antissenso si-LOC100859339-2.
[00187] SEQ ID NO: 61: sequência de nucleotídeos senso si-LOC100859339-3.
[00188] SEQ ID NO: 62: sequência de nucleotídeos antissenso si-LOC100859339-3.
[00189] SEQ ID NO: 63: sequência de nucleotídeos senso si-LOC100859339-4.
[00190] SEQ ID NO: 64: sequência de nucleotídeos antissenso si-LOC100859339-4.
[00191] SEQ ID NO: 65: sequência de nucleotídeos senso si-CNOT4-1.
[00192] SEQ ID NO: 66: sequência de nucleotídeos antissenso si-CNOT4-1.
[00193] SEQ ID NO: 67: sequência de nucleotídeos senso si-CNOT4-2.
[00194] SEQ ID NO: 68: sequência de nucleotídeos antissenso si-CNOT4-2.
[00195] SEQ ID NO: 69: sequência de nucleotídeos senso si-CNOT4-3.
[00196] SEQ ID NO: 70: sequência de nucleotídeos antissenso si-CNOT4-3.
[00197] SEQ ID NO: 71: sequência de nucleotídeos senso si-CNOT4-4.
[00198] SEQ ID NO: 72: sequência de nucleotídeos antissenso si-CNOT4-4.
[00199] SEQ ID NO: 73: sequência de nucleotídeos senso si-CAPN13-1.
[00200] SEQ ID NO: 74: sequência de nucleotídeos antissenso si-CAPN13-1.
[00201] SEQ ID NO: 75: sequência de nucleotídeos senso si-CAPN13-2.
[00202] SEQ ID NO: 76: sequência de nucleotídeos antissenso si-CAPN13-2.
[00203] SEQ ID NO: 77: sequência de nucleotídeos senso si-CAPN13-3.
[00204] SEQ ID NO: 78: sequência de nucleotídeos antissenso si-CAPN13-3.
[00205] SEQ ID NO: 79: sequência de nucleotídeos senso si-CAPN13-4.
[00206] SEQ ID NO: 80: sequência de nucleotídeos antissenso si-CAPN13-4.
[00207] SEQ ID NO: 81: sequência de nucleotídeos senso si-DNASE1L2-1.
[00208] SEQ ID NO: 82: sequência de nucleotídeos antissenso si-DNASE1L2-1.
[00209] SEQ ID NO: 83: sequência de nucleotídeos senso si-DNASE1L2-2.
[00210] SEQ ID NO: 84: sequência de nucleotídeos antissenso si-DNASE1L2-2.
[00211] SEQ ID NO: 85: sequência de nucleotídeos senso si-DNASE1L2-3.
[00212] SEQ ID NO: 86: sequência de nucleotídeos antissenso si-DNASE1L2-3.
[00213] SEQ ID NO: 87: sequência de nucleotídeos senso si-DNASE1L2-4.
[00214] SEQ ID NO: 88: sequência de nucleotídeos antissenso si-DNASE1L2-4.
[00215] SEQ ID NO: 89: sequência de nucleotídeos senso si-PHF21A-1.
[00216] SEQ ID NO: 90: sequência de nucleotídeos antissenso si-PHF21A-1.
[00217] SEQ ID NO: 91: sequência de nucleotídeos senso si-PHF21A-2.
[00218] SEQ ID NO: 92: sequência de nucleotídeos antissenso si-PHF21A-2.
[00219] SEQ ID NO: 93: sequência de nucleotídeos senso si-PHF21A-3.
[00220] SEQ ID NO: 94: sequência de nucleotídeos antissenso si-PHF21A-3.
[00221] SEQ ID NO: 95: sequência de nucleotídeos senso si-PHF21A-4.
[00222] SEQ ID NO: 96: sequência de nucleotídeos antissenso si-PHF21A-4.
[00223] SEQ ID NO: 97: sequência de nucleotídeos senso si-PCGF5-1.
[00224] SEQ ID NO: 98: sequência de nucleotídeos antissenso si-PCGF5-1.
[00225] SEQ ID NO: 99: sequência de nucleotídeos senso si-PCGF5-2.
[00226] SEQ ID NO: 100: sequência de nucleotídeos antissenso si-PCGF5-2.
[00227] SEQ ID NO: 101: sequência de nucleotídeos senso si-PCGF5-3.
[00228] SEQ ID NO: 102: sequência de nucleotídeos antissenso si-PCGF5-3.
[00229] SEQ ID NO: 103: sequência de nucleotídeos senso si-PCGF5-4.
[00230] SEQ ID NO: 104: sequência de nucleotídeos antissenso si-PCGF5-4.
[00231] SEQ ID NO: 105: sequência de nucleotídeos senso si-HSBP1-1.
[00232] SEQ ID NO: 106: sequência de nucleotídeos antissenso si-HSBP1-1.
[00233] SEQ ID NO: 107: sequência de nucleotídeos senso si-HSBP1-2.
[00234] SEQ ID NO: 108: sequência de nucleotídeos antissenso si-HSBP1-2.
[00235] SEQ ID NO: 109: sequência de nucleotídeos senso si-HSBP1-3.
[00236] SEQ ID NO: 110: sequência de nucleotídeos antissenso si-HSBP1-3.
[00237] SEQ ID NO: 111: sequência de nucleotídeos senso si-HSBP1-4.
[00238] SEQ ID NO: 112: sequência de nucleotídeos antissenso si-HSBP1-4.
[00239] SEQ ID NO: 113: sequência de nucleotídeos senso si-GAPDH-1.
[00240] SEQ ID NO: 114: sequência de nucleotídeos antissenso si-GAPDH-1.
[00241] SEQ ID NO: 115: sequência de nucleotídeos senso si-GAPDH-2.
[00242] SEQ ID NO: 116: sequência de nucleotídeos antissenso si-GAPDH-2.
[00243] SEQ ID NO: 117: sequência de nucleotídeos senso si-GAPDH-3.
[00244] SEQ ID NO: 118: sequência de nucleotídeos antissenso si-GAPDH-3.
[00245] SEQ ID NO: 119: sequência de nucleotídeos senso si-GAPDH-4.
[00246] SEQ ID NO: 120: sequência de nucleotídeos antissenso si-GAPDH-4.
[00247] SEQ ID NO: 121: sequência de nucleotídeos senso si-IFNAR1-1.
[00248] SEQ ID NO: 122: sequência de nucleotídeos antissenso si-IFNAR1-1.
[00249] SEQ ID NO: 123: sequência de nucleotídeos senso si-IFNAR1-2.
[00250] SEQ ID NO: 124: sequência de nucleotídeos antissenso si-IFNAR1-2.
[00251] SEQ ID NO: 125: sequência de nucleotídeos senso si-IFNAR1-3.
[00252] SEQ ID NO: 126: sequência de nucleotídeos antissenso si-IFNAR1-3.
[00253] SEQ ID NO: 127: sequência de nucleotídeos senso si-IFNAR1-4.
[00254] SEQ ID NO: 128: sequência de nucleotídeos antissenso si-IFNAR1-4.
[00255] SEQ ID NO: 129: sequência de nucleotídeos senso si-IL28RA-1.
[00256] SEQ ID NO: 130: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL28RA-1.
[00257] SEQ ID NO: 131: sequência de nucleotídeos senso si-IL28RA-2.
[00258] SEQ ID NO: 132: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL28RA-2.
[00259] SEQ ID NO: 133: sequência de nucleotídeos senso si-IL28RA-3.
[00260] SEQ ID NO: 134: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL28RA-3.
[00261] SEQ ID NO: 135: sequência de nucleotídeos senso si-IL28RA-4.
[00262] SEQ ID NO: 136: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL28RA-4.
[00263] SEQ ID NO: 137: sequência de nucleotídeos senso si-MDA5-1.
[00264] SEQ ID NO: 138: sequência de nucleotídeos antissenso si-MDA5-1.
[00265] SEQ ID NO: 139: sequência de nucleotídeos senso si-MDA5-2.
[00266] SEQ ID NO: 140: sequência de nucleotídeos antissenso si-MDA5-2.
[00267] SEQ ID NO: 141: sequência de nucleotídeos senso si-MDA5-3.
[00268] SEQ ID NO: 142: sequência de nucleotídeos antissenso si-MDA5-3.
[00269] SEQ ID NO: 143: sequência de nucleotídeos senso si-MDA5-4.
[00270] SEQ ID NO: 144: sequência de nucleotídeos antissenso si-MDA5-4.
[00271] SEQ ID NO: 145: sequência de nucleotídeos senso si-IL-6-1.
[00272] SEQ ID NO: 146: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL-6-1.
[00273] SEQ ID NO: 147: sequência de nucleotídeos senso si-IL-6-2.
[00274] SEQ ID NO: 148: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL-6-2.
[00275] SEQ ID NO: 149: sequência de nucleotídeos senso si-IL-6-3.
[00276] SEQ ID NO: 150: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL-6-3.
[00277] SEQ ID NO: 151: sequência de nucleotídeos senso si-IL-6-4.
[00278] SEQ ID NO: 152: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL-6-4.
[00279] SEQ ID NO: 153: sequência de nucleotídeos senso si-IL1R1-1.
[00280] SEQ ID NO: 154: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL1R1-1.
[00281] SEQ ID NO: 155: sequência de nucleotídeos senso si-IL1R1-2.
[00282] SEQ ID NO: 156: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL1R1-2.
[00283] SEQ ID NO: 157: sequência de nucleotídeos senso si-IL1R1-3.
[00284] SEQ ID NO: 158: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL1R1-3.
[00285] SEQ ID NO: 159: sequência de nucleotídeos senso si-IL1R1-4.
[00286] SEQ ID NO: 160: sequência de nucleotídeos antissenso si-IL1R1-4.
[00287] SEQ ID NO: 161: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00288] SEQ ID NO: 162: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00289] SEQ ID NO: 163: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00290] SEQ ID NO: 164: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00291] SEQ ID NO: 165: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00292] SEQ ID NO: 166: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00293] SEQ ID NO: 167: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00294] SEQ ID NO: 168: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
[00295] SEQ ID NO: 169: Local de integração cromossômica Tol2 de sequência de nucleotídeos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO TÉCNICAS GERAIS E DEFINIÇÕES SELECIONADAS
[00296] A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento devem ser considerados como tendo o mesmo significado que o comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, aviários transgênicos, imunologia, imuno-histoquímica, engenharia genômica de precisão, química de proteínas e bioquímica).
[00297] A menos que indicado de outra forma, as técnicas de cultura de células e imunológicas utilizadas na presente invenção são procedimentos padrão, bem conhecidos das pessoas versadas na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley e Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 e 2, IRL Press (1991), D.M. Glover e B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1 a 4, IRL Press (1995 e 1996), e F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates e Wiley-Interscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow e David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente).
[00298] O termo “e/ou”, por exemplo, “X e/ou Y” deve ser entendido com o significado “X e Y” ou “X ou Y” e deve ser utilizado para fornecer suporte explícito a ambos os significados ou a qualquer significado.
[00299] Por todo esse relatório descritivo a palavra “compreender”, ou variações como “compreende” ou “que compreende”, serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento, integralidade ou etapa apresentada, ou grupo de elementos, integralidades ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, integralidade ou etapa, ou grupo de elementos, integralidades ou etapas.
[00300] Como usado no presente documento, o termo
“cromossomo Z” se refere a um cromossomo sexual aviário. Aves macho compreendem duas cópias do cromossomo Z (ZZ) e as fêmeas compreendem uma cópia do cromossomo Z derivada do progenitor materno e uma cópia do cromossomo W (ZW).
[00301] Como usado no presente documento, o termo “ovo” se refere a um óvulo que foi posto por um pássaro. Tipicamente, ovos aviários consistem em uma casca de ovo externa oval dura, clara de ovo ou albume, gema de ovo e várias membranas finas. O ovo pode ou não ser fertilizado.
[00302] Como usado no presente documento, “integridade da casca do ovo” se refere à casca do ovo que está suficientemente intacta para permitir o desenvolvimento de um pinto ou suficientemente intacta para permitir que o ovo seja usado como um biorreator (para produção de vírus ou proteína). Em uma modalidade, a casca pode ter um orifício pequeno para inserção de, por exemplo, uma fibra óptica para detectar a presença de um marcador. Em uma modalidade, a casca do ovo está inteira e sem interrupções (o marcador é detectado através da casca do ovo).
MODIFICAÇÕES GENÉTICAS
[00303] Como usado no presente documento, o termo “modificação genética” é qualquer alteração feita pelo homem no material genético na ave e/ou ovo aviário. A modificação pode ter sido feita a um ou ambos os progenitores do ovo ou ave, ou um ancestral de um de ambos os progenitores. Métodos para modificar geneticamente células são bem conhecidos na técnica e podem incluir qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica.
[00304] Em um exemplo, a modificação genética é uma mutação para um gene endógeno no genoma introduzido por uma nuclease programável. Por exemplo, a mutação pode ser uma mudança de quadro e/ou exclusão que resulta no gene não codificar mais uma proteína funcional. Em outra modalidade, recombinação homóloga é usada para excluir parte ou todo um gene alvo, de modo que a proteína não seja produzida. Em uma modalidade, a modificação genética é introduzida por união de extremidade não homóloga. Em uma modalidade, a modificação genética é introduzida por um mutagênico químico. Em uma modalidade alternativa, a modificação genética é a inserção de um transgene, por exemplo, em um construto de ácido nucleico, que expressa um polinucleotídeo no ovo. O transgênico pode ser extracromossômico ou integrado ao genoma do ovo. De preferência o transgênico é inserido no cromossomo Z.
[00305] Em uma modalidade, a modificação genética é uma mutação de um gene endógeno que inativa parcial ou completamente o gene, tal como uma mutação pontual, uma inserção ou uma exclusão (ou uma combinação de uma ou mais das mesmas). A mutação pontual pode ser um códon de parada prematuro (uma mutação não senso), uma mutação no local de emenda, uma exclusão, uma mutação de mudança de quadro ou uma mutação de substituição de amino ácido que reduz a atividade do gene ou do polipeptídeo codificado.
[00306] Em uma modalidade, o transgênico codifica um polinucleotídeo antissenso, um polinucleotídeo senso, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que liga a enzima endógena, um transposon, um aptâmero, uma molécula de RNA de cadeia dupla e uma molécula de RNA processada derivada da mesma. Em uma modalidade, o transgênico compreende um quadro de leitura aberto que codifica o polinucleotídeo operacionalmente ligado a um promotor que direciona a expressão do polinucleotídeo na ave e/ou no ovo aviário.
NUCLEASES PROGRAMÁVEIS
[00307] Em algumas modalidades, uma modificação genética como referenciada no presente documento pode ser introduzida para a ave ou na ave ou na linha germinativa progenitora materna e/ou paterna do ovo por meio de uma nuclease programável. Em uma modalidade preferencial, uma ou mais modificações genéticas são introduzidas no cromossomo Z de uma das linhas germinativas progenitoras materna e/ou paterna do ovo por meio de uma nuclease programável. Em uma modalidade, a modificação genética introduzida pela nuclease programável modifica uma característica de produção na ave e/ou no ovo ou progênie do mesmo.
[00308] Como usado no presente documento, o termo “nuclease programável” se refere a nuclease que é “direcionada” (“programada”) para reconhecer e editar um local pré- determinado em um genoma de um ovo aviário ou na linha germinativa progenitora materna e/ou paterna de um ovo aviário.
[00309] Em uma modalidade, a nuclease programável pode induzir clivagem de DNA específica do local em um local pré-determinado em um genoma. Em uma modalidade, a nuclease programável pode ser programada para reconhecer uma localização genômica com um domínio de proteína de ligação ao DNA ou combinação de domínios de proteína de ligação ao DNA. Em uma modalidade, a nuclease introduz uma exclusão, substituição ou uma inserção no gene ou em uma região reguladora do mesmo.
[00310] Em uma modalidade, a nuclease programável pode ser programada para reconhecer uma localização genômica por uma combinação de domínios de proteína de dedo de zinco de ligação ao DNA (ZFP). As ZFPs reconhecem um 3-bp específico em uma sequência de DNA, uma combinação de ZFPs pode ser usada para reconhecer uma localização genômica específica.
[00311] Em uma modalidade, a nuclease programável pode ser programada para reconhecer uma localização genômica por domínios de ligação a DNA de efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs).
[00312] Em uma modalidade alternativa, a nuclease programável pode ser programada para reconhecer uma localização genômica por uma ou mais sequências de RNA. Em uma modalidade alternativa, a nuclease programável pode ser programada por uma ou mais sequências de DNA. Em uma modalidade alternativa, a nuclease programável pode ser programada por uma ou mais sequências de DNA/RNA híbridas. Em uma modalidade alternativa, a nuclease programável pode ser programada por uma ou mais dentre uma sequência de RNA, uma sequência de DNA e uma sequência híbrida de DNA/RNA.
[00313] Em uma modalidade alternativa, a nuclease programável pode ser usada para silenciamento multiplex, ou seja, entrega de nuclease programável com mais do que um “direcionamento” ou “sequência de programação” (ou seja, duas, três, quatro, cinco ou mais sequências de programação) de modo que duas, três, quatro, cinco ou mais genes possam ser visados simultaneamente (Kim et al., 2014).
[00314] As nucleases programáveis que podem ser usadas de acordo com a presente revelação incluem, porém, sem limitação, nuclease manipulada guiada por RNA (RGEN) derivada do sistema bacteriano de repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR) (associado às
CRISPR), nuclease de dedo de zinco (ZFN), nuclease do tipo ativador de transcrição (TALEN) e argonautas.
[00315] O sistema (CRISPR)-cas (associado às CRISPR) é um sistema de nuclease microbiana envolvido na defesa contra fagos e plasmídeos invasores. As localizações de CRISPR nos hospedeiros microbianos contêm uma combinação de genes associados a CRISPR (Cas), bem como elementos de RNA não codificadores capazes de programar a especificidade da clivagem de ácido nucleico mediada por CRISPR. Três tipos (I a III) de sistemas de CRISPR foram identificados em uma ampla gama de hospedeiros bacterianos com classes RGEN II (Makarova et al., 2015). Uma característica chave de cada local de CRISPR é a presença de uma matriz de sequências repetitivas (repetições diretas) intercaladas por trechos curtos de sequências não repetitivas (espaçadores). A matriz de CRISPR não codificante é transcrita e clivada dentro de repetições diretas em pequenos CRRNAs contendo sequências espaçadoras individuais, que direcionam as nucleases de Cas para o local alvo (protoespaçador).
[00316] O CRISPR Tipo II realiza a quebra de cadeia dupla do DNA visado em quatro etapas sequenciais (por exemplo, consultar Cong et al., 2013). Primeiro, dois RNA não codificadores, a matriz pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos do local de CRISPR. Segundo, o tracrRNA hibridiza para as regiões repetidas do pré-crRNA e media o processamento do pré- crRNA em crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o complexo crRNA:tracrRNA maduro direciona Cas9 para o DNA alvo por meio do pareamento de base Watson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo próximo ao motivo adjacente ao protoespaçador (PAM),
um requisito adicional para o reconhecimento do alvo. Por fim, Cas9 media a clivagem de DNA alvo para criar uma quebra de cadeia dupla no protoespaçador. O sistema de CRISPR também pode ser usado para gerar quebras de cadeia simples no genoma. Assim, o sistema de CRISPR pode ser usado para editar genoma de local específico guiado por RNA (ou programado por RNA).
[00317] Em uma modalidade, a nuclease é uma nuclease manipulada guiada por RNA (RGEN). Em uma modalidade, a RGEN é de um genoma archaeal ou é uma versão recombinante do mesmo. Em uma modalidade, a RGEN é de um genoma bacteriano ou é uma versão recombinante do mesmo. Em uma modalidade, a RGEN é de um sistema de (CRISPR-associado) (CRISPR)-cas Tipo I. Em uma modalidade, a RGEN é de um sistema de (CRISPR- associado) (CRISPR)-cas Tipo II. Em uma modalidade, a RGEN é de um sistema de (CRISPR- associado) (CRISPR)-cas Tipo III. Em uma modalidade, a nuclease é uma RGEN classe I. Em uma modalidade, a nuclease é uma RGEN classe II. Em uma modalidade, a RGEN é uma enzima de múltiplos componentes. Em uma modalidade, a RGEN é uma enzima de componente único. Em uma modalidade, a RGEN é CAS3. Em uma modalidade, a RGEN é CAS10. Em uma modalidade, a RGEN é CAS9. Em uma modalidade, a RGEN é Cpf1 (Zetsche et al., 2015). Em uma modalidade, a RGEN é direcionada por um único RNA ou DNA. Em uma modalidade, a RGEN é direcionada por mais do que um RNA e/ou DNA. Em uma modalidade, o CAS9 é de Steptococcus pyogenes.
[00318] Em uma modalidade, a nuclease programável pode ser uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALE) (consultar, por exemplo, Zhang et al., 2011). As TALEs são fatores de transcrição do patógeno vegetal Xanthomonas que podem ser prontamente manipulados para se ligar a novos alvos de DNA. As TALEs ou suas versões truncadas podem estar ligadas ao domínio catalítico de endonucleases, como Fokl, para criar endonucleases direcionadas chamadas nucleases TALE ou TALENs.
[00319] Em uma modalidade, a nuclease programável é uma nuclease de dedo de zinco (ZFN). Em uma modalidade, cada monômero da ZFN compreende 3 ou mais domínios de ligação ao DNA à base de dedo de zinco, em que cada domínio de ligação ao DNA à base de dedo de zinco se liga a um sublocal de 3 pb. Em outras modalidades, a ZFN é uma proteína quimérica que compreende um domínio de ligação ao DNA à base de dedo de zinco ligado operacionalmente a uma nuclease independente. Em uma modalidade, a endonuclease independente é uma endonuclease FokI. Em uma modalidade, o agente de nuclease compreende uma primeira ZFN e uma segunda ZFN, em que cada uma dentre a primeira ZFN e a segunda ZFN é ligada operacionalmente a uma nuclease FokI, em que a primeira e a segunda ZFN reconhecem duas sequências de DNA alvo contíguas em cada cadeia da sequência de DNA alvo separadas por um local de clivagem de cerca de 6 pb a cerca de 40 pb ou um local de clivagem de 5 pb a cerca de 6 pb, e em que as nucleases de FokI se dimerizam e fazem uma quebra de cadeia dupla (consultar, por exemplo, US20060246567, US20080182332, US20020081614, US20030021776, WO/2002/057308, US20130123484, US20100291048 e WO 11/017293).
[00320] Em uma modalidade, a nuclease programável pode ser um argonauta programado por DNA (WO 14/189628). Argonautas procarióticos e eucarióticos são enzimas envolvidas nas vias de interferência de RNA. Um argonauta pode ligar e clivar um ácido nucleico alvo formando-se um complexo com um ácido alvo de ácido nucleico projetado. A clivagem pode introduzir quebras de cadeia dupla no ácido nucleico alvo que pode ser reparado por maquinário de união de extremidade não homólogas. Um argonauta “guiado” ou “programado” por DNA pode ser direcionado para a introdução de quebras de DNA de cadeia dupla em locais predeterminados no DNA. Em uma modalidade, o argonauta é de Natronobacterium gregoryi.
RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA
[00321] Em uma modalidade, uma modificação genética é introduzida por recombinação homóloga. A recombinação homóloga é um tipo de recombinação genética na qual as sequências de nucleotídeos são trocadas entre duas moléculas de DNA semelhantes ou idênticas, que pode envolver o uso da via de reparo de quebra de cadeia dupla (DSBR) e a hibridação de cadeias dependentes de síntese (via SDSA) (Lodish et al., 2000; Weaver, 2002). A recombinação de homólogos pode ser usada para excluir um gene ou porção do mesmo, ou para introduzir uma substituição ou uma inserção em um gene como um gene antiviral ou uma região reguladora do mesmo. Além disso, a recombinação homóloga pode ser usada para inserir um transgene. A recombinação homóloga pode ser usada para introduzir uma modificação genética no DNA de uma célula hospedeira por qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, a recombinação homóloga pode ser desencadeada por uma nuclease programável.
RNA DE CADEIA DUPLA
[00322] Em uma modalidade, a modificação genética, preferencialmente a segunda modificação genética, é um transgene que codifica uma molécula de dsRNA para RNAi, preferencialmente integrada no genoma da ave.
[00323] Os termos "interferência de RNA", "RNAi" ou "silenciamento de genes" se referem geralmente a um processo no qual uma molécula de dsRNA reduz a expressão de uma sequência de ácido nucleico com a qual a molécula de RNA de cadeia dupla compartilha homologia substancial ou total. No entanto, foi mostrado que a interferência de RNA pode ser alcançada com o uso de moléculas de cadeia dupla não RNA (consultar, por exemplo, US 20070004667).
[00324] As regiões de cadeia dupla devem ter pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, por exemplo, cerca de 19 a 23 nucleotídeos, ou podem ser mais longas, por exemplo, 30 ou 50 nucleotídeos, ou 100 nucleotídeos ou mais. A sequência completa que corresponde à transcrição do gene inteiro pode ser usada. De preferência, as mesmas têm cerca de 19 a 23 nucleotídeos de comprimento.
[00325] O grau de identidade de uma região de cadeia dupla de uma molécula de ácido nucleico para o transcrito visado deve ser de pelo menos 90% e mais preferencialmente de 95 a 100%. A molécula de ácido nucleico pode, naturalmente, compreender sequências não relacionadas que podem funcionar para estabilizar a molécula.
[00326] O termo "RNA interferente curto" ou "siRNA", como usado no presente documento, se refere a uma molécula de ácido nucleico que compreende ribonucleotídeos capazes de inibir ou regular para baixo a expressão gênica, por exemplo, mediando-se o RNAi de uma maneira específica de sequência, em que a porção de cadeia dupla tem menos do que 50 nucleotídeos de comprimento, preferencialmente cerca de 19 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento. Por exemplo, o siRNA pode ser uma molécula de ácido nucleico que compreende regiões senso e antissenso autocomplementares, em que a região antissenso compreende a sequência nucleotídica que é complementar à sequência nucleotídica em uma molécula de ácido nucleico alvo ou uma porção da mesma e a região senso que tem a sequência nucleotídica que corresponde à sequência de ácido nucleico alvo ou uma porção da mesma. O siRNA pode ser montado a partir de dois oligonucleotídeos separados, em que uma cadeia é a cadeia senso e a outra é a cadeia antissenso, em que as cadeias antissenso e senso são autocomplementares.
[00327] Como usado no presente documento, o termo siRNA deve ser equivalente a outros termos usados para descrever moléculas de ácido nucleico que são capazes de mediar RNAi específico de sequência, por exemplo, micro-RNA (miRNA), RNA curto em gancho de cabelo (shRNA), oligonucleotídeo interferente curto, ácido nucleico interferente curto (siNA), oligonucleotídeo modificado interferente curto, siRNA modificado quimicamente, RNA de silenciamento de genes pós- transcricional (ptgsRNA) e outros. Além disso, como utilizado no presente documento, o termo RNAi deve ser equivalente a outros termos usados para descrever a interferência de RNA específica de sequência, como silenciamento de genes pós- transcricional, inibição de tradução ou epigenética. Por exemplo, as moléculas de siRNA da invenção podem ser usadas para silenciar epigeneticamente genes no nível tanto pós- transcricional quanto pré-transcricional. Em um exemplo não limitante, a regulação epigenética da expressão gênica por moléculas de siRNA da invenção pode resultar da modificação mediada por siRNA da estrutura de cromatina para alterar a expressão gênica.
[00328] Por "shRNA" ou "RNA curto em gancho de cabelo" entende-se uma molécula de RNA em que menos de cerca de 50 nucleotídeos, de preferência cerca de 19 a 23 nucleotídeos, são emparelhados na base com uma sequência complementar localizada na mesma molécula de RNA e em que a dita sequência e a sequência complementar são separadas por uma região não emparelhada de pelo menos cerca de 4 a cerca de 15 nucleotídeos, que forma um laço de cadeia única acima da estrutura tronco criada pelas duas regiões de complementaridade de bases. Um Exemplo de uma sequência de um laço de cadeia única inclui: 5’ UUCAAGAGA 3’.
[00329] Os shRNAs incluídos são dsRNAs em gancho de cabelo duplo ou com dois dedos e com múltiplos dedos, nos quais a molécula de RNA compreende duas ou mais dessas estruturas em laço de tronco separadas por regiões espaçadoras de cadeia simples.
[00330] Os dsRNAs como descritos no presente documento podem ser usados para reduzir a expressão de um gene que controla uma característica de produção, como a produção viral. Por exemplo, os dsRNAs podem ser expressos a partir de um construto de ácido nucleico inserido no cromossomo Z da ave com expressão dos dsRNA que resulta em expressão reduzida de gene que controla uma característica de produção em uma ave. Em uma modalidade, o gene é BACE2, GNAZ, UBE1DC1, CDX2, ZFPM2, TRIM50, DDI2, LOC1008859339, CNOT4, CAPN13, DNASEIL2, PHF21A, PCGF5, HSBP1, GAPDH, IFNAR1, IL28RA, MDA5, IL-6, IL1R1. Em uma modalidade, o dsRNA compreende uma sequência como mostrada na Tabela 1. TABELA 1. SEQUÊNCIAS DE SIRNA PARA SILENCIAMENTO DE
GENES ANTIVIRAIS G Sequên Sequênc N ene alvo cia senso (5’ a ia antissenso (5’ o de
3’) a 3’) adesão SEQ SEQ NO: s X B NO:1 2 i-BACE2- M_41673 ACE2 GUGCAAGCAUAGAUCU UUAAGAUCUAUGCUUG 1 5
UAAUU CACUU SEQ SEQ NO: s NO: 3 4 i-BACE2-
GGGAUUGAAGUCACAG UAACUGUGACUUCAAU 2
UUAUU CCCUU SEQ SEQ NO: s NO: 5 6 i-BACE2-
CGUUAAAUAUUCUGGU UCAACCAGAAUAUUUA 3
UGAUU ACGUU SEQ SEQ NO: s NO: 7 8 i-BACE2-
GGGUUAAAUGGCAUGG AUUCCAUGCCAUUUAA 4
AAUUU CCCUU SEQ SEQ NO:
X G NO: s 9 10 M_00123 NAZ i-GNAZ-1 ACGCAUAAUUCGGGCU UAGAGCCCGAAUUAUG 2444
CUAUU CGUUU SEQ SEQ NO: NO: s 11 12 i-GNAZ-2 CCACUAGCCUGUUACA UAAUGUAACAGGCUAG
UUAUU UGGUU s SEQ SEQ NO: i-GNAZ-3 NO: 13 14
AGGUUAAAGAUGAGCG UAUCGCUCAUCUUUAA
AUAUU CCUUU SEQ SEQ NO: NO: s 15 16 i-GNAZ-4 GUGUGGAGCUGAGUGG UAUCCACUCAGCUCCA
AUAUU CACUU s SEQ SEQ NO:
N i- U NO: 17 18 M_00100 BE1DC1 UBE1DC1- UCCACAAUGUAGUGAU UUGAUCACUACAUUGU 1765 1 CAAUU GGAUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 19 20 UBE1DC1- CGAAUUAGUAUCAGAA AGUUUCUGAUACUAAU 2 ACUUU UCGUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 21 22 UBE1DC1- CGGAAUUACUGUAGCA AUAUGCUACAGUAAUU 3 UAUUU CCGUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 23 24 UBE1DC1- CAAUUAACACGGCCUG UUGCAGGCCGUGUUAA 4 CAAUU UUGUU SEQ SEQ NO:
N C NO: s 25 26 M_20431 DX2 i-CDX2-1 UCUGCGAGUGGGUGAG UUCCUCACCCACUCGC 1
GAAUU AGAUU s SEQ SEQ NO:
i-CDX2-2 NO: 27 28
CCAGGACGAAGGACAA UAUUUGUCCUUCGUCC
AUAUU UGGUU SEQ SEQ NO: NO: s 29 30 i-CDX2-3 UGAGCUACCUCCUGGA UUGUCCAGGAGGUAGC
CAAUU UCAUU SEQ SEQ NO: NO: s 31 32 i-CDX2-4 GCUCGGUAGCCAAGUC UUUGACUUGGCUACCG
AAAUU AGCUU SEQ SEQ NO: s X Z NO: 33 34 i-ZFPM2- M_41838 FPM2 UUAACAAGGUAGAGAA UAGUUCUCUACCUUGU 1 0
CUAUU UAAUU
SEQ SEQ s NO: 35 NO:36 i-ZFPM2-
GAGGCAUGGUAAUAGU UUAACUAUUACCAUGC 2
UAAUU CUCUU SEQ SEQ NO: s NO: 37 38 i-ZFPM2-
GUACCUGUGUUUAGCA AUAUGCUAAACACAGG 3
UAUUU UACUU SEQ SEQ NO: s NO: 39 40 i-ZFPM2-
GGAAUAAAGCCAAGCG AAUCGCUUGGCUUUAU 4
AUUUU UCCUU
SEQ SEQ NO: s X T NO: 41 42 i- M_41570 RIM50 GCUCAUCGGCCUCAAG UUCCUUGAGGCCGAUG TRIM50-1 9
GAAUU AGCUU SEQ SEQ NO: s NO: 43 44 i-
CGGAAGAUGAGCAUUG UGUCAAUGCUCAUCUU TRIM50-2
ACAUU CCGUU SEQ SEQ NO: s NO: 45 46 i-
ACGAAAGUCAGCUUGA AAAUCAAGCUGACUUU TRIM50-3
UUUUU CGUUU SEQ SEQ NO: s NO: 47 48 i-
GGGCACAGUCAGCCGC UUUGCGGCUGACUGUG TRIM50-4
AAAUU CCCUU SEQ SEQ NO:
X D NO: s 49 50 M_42329 DI2 i-DDI2-1 CGACAGAAAGAUACCG CUACGGUAUCUUUCUG 3
UAGUU UCGUU SEQ SEQ NO: NO: s 51 52 i-DDI2-2 GAUUAUACCAGCAAGA AUUUCUUGCUGGUAUA
AAUUU AUCUU SEQ SEQ NO: NO: s 53 54 i-DDI2-3 CAGUGGAGACCUAGAU UUUAUCUAGGUCUCCA
AAAUU CUGUU
SEQ SEQ NO: NO: s 55 56 i-DDI2-4 AGAGAGGAUCCGACUG AUACAGUCGGAUCCUC
UAUUU UCUUU s SEQ SEQ NO:
L X i- NO: 57 58 OC100859 M_00364 LOC10085 UGACGGGACUGGUGAG AUGCUCACCAGUCCCG 339 2919 9339-1 CAUUU UCAUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 59 60 LOC10085 UCGACAACUUUGACGU UACACGUCAAAGUUGU 9339-2 GUAUU CGAUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 61 62 LOC10085 GCGUCGAGUUCAUGAG GAGCUCAUGAACUCGA 9339-3 CUCUU CGCUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 63 64 LOC10085 GCGCAGAGCGGUACCA UUAUGGUACCGCUCUG 9339-4 UAAUU CGCUU SEQ SEQ NO: s N C NO: 65 66 i-CNOT4- M_00101 NOT4 CCGCAAAGCCUUAGCA GUCUGCUAAGGCUUUG 1 2811
GACUU CGGUU SEQ SEQ NO: s NO: 67 68 i-CNOT4-
GCAAGAACUAUACAAA UAGUUUGUAUAGUUCU 2
CUAUU UGCUU
SEQ SEQ NO: s NO: 69 70 i-CNOT4-
CGGGUAAGCACCAAGA UAUUCUUGGUGCUUAC 3
AUAUU CCGUU SEQ SEQ NO: s NO: 71 72 i-CNOT4-
ACACGAGCUAGGAGAU UUCAUCUCCUAGCUCG 4
GAAUU UGUUU SEQ SEQ NO: s X C NO: 73 74 i- M_41936 APN13 GGAGUUAGCAGAUUUG UAUCAAAUCUGCUAAC CAPN13-1 9
AUAUU UCCUU SEQ SEQ NO: s NO: 75 76 i-
CGACAGAGGACCGAGA AAUUCUCGGUCCUCUG CAPN13-2
AUUUU UCGUU SEQ SEQ NO: s NO: 77 78 i-
GGUCAUUUCACUCAUA UUGUAUGAGUGAAAUG CAPN13-3
CAAUU ACCUU SEQ SEQ NO: s NO: 79 80 i-
UUGUAAAGAAUCAAGA UCGUCUUGAUUCUUUA CAPN13-4
CGAUU CAAUU s SEQ SEQ NO:
X i- D NO: 81 82 M_42525 NASE1L2 DNASE1L2 CGGAGGAGUUCGUGAU ACCAUCACGAACUCCU 6 -1 GGUUU CCGUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 83 84 DNASE1L2 CCGUCGAGGUGAAGCU AUCAGCUUCACCUCGA -2 GAUUU CGGUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 85 86 DNASE1L2 AAGCAGAGCGACUGGG AGGCCCAGUCGCUCUG -3 CCUUU CUUUU s SEQ SEQ NO: i- NO: 87 88 DNASE1L2 UGGCAGUCAGCGACCA UAAUGGUCGCUGACUG -4 UUAUU CCAUU SEQ SEQ NO: s N P NO: 89 90 i- M_00119 HF21A UGUCAAGACCAGAUGU UUAACAUCUGGUCUUG PHF21A-1 9647
UAAUU ACAUU SEQ SEQ NO: s NO: 91 92 i-
GUGAUAUCCAUGAGGA AAGUCCUCAUGGAUAU PHF21A-2
CUUUU CACUU SEQ SEQ NO: s NO: 93 94 i-
ACAAGGGCGAUGAGAC UUAGUCUCAUCGCCCU PHF21A-3
UAAUU UGUUU SEQ SEQ NO: s NO: 95 96 i-
CCAUUGGCACAGUCAG UUUCUGACUGUGCCAA PHF21A-4
AAAUU UGGUU
SEQ SEQ NO: s X P NO: 97 98 i-PCGF5- M_42166 CGF5 UGGGAAAGGAUCAUAC AUAGUAUGAUCCUUUC 1 8
UAUUU CCAUU SEQ SEQ NO: s NO: 99 100 i-PCGF5-
CGGUUAGACCAAAGGG UGGCCCUUUGGUCUAA 2
CCAUU CCGUU SEQ SEQ NO: s NO: 101 102 i-PCGF5-
CGAGUAACCGUGGGAA UAGUUCCCACGGUUAC 3
CUAUU UCGUU SEQ SEQ NO: s NO: 103 104 i-PCGF5-
GCAUGAGACCAACCCA UAGUGGGUUGGUCUCA 4
CUAUU UGCUU SEQ SEQ NO: s N H NO: 105 106 i-HSBP1- M_00111 SBP1 UCAAGUAACGGGUGUA AAAUACACCCGUUACU 1 2809
UUUUU UGAUU SEQ SEQ NO: s NO: 107 108 i-HSBP1-
GACACAAGCGGGAGUA UUCUACUCCCGCUUGU 2
GAAUU GUCUU SEQ SEQ NO: s NO: 109 110 i-HSBP1-
CGAUUUGUGUACUGUA AAUUACAGUACACAAA 3
AUUUU UCGUU
SEQ SEQ NO: s NO: 111 112 i-HSBP1-
GUGGAUGACUGUAUUA AAAUAAUACAGUCAUC 4
UUUUU CACUU SEQ SEQ NO: s N G NO: 113 114 i-GAPDH- M_20430
APDH GGGUGUCAACCAUGAG UUUCUCAUGGUUGACA 1 5
AAAUU CCCUU SEQ SEQ NO: s NO: 115 116 i-GAPDH-
GUACCACCUUACAUCA UAUUGAUGUAAGGUGG 2
AUAUU UACUU SEQ SEQ NO: s NO: 117 118 i-GAPDH-
ACGGGAAACUUGUGAU UUGAUCACAAGUUUCC 3
CAAUU CGUUU SEQ SEQ NO: s NO: 119 120 i-GAPDH-
AGUCGGAGUCAACGGA AAAUCCGUUGACUCCG 4
UUUUU ACUUU SEQ SEQ NO: s N I NO: 121 122 i- M_20485 FNAR1 GGUAUCAGGAUGUGAG GUUCUCACAUCCUGAU IFNAR1-1 9
AACUU ACCUU SEQ SEQ NO: s NO: 123 124 i-
GUGGCUAAUUUCUGUG AAACACAGAAAUUAGC IFNAR1-2
UUUUU CACUU
SEQ SEQ NO: s NO: 125 126 i-
AGAAGUAGAUCCUCCG UACCGGAGGAUCUACU IFNAR1-3
GUAUU UCUUU SEQ SEQ NO: s NO: 127 128 i-
GAGUAGGAUCACAGAA UUCUUCUGUGAUCCUA IFNAR1-4
GAAUU CUCUU SEQ SEQ NO: s X I NO: 129 130 i- M_41784 L28RA UGACGUGUGUGAUUCC UUUGGAAUCACACACG IL28RA-1 1
AAAUU UCAUU SEQ SEQ NO: s NO: 131 132 i-
CCAGUGUGCAUGCAGU UUAACUGCAUGCACAC IL28RA-2
UAAUU UGGUU SEQ SEQ NO: s NO: 133 134 i-
AUUCCGGGCUCAAGUG UUUCACUUGAGCCCGG IL28RA-3
AAAUU AAUUU SEQ SEQ NO: s NO: 135 136 i-
AAAUCA AUUCCUUGAACUGUGA IL28RA-4
CAGUUCAAGGAAUUU UUUUU SEQ SEQ NO:
N M NO: s 137 138 M_00119 DA5 i-MDA5-1 CGAAAGGAGUUUAAUC AUGGAUUAAACUCCUU 3638
CAUUU UCGUU
SEQ SEQ NO: NO: s 139 140 i-MDA5-2 CGUUAGUGGAACAGCA AAAUGCUGUUCCACUA
UUUUU ACGUU SEQ SEQ NO: NO: s 141 142 i-MDA5-3 GGGGAAAUAUGAUAAU UAAACCAUCAUAUUUC
UUAUU CCCUU SEQ SEQ NO: NO: s 143 144 i-MDA5-4 GCAGAUGACUUAAGUG UUCCACUUAAGUCAUC
GAAUU UGCUU SEQ SEQ NO:
N I NO: s 145 146 M_20462 L-6 i-IL-6-1 CGGCAGAUGGUGAUAA GAUUUAUCACCAUCUG 8
AUCUU CCGUU SEQ SEQ NO: NO: s 147 148 i-IL-6-2 CGUGAGGGCCGUUCGC AUAGCGAACGGCCCUC
UAUUU ACGUU SEQ SEQ NO: NO: s 149 150 i-IL-6-3 ACGAGAUGUGCAAGAA AACUUCUUGCACAUCU
GUUUU CGUUU SEQ SEQ NO: NO: s 151 152 i-IL-6-4 AUUCAAGAGACUUUCG UAUCGAAAGUCUCUUG
AUAUU AAUUU
SEQ SEQ NO: s N I NO: 153 154 i-IL1R1- M_20548 L1R1 ACACAUGCCGUAUGGU UAUACCAUACGGCAUG 1 5
AUAUU UGUUU SEQ SEQ NO: s NO: 155 156 i-IL1R1-
GCUUAUUGGUCAUCUA AAUUAGAUGACCAAUA 2
AUUUU AGCUU SEQ SEQ NO: s NO: 157 158 i-IL1R1-
CGUAUCAAGUGGUGUG AUACACACCACUUGAU 3
UAUUU ACGUU SEQ SEQ NO: s NO: 159 160 i-IL1R1-
GGUAGUAACAUGCCGA UUAUCGGCAUGUUACU 4
UAAUU ACCUU CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO
[00331] Um “transgênico” como denominado no presente documento tem o significado normal na técnica de biotecnologia e inclui uma sequência genética que foi produzida ou alterada por tecnologia de DNA ou RNA recombinante e que foi introduzida em um ovo aviário, ou progenitor (ou progenitores) do ovo ou um predecessor do mesmo. O transgênico pode incluir sequências genéticas derivadas de uma célula aviária. Tipicamente, o transgênico foi introduzido na ave, ou ovo da mesma, por manipulação humana como, por exemplo, por transformação, mas qualquer método pode ser usado como reconhece uma pessoa versada na técnica. Um transgênico inclui sequências genéticas que são introduzidas em um cromossomo bem como aquelas que são extracromossômicas. O transgênico compreenderá tipicamente um quadro de leitura aberto que codifica um polinucleotídeo de interesse ligado operacionalmente a um promotor adequado para expressar o polinucleotídeo em um ovo aviário.
[00332] A introdução de uma modificação genética em uma ave e/ou em um ovo de uma ave pode envolver o uso de construto de ácido nucleico. Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico pode compreender um transgene. Como usado no presente documento, “construto de ácido nucleico” se refere a qualquer molécula de ácido nucleico que codifica, por exemplo, uma molécula de RNA de cadeia dupla como definida no presente documento, uma sequência de RNA, DNA ou RNA/DNA híbrida “guia” ou “direciona” uma nuclease programável, ou uma proteína de interesse como um marcador detectável. Tipicamente, o construto de ácido nucleico será DNA de cadeia dupla ou RNA de cadeia dupla, ou uma combinação dos mesmos. Além disso, o construto de ácido nucleico compreenderá tipicamente um promotor adequado ligado operacionalmente a um quadro de leitura aberto que codifica o polinucleotídeo. O construto de ácido nucleico pode compreender, por exemplo, um primeiro quadro de leitura aberto que codifica uma primeira cadeia simples da molécula de RNA de cadeia dupla, sendo que a cadeia complementar (segunda) é codificada por um segundo quadro de leitura aberto por um construto de ácido nucleico diferente, ou preferencialmente o mesmo. O construto de ácido nucleico pode ser um fragmento linear ou uma molécula circular e pode ou não ser capaz de replicação. O especialista na técnica entenderá que o construto de ácido nucleico da invenção pode ser incluído dentro de um vetor adequado. A transfecção ou transformação do construto de ácido nucleico em uma célula receptora permite que a célula expresse uma molécula de RNA ou DNA codificada pelo construto de ácido nucleico.
[00333] Em outro exemplo, o construto de ácido nucleico pode expressar múltiplas cópias do mesmo e/ou uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 ou mais), incluindo múltiplas moléculas de RNA diferentes que compreendem uma região de cadeia dupla, por exemplo, um RNA curto em gancho de cabelo. Em outro exemplo, o construto de ácido nucleico pode ser um cassete de direcionamento de gene como descrito em Schusser et al. (2013)
[00334] O construto de ácido nucleico também pode conter elementos genéticos adicionais. Os tipos de elementos que podem ser incluídos no construto não são limitados de forma alguma e podem ser escolhidos por uma pessoa versada na técnica. Em algumas modalidades, o construto de ácido nucleico é inserido em uma célula hospedeira como um transgene. Em tais casos, pode ser desejável incluir fragmentos "empacotadores" no construto que são projetados para proteger as sequências que codificam a molécula de RNA do processo de inserção do transgene e reduzir o risco de transcrição externa lida. Fragmentos empacotadores também podem ser incluídos no construto para aumentar a distância entre, por exemplo, um promotor e uma sequência de codificação e/ou componente terminador. O fragmento empacotador pode ter qualquer comprimento de 5 a 5.000 ou mais nucleotídeos. Pode haver um ou mais fragmentos empacotadores entre os promotores. No caso de vários fragmentos empacotadores, os mesmos podem ter comprimentos iguais ou diferentes. Os fragmentos de DNA empacotadores são preferencialmente sequências diferentes. Preferencialmente, as sequências de empacotadores compreendem uma sequência idêntica àquela encontrada dentro de uma célula, ou descendência da mesma, na qual as mesmas foram inseridas. Em uma modalidade adicional, o construto de ácido nucleico compreende regiões de empacotamento que flanqueiam o quadro (ou quadros) de leitura aberto que codifica o RNA (ou RNAs) de cadeia dupla.
[00335] Alternativamente, o construto de ácido nucleico pode incluir um elemento transponível, por exemplo, um transposon caracterizado por sequências repetidas invertidas terminais que flanqueiam os quadros de leitura abertos que codificam o RNA (ou RNAs) de cadeia dupla. Exemplos de transposons adequados incluem Tol2, mini-Tol, Bela Adormecida, Mariner e Galluhop.
[00336] Outros elementos genéticos que podem ser úteis em modalidades da presente invenção incluem aqueles que codificam proteínas que conferem uma vantagem de crescimento seletiva em células como adenosina desaminase, fosfotransferase aminoglicosídica, diidrofolato redutase, higromicina-B-fosfotransferase ou resistência a medicamentos.
[00337] Onde a construção de ácido nucleico deve ser transfectada para uma ave, é desejável que o promotor e quaisquer elementos genéticos adicionais consistam em sequências nucleotídicas que ocorrem naturalmente no genoma da ave.
[00338] Em alguns casos, pode ser desejável inserir o construto de ácido nucleico em um vetor. O vetor pode ser, por exemplo, um plasmídeo, vírus ou cromossomo artificial derivado de, por exemplo, um bacteriófago,
adenovírus, vírus adenoassociado, retrovírus, poxvírus ou herpesvírus. Tais vetores incluem vetores cromossômicos, epissomais e derivados de vírus, por exemplo, vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos e vírus, vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como aqueles derivados de elementos genéticos de plasmídeo e bacteriófago, cosmídeos e fagemídeos.
[00339] Em uma modalidade, o construto de ácido nucleico compreende um promotor. O especialista reconhecerá que um promotor tal como um promotor constitutivo, promotor específico para um tecido ou específico para um estágio de desenvolvimento ou um promotor indutível pode ser usado na presente invenção. Em uma modalidade, o promotor é um promotor aviário. Em uma modalidade, o promotor é um promotor Pol I, Pol II ou Pol II. Exemplos de promotores aviários incluem o promotor 7sK RNA polimerase III, promotor U6 RNA polimerase II (Bannister et al., 2007; Massin et al., 2005).
AVES TRANSGÊNICAS
[00340] O termo “ave” como usado no presente documento se refere a qualquer espécie, subespécie ou raça de organismo da classe taxonômica Aves, tal como, porém, sem limitação, galinha, peru, pato, ganso, codorna, faisão, papagaio, tentilhão, falcão, corvos e ratitas, incluindo avestruz, ema e casuar. O termo inclui as linhas tanto de galinha de postura comercial quanto frango de corte. O termo inclui as várias raças conhecidas de Gallus gallus (galinhas), por exemplo, CA, Ancona, Andaluz, Amrox, Galinha Barbuda de Appenzell, Galinha Appenzell Apontada, Araucana, Aseel, Australorp, Bandara, Baheij, Barred-Rock, Brahma, Brown Leghorn, Barnevelders, Buckeye, Botão de ouro, California
Gray, Campine, Catalana, Chantecler, Cochin, Cornish, Crevecoeur, Cubalaya, Delaware, Dominiques, Dorking, Bantams Holandesas, Faverolles, Frieslands, Frizzle, Gallus Inauris, Gimmizah, Golden Montazah, Hamburgs , Holland, Houdan, Java, Jersey Giant, Partidge colorida Italiana, Junglefowl (Verde), Junglefowl (Cinza), La Fleche, Lakenvelder, Lamona, Langshan, Leghorn, Malaia, Matrouh, Minorca, Gam Moderna, Pescoço Nu (Turken), New Hampshire Red, Old English Game, Orpington, Plymouth Rock, Polonesa, Red Cap, Rhode Island Red, Silkie Bantam, Silver Montazah, Styrian, Sultan, Sumatra, Sussex, Galinha Suíça, Espanhola Cara de Palhaço Preta, Legorne branca, Wyandottes, bem como linhagens de perus, faisões, codornas, pato, galinha de caça, galinha-d'angola, pombo, avestruzes e outras aves domésticas comumente criadas em quantidades comerciais. O termo inclui várias raças conhecidas de patos. O termo inclui várias raças conhecidas de patos, por exemplo, Call, Cayuga, Crested, Khaki Campbell, Moscóvia, Orpington, Pekin, Pommeranian, Rouen e Runner. O termo inclui várias raças conhecidas de perus Preto, Bourbon, Bronze, Narragansett, Royal Palm, Slate e Branco. O termo inclui várias raças conhecidas de gansos, por exemplo, Africano, Castanho Chinês, Branco Chinês, Diepholz, Embden, Egípcio, Peregrino e Toulouse.
[00341] Como usados no presente documento, os termos “ave macho transgênica”, “ave fêmea transgênica”, “ave transgênica”, ou variações dos mesmos se referem a uma ave na qual uma ou mais, preferencialmente todas, células da ave contêm a primeira modificação genética, a segunda modificação genética ou preferência ambas. A ave transgênica pode ser uma ave na estrutura de criação da indústria de postura de ovos ou frangos de corte, por exemplo, uma linha de progenitor, linha de avós ou linha de bisavós (consultar a Figura 2).
[00342] Em uma modalidade, a ave é uma fêmea (ZW) na linha de progenitor ou dos bisavós como mostrado na Figura 2 e compreende a primeira e/ou a segunda modificação genética no cromossomo Z, preferencialmente ambas as modificações genéticas.
[00343] Em outra modalidade, a ave é um macho (ZZ) na linha de avós como mostrado na Figura 2 e compreende a primeira e/ou a segunda modificação genética em ambos os cromossomos Z, preferencialmente ambas as modificações genéticas.
[00344] Em outra modalidade, a ave é um macho (ZZ) na linha de avós como mostrado na Figura 2 e compreende a primeira e/ou a segunda modificação genética em um único cromossomo Z, preferencialmente ambas as modificações genéticas.
[00345] Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão em um local que não afeta negativamente a viabilidade da galinha. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão em um local que não impacta prejudicialmente a expressão e regulação de genes no cromossomo Z. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão em um exon de um gene localizado no cromossomo Z. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão em um intron de um gene localizado no cromossomo Z. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão em um local de inserção ou em um gene localizado no cromossomo Z como mostrado na Tabela 4 ou na Tabela 5. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão localizadas em um gene selecionado dentre PALM2, UGCG, MAP1b, IFNβ, IFNA1, IFNA3, IL11RA, NP_990383.1, IPI00681421.2, NP_001026617.1, A1EA95, NP_989906.1, IPI00576148.2, IPI00679858.2, NP_990202.1, IPI00818057.1, NFIL3, TFIP8, TICAM2, MEKK1 e IFNKL (tipo interferon kappa). Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão localizadas no ID de Conjunto selecionado dentre ENSGALT00000045403, ENSGALT00000025241, ENSGALT00000025295 e ENSGALT00000024188. Em uma modalidade, a primeira e/ou segunda modificação genética no cromossomo Z estão localizadas na previsão Genescan selecionada dentre chrZ.1779, chrZ.1406, chrZ.889, chrZ.25 e chrZ.1602.
[00346] Aves transgênicas que compreendem uma modificação genética na linha germinativa podem ser usadas para a produção de aves e/ou ovos que compreendem a modificação genética da linha germinativa. Em uma modalidade, a ave transgênica é uma ave transgênica fêmea que compreende uma modificação genética no cromossomo Z em que apenas aves e/ou ovos macho produzidos pela ave herdam a modificação genética.
[00347] Aves transgênicas da presente invenção podem ser usadas para a produção de ovos que compreendem uma modificação genética em que a modificação genética reduz a expressão de um gene e/ou proteína antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da modificação genética. Em uma modalidade, a modificação genética resulta em expressão reduzida de um ou mais genes e/ou proteínas no animal e/ou progênie do mesmo e/ou ovos produzidos pela ave ou progênie da mesma. Em uma modalidade, um animal nocaute para o gene pode ser produzido. Em outra modalidade, a modificação genética é pelo menos introduzida no DNA do óvulo fertilizado (no estágio de célula única). Como a pessoa versada reconhecerá, nessa modalidade a modificação genética pode ser introduzida no DNA derivado materno ou paterno, ou ambos.
[00348] As técnicas para produzir animais transgênicos são bem conhecidas na técnica. Um livro geral útil sobre esse assunto é Houdebine, Transgenic animals – Generation and Use (Harwood Academic, 1997). Nos últimos anos, houve rápidos avanços nas tecnologias para manipular o genoma de espécies aviárias (revisado em Doran et al., 2016).
[00349] O DNA heterólogo pode ser introduzido, por exemplo, em óvulos fertilizados. Por exemplo, células-tronco totipotentes ou pluripotentes podem ser transformadas por microinjeção, precipitação mediada por fosfato de cálcio, fusão de lipossomas, infecção retroviral ou outros meios, as células transformadas são então introduzidas no embrião e o embrião então se desenvolve em um animal transgênico. Em um método, os embriões em desenvolvimento são infectados com um retrovírus contendo o DNA desejado e os animais transgênicos produzidos a partir do embrião infectado. Em um método alternativo, no entanto, os DNAs apropriados são coinjetados no pronúcleo ou citoplasma de embriões, de preferência no estágio de célula única, e os embriões deixados se desenvolverem em animais transgênicos maduros.
[00350] Outro método usado para produzir uma ave transgênica envolve microinjetar um ácido nucleico em óvulos de estágio pró-nuclear por métodos padrão. Os ovos injetados são então cultivados antes de serem transferidos para os ovidutos de receptores pseudográvidos.
[00351] As aves transgênicas também podem ser produzidas pela tecnologia de transferência nuclear. Com o uso desse método, os fibroblastos de animais dadores são transfectados de forma estável com um plasmídeo que incorpora as sequências de codificação para um domínio de ligação ou parceiro de ligação de interesse sob o controle de sequências reguladoras. Os transfectantes estáveis são então fundidos com oócitos enucleados, cultivados e transferidos para receptoras femininas.
[00352] A transferência de genes mediada por oidespermatozoides (SMGT) é outro método que pode ser usado para gerar animais transgênicos. Esse método foi descrito pela primeira vez por Lavitrano et al. (1989). A transferência mediada por oidespermatozoides pode compreender o uso de uma nuclease programável como descrito no documento WO2017024343.
[00353] Outro método para produzir animais transgênicos é a tecnologia de transferência de genes mediada por esperma com base em ligante (LB-SMGT). Esse procedimento é descrito no documento US 7067308. Resumidamente, o sêmen recém-colhido é lavado e incubado com o anticorpo monoclonal murino mAbC (secretado pelo hibridoma ao qual é atribuído o número de acesso ATCC PTA-6723) e então o DNA do construto. O anticorpo monoclonal auxilia na ligação do DNA ao sêmen. O complexo esperma/DNA é então inseminado artificialmente em uma fêmea.
[00354] Outro método usado para produzir uma ave transgênica é a recombinação homóloga. Um exemplo desse procedimento é fornecido em Schusser et al. (2013). Schusser et al. descrevem o direcionamento de gene por recombinação homóloga em células germinativas primordiais cultivadas para gerar aves nocaute para o gene específico. Em um exemplo, a ave transgênica é produzida com o uso do cassete de silenciamento de genes descrito em Schusser et al. (2013).
[00355] As galinhas transgênicas da linha germinativa podem ser produzidas injetando-se retrovírus com defeito de replicação na cavidade subgerminal dos blastodermes de pintos em ovos recém-postos (US 5.162.215; Bosselman et al., 1989; Thoraval et al., 1995). O ácido nucleico retroviral que transporta um gene estranho se insere aleatoriamente em um cromossomo das células embrionárias, gerando animais transgênicos, alguns dos quais portam o transgene em sua linhagem germinativa. Foi descrito o uso de elementos isoladores inseridos na região 5’ ou 3' do construto do gene fundido para superar os efeitos de posição no local de inserção (Chim et al., 1993).
[00356] Outro método para gerar animais transgênicos da linha germinativa é com o uso de um transposon, por exemplo, o transposon Tol2, para integrar um construto de ácido nucleico da invenção no genoma de um animal. O transposon Tol2 que foi isolado pela primeira vez a partir do peixe medaka Oryzias latipes e pertence à família de transposons hAT é descrito em Koga et al. (1996) e Kawakami et al. (2000). Mini- Tol2 é uma variante de Tol2 e é descrito em Balciunas et al. (2006). Os transposons Tol2 e Mini-Tol2 facilitam a integração de um transgene no genoma de um organismo quando coatuam com a transposase Tol2. Ao entregar a transposase Tol2 em um plasmídeo não replicante separado, apenas o transposon Tol2 ou Mini-Tol2 e transgene são integrados no genoma e o plasmídeo contendo a transposase Tol2 é perdido dentro de um número limitado de divisões celulares. Assim, um transposon Tol2 ou
Mini-Tol2 integrado não terá mais a capacidade de sofrer um evento de transposição subsequente. Além disso, como Tol2 não é conhecido por ser um transposon aviário que ocorre naturalmente, não há atividade de transposase endógena em uma célula aviária, por exemplo, uma célula de galinha, para causar eventos de transposição adicionais.
[00357] Qualquer outro sistema de transposon adequado pode ser usado nos métodos da presente invenção. Por exemplo, o sistema de transposon pode ser um sistema de transposon Bela Adormecida, Frog Prince ou Mos1, ou pode ser usado qualquer transposon que pertença à família de transposons tc1/mariner ou hAT.
[00358] A injeção de células-tronco embrionárias aviárias em embriões receptores para produzir aves quiméricas é descrita no documento US 7.145.057. A criação da quimera resultante produz aves transgênicas cujo genoma compreende a modificação (ou modificações) genética.
[00359] Métodos para obter galinhas transgênicas a partir de culturas de longo prazo de células germinativas primordiais aviárias (PGCs) são descritos no documento US
20060206952. Quando combinados com um embrião aviário hospedeiro por procedimentos conhecidos, os PGCs modificados são transmitidos através da linha germinativa para produzir descendentes transgênicos.
[00360] Um sistema de entrega viral com base em qualquer vírus apropriado pode ser usado para entregar os construtos de ácido nucleico da presente invenção a uma célula. Além disso, sistemas virais híbridos podem ser úteis. A escolha do sistema de entrega viral dependerá de vários parâmetros, como eficiência de entrega para a célula, tecido ou órgão de interesse, eficiência de transdução do sistema, patogenicidade, preocupações imunológicas e de toxicidade e similares. É claro que não existe um sistema viral único que seja adequado para todas as aplicações. Ao selecionar um sistema de entrega viral para usar na presente invenção, é importante escolher um sistema em que as partículas virais contendo o construto de ácido nucleico sejam preferencialmente: 1) propagável de forma reproduzível e estável; 2) capazes de serem purificadas com títulos altos e 3) capazes de mediar a entrega direcionada (entrega do construto de expressão de ácido nucleico para a célula, tecido ou órgão de interesse, sem disseminação generalizada).
[00361] Em uma modalidade, os reagentes de transfecção podem ser misturados com uma molécula de ácido nucleico isolada, polinucleotídeo ou construto de ácido nucleico, como descrito no presente documento e injetados diretamente no sangue de embriões aviários em desenvolvimento, como descrito no documento WO 2013/155572 e Tyack et al. (2013). Esse método é denominado no presente documento como “injeção direta”. Com o uso desse método, o transgene é introduzido em células germinativas primordiais (PGCs) no embrião e inserido no genoma das aves. A injeção direta pode ser usada adicionalmente para administrar uma nuclease programável.
[00362] Consequentemente, um polinucleotídeo, tal como um transgene e/ou construto de ácido nucleico, como definido no presente documento, pode ser complexado ou misturado com um reagente de transfecção adequado. O termo "reagente de transfecção", conforme usado no presente documento, se refere a uma composição adicionada ao polinucleotídeo para melhorar a captação do polinucleotídeo em uma célula eucariótica, incluindo, porém, sem limitação, uma célula aviária tal como uma célula germinativa primordial. Embora possa ser utilizado qualquer reagente de transfecção conhecido na técnica como adequado para transfectar células eucarióticas, os reagentes de transfecção que compreendem um lipídeo catiônico são particularmente úteis. Exemplos não limitantes de reagentes de transfecção adequados disponíveis comercialmente que compreendem lipídios catiônicos incluem Lipofectamina (Life Technologies) e Lipofectamina 2000 (Life Technologies).
[00363] O polinucleotídeo pode ser misturado (ou "complexado") com o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante ou protocolos conhecidos. A título de exemplo, ao transfectar DNA de plasmídeo com reagente de transfecção Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Life Technologies), o DNA pode estar diluído em 50 μl de meio Opit- MEM e misturado suavemente. O reagente Lipofectamina 2000 é misturado suavemente e uma quantidade apropriada é diluída em 50 ml de meio Opti-MEM. Após uma incubação de 5 minutos, o DNA diluído e o reagente de transfecção são combinados e misturados suavemente à temperatura ambiente por 20 minutos.
[00364] Um volume adequado da mistura de transfecção pode então ser injetado diretamente em um embrião aviário de acordo com o método da invenção. Tipicamente, um volume adequado para injeção em um embrião aviário é de cerca de 1 μl a cerca de 3 μl, embora volumes adequados possam ser determinados por fatores tais como o estágio do embrião e espécies de aves que estão sendo injetadas. O especialista reconhecerá que os protocolos para misturar o reagente de transfecção e o DNA, bem como o volume a ser injetado no embrião aviário, podem ser otimizados à luz dos ensinamentos da presente especificação.
[00365] Antes da injeção, os ovos são incubados a uma temperatura adequada para o desenvolvimento embrionário, por exemplo, em torno de 37,5 a 38 °C, com a extremidade pontiaguda para cima por aproximadamente 2,5 dias (Estágios 12 a 17) ou até um tempo em que os vasos sanguíneos no embrião sejam de tamanho suficiente para permitir a injeção. O momento ideal para injeção da mistura de transfecção é o momento da migração de PGC que ocorre tipicamente em torno dos Estágios 12 a 17, mas mais preferencialmente dos Estágios 13 a 14. Como o especialista reconhecerá, as galinhas da linhagem de frangos de carne tipicamente têm embriões de crescimento mais rápido e, portanto, a injeção deve ocorrer preferencialmente no início dos Estágios 13 a 14, para introduzir a mistura de transfecção na corrente sanguínea no momento da migração do PGC.
[00366] Para acessar um vaso sanguíneo do embrião aviário, é feito um orifício na casca do ovo. Por exemplo, um orifício de aproximadamente 10 mm pode ser feito na extremidade pontiaguda do ovo com o uso de um implemento adequado tal como uma pinça. A seção da casca e as membranas associadas são cuidadosamente removidas, evitando lesões no embrião e suas membranas.
[00367] Após a injeção de mistura de transfecção no vaso sanguíneo do embrião aviário, o ovo é vedado com o uso de uma quantidade suficiente de parafilme ou outro filme vedante adequado, como conhecido na técnica. Por exemplo, onde um orifício de 10 mm foi feito na casca, uma peça quadrada de aproximadamente 20 mm de parafilme pode ser usada para cobrir o orifício. Uma lâmina de bisturi quente pode então ser usada para fixar o parafilme na superfície externa do ovo. Os ovos são, então, virados para a posição com a extremidade pontuda para baixo e incubados a uma temperatura suficiente para o embrião se desenvolver, tal como até análises posteriores ou eclosão. A técnica de injeção direta é descrita adicionalmente no documento WO 2013/155572, que reivindica a prioridade do documento US 61/636.331.
[00368] Os animais e/ou ovos produzidos com o uso dos métodos da invenção podem ser triados quanto à presença da modificação genética. Essa etapa pode ser realizada com o uso de qualquer procedimento adequado conhecido na técnica. Por exemplo, uma amostra de ácido nucleico, tal como uma amostra de DNA genômico, pode ser analisada com o uso de procedimentos padrão de amplificação e sequenciamento de DNA para determinar se a modificação genética está presente no local alvo (locus) no genoma. Em uma modalidade, a triagem também determina se o animal e/ou ovo é homozigoto ou heterozigoto para a modificação genética. Em outra modalidade, a ave é triada para identificar se a modificação genética pode ser encontrada nas células da linha germinativa, de modo que possa ser transmitida à sua prole.
MARCADOR DETECTÁVEL NO OVO
[00369] Como usados no presente documento, os termos “um marcador detectável no ovo” e “marcador detectável” de forma intercambiável no contexto da primeira modificação genética. O marcador detectável pode ser uma proteína que pode ser expressa no ovo de uma ave da invenção e detectada por qualquer método conhecido de uma pessoa versada na técnica que não perturbe a integridade do ovo da casca. Em uma modalidade,
o marcador detectável pode ser uma proteína fluorescente, uma proteína luminescente, uma proteína auditiva (proteína vibratória), uma proteína sônica, um marcador metabólico ou uma proteína quelante seletiva. Em uma modalidade, o marcador é detectável dentro de um dia, ou dois dias, do ponto de postura sem perturbar a integridade da casca do ovo. Em uma modalidade, o marcador é detectável antes do ovo eclodir. Em uma modalidade, o marcador é detectável pelo menos no dia 1 da embriogênese, ou pelo menos no dia 2 da embriogênese, ou pelo menos no dia 2,4 da embriogênese, ou pelo menos no dia 4 da embriogênese, ou pelo menos no dia 6 da embriogênese, ou pelo menos no dia 8 da embriogênese, ou pelo menos no dia 10 da embriogênese, ou pelo menos no dia 12 da embriogênese, ou pelo menos no dia 14 da embriogênese, ou pelo menos no dia 16 da embriogênese, ou pelo menos no dia 18 da embriogênese.
[00370] Em uma modalidade preferencial o marcador é uma proteína fluorescente. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é uma proteína fluorescente próxima a infravermelha, por exemplo, TagRFP657. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é uma proteína fluorescente fotoativável. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é selecionada dentre, porém, sem limitação, Proteína fluorescente verde (GFP), Proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP), Emerald, Superfolder GFP, Verde Azami, mWasabi, TagGFP, TurboGFP, mNeonGreen, mUKG, AcGFP, ZsGreen, Cloverm Sapphire, T-Sapphire, Proteína fluorescente azul aprimorada (EBFP), EBFP2, Azurite, TagBFP, mTagBFP, mKalama1, proteína fluorescente ciano (CFP), mCFP, proteína fluorescente ciano aprimorada (ECFP), mECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1
(Teal), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP), superproteína fluorescente amarela (SYFP), Topaz, Venus, Citrine, mCitrine, YPet, TagYFP, TurboYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato- Tandem, Proteína fluorescente vermelha (RFP), TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, proteína fluorescente Tag ref (RFP), TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine, mKeima-Red, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mKate2, mKate (TagFP635), HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, mNeptune, NirFP, Sirius, TagRFP657, AQ143, Kaede, KikGR1, PX- CFP2, mEos2, IrisFP, mEOS3.2, PSmOrange, PAGFP, Dronpa, Aloficocianina, GFPuv, R-fitoeritrina (RPE), Clorofila Peridinina (PerCP), P3, Katusha, B-fitoeritrina (BPE), mKO, J- Red. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é RFP. Em uma modalidade, a proteína fluorescente é GFP. Em uma modalidade GFP compreende uma ou mais das seguintes mutações GFP (mutação Y66H), GFP (mutação Y66F), GFP (mutação Y66W), GFP (mutação S65A), GFP (mutação S65C), GFP (mutação S65L), GFP (Mutação S65T).
[00371] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína luminescente. Em uma modalidade, a proteína luminescente é selecionada dentre aequorina ou uma luciferase.
[00372] Em uma modalidade, uma proteína auditiva (proteína vibratória), que pode ser detectada detectando-se uma onda sonora ou vibração do ovo.
[00373] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína sônica. Como usado no presente documento “proteína sônica” se refere a uma proteína que forma uma estrutura em resposta ao som que pode ser detectado por, por exemplo, ooscopia (exposição à luz direta) ou imageamento por ressonância magnética (MRI) ou outros sistemas de detecção.
[00374] Em uma modalidade, o marcador é um marcador metabólico. O marcador metabólico, por exemplo, pode ser um produto volátil de uma enzima marcadora introduzida. Esses marcadores podem ser detectados com um biossensor, por exemplo, o dispositivo Cybernose®.
[00375] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína quelante seletiva. Como usado no presente documento “proteína quelante seletiva” se refere a uma proteína capaz de sequestrar e concentrar íons metálicos responsivos a (MRI) ou a outros sistemas de detecção.
[00376] Em uma modalidade, o marcador pode ser detectado sem perturbar a integridade da casca do ovo. Isso pode ser alcançado através da criação de um orifício fino no ovo adequado para a inserção de uma fibra óptica ou biossensor que permita a avaliação da presença/ausência do marcador. Tais fibras ópticas ou biossensores podem ter o tamanho de largura de cabelo e podem ser incorporadas em agulhas que são inseridas em ovos que podem, por exemplo, detectar, marcar e remover embriões machos. Tais fibras ópticas ou biossensores podem ser combinados com plataformas de injeção de ovo existentes (por exemplo, sistemas de injeção Embrex in ovo) para detecção e remoção rápidas de embriões machos que compreendem o marcador. Tais fibras ópticas podem ser adequadas para detectar uma fluorescência, luminescência, audível (proteína vibratória), marcador metabólico ou proteína sônica. Em uma modalidade, as fibras ópticas referenciadas no presente documento são menores do que 1000µm, ou são menores do que 900 µm, ou são menores do que 900 µm, ou são menores do que 800 µm, ou são menores do que 700 µm, ou são menores do que 600 µm, ou são menores do que 500 µm, ou são menores do que 400 µm, ou são menores do que 300 µm, ou são menores do que 200 µm, ou são menores do que 100 µm, ou são menores do que 50 µm, ou são menores do que 40 µm, ou são menores do que 30 µm, ou são menores do que 20 µm, ou são menores do que 10 µm, ou são menores do que 5 µm, ou são menores do que 4 µm, ou são menores do que 3 µm, ou são menores do que 2 µm, ou são menores do que 1 µm de diâmetro.
[00377] Em uma modalidade, o marcador pode ser detectado através da casca do ovo, ou seja, a casca do ovo está inteira e sem interrupções (nenhum orifício adequado para uma fibra óptica ou biossensor). Tais modalidades reduzem o risco de contaminação do ovo que pode ser usado para, por exemplo, produção de vírus ou proteínas.
[00378] Em uma modalidade, o marcador é uma proteína fluorescente e o marcador é triado através de exposição do ovo a um primeiro comprimento de onda de luz e avaliação da fluorescência em um segundo comprimento de onda de luz. Em uma modalidade o primeiro e o segundo comprimentos de onda são o mesmo comprimento de onda. Em uma modalidade o primeiro e o segundo comprimentos de onda são diferentes. Em uma modalidade a fonte de luz pode ser um laser. Os comprimentos de onda apropriados para avaliar a fluorescência das proteínas fluorescentes, conforme descrito no presente documento, podem ser prontamente determinados por uma pessoa versada na técnica, com base na literatura. Em uma modalidade a triagem também pode compreender o uso de um filtro.
[00379] Uma pessoa versada na técnica reconheceria que os métodos de detecção como descritos no presente documento podem ser automatizados. O método automatizado pode compreender um meio transportador que move os ovos através e/ou passa por um meio para expor os ovos a um primeiro comprimento de onda de luz e através e/ou passa por um meio para detectar a presença de expressão em um segundo comprimento de onda de luz. A automação pode compreender a adaptação de um sistema de injeção Embrex in ovo, ou a adaptação de sistemas semelhantes para detecção dos marcadores referenciados no presente documento. Os ovos que fluorescem podem ser separados dos ovos que não fluorescem, por exemplo, manualmente por mãos humanas, um braço robótico, um aparelho de vácuo que engata e levanta cada ovo por vácuo ou por um meio de chaveamento, onde os ovos são separados por portas que são abertas apenas se o ovo for fluorescente e/ou são abertas apenas se o ovo não for fluorescente.
[00380] Em uma modalidade, o método é usado para classificação por gênero de alto volume de ovos aviários. Em uma modalidade, os ovos machos são separados de ovos fêmeas e usados para a produção de vírus ou produção de proteínas terapêuticas. Em uma modalidade, os ovos fêmeas são separados dos ovos machos e usados para produção de ovos (para alimentação) ou produção de carne.
CARACTERÍSTICAS DE PRODUÇÃO
[00381] Como usado no presente documento, o termo “característica de produção” se refere a qualquer fenótipo de uma ave
[00382] que tem valor comercial, tal como, porém, sem limitação, produção de vírus, produção de proteínas recombinantes, massa muscular, conteúdo nutricional, fertilidade, produção de ovos, eficiência alimentar,
habitabilidade, rendimento de carne, longevidade, rendimento de carne branca, rendimento de carne escura, resistência a doenças , suscetibilidade a doenças, tempo ideal de dieta até a maturidade, tempo para atingir o peso alvo, peso no ponto alvo no tempo, ganho de peso médio diário, qualidade da carne, conteúdo muscular, massa muscular, conteúdo gordo, ingestão de alimento, conteúdo de proteína, conteúdo de osso, exigência de energia de manutenção, tamanho maduro, perfil de aminoácidos, perfil de ácidos graxos, suscetibilidade e resposta ao estresse, capacidade digestiva, atividade da miostatina, padrão de deposição de gordura. Numa modalidade, a característica é resistência à infecção por Salmonella, ascite e infecção por listeria. A característica do ovo pode ser livre de alérgenos, qualidade, tamanho, formato, prazo de validade, frescura, teor de colesterol, cor, teor de biotina, teor de cálcio, qualidade da casca, cor da gema, teor de lecitina, número de gemas, teor de gemas, teor de clara, teor de vitamina, teor de vitamina D, densidade de nutrientes, teor de proteínas, teor de albúmen, qualidade de proteínas, teor de avidina, teor de gordura, teor de gordura saturada, teor de gordura não saturada, qualidade interna dos ovos, número de manchas de sangue, tamanho da célula de ar, grau, uma característica de desenvolvimento, prevalência ou aparência de chalaza, facilidade de descascar, probabilidade de ser um ovo restrito, conteúdo de Salmonella.
[00383] Em uma modalidade, a característica de produção é selecionada dentre: produção de vírus, produção de proteína recombinante, massa muscular, conteúdo nutricional, fertilidade e alergenicidade.
[00384] Em uma modalidade, a característica de produção não é sexo. Em uma modalidade, a ave compreende um gene DMRT1 não modificado funcional.
[00385] Em uma modalidade, a característica de produção é modulada por um gene localizado no cromossomo Z. Por exemplo, o gene pode ser selecionado dentre: IFNB (ENSGALG00000005759) Z:6888741-6889590; IFNA1 (ENSGALG00000013245) Z:6896104-6896866; IFNA3 (ENSGALG00000005764) Z:6906540-6907121; IL11RA (ENSGALG00000005848) Z:7805781-7828820; NP_990383.1 (ENSGALG00000005194) Z:8423047-8426804; IPI00681421.2 (ENSGALG00000021353) Z:8426772-8430612; NP_001026617.1 (ENSGALG00000002383) Z:8431894-8435719; A1EA95 (ENSGALG00000013372) Z:10231937-1024566; NP_989906.1 (ENSGALG00000003733) Z:11395953-11424499; IPI00576148.2 (ENSGALG00000003747) Z:11551082-11574029; IPI00679858.2 (ENSGALG00000014714) Z:16329446-16353112; NP_990202.1 (ENSGALG00000014716) Z:16366576-16391591; IPI00818057.1 (ENSGALG00000023411) Z:20717464-20724015; IPI00598932.2 (ENSGALG00000015031) Z:28205728-28210197; NFIL3 (ENSGALG00000015209) Z:43619547-43620923; TFIP8 (ENSGALG00000002196) Z:69693040-69693606; TICAM2 (ENSGALG00000021410) Z:71110462-71115876; IFNKL interferon kappa-like (ENSGALG00000015062) Z: 34282788-34285316 e MEKK1 (ENSGALG00000014718) Z:47924788.
PRODUÇÃO DE VÍRUS
[00386] Como usado no presente documento, o termo “produção de vírus” se refere ao aumento da capacidade de produção de vírus de um ovo ou ao aumento da adequação (imunogenicidade) de um vírus para produção de vacina ou ao aumento da qualidade (imunogenicidade) do vírus produzido no ovo aviário. Em uma modalidade, um ovo transgênico da presente invenção, quando inoculado com um vírus, produz uma quantidade maior de vírus do que um ovo isogênico sem a mesma modificação. Em uma modalidade, um ovo transgênico da presente invenção, quando inoculado com, por exemplo, um vírus de mamífero, produz um vírus que representa mais de perto o vírus do tipo selvagem (isto é, é menos adaptado ao ovo ou mais imunogênico) e, como consequência, as vacinas derivadas do vírus induzem uma resposta imune protetora superior a um vírus produzido em um ovo isogênico que carece da mesma modificação genética. Em uma modalidade, o vírus é mais imunogênico em seres humanos do que um vírus produzido em um ovo isogênico que carece da mesma modificação genética.
[00387] Como usado no presente documento, o termo “produzir mais vírus do que o ovo isogênico” se refere à capacidade de um ovo aviário da invenção para ser usado para cultivar mais vírus do que o ovo isogênico. Em uma modalidade, o ovo isogênico é da mesma cepa de ave que o ovo aviário da invenção. Em uma modalidade, o ovo isogênico aviário é geneticamente idêntico ao ovo da invenção, além da presença da modificação genética. Em uma modalidade, uma ave da invenção produz pelo menos 0,5 vez ou pelo menos 1 vez ou pelo menos 2 vezes ou pelo menos 3 vezes ou pelo menos 5 vezes ou pelo menos 10 vezes ou pelo menos 15 vezes vírus, pelo menos 20 vezes, ou pelo menos 50 vezes, ou pelo menos 100 vezes mais vírus quando comparada a um ovo isogênico sem a modificação genética. Esse aumento na produção de vírus pode ser prontamente determinado pelo especialista, como uso de técnicas de rotina. Por exemplo, um ovo da invenção e o ovo isogênico podem ser inoculados com a mesma quantidade do mesmo vírus e incubados sob as mesmas condições pelo mesmo período de tempo e a quantidade de partículas de vírus presentes em cada ovo pode ser determinada com o uso de técnicas padrão, como aquelas descritas nos Exemplos.
[00388] Como usado no presente documento, o termo “vírus ou partículas do mesmo” se refere a vírus inteiro que pode ou não ser inativado e a partículas de tais vírus. Uma partícula de vírus pode ter qualquer tamanho adequado para uso em uma vacina de vírus dividido ou vacina de subunidade de vírus. Todo o vírus ou partículas do vírus podem ser colhidos do fluido alantoico do ovo. Um vírus inteiro colhido pode ser rompido durante a preparação de uma composição de vacina para formar partículas de tamanho adequado para uma vacina de vírus dividido ou vacina de subunidade de vírus.
[00389] Em uma modalidade, a produção de vírus pode ser aumentada pela introdução de uma modificação genética que reduz a expressão de um gene antiviral e/ou atividade de proteína antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da mesma modificação.
[00390] Como usado no presente documento, o termo “reduz a expressão de um gene antiviral” se refere à capacidade da modificação genética para regular de forma decrescente o nível de transcrição de RNA e/ou o nível de tradução do transcrito de RNA no ovo quando comparado ao nível (ou níveis) no ovo isogênico. Em uma modalidade, o ovo isogênico é da mesma cepa de ave que o ovo aviário da invenção. Em uma modalidade, o ovo isogênico aviário é geneticamente idêntico ao ovo da invenção, além da presença da modificação genética. Em uma modalidade, o gene codifica uma proteína antiviral e, consequentemente, o nível de atividade da proteína antiviral no ovo também será reduzido quando comparado ao nível no ovo isogênico. Em uma modalidade, a modificação genética reduz expressão do gene antiviral no ovo por pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% em comparação com o ovo isogênico que carece da modificação genética. Essa redução pode ser identificada com o uso de procedimentos padrão.
[00391] Como usado no presente documento, o termo "reduz o nível de atividade da proteína antiviral" se refere à capacidade da modificação genética de regular de modo decrescente o nível de atividade da proteína antiviral no ovo quando comparado ao nível no ovo isogênico. Em uma modalidade, o ovo isogênico é da mesma cepa de ave que o ovo aviário da invenção. Em uma modalidade, o ovo isogênico aviário é geneticamente idêntico ao ovo da invenção, além da presença da modificação genética. A atividade da proteína pode ser reduzida, por exemplo, reduzindo-se a quantidade de proteína no ovo e/ou reduzindo-se a capacidade da proteína de desempenhar sua função natural (tal como a ligação da proteína por um aptâmero). Em uma modalidade, a modificação genética reduz o nível de atividade da proteína antiviral no ovo por pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% em comparação com o ovo isogênico que carece da modificação genética. Essa redução pode ser identificada com o uso de procedimentos padrão.
[00392] Como usado no presente documento, um “gene antiviral” é qualquer gene aviário endógeno, cuja expressão limita a produção do vírus no ovo por qualquer meio. Um gene antiviral pode codificar uma proteína antiviral.
[00393] Como usado no presente documento, uma "proteína antiviral" é qualquer proteína aviária endógena, cuja presença limita a produção do vírus no ovo.
[00394] O gene e/ou a proteína antiviral podem estar envolvidos na capacidade de uma ave adulta de montar uma resposta imune a uma infecção viral. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral fazem parte de uma via de interferon (IFN). Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral estão na via de interferon Tipo I, Tipo II ou Tipo III. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral estão na via de interferon Tipo I ou Tipo III. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são a cadeia IFN-α / β receptor1 (IFNAR1). Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são IL-6.
[00395] Em uma modalidade alternativa, o gene e/ou proteína antiviral podem estar, ou conhecidos por estar, envolvidos na capacidade de uma aviária adulta para montar uma resposta imune a uma infecção viral. Exemplos de algumas funções conhecidas previamente de tais genes/proteínas incluem serem envolvidos no metabolismo celular, desenvolvimento embrionário, sinalização celular ou síntese de ácido nucleico.
[00396] Em uma modalidade alternativa, reduzir a expressão do gene e/ou proteína antiviral reduz a apoptose de células do ovo aviário infectado com o vírus.
[00397] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são selecionados dentre um, dois, três, quatro ou mais de: IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ,
IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB e XPO1 ou o seu receptor ou agonista correspondente. Em uma modalidade, o IFNα é uma ou mais das seguintes isoformas: IFNα1, IFNα2, IFNα4, IFNα5, IFNα6, IFNα7, IFNA8, IFNα10, IFNα13, IFNα14, IFNα16, IFNα17 e IFNα21. Em uma modalidade, o IFNλ é uma ou mais das seguintes isoformas: IFNλ1, IFNλ2, IFNλ3, IFNλ4.
[00398] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são selecionados dentre um, dois, três, quatro ou mais de: IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, BACE2, UBA5, ZFPM2, TRIM50, DDI2, NPR2, CAPN13, DNASE1L2, PHF21A, PCGF5, IFIH1, IL-1RA, LAMP1, EFR3A, ABI1, GADL1, PLVAP, CYYR1, ASAP1, NXF1, NSUN6, ANGPTL7, SIL1, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, CBLN4, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GCOM1, GTPBP4, IFT43, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SMYD2, XPO1 e ZKSCAN7 ou o seu receptor ou agonista correspondente.
[00399] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são selecionados dentre um, dois, três, quatro ou mais de: IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2,
PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB e XPO1 ou o seu receptor ou agonista correspondente.
[00400] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são selecionados dentre um, dois, três, quatro ou mais de: IL-6, CNOT4, MDA5, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2,CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB e XPO1 ou o seu receptor ou agonista correspondente.
[00401] Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNAR1. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IL-6. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é MDA5. Em uma modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é CNOT4. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNα. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNβ. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNγ. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral é IFNλ. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são IL-1RA. Em outra modalidade, o gene e/ou proteína antiviral são IL-1RB.
[00402] Detalhes adicionais em relação aos genes e/ou proteínas antivirais que podem ser visados são fornecidos abaixo na Tabela 2. TABELA 2: GENES E/OU PROTEÍNAS ANTIVIRAIS
S
I G eqID de Nome D DO Via ene referência
GENE de mRNA Sín C homeobo 3 N tese de ácido DX2 x tipo caudal 2 74205 M_204311 nucléico proteín Des a H1 de ligação ao 4 N envolvimento SBP1 fator de choque 15813 M_001112809 embrionário térmico glicera G 3 N Met ldeído-3-fosfato APDH 74193 M_204305 abolismo desidrogenase domínio A 4 X Met arrestina RRDC3 27107 M_424699.3 abolismo contendo 3
Fator 4 N Sín S 4 associado ao CTD M_001012822 tese de ácido CAF4 18492 relacionado a SR .1 nucléico Domínio de RNA X Sín R 7 pseudouridilato M_004945221 tese de ácido PUSD1 71031 sintase contendo .1 nucléico 1 Regulad or U UPF3 de 4 X Met PF3A transcritos não 18734 M_416933.4 abolismo senso homólogo A topoiso N T 4 Met merase (DNA) I, M_001001300 OP1MT 08025 abolismo mitocondrial .1 Proteín N Sin a R ativadora Ral 4 M_001030846 alização ALGAPB GTPase, 19128 .1 celular subunidade beta succina N Des to-CoA S ligase, 4 M_001006271 envolvimento UCLA2 subunidade beta 18857 .2 embrionário de formação de ADP Proteín
N a G de empilhamento 4 Res M_001012594 ORASP2 da remontagem de 24156 posta imune .1 Golgi 2, 55kDa
CUGBP, N Des membro C da família 3 M_001012521 envolvimento ELF1 semelhante a Elav 73923 .1 embrionário 1 família portadora de N S 4 Met soluto 26 M_001252254 LC26A6 16012 abolismo (trocador de .1 ânions), membro 6
Região de cromossomo da X Des W 7 síndrome de M_001234037 envolvimento BSCR27 70708 Williams Beuren .3 embrionário 27
H hunting 4 X Met TT tina 22878 M_420822.4 abolismo miocili na, resposta M 4 X Met glicocorticoide YOC 24391 M_422235.4 abolismo induzível por malha trabecular membro T 4 X Met 2 da superfamília M9SF2 18777 M_416972.4 abolismo transmembrana 9 proteín X Sín C 4 a centrossomal M_004946945 tese de ácido EP250 19138 250kDa .1 nucléico família Sín com F similaridade 4 X tese de ácido AM188A de sequência 188, 20526 M_418629.4 nucléico membro A Proteín Sin A 4 X a âncora 10 da alização KAP10 17612 M_415856.4 quinase (PRKA) celular Des A ALX 4 X envolvimento LX1 homeobox 1 27871 M_425445.4 embrionário homólog o do oncogene do C 4 L Res vírus da sarcoma RK 17553 08168.1 posta imune aviária v-crk CT10 Fator de troca de nucleotídeo de Sin G 4 X guanina alização BF1 23758 M_421632.4 resistente à celular Golgi brefeldina A 1
X H homeobo 7 Met M_001233690 OXB9 x B9 71865 abolismo .3 Ribonuc 1 N Sín
I leoproteína 0085720 M_001277715 tese de ácido MP4 nucleolar pequena 0 .1 nucléico
U3 Homólog Sín o I do fator de 4 X tese de ácido SY1 união (S. 15968 M_414311.2 nucléico cerevisiae)
N K 4 Talpid3 M_001040707 IAA0586 23540 .1 inibido r da serpina peptidase, clado H (proteína de S 3 N Met choque térmico ERPINH1 96228 M_205291.1 abolismo 47), membro 1, (proteína de ligação ao colágeno 1) família
N de S portadores de 4 Met M_001135679 LC47A2 soluto 47, membro 17616 abolismo .1 2 Des S estabil 4 X envolvimento TAB1 ina 1 15894 M_414246.4 embrionário Sin T Proteín 4 X alização TK a quinase TTK 21849 M_419867.4 celular família de locais de N Sin W 3 integração MMTV M_001081696 alização NT3 74142 do tipo wingless, .1 celular membro 3 proteín a de ligação ao nucleotídeo G de 7 X Met NAZ guanina (proteína 70226 M_001232444 abolismo G), polipeptídeo alfa z trans- 2-enoil-CoA M 4 X Met ECR redutase 19601 M_417748.4 abolismo mitocondrial enzima de B clivagem de APP 4 X Met ACE2 no local beta 2 18526 M_416735.4 abolismo (BACE2)
proteín Sín aZ de dedo de 4 X tese de ácido FPM2 zinco, membro da 20269 M_418380 nucléico família FOG 2 motivo T 4 X Met tripartido RIM50 17461 M_415709 abolismo contendo 50
D Dano 4 X Met DI2 induzível ao DNA 1 25541 M_423293 abolismo homólogo 2 (S. cerevisiae)
recepto r de peptídeo natriurético B/guanilato 1 N X Met ciclase B 0085933 PR2 M_003642919 abolismo (receptor de 9 peptídeo atrionatriurético B)
Complex Sín o C de transcrição 4 N tese de ácido NOT4 CCR4-NOT, 17936 M_001012811 nucléico subunidade 4
C calpaín 4 X Met APN13 a 13 21304 M_419369 abolismo análogo aD 4 X Met NASE1L2 desoxirribonuclea 27682 M_425256 abolismo se I 2
Sín P Proteín 4 N tese de ácido HF21A a de dedo PHD 21A 23199 M_001199647 nucléico dedo Sín P 4 X anelar de grupo tese de ácido CGF5 23796 M_421668 policomb 5 nucléico
R recepto eceptor r de interferon 3 N Res alfa IFN (alfa, beta e 95665 M_204859 posta imune (IFNAR1 ômega) 1 )
I interle 3 N Res L-6 ucina 6 95337 M_204628 posta imune recepto I 3 N Res r de interleucina L-1RA 96481 M_205485 posta imune 1, tipo I proteín aL de membrana 3 N Res AMP1 lisossomal- 96220 M_205283.2 posta imune associada 1
Homólog Des E 4 N o EFR3 A (S. envolvimento FR3A 20327 C_006089.3 cerevisiae) embrionário
A abl- 4 A Res BI1 interactor 1 20489 J720766.1 posta imune similar 1 X G Met a glutamato 0085713 M_003640735 ADL1 abolismo descarboxilase 1 4 .2 proteín 1 X aP associada à Res 0085741 M_004950319 LVAP vesícula posta imune 7 .1 plasmática
C rico em 7 X Sin
YYR1 cisteína/tirosina 70067 M_001233378 alização 1 .3 celular ArfGAP com domínio SH3, A 4 X Res repetição de SAP1 28385 M_425945.4 posta imune anquirina e domínio PH 1 fator X Sín N 7 de exportação de M_001232980 tese de ácido XF1 69691 RNA nuclear 1 .3 nucléico Família X Sín de N domínio 4 M_004939249 tese de ácido SUN6 NOP2/Sun, membro 28419 .1 nucléico 6 semelha 1 X Des
A nte à 0175003 M_004947467 envolvimento NGPTL7 angiopoietina 7 3 .1 embrionário Fator X Des S 4 de troca de M_004944772 envolvimento IL1 16185 nucleotídeo SIL1 .1 embrionário resistê
X ncia B ao câncer de 4 Res M_004936593 CAR3 mama 24494 posta imune .1 antiestrogênio 3 Semelha X Sín G 4 nte à M_004948290 tese de ácido OLPH3L 25072 fosfoproteína de .1 nucléico
Golgi 3 express N Des H 4 o hematológico e M_001006425 envolvimento N1 22119 neurológico 1 .1 embrionário A adenila 4 X Res DCY7 to ciclase 7 15732 M_414097.4 posta imune
N C precurs 7 Met M_001079487 BLN4 or de cerebelina 4 69254 abolismo .1 quadro
X de C leitura aberta 4 M_003641123 XORF56 do cromossomo 4, 28719 .2 humano CXorf56 Polipep tídeo D de caixa 4 A Met DX10 DEAD (Asp-Glu- 18965 J720478.1 abolismo Ala-Asp) 10 Proteín a semelhante à subunidade 3 de N E 4 Met fator putativo de M_001006260 IF2S3 18597 abolismo iniciação da .2 tradução eucariótica 3 homólog N Sín E 4 o de proteína de M_001031519 tese de ácido SF1 28551 processamento .1 nucléico nucleolar pré- rRNA
Local Sín G 4 X do complexo tese de ácido COM1 15404 M_413789.4 GRINL1A 1 nucléico
Proteín N Sín G 4 a de ligação ao M_001006354 tese de ácido TPBP4 20458 GTP 4 .1 nucléico
Sin K cariofe 4 C alização PNA3 rina alfa 3 18870 N232780.1 celular
Repetiç ões ricas em Des L 4 X leucina e envolvimento RRIQ1 17882 M_416125.4 contendo motivo embrionário de QI 1
Semelha Sín L 4 X nte a LUC7 (S. tese de ácido UC7L 16654 R_213192.1 cerevisiae) nucléico proteín X M 7 Met a ribossômica M_001232213 RPL12 69031 abolismo mitocondrial L12 .3 polipep tídeo da Sín P 4 X polimerase (RNA) tese de ácido OLR3E 16620 M_414921.4 III (direcionado nucléico ao DNA) E
Homólog o periódico da Sín P 4 X proteína do tese de ácido WP2 18551 M_416757.4 triptofano PWP2 nucléico (levedura) N Sín R proteín 4 M_001004379 tese de ácido PL7A a ribossômica L7a 17158 .1 nucléico Contend N Sín S 4 o domínio SET e M_001277571 tese de ácido MYD2 21361 MYND 2 .1 nucléico exporti N Sin X 4 na 1 (homólogo M_001290134 alização PO1 21192 CRM1, levedura) .1 celular dedo de
Z X zinco com 4 KSCAN7/ M_004945381 domínios KRAB e 16664 ZNF436 .1 SCAN 7 transporte X Des I 7 intraflagelar 43 M_004941812 envolvimento FT43 71922 homólogo .1 embrionário (Chlamydomonas) I interfe 3 N Res FNα ron IFNA3 96398 M_205427.1 posta imune I Interfe 5 N Res FNβ ron, beta 54219 M_001024836 posta imune
.1 interle
I N ucina 28B 7 Res FNλ M_001128496 (interferon, 70778 posta imune (IFNL3) .1 lambda 3) I interfe 3 N Res FNγ ron gama 96054 M_205149.1 posta imune interfe
M N ron induzido com o 4 Res DA5/IF1 M_001193638 domínio helicase 24185 posta imune H1 .1 C 1 enzima ativadora U de N 4 Res BE1DC1/ modificador M_001001765 14879 posta imune UBA5 semelhante à .1 ubiquitina 5
R recepto eceptor r de interferon 3 N Res alfa IFN (alfa, beta e 95664 M_204858.1 posta imune (IFNAR2 ômega) 2 ) Recepto N I 4 Res r de Interferon M_001130387 FNGR1 21685 posta imune Gama 1 .1 Recepto N I 4 Res r de Interferon M_001008676 FNGR2 18502 posta imune Gama 2 .2
(Transdutor de Interferon Gama 1) subunid ade I beta do 3 N Res L10R2 receptor de 95663 M_204857.1 posta imune interleucina 10 Recepto I 4 X Res r de interleucina L1RB 18715 M_416914.5 posta imune 1 tipo 2
I FNκ/IFN interfe 5 N Res K/IFN ron kappa 6832 M_020124.2 posta imune Kappa
I Interfe 3 N Res FNΩ/IFN ron ômega 467 M_002177.2 posta imune ômega recepto r de peptídeo natriurético
L OC10085 B/guanilato 1 X Res 9339/NP ciclase B 0085933 M_003642919 posta imune R2 (receptor de 9 .2 peptídeo atrionatriurético B) I interfe 4 X Res L28RA/I ron, receptor 19694 M_004947908 posta imune
FNLR1 lambda 1 .1
[00403] Em uma modalidade, um ovo transgênico da presente invenção, quando inoculado com, por exemplo, um vírus de mamífero, produz um vírus que representa mais de perto o vírus do tipo selvagem (ou seja, é menos adaptado ao ovo) e, como consequência, as vacinas derivadas do vírus induzem uma resposta imune protetora maior (um vírus mais imunogênico) do que um vírus produzido em um ovo isogênico que carece da mesma modificação genética. Em uma modalidade, a resposta imune protetora produzida por vírus produzido por um ovo como descrito no presente documento é aumentada por pelo menos 5%, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 40%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 70%, ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, ou 100% em comparação com um vírus produzido em um ovo isogênico que carece da modificação genética. Em uma modalidade, a modificação genética altera padrões de glicosilação, tal como sialiação no ovo aviário. Em uma modalidade, a modificação genética aumenta a α-2,6-sialiação no ovo aviário (Oh et al., 2008). Em uma modalidade, a modificação genética diminui α-2,3-sialiação no ovo aviário. Em uma modalidade, a modificação genética aumenta a expressão da ST6 proteína Beta-galactosídeo Alfa-2,6- Sialiltransferase 1 (SIAT1 também conhecida como ST6GaII), que aumenta o ácido siálico ligado a-2,6 (α-2,6- sialiação) no ovo aviário. Assim, em uma modalidade, a presente invenção permite aumentar a imunogenicidade do vírus produzido para produção de vacina no ovo aviário.
[00404] Em uma modalidade, um ovo aviário como descrito no presente documento compreende uma modificação genética que aumenta a quantidade de vírus produzido em um ovo aviário e uma modificação genética que aumenta a qualidade (imunogenicidade) do vírus produzido no ovo aviário em comparação com um ovo isogênico que carece da mesma modificação. Em uma modalidade, o ovo compreende uma modificação genética que aumenta a expressão da proteína SIAT1 no ovo aviário em comparação com um ovo isogênico que carece da mesma modificação. Em uma modalidade, o ovo compreende uma modificação genética que reduz a expressão de um gene e/ou proteína antiviral como descrito no presente documento e uma modificação genética que aumenta a expressão da proteína SIAT1. Em uma modalidade, SIAT1 é SIAT1 de mamífero. Em uma modalidade, SIAT1 é SIAT1 humano. Em uma modalidade, SIAT1 é a sialiltransferase descrita no Gene ID: 6480. Em uma modalidade, o ovo compreende uma modificação genética que reduz a expressão do gene e/ou proteína IFNAR e uma modificação genética que aumenta a expressão da proteína SIAT1.
PROTEÍNAS RECOMBINANTES
[00405] Como usado no presente documento, o termo “produção de proteína recombinante” se refere à produção de uma proteína recombinante em um ovo aviário. Em uma modalidade, a proteína recombinante é produzida nas claras de ovo. A proteína recombinante pode ser colhida do fluido alantoico do ovo. Em uma modalidade, a proteína recombinante não precisa ser colhida do ovo e pode ser administrada por ingestão do ovo. Em uma modalidade, a proteína recombinante pode ser uma proteína antimicrobiana, uma proteína de ligação, uma citocina ou quimiocina, um hormônio, um fator de coagulação sanguínea, uma enzima, um antígeno para uso na produção de vacinas. Em uma modalidade, a proteína recombinante é uma proteína terapêutica.
[00406] O termo “proteína antimicrobiana” se refere a uma proteína que fornece proteção antimicrobiana a um ovo aviário ou ave que compreende a proteína antimicrobiana. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana protege um ovo contra contaminação, reduzindo o desperdício durante a produção da vacina. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana é uma defensina, ovolactoferrina ou ovotransferrina. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana é ovotransferrina. Em uma modalidade, a proteína antimicrobiana é beta-defensina.
[00407] Em uma modalidade, a "proteína de ligação" é um anticorpo ou um fragmento do mesmo. O termo "anticorpo", como usado no presente documento, inclui anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, diacorpos de fusão, triacorpos, anticorpos heteroconjugados, anticorpos quiméricos, incluindo moléculas intactas, bem como seus fragmentos, e outras moléculas semelhantes a anticorpos. Os anticorpos incluem modificações em diversas formas, que incluem, por exemplo, porém, sem limitações, anticorpos de domínio que incluem o domínio VH ou VL, um dímero da região variável da cadeia pesada (VHH, como descrito para um camelídeo), um dímero da região variável da cadeia leve (VLL), fragmentos Fv contendo apenas as regiões variáveis da cadeia leve (VL) e cadeia pesada (VH) que podem ser unidas diretamente ou através de um ligante, ou fragmentos Fd contendo a região variável da cadeia pesada e o domínio CH1.
[00408] Um scFv que consiste nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve ligadas entre si para formar um anticorpo de cadeia única (Bird et al., 1988; Huston et al.,
1988) e oligômeros de scFvs como diacorpos e triacorpos também são englobados pelo termo "anticorpo". Também são abrangidos fragmentos de anticorpos tais como Fab, (Fab')2 e fragmentos FabFc2 que contêm as regiões variáveis e partes das regiões constantes. Os fragmentos de anticorpo enxertados na região de determinação de complementaridade (CDR) e os oligômeros de fragmentos de anticorpo também são abrangidos. Os componentes das cadeias pesada e leve de um Fv podem ser derivados do mesmo anticorpo ou anticorpos diferentes, produzindo assim uma região Fv quimérica.
[00409] Os anticorpos podem ser regiões Fv que compreendem uma cadeia leve variável (VL) e uma cadeia pesada variável (VH) em que as cadeias leve e pesada podem ser unidas diretamente ou através de um ligante. Como usado aqui, um ligante se refere a uma molécula que está ligada covalentemente à cadeia leve e pesada e fornece espaçamento e flexibilidade suficientes entre as duas cadeias, de modo que as mesmas sejam capazes de alcançar uma conformação na qual são capazes de ligar especificamente o epítopo ao qual as mesmas são direcionadas. Os ligantes de proteína são particularmente preferenciais, uma vez que os mesmos podem ser expressos como um componente intrínseco da porção Ig do polipeptídeo de fusão.
[00410] O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, anticorpo de cadeia única, diacorpo, triacorpo ou tetracorpo. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser um anticorpo bi- específico, um anticorpo manipulado, um conjugado anticorpo- fármaco ou um anticorpo biossimilar. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser Abatacept, Abciximabe, Alirocumabe, Adalimumabe, Afibercept, Alemtuzumabe, Basiliximabe,
Belimumabe, Bevacizumabe (Avastin), Brentuximabe vedotina, Bococizumabe, Canakinumabe, Cetuximabe, Certolizumabe pegol, Daclizumabe, Daratumumabe, Denosumabe, Durvalumabe, Eculizumabe, Efalizumabe, Elotuzumabe, Etanercept, Evolocumabe, Golimumabe, Ibritumomabe tiuxetan, Infliximabe, Ipilimumabe, Muromonab-CD3, Natalizumabe, Nivolumabe, Ocrelizumabe, Ofatumumabe, Omalizumabe, Pembrolizumabe, Palivizumabe, Panitumumabe, Pidilizumabe, Ranibizumabe, Rituximabe, Tocilizumabe (ou Atlizumabe), Tositumomabe, Trastuzumabe, Tremelimumabe Ustequinumabe, Vedolizumabe, ou um modificado ou biossimilar dos mesmos.
[00411] Em uma modalidade, a "citocina ou quimiocina" pode ser proteína morfogenética óssea, eritropoietina, fator estimulador de colônias de granulócitos, fator estimulador de colônias de granulócitos de macrófagos, trombopoietina, IFNα, IFNβ, IFNλ, IFNγ, TNFα, TNFβ, antagonista do receptor de interleucina 1 (IL1RA), linfopoietina estromal do timo ou uma ou mais interleucinas. Em uma modalidade, a citocina é IFNβ. Em uma modalidade, a citocina é IL1RA.
[00412] Em uma modalidade, o "hormônio" pode ser epinefrina, melatonina, triiodotironina, tiroxina, prostaglandina, leucotrienos, prostaciclina, tromboxano, amilina, hormônio antimulleriano, adponectina, hormônio adrenocorticotrópico, angiotensinogênio, angiotensina, peptídeo natriurético atrial, peptídeo natriurético cerebral, calcitonina, colecistocinina, hormônio liberador de corticotropina, cortistatina, encefalina, endotelina, eritropoietina, hormônio folículo estimulante, galanina, glucagon, peptídeo semelhante a glucagon 1, hormônio liberador de gonadotropina, hormônio liberador de hormônio de crescimento, hepcidina, gonadotropina coriónica humana, lactogênio placentário humano, hormônio do crescimento, inibina, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina, leptina, hormônio luteinizante, hormônio estimulador de melanócitos, motilina, orexina, ocitocina, polipeptídeo pancreático, peptídeo ativador de adenilato ciclase da hipófise, prolactina, hormônio liberador de prolactina, relaxina, renina, secretina, somatostatina, trombopoietina, hormônio estimulador da tireoide, hormônio liberador de tirotropina, peptídeo intestinal vasoativo ou um derivado ou análogo dos mesmos.
[00413] Em uma modalidade, o "fator de coagulação" pode ser fator I, fator II, fator III, fator IV, fator V, fator VI, fator VII, fator VIII, fator IX, fator IX, fator IX, fator X, fator XII, fator XIII, cininogênio de alto peso molecular, fibronectina, antitrombina II, cofator II da heparina, proteína C, proteína S, proteína Z, inibidor de protease relacionada à proteína Z, plasminogênio, alfa 2-antiplasmina, ativador do plasminogênio tecidual, uroquinase, inibidor do ativador do plasminogênio 1 ou inibidor do ativador do plasminogênio 2.
[00414] Em uma modalidade, a "enzima" pode ser uma protease, lipase, asparaginase, liprotamase, ativador de plasminogênio tecidual, colagenase, glutaminase, hialuronidase, estreptoquinase, uricase, uroquinase ou nuclease, tal como uma nuclease programável. Em uma modalidade a proteína recombinante é uma proteína terapêutica, ou seja, lipase ácida lisossômica (LAL) comercializada como o fármaco "Kanuma".
MASSA MUSCULAR
[00415] Como usado no presente documento, o termo “massa muscular” se refere ao peso do tecido muscular. Um aumento na massa muscular pode ser determinado pela pesagem do tecido muscular total de uma ave que eclode de um ovo tratado como descrito no presente documento quando comparada a uma ave da mesma espécie aviária, mais preferencialmente linhagem ou raça de ave, e ainda mais preferencialmente a mesma ave, que não foi administrado com um ácido nucleico como definido no presente documento. Alternativamente, músculos específicos tais como músculos do peito e/ou pernas, podem ser usados para identificar um aumento na massa muscular. De preferência, os métodos da invenção aumentam a massa muscular em pelo menos cerca de 1%, 2,5%, 5%, 7,5% e ainda mais preferencialmente, cerca de 10%. Exemplos de genes que podem ser direcionados para modificar a massa muscular como uma característica em uma ave incluem miostatina (MSTN), fator de diferenciação de crescimento-8 (GDF-8), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1), diferenciação miogênica 1 (MyoD1), hormônio do crescimento (GH), fator de liberação do hormônio do crescimento (GRF), fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2), c-ski, interleucina-15 (IL-15) e fator de crescimento de fibroblastos 5 (FGF5) (US7732571, WO1991000287, WO1996037223, WO2007062000, US7732571).
CONTEÚDO NUTRICIONAL
[00416] Como usado no presente documento, o termo “conteúdo nutricional” se refere ao conteúdo nutricional do ovo e/ou carne produzidos por uma ave. O conteúdo nutricional pode se referir ao aumento do conteúdo de uma vitamina, mineral, aminoácido, proteína ou carboidrato no ovo e/ou carne.
De preferência, os métodos da invenção aumentam a concentração de um nutriente no ovo ou ave em pelo menos cerca de 0,5%, 1%, 2,5%, 5%, 7,5% e, ainda mais preferencialmente, cerca de 10%.
FERTILIDADE
[00417] Conforme usado neste documento, o termo "fertilidade" se refere à capacidade reprodutiva ao aviário geneticamente modificado, conforme descrito aqui ou a sua descendência. Por exemplo fertilidade aumentada pode incluir uma taxa de ovulação ou taxa de concepção aumentada.
ALERGENICIDADE
[00418] Exemplos de genes que podem ser direcionados para modificar a “alergenecidade” como uma característica incluem ovomucoide (Gald1), ovalbumina, lisozima e ovotransferrina, livetina, apovitilina, albumina sérica de galinha e YGP42 e fosvitina (Dhanapale et al., 2015).
VÍRUS
[00419] Os vírus que podem ser produzidos em ovos de aves da invenção incluem qualquer vírus capaz de replicar e produzir novas partículas virais em um ovo aviário. Tais vírus incluem vírus de DNA e RNA. Em uma modalidade, o vírus é um vírus animal. Em uma modalidade, o vírus animal é um vírus humano. Numa modalidade, o vírus é um vírus não humano. Numa modalidade, o vírus é um vírus aviário.
[00420] Exemplos de vírus para uso na presente invenção incluem, porém, sem limitação, vírus em uma família selecionada entre: Orthomyxoviridae, Herpesviridae, Paramyxoviridae, Flaviviridae e Coronaviridae. Numa modalidade, o vírus é um membro da família Orthomyxoviridae.
[00421] O vírus Orthomyxoviridae pode ser, por exemplo, vírus Influenza A, vírus Influenza B, vírus Influenza
C, Isavírus, Thogotovírus e/ou Quaranjavírus. O vírus influenza pode ser um vírus influenza A. O vírus influenza A pode ser selecionado dentre os vírus influenza A isolados de um animal. Em uma modalidade, o animal é um ser humano ou uma ave. Em particular, o vírus Influenza A pode ser selecionado dentre H1N1, H1N2, H1N3, H1N4, H1N5, H1N6, H1N7, H1N9, H2N1, H2N2, H2N3, H2N4, H2N5, H2N7, H2N8, H2N9, H3N1, H3N2, H3N3, H3N4, H3N5, H3N6, H3N8, H4N1, H4N2, H4N3, H4N4, H4N5, H4N6, H4N8, H4N9, H5N1, H5N2, H5N3, H5N6, H5N7, H5N8, H5N9, H6N1, H6N2, H6N3, H6N4, H6N5, H6N6, H6N7, H6N8, H6N9, H7N1, H7N2, H7N3, H7N4, H7N5, H7N7, H7N8, H7N9, H9N1, H9N2, H9N3, H9N5, H9N6, H9N7, H9N8, H10N1, H10N3, H10N4, H10N6, H10N7, H10N8, H10N9, H11N2, H11N3, H11N6, H11N9, H12N1, H12N4, H12N5, H12N9, H13N2, H13N6, H13N8, H13N9, H14N5, H15N2, H15N8, H15N9 e H16N3. Em uma modalidade, o vírus Influenza A é selecionado dentre H1N1, H3N2, H7N7 e/ou H5N1.
[00422] O vírus Herpesviridae pode ser, por exemplo, um vírus HSV-1, HSV-2, vírus varicela zoster, vírus Epstein-barr ou Citômegalovírus.
[00423] O vírus Paramyxoviridae pode ser, por exemplo, um Paramyxovirinae ou Pneumovirinae. Em uma modalidade, o Paramyxoviridae é vírus da doença de Newcastle.
[00424] Os Flaviviridae podem ser, por exemplo, um Flavivírus, Hepacivírus, Pegivírus, Pestivírus. Em uma modalidade, os Flaviviridae podem ser o vírus Apoi, vírus Aroa, vírus Bagaza, vírus Banzi, vírus Bouboui, vírus de morcego de Bukalasa, vírus Cacipacore, vírus Carey Island, vírus Cowbone Ridge, vírus de morcego de Dakar, vírus Dengue, vírus Edge Hill, Vírus de morcego de Entebbe, vírus Gadgets Gully, vírus Ilheus, Vírus da meningoencefalomielite de peru de Israel,
vírus da encefalite japonesa, vírus Jugra, vírus Jutiapa, vírus Kadam, vírus Kedougou, vírus Kokobera, vírus Koutango, vírus da doença da floresta Kyasanur, vírus Langat, vírus da doença de Louping, Vírus Meaban, vírus Modoc, vírus leucoencefalite Montana myotis, vírus da encefalite do vale Murray, vírus Ntaya, vírus da febre hemorrágica de Omsk, vírus de morcego de Phnom Penh, vírus Powassan, vírus Rio Bravo, vírus Royal Farm, vírus Saboya, vírus Sal Vieja, vírus San Perlita , VÍRUS Saumarez Reef, vírus Sepik, vírus da encefalite de St. Louis, vírus Tembusu, vírus de encefalite transmitida por carrapatos, vírus Tyuleniy, vírus Uganda S, vírus Usutu, vírus Wesselsbron, vírus do Nilo Ocidental, vírus Yaounde, vírus da febre amarela, vírus Yokose, vírus Zika
[00425] O vírus Coronaviradae pode ser, por exemplo, um Coronavirinae ou um Corovirinae. O Coronavirinae pode ser um Alphacoronavírus, Betacoronavírus, Deltacoronavírus ou Gammacoronavírus. O Torovirinae pode ser um Alfacoronavírus ou Betacoronavírus. Na modalidade, o Coronaviradae pode ser o coronavírus SARS (síndrome respiratória aguda grave).
[00426] Em uma modalidade, o vírus é selecionado dentre: vírus Influenza, Vírus da cinomose canina, Vírus do sarampo, Reovírus, Vírus da encefalite equina oriental, Vírus da parainfluenza canina, Vírus da raiva, vírus Fowlpox, Vírus da encefalite equina ocidental, vírus Mups, Encefalomielite equina, Vírus da rubéola, Vírus da síndrome da queda de postura, Vírus oncolíticos aviários, Herpesvírus da laringotraqueíte infecciosa aviária, vírus da doença de Newcastle, Vírus da parainfluenza bovina, Vírus da varíola, Doença infecciosa bursal, Vírus bovino da doença de Ibaraki,
Poxvírus recombinante, Adenovírus aviário tipo I, II ou III, Vírus da encefalite suína japonesa , Vírus da febre amarela, Vírus do Herpes, Vírus Sindbis, Vírus da bronquite por infecções, Vírus da floresta Semliki, Vírus da encefalomielite, Vírus da EEV venezuelana, Vírus da anemia de galinha, Vírus da doença de Marek, Parvovírus, Vírus da febre aftosa, Vírus da síndrome reprodutiva e respiratória porcina, Vírus da peste suína clássica, Vírus da febre catarral ovina, vírus Kabane, Vírus da anemia infecciosa do salmão, Vírus da necrose hematopoiética infecciosa, Vírus da septicemia hemorrágica viral e Vírus da necrose pancreática infecciosa.
PRODUÇÃO DE VACINAS EM OVOS
[00427] Métodos para replicar vírus em ovos aviários e produzir vacinas a partir desses ovos já existem há mais de 70 anos e, portanto, são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos convencionais para produzir composições de vacina contra influenza tipicamente envolvem o crescimento dos vírus em ovos de galinha embrionados. Os vírus cultivados por este método são então usados para produzir, por exemplo, vírus vivos atenuados, composições de vacinas de vírus inteiros ou subunidades mortas. Um método para produzir a composição da vacina contra influenza é por inoculação do vírus influenza vivo em ovos de galinha embrionados com 10 a 11 dias de idade. Esse vírus de vacina inoculado é incubado por um período de tempo predeterminado, por exemplo, 2 ou mais dias para permitir a replicação do vírus antes da colheita do fluido alantoico rico em vírus (Hoffmann et al., 2002). Em um exemplo, o tempo predeterminado é de pelo menos 12 horas, ou pelo menos 24 horas, ou pelo menos 18 horas, ou pelo menos 24 horas, ou pelo menos 48 horas ou pelo menos 48 horas, ou pelo menos 72 horas,
ou pelo menos 4 dias, ou pelo menos 5 dias, ou pelo menos 6 dias, ou pelo menos 7 dias, ou pelo menos 8 dias, ou pelo menos 9 dias, ou pelo menos 10 dias.
[00428] Em uma operação típica, os ovos devem ser submetidos a ooscopia, as cascas devem ser esterilizadas e cada ovo deve ser inoculado por injeção de um pequeno volume de vírus na cavidade alantoica. Os ovos injetados são então incubados por 48 a 72 horas a 33 a 37 °C, novamente submetidos a ooscopia, refrigerados durante a noite e abertos para permitir a colheita do fluido alantoico. O fluido colhido pode então ser clarificado por filtração e/ou centrifugação antes do processamento para purificação adicional. Requisitos Para Vacina Inativada Contra a Gripe, Relatório Técnico da Organização Mundial da Saúde, 384 (1966). Muitas vacinas contra influenza disponíveis comercialmente nos Estados Unidos foram propagadas em ovos de galinha embrionados. Em uma modalidade, o ovo é um ovo de galinha e o vírus é colhido do dia 8 ao dia
11. Em uma modalidade, o ovo é um ovo de galinha e o vírus é colhido por volta do dia 10.
[00429] Colheita do Vírus Replicado ou Partículas do Mesmo a Partir do Ovo
[00430] O vírus replicado ou partículas do mesmo (tais como partículas de vírus dividido ou partículas de subunidades de vírus) podem ser colhidas do ovo, preferencialmente do fluido alantoico do ovo por qualquer método conhecido pelo especialista. Por exemplo, a colheita de vírus replicados ou de partículas do mesmo pode envolver uma ou mais das seguintes etapas: clarificação, concentração, inativação, tratamento de nuclease, separação/purificação, polimento e filtragem estéril (Wolf et al., 2008; Wolf et al.,
2011; Kalbfuss et al., 2006; Josefsberg et al., 2012). Em um exemplo, clarificação é realizada por centrifugação, microfiltração e/ou filtragem em profundidade. Num exemplo, a concentração é realizada por centrifugação, ultrafiltração, precipitação, monólitos e/ou adsorvedor de membrana. Em um exemplo, a inativação é realizada por tratamento UV, térmico ou químico. As formas químicas de inativação incluem formalina, etilenoimina binária e β-propiolactona ou qualquer outro método conhecido pelo especialista. Em uma modalidade, o tratamento de nuclease é tratamento com benzonase. Em um exemplo, a separação/purificação é realizada por ultracentrifugação (por exemplo, gradiente de densidade), cromatografia de esferas (por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de troca iônica ou cromatografia de afinidade) e/ou adsorvedor de membrana (por exemplo, cromatografia de troca iônica ou cromatografia de afinidade). Em um exemplo, o polimento é realizado por ultrafiltração e/ou diafiltração. Em um exemplo, vírus ou partículas de vírus podem ser concentradas por precipitação de álcool ou polietileno glicol. Em um exemplo, colher o vírus replicado ou partículas do mesmo compreende o uso de uma membrana como descrito em Grein et al. (2013).
[00431] Em outro exemplo, a colheita do vírus replicado pode incluir uma etapa de ruptura do vírus para produzir partículas virais de tamanho adequado para uma composição de vacina dividida ou uma composição de subunidade de vacina (Wolf et al., 2008; Josefsberg et al., 2012). Essa etapa pode ser qualquer método que produz partículas de vírus de um tamanho adequado para uma composição de vacina dividida ou composição de subunidade de vacina. Em um exemplo, a etapa de ruptura é solubilização em detergente.
[00432] Um especialista entenderia que vírus colhido (todo atenuado ou inativado) ou partículas de vírus colhidas (partículas de vírus dividido ou partículas de subunidades de vírus) podem ser formuladas em composições de vacina. Tais composições podem compreender um ou mais dentre: um adjuvante, um excipiente, um aglutinante, um conservante, um acoplamento de transportador, um agente tamponante, um agente estabilizante, um agente emulsificante, um agente umectante, um vetor não viral e um composto que facilita transfecção (Josefsberg et al., 2011; Jones, 2008). Um especialista compreenderia adicionalmente que tais composições de vacina podem ser liofilizadas. Em um exemplo, a composição de vacina produzida é adequada para uso humano. Em um exemplo, a composição de vacina produzida é adequada para uso veterinário.
EXEMPLOS EXEMPLO 1 - PINTOS FÊMEAS PARA INCUBAÇÃO SELETIVA
[00433] Em galinhas, e abes em geral, a fêmea é o sexo heterogamético, que carrega um cromossomo Z e um W, portanto ZW. O macho é homogamético, sendo ZZ, e a melhor evidência indica que uma dose dupla do gene DMRT1 no cromossomo Z é chave no desenvolvimento masculino (Smith et al., 2009). Isso contrasta com o sexo de mamíferos, que é definido por XY para o macho e XX para a fêmea. A inserção de um gene marcador em um local adequado no cromossomo Z (Z*, * indica uma mutação no cromossomo Z), então, um par reprodutor Z*W (fêmea) cruzado com ZZ (macho) produziria a seguinte descendência: ZW (f), Z*Z (m), ZZ* (m), ZW (f).
[00434] Um gene marcador no cromossomo Z de uma fêmea quando cruzado com um macho selvagem sempre produzirá machos portadores do gene marcador e fêmeas livres do gene marcador (Figura 1). A incorporação desse marcador na estrutura de criação da indústria de postura de ovos é mostrada na Figura
2. O gene marcador, pode ser, por exemplo, uma proteína fluorescente verde expressa constitutivamente, tal como GFP ou RFP, de modo que os embriões machos, mesmo no ponto de postura, quando o embrião é de apenas 60.000 células, na sua maioria indiferenciadas, sejam fluorescentes e claramente distinguíveis das fêmeas como uso de um sistema de detecção de fluorescência.
[00435] Existem muitos genes alternativos que também podem ser usados para fornecer outros meios de detecção do cromossomo Z* marcado e triagem dos machos. O poder dessa técnica é combinar o transgene selecionável com a exclusão nula-segregante, gerando fêmeas do tipo selvagem que produzem ovos para o consumidor - com o valor agregado de ética de produção aprimorada sem “eclosão e abate”. O agricultor também se beneficia da redução da incubação, manuseio de ovos e recuperação mais fácil de nutrientes dos machos. A incorporação de uma segunda mutação no cromossomo Z, por exemplo, uma mutação em um gene tal como um gene antiviral que aumenta a produção de vírus em um ovo aviário, facilitaria o uso de um material previamente descartado, aumentando a produtividade da indústria avícola e reduzindo os resíduos biológicos na indústria. EXEMPLO 2 - ENGENHARIA GENÉTICA DE ESPÉCIES AVIÁRIAS
[00436] Métodos para transgênese de linha germinativa em espécies aviárias geralmente têm sido baseados em duas abordagens. A primeira abordagem envolve lentivírus recombinante injetado no blastoderma (estágio X) ou embrião de pinto em estágio inicial (McGrew et al., 2004) e o segundo exige cultura ex vivo e manipulação de células germinativas primordiais (PGCs), seguida pela injeção das células de volta para um embrião receptor (Van de Lavoir et al., 2006). Ambos os métodos não são ideais para aplicações em laboratórios que gostariam de evitar métodos de lentivírus por razões de biossegurança e, por exemplo, têm exigências para evitar produtos biológicos importados usados para a cultura de PGC devido a regulamentos de conformidade com quarentena específicos da Austrália.
[00437] Portanto, um método alternativo para a produção de aves transgênicas por meio de transfecção direta in vivo de PGCs foi desenvolvido (Tyack et al., 2013). Os resultados apresentados neste artigo demonstram um procedimento simples para a transfecção in vivo de PGCs com plasmídeos de transposon miniTol2 para gerar frangos machos transgênicas em linha germinativa estável capazes de passar o transgene para a próxima geração (Figura 3). O método se baseia em uma melhoria significativa em relação a um método publicado anteriormente que demonstrou que a transfecção de PGCs pode ser alcançada injetando-se complexos plasmídeos de DNA- lipossomo na corrente sanguínea de embriões HH do estágio 14 (Watanabe et al., 1994).
[00438] Esse estudo anterior mostrou que, embora fosse possível introduzir DNA exógeno nas células germinativas gonadais através de transfecção de PGCs circulantes in vivo, o mesmo era um processo muito ineficiente e instável. Além disso, os mesmos foram incapazes de demonstrar que essa abordagem foi capaz de gerar aves transgênicas. Com o uso da tecnologia de lipofecção, essa abordagem avançou significativamente para transformar PGCs de forma estável in vivo e gerar com sucesso e eficiência descendência transgênica que expressa o gene de proteína fluorescente verde aprimorado (EGFP) transportado em um transposon. Essa abordagem usou o sistema de transposon miniTol, que é composto por dois plasmídeos; o primeiro plasmídeo continha o transgene EGFP sob o controle do promotor CAGGS e flanqueado pelas ITRs Tol2 (pMiniTol-EGFP), e o segundo plasmídeo (pTrans) codificou a transposase Tol2 sob o controle do promotor imediato-precoce do CMV para expressão em trans da transposase e transposição subsequente de miniTol-EGFP do plasmídeo para o cromossomo em PGCs transfectados. O pMiniTol-EGFP e o pTrans foram combinados e formulados com lipofectamina 2000 e injetados por via intravenosa em embriões HH do estágio 14.
[00439] A transfecção bem sucedida foi confirmada pela visualização da expressão de EGFP nas gônadas de embriões com 14 dias de idade. Quarenta por cento dos embriões restantes sobreviveram à eclosão e os pintos machos cresceram até a maturidade sexual. O sêmen foi então coletado de todos os galos e testado com o uso de PCR quanto à presença do transgene miniTol-EGFP e foi constatado que 45% dos machos tinham sêmen transgênico. Três machos com os níveis mais altos de DNA miniTol em seu sêmen foram selecionados como galos fundadores para procriar descendentes transgênicos da linha germinativa G1. Os galos selecionados foram acasalados com galinhas da mesma linhagem e um total de 419 pintos G1 foram chocados e triados quanto à expressão visual de EGFP de corpo inteiro. Um total de 5 dos 419 pintos foi positivo para a expressão de EGFP, confirmando a integração estável do miniTol-EGFP em PGCs transfectados dos galos fundadores e na transmissão de linha germinativa do transgene para a descendência G1. Dois dos três galos tiveram transmissão de linha germinativa de aproximadamente 1,5%. A análise de Southern blot de DNA genômico dos 5 pintos G1 positivos revelou que um evento de transposição única ocorreu em 4 dos 5 pintos e um evento de transposição dupla ocorreu em 1 filhote. EXEMPLO 3 - INTEGRAÇÃO ESPECÍFICA DE TRANSGENES NO
CROMOSSOMO Z
[00440] O método descrito em (Tyack et al., 2013) foi utilizado para desenvolver uma abordagem genética para a seleção de sexo in ovo para a indústria de postura de ovos, gerando-se uma galinha reprodutora com uma única inserção específica de miniTol-EGFP no cromossomo Z.
[00441] A transfecção direta de células germinativas primordiais embrionárias (PGCs) foi usada para gerar mais de 100 galinhas G1 transgênicas da linha germinativa com o uso do transposon Tol 2. O número de cópias do transgene foi analisado em galinhas G1 com o uso de Southern blot e o número de inserções de Tol2 pode variar de 1 a 7 cópias. A maioria dos pintos G1 (63%) tem apenas uma única inserção de transgene. A região do genoma em que as inserções ocorreram também foi analisada (Figura 4).
[00442] Das inserções, 49,4% estavam em introns, 1,3% em exons (regiões que seriam ativamente evitadas, a menos que visassem interromper a expressão de um gene específico ligado a uma característica de produção), 24,6% estavam em regiões repetidas, 3,9% estavam em UTRs (regiões não traduzidas) e 20,8% estavam em regiões desconhecidas (isto é, não caracterizadas na versão atual do genoma da galinha). A distribuição cromossômica das inserções revelou que 12,3% estão localizadas no cromossomo Z (Figura 4). Cromossomo 3 é 18,5%; Cromossomo 1 é 13,8% e Cromossomo 5 também é de 12,3%. Todos esses cromossomos são os maiores e, portanto, estatisticamente esperado que tenham o maior número de inserções.
[00443] A partir dos dados gerais do local de inserção do cromossomo Z, foram identificadas 8 localizações no Cromossomo Z que são adequadas para uma integração do transgene marcador. Essas localizações são mostradas nas Tabelas 4 e 5. Os mesmos estão em localizações que não afetam a viabilidade do frango e não têm impacto negativo na expressão e regulação do gene Z. Como resultado dessa análise, estudos adicionais foram focados em uma linha de galinhas em que as galinhas portam especificamente uma única inserção de Tol2 EGFP dentro de um intron de galinha Talin1 (chTLN1) no cromossomo Z. Esse estudo mostra que um marcador selecionável ligado ao Z pode ser aplicado in ovo com sucesso para identificar embriões machos e permitir sua remoção do sistema de produção no estágio inicial, com o uso da tecnologia de transposon. Esses estudos permitiram a identificação de diversas localizações adequadas do cromossomo Z que poderiam ser usadas para o desenvolvimento desta aplicação e mostraram que é possível detectar a expressão do gene marcador ligado a Z a qualquer momento, do ponto de postura até a eclosão. O marcador de seleção é uma proteína fluorescente que é inserida no cromossomo Z de aves reprodutoras fêmeas com o uso de técnicas de engenharia genética. Esse cromossomo modificado é transmitido apenas para a descendência masculina. Por outro lado, toda a descendência feminina recebe apenas o cromossomo
W do genitor feminino e, portanto, é impossível que ela porte o marcador de proteína fluorescente. As mesmas não são geneticamente modificadas e, portanto, não podem expressar o marcador fluorescente. TABELA 4 - LOCAIS DE INTEGRAÇÃO CROMOSSÔMICA DE TOL2: GENES DE CODIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (INJEÇÃO DIRETA) Posição de
L N inserção ocalização L ome do C (em ocal de do gene /ID onstrut negrito, sequência de inserçã cromossomo: do o repetição terminal o atingido a conjunto/E invertida de partir de ST/mRNA transposon) CTGCTTTGGTA c E
I CCAGGCCACCCT hrZ: NSGALT0000 ntron SEQ ID: 161 8877562 0045403
A P CTGCAAAATCT c romatas I revisão CACCGGGGATCA hrZ: e Tol2 ntron Genscan SEQ ID: 162 79634878 P chrZ.1779 eptídeo P antivir TGGACTTGATG c I revisão al Tol2 ATTCCTGTGCAG ntron hrZ: Genscan SEQ ID: 163 59776665 chrZ.1406 CTGGCATAGTT c P
I TTCCACTAAACG hrZ: revisão ntron SEQ ID: 164 37870898 Genscan chrZ.889
P CCCAGGTACCT c I ALM2 GGCTGTCAGCAG hrZ: ntron (ENSGALT00 SEQ ID: 165 65499389 000025241) TABELA 5 - LOCAIS DE INTEGRAÇÃO CROMOSSÔMICA DE TOL2: GRAMPOS DE RNAI (INJEÇÃO DIRETA E MICROINJEÇÃO) Posição de
L N inserção ocalização L ome do C (em ocal de do gene /ID onstrut negrito, sequência de inserçã cromossomo: do o repetição terminal o atingido a conjunto/E invertida de partir de ST transposon)
U B CTGACCATAAG c
I GCG ussulfa AATTAATGTTTA hrZ: ntron (ENSGALT00 no SEQ ID NO: 166 66095580 000025295)
P romotor M es CTGCTACATAT c AP1B
I atenuad GACCTCTCGGTG hrZ: (ENSGALT00 ntron os de SEQ ID NO: 167 25222900 000024188) Tol2/an tigripe TGGGATGGCAC c P hp I ACATAGGGGCAG hrZ: revisão I ntron SEQ ID NO: 168 1273684 Genscan njeção chrZ.25 direta
P romotor
P es CTGCATAGAGC c I revisão atenuad TAAGAGTCACAG hrZ: ntron Genscan os de SEQ ID NO: 169 67340009 chrZ.1602 Tol2/an tigripe hp
[00444] Os locais de integração mostrados nas Tabelas 4 e 5 foram determinados com o uso do algoritmo BLAT no Navegador de Genoma da Universidade da Califórnia, Santa Cruz (UCSC) (http://genome.ucsc.edu) no genoma de galinha (versão ICGSC Gallus_gallus-4.0/galGal4 ). EXEMPLO 4 - DETECÇÃO DE GENE MARCADOR DE
FLUORESCÊNCIA EM EMBRIÕES
[00445] A fluorescência da GFP foi analisada em vários estágios do desenvolvimento embrionário. A fluorescência foi detectada nos dias 2,5, 10 e 18 da embriogênese com o uso de uma fonte de luz de detecção de GFP com filtro para detectar a fluorescência (Figura 5). Esse método pode ser adaptado para uso com fibra ótica e microendoscopia para detectar alternativamente um embrião macho fluorescente. Certas proteínas fluorescentes também podem ser detectadas diretamente através da casca do ovo. EXEMPLO 5 - INTERRUPÇÃO DE RESPOSTA DE INTERFERON
POR ANTICORPOS DE NEUTRALIZAÇÃO AUMENTA O RENDIMENTO VIRAL IN OVO
[00446] As ORF de ChIFNα, ChIFNβ, ChIFNγ e ChIFNλ foram expressas em células competentes Top F'10 de Escherichia coli (E. coli) com o uso de um sistema de expressão pQE50 e após indução com IPTG. A proteína recombinante foi solubilizada e purificada com o uso de Ni-NTA-Agarose. As atividades biológicas de rchIFNs foram medidas com o uso de um ensaio de neutralização de vírus (Lowenthal et al., 1995). As células protegidas com rchIFNs em uma faixa de concentrações e, portanto, são biologicamente ativas (Figura 6).
[00447] Os rchIFNs foram usados como imunógenos para gerar antissoro de coelho contra a proteína recombinante homóloga. Coelhos brancos fêmeas da Nova Zelândia foram imunizados por via subcutânea com a proteína rchIFN no adjuvante de coquetel Quilaja saponaria (Quil A) até 7 vezes. Sulfato de amônio foi usado para enriquecer as proteínas séricas globulares no antissoro anti-chIFN de coelho. Os antissoros enriquecidos foram quantificados com o uso de um espectrofotômetro (NanoDrop® ND-1000, NanoDrop Technologies, EUA) antes da esterilização por filtro de 0,2 μm (Sartorius, Alemanha) dos anticorpos para injeção in ovo. A reatividade dos soros e o reconhecimento de anticorpos policlonais foram testados com o uso de uma análise ELISA indireta. Em resumo, os rchIFNs purificados foram diluídos para 5 μg/ml em tampão de revestimento em placas ELISA de 96 poços lidas a 450 nm em um leitor de placas Titertek Multiscan Plus. A análise mostrou uma reatividade dose-efeito do soro contra a proteína correspondente (Figura 6A).
[00448] Em seguida, ovos marrons Hyline (Hy-Line,
Austrália) no dia 10-11 da idade embrionária foram inoculados por meio de fluido alantoico com anticorpo e/ou vírus. Os estoques de vírus influenza (fornecidos pela CSL Pty Ltd) foram diluídos para 10-5 no diluente do vírus contendo 1% de neomicina/polimixina. As inoculações de ovos com vírus da vacina PR8 (H1N1) ou H5N1 (NIBRG-14) (CSL, Austrália) foram realizadas separadamente. Os anticorpos anti-chIFN e anti- chIL-6 purificados também foram diluídos em solução de diluente viral para inoculação em ovos a 1000 μg, 200 μg ou 20 μg por ovo. Após a inoculação, os ovos foram incubados a 35 °C por 48 h.
[00449] Os ovos foram submetidos a ooscopia após a incubação para verificar a viabilidade antes de serem refrigerados com O/N a 4 °C em preparação para a colheita. O fluido alantoico (5 ml) foi removido de cada ovo para análise adicional. Os ensaios de HA foram realizados no mesmo dia da colheita. Resumidamente, as amostras de fluido alantoico foram diluídas em série 1/25 em PBS e adicionadas em duplicata à última linha de placas de 96 poços de fundo redondo (ICN Biochemicals, EUA). Foram adicionados 50 μl de 0,5% de RBC de galinha lavado a todos os poços, batidos suavemente para misturar e deixados à RT por pelo menos 40 min e o ponto final de HA foi determinado. Os experimentos in ovo indicaram que os anticorpos anti-chIFN-α (Figura 7B) e anticorpos anti-chIFN-β (Figura 7C) em todas as concentrações não tiveram um efeito significativo no título HA do vírus PR8 ou NIBRG-14 nos ovos. No entanto, os anticorpos anti-chIFN-λ (Figura 8A) demonstraram melhorar estatisticamente o título do vírus PR8 quando administrados a 200 μg/ovo (p=0,04). O título do vírus da vacina H5N1 foi melhorado estatisticamente, até 1,5 vezes,
quando os anticorpos foram injetados tanto a 1000 μg/ovo (p=0,0045) quanto a 20 μg/ovo (p=0,0001). Da mesma forma, os anticorpos anti-chIFN-γ (Figura 8B), quando inoculados a 1000 μg/ovo (p=0,015), foram capazes de melhorar o título de HA do vírus da vacina H5N1. Além disso, os anticorpos anti-chIL-6 (Figura 8C) também aumentaram estatisticamente os títulos do vírus da vacina H5N1 nos ovos. EXEMPLO 6 - ROMPIMENTO DE INÚMEROS GENES POR SIRNA
IN VITRO AUMENTA OS TÍTULOS VIRAIS
[00450] A fim de identificar candidatos a genes com uma função antiviral, um conjunto de genes foi avaliado pelo ensaio de RNA de interferência pequena (siRNA). As células DF-1 foram transfectadas com um multiplex (smartpool) de siRNA contra cada gene antes da infecção pelo vírus da influenza aviária (AI). Os resultados mostram um aumento nos títulos virais após a KD sem nenhum efeito tóxico aparente nas células (Figura 9). Pelo menos em alguns casos, nenhum efeito aparente foi observado, mas isso pode ser devido ao fato do siRNA não ter sido administrado suficientemente cedo para produzir KD eficiente (por exemplo, considerando os dados de anticorpos anti-IL6, isso mais provavelmente explicará os dados de si-RNA de IL-6 na Figura 9). Para CNOT4, IFNAR ou MDA5, o efeito de siRNAs de smartpool individuais na viabilidade celular e silenciamento de genes foi avaliado (Figura 10). EXEMPLO 7 - REGULAÇÃO DECRESCENTE DE INÚMEROS GENES
POR SHRNA IN OVO AUMENTA TÍTULOS VIRAIS
[00451] Para análise in ovo, o siRNA foi entregue como complexo com polímero ABA-21/117Q/PF (polímero ABA- 21/117Q; sem marcas de corante PolyFluor 570) em razões molares de 4:1 de polímero para 2 nmol de siRNA em um total de 200 µl.
Os complexos foram formados em solução aquosa na presença de solução salina tamponada com fosfato (PBS). A quantidade necessária de polímero (316 µg), ressuspensa em água, foi adicionada aos tubos e misturada por vórtice. Um total de 2 nmol, equivalente a 30 µg de siControl ou 24,5 µg de siAntiIFNAR1 foi então adicionado aos tubos e a amostra foi submetida a vórtice. A complexação foi deixada continuar por 1 h a temperatura ambiente. Os complexos foram injetados diretamente no fluido corioalantoico. Após 48 horas, o vírus foi injetado como descrito anteriormente e amostras foram coletadas 24 horas após a infecção pelo vírus. Os resultados mostram um aumento do crescimento do vírus após KD de IFNAR1 (Figura 11 e Figura 12). EXEMPLO 8 - EXCLUSÃO DO GENE IFNAR1 EM GALINHAS
AUMENTA OS TÍTULOS VIRAIS IN VITRO
[00452] Para sondar essa exclusão permanente do receptor 1 do interferon (alfa, beta e ômega) de galinha, IFNAR1 (Gene ID: 395665) têm um efeito no rendimento viral; foram geradas linhas celulares KO das linhas celulares contínuas de fibroblastos de embriões de galinha (DF-1). Com o uso da nuclease Cas9 guiada por RNA do sistema microbiano de repetições palindrômicas curtas e interespaçadas regularmente agrupadas (CRISPR / Cas9), dois RNAs de guia único diferentes (sgRNA) foram projetados a fim de produzir uma quebra dupla de cadeia dupla por duplexação. O sgRNA foi clonado de acordo com (Ran et al., 2013) e os construtos correspondentes foram transfectadas para células DF-1 com o uso da codificação da exclusão de cerca de 200 bb removidos completamente do local de início da transcrição (TSS) e do exon um do precursor de IFNAR1. As células únicas foram isoladas após a classificação como uso deum classificador de células BD FACS Aria II™. A exclusão em cada clone foi identificada após a triagem de PCR genômica para distinguir entre as linhas celulares do tipo selvagem e direcionadas monoalélicas e bialélicas.
[00453] Após a transfecção, cerca de 30% dos alelos apresentaram uma exclusão de mais de 200 pb que foi confirmada pela clonagem e sequenciação do amplicom. Após a classificação de células para clones únicos, as células foram triadas por PCR de gDNA e as linhas celulares monoalélicas e bialélicas foram isoladas. Além disso, a exclusão induzida provou interromper a expressão do gene no nível transcricional de uma maneira dependente da dosagem do gene, em que as linhas celulares monoalélicas mostraram metade do nível de expressão em comparação com as do tipo selvagem e as linhas celulares bialélicas mostraram níveis próximos a zero. Esse efeito durou mesmo após o desafio com o vírus ou poli(I: C), este último, um forte indutor da resposta inata (Figura 13A, B e C).
[00454] Para avaliar o impacto da deleção na produção da vacina, a cepa de H1N1 A/WSN/1933 foi usada com multiplicidade alta e baixa de infecção (1 e 0,1 MOI, respectivamente). Com o uso dessa abordagem, o rendimento viral aumenta significativamente nas linhas celulares bialélicas após dez horas de infecção, cerca de três vezes os níveis encontrados nas linhas celulares do tipo selvagem quando medidos em um ensaio de unidades de placas de formação (PFU). O vírus isolado também mostrou TCID50s cinco vezes mais altos das linhas celulares bialélicas quando comparado à linha celular progenitora (Figura 13D). EXEMPLO 9 - TRIAGEM E IDENTIFICAÇÃO DE GENES
ANTIVIRAIS CONTRA O VÍRUS HENDRA
[00455] Diversos genes relevantes para a produção de vírus foram identificados em uma triagem de siRNA que investiga as proteínas exigidas para a infecção pelo vírus Hendra (HeV) em células HeLa humanas.
As células HeLa (ATCC CCL-2) foram mantidas em meio de crescimento (Eagles Modified Eagle Medium; EMEM) suplementado com soro fetal bovino (FBS) a 10% v/v, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM e penicilina 100 U/ml e estreptomicina 100 μg/ml (P/S; Life Technologies). As células HeLa (7 x 104) foram transfectadas reversamente com conjuntos de siRNA (GE Life Sciences) com o uso de Dharmafect-1 (GE Life Sciences) em Opti-MEM (Life Technologies) durante a noite, após o que o meio foi removido e substituído pelo meio de transfecção (meio de crescimento menos antibióticos) e as células incubadas por mais 24 horas.
O meio foi substituído ~6 horas após a transfecção (hpt) e incubado por 18 horas adicionais.
As células foram então infectadas com o Vírus Hendra (HeV) (Hendra virus/Australia/Horse/1994/Hendra). Para a dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50), foram feitas diluições de 10 vezes dos sobrenadantes da cultura de tecidos em meio em uma cultura de tecidos de 96 poços.
As placas foram incubadas por 3 dias (HeV) a 37 °C e 5% de CO2 e pontuadas quanto ao efeito citopático.
O título infeccioso foi calculado pelo método de Reed e Muench (1938). A replicação viral de genes silenciados foi comparada a um controle de siRNA não direcionado (siNT). Um aumento significativo na replicação viral foi observado com o silenciamento de diversos genes (consultar a Figura 14 e a Tabela 3). O silenciamento de ADCY7 demonstrou o maior aumento no título viral (consultar a Tabela 3). EXEMPLO 10 - SUPEREXPRESSÃO DE OVOTRANSFERRINA EM
AVES E OVOS AVIÁRIOS
[00456] As galinhas que superexpressam a ovotransferrina Gallus gallus foram produzidas geralmente com o uso dos métodos de injeção direta descritos em Tyack et al. (2013). Ovos de galinhas G1 foram injetados com Salmonella Kiambu, uma cepa de Salmonella conhecida por crescer em ovos de aves. As claras foram colhidas dos ovos infectados e o crescimento de Salmonella avaliado em placas de cultura de células. Como mostrado na Figura 15, a superexpressão da ovotransferrina aumenta as propriedades antimicrobianas da clara do ovo em comparação com os controles. Tais modificações podem ser úteis na redução de infecções por Salmonella em populações reprodutoras e ovos produzidos a partir das mesmas que podem ser usados como biorreatores. TABELA 3: SILENCIAMENTO DE GENES SELECIONADOS
AUMENTA A REPLICAÇÃO DO VÍRUS HENDRA NAS CÉLULAS HELA TCID50/ml (Vírus Hendra) M D teste gene ÉDIA .P. ANOVA unidirecional mock 9 1 N/A (controle negativo) 53524 024787 si NEG 8 7 N/A (controle negativo) 36250 01595 PLK 7 8 *** (controle positivo) 47 01 5 3 ADCY7 ** 3600 3069 AKAP10 3 1 ***
ALX1 *** 696 278
3 1 CBLN4 *** 730 820
1 1 CRK ** 10100 37444
8 2 CXorf56 ** 6600 6800
2 1 DDX10 *** 236 272
1 2 EIF2S3 *** 642 015
8 8 ESF1 ** 510 755
1 7 GBF1 * 0220 996
1 7 GC0M1 * 1190 652
1 8 GTPBP4 * 4460 530
1 1 HOXB9 * 27200 28378
4 3 IFT43 * 3300 9147
IMP4 1 1 *
ISY1 * 235 317
1 2 KIAA0586 * 642 015
1 1 KPNA3 * 5250 3740
3 1 LRRIQ1 ** 6500 2139
2 1 LUC7L ** 3700 0278
8 9 MECR ** 14 00
4 4 MRPL12 ** 3160 1593
7 9 POLR3E ** 970 247
2 1 PWP2 ** 3560 7198
4 3 RPL7A ** 620 618
1 1 SERPINH1 ** 6960 2057
3 1 SLC47A2 ** 0300 1723
SMYD2 4 3 **
STAB1 ** 1560 150 7 9 TTK ** 2300 6300 3 1 WNT3 ** 0300 1700 2 1 XP01 ** 740 544 EXEMPLO 11 - INTEGRAÇÃO DO GENE SIAT1 NAS CÉLULAS DE GALINHA AUMENTA O NÚMERO DE RESÍDUOS DE ÁCIDO SIÁLICO Α-2,6
[00457] Ovos embrionados são úteis para a produção de vacina do vírus influenza humano. No entanto, os receptores de células de ácido siálico usados para entrada e replicação viral diferem na conformação entre humanos e galinhas. Em vez dos receptores de ácido siálico α-2,6 presentes no ser humano, as galinhas exibem números superiores de receptores α-2,3. O vírus inoculado se adapta ao ambiente do ovo, reduzindo a imunogenicidade humana e, portanto, a eficácia da vacina resultante, quando administrada a seres humanos. O gene SIAT1 catalisa a produção de receptores α-2,6. Foi avaliado se o SIAT1 humano poderia ser integrado ao genoma da galinha em conjunto com um gene marcador com o uso de transposases. A atividade da transposase é tal que integrações estáveis dos genes SIAT1 e marcadores podem ocorrer em todo o genoma. Devido ao tamanho relativo do cromossomo Z, existe uma alta probabilidade de integração de transgene naquela localização e, nesse caso, isso permitiria que o gene marcador fosse usado para seleção de progênie por sexo.
[00458] As células de fibroblastos de frango DF1 foram transfectadas com o uso de Lipofectamina 2000 com um plasmídeo transposase tol2 e um plasmídeo transposon contendo um cassete acionado por promotor CAG, com eGFP isolado ou com eGFP, eGFP, um peptídeo ribossômico T2A e SIAT1. Após a transfecção (10 dias), as populações DF1 positivas para GFP foram classificadas.
[00459] As células na confluência de 80 a 90% foram incubadas com lectinas biotiniladas (Vector Laboratories, lectina MAL II para coloração de resíduos α2,3, lectina SNA para coloração de resíduos α2,6), em seguida incubadas com estreptavidina-fitoeritrina conjugadas e fixadas em paraformaldeído a 4% para imageamento sob fluorescência. Utilizou-se PBS frio/BSA a 1% para lavar as células entre cada passo de incubação.
[00460] Para analisar as células por FACS, tripsina-EDTA a 0,25% foi utilizada para separar suavemente as células, e 1 x 106 células foram aliquotadas em poços de uma placa de 96 poços. As células foram coradas como acima, sem fixação, e então passadas através de um classificador de células FACS Aria II.
[00461] A transfecção de células DF1 com um transposon para integrar um cassete CAG-eGFP resultou em expressão forte e estável de eGFP. O mesmo cassete CAG-eGFP (GFP) foi então alterado para incluir a sequência de codificação para SIAT1 humano, separado da sequência eGFP por um peptídeo 2A. As células DF1 transfectadas com o cassete CAG-eGFP-2A-SIAT1 (GFP-SIAT) expressaram eGFP em níveis semelhantes às células transfectadas com CAG-eGFP.
[00462] A coloração de ácido siálico na superfície das populações de células DF1 classificadas com eGFP revelou a presença de resíduos de ácido siálico α-2,3 nas células DF1 transfectadas com GFP e GFP-SIAT, mas a presença de resíduos de ácido siálico α-2,6 apenas em DF1s transfectados com GFP- SIAT (Figuras 16A e 16B). A quantificação de resíduos α-2,6 presentes nas células DF1 por análise FACS mostrou um aumento de 3 vezes na coloração média de fluorescência entre células transfectadas com GFP (x̅ = 1.200 rfu) e GFP-SIAT (x̅ = 3.800 rfu) (Figura 16C).
[00463] Portanto, inserindo SIAT1 em conjunto com um gene marcador de seleção de sexo, os ovos selecionados por sexo poderiam ser usados para a produção de vacinas em um processo que evita a adaptação dos ovos.
[00464] Será reconhecido por pessoas versadas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas à invenção, como mostrado nas modalidades específicas, sem que se afaste do espírito ou escopo da invenção, conforme descrito em termos gerais. As presentes modalidades devem, portanto, ser consideradas em todos os aspectos como sendo ilustrativas e não restritivas.
[00465] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório Australiano no 2017902123, intitulado "Trait selection in avians", depositado em 31 de maio de 2017. Todo o conteúdo desse pedido é incorporado ao presente documento a título de referência.
[00466] Todas as publicações discutidas e/ou referenciadas no presente documento são incorporadas ao mesmo em sua totalidade.
[00467] Qualquer discussão de documentos, ações,
materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo é apenas com o propósito de fornecer um contexto para a presente invenção. Esses não devem ser tomados como uma admissão de que todas ou algumas dessas matérias fazem parte da técnica anterior ou eram conhecimento geral comum no campo relevante para a presente invenção uma vez que os mesmos existiam antes da data de prioridade de cada reivindicação desse pedido.
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153.

Claims (41)

REIVINDICAÇÕES
1. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, caracterizado por compreender: i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável no ovo; e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética.
2. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas modificações genéticas serem herdadas maternalmente.
3. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo marcador ser detectável sem interromper a integridade do invólucro do ovo.
4. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo marcador ser detectável dentro de dois dias do ponto de postura sem interromper a integridade da casca do ovo.
5. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo marcador ser uma proteína fluorescente e luminescente, uma proteína auditiva (proteína vibratória), uma proteína sônica, um marcador metabólico ou uma proteína quelante seletiva.
6. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela proteína fluorescente ser selecionada dentre: Proteína fluorescente verde (GFP), Proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP), Emerald, Superfolder GFP, Verde Azami, mWasabi, TagGFP, TurboGFP,
mNeonGreen, mUKG, AcGFP, ZsGreen, Cloverm Sapphire, T- Sapphire, Proteína fluorescente azul aprimorada (EBFP), EBFP2, Azurite, TagBFP, mTagBFP, mKalama1, proteína fluorescente ciano (CFP), mCFP, proteína fluorescente ciano aprimorada (ECFP), mECFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, CyPet, AmCyan1, Midori-Ishi Cyan, TagCFP, mTFP1 (Teal), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente amarela aprimorada (EYFP), superproteína fluorescente amarela (SYFP), Topaz, Venus, Citrine, mCitrine, YPet, TagYFP, TurboYFP, PhiYFP, ZsYellow1, mBanana, Kusabira Orange, Kusabira Orange2, mOrange, mOrange2, dTomato, dTomato-Tandem, Proteína fluorescente vermelha (RFP), TurboRFP, TurboFP602, TurboFP635, proteína fluorescente Tag ref (RFP), TagRFP-T, DsRed, DsRed2, DsRed-Express (T1), DsRed-Monomer, mTangerine, mKeima-Red, mRuby, mRuby2, mApple, mStrawberry, AsRed2, mRFP1, JRed, mCherry, mKate2, mKate (TagFP635), HcRed1, mRaspberry, dKeima-Tandem, HcRed-Tandem, mPlum, mNeptune, NirFP, Sirius, TagRFP657, AQ143, Kaede, KikGR1, PX-CFP2, mEos2, IrisFP, mEOS3.2, PSmOrange, PAGFP, Dronpa, Aloficocianina, GFPuv, R-fitoeritrina (RPE), Clorofila Peridinina (PerCP), P3, Katusha, B-fitoeritrina (BPE), mKO, J-Red.
7. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pela primeira e/ou pela segunda modificações genéticas serem transgênicas.
8. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelas modificações genéticas serem em uma construção genética exógena única.
9. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela característica de produção ser selecionada a partir de: produção de vírus, produção de proteínas recombinantes, massa muscular, conteúdo nutricional e fertilidade.
10. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela característica de produção ser produção de vírus e a segunda modificação genética reduzir a expressão de um gene e/ou proteína antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética e em que o ovo tem capacidade para produzir mais vírus do que o ovo isogênico.
11. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo gene e/ou proteína antiviral serem selecionados dentre: IFNAR1, IL-6, CNOT4, MDA5, IFNα, IFNβ, IFNγ, IFNλ, IFNAR2, UBE1DC1, GNAZ, CDX2, LOC100859339, IL28RA, ZFPM2, TRIM50, DNASEIL2, PHF21A, GAPDH, BACE2, HSBP1, PCGF5, IL-1RA, DDI2, CAPN13, UBA5, NPR2, IFIH1, LAMP1, EFR3A, ARRDC3, ABI1, SCAF4, GADL1, ZKSCAN7, PLVAP, RPUSD1, CYYR1, UPF3A, ASAP1, NXF1, TOP1MT, RALGAPB, SUCLA2, GORASP2, NSUN6, CELF1, ANGPTL7, SLC26A6, WBSCR27, SIL1, HTT, MYOC, TM9SF2, CEP250, FAM188A, BCAR3, GOLPH3L, HN1, ADCY7, AKAP10, ALX1, CBLN4, CRK, CXORF56, DDX10, EIF2S3, ESF1, GBF1, GCOM1, GTPBP4, HOXB9, IFT43, IMP4, ISY1, KIAA0586, KPNA3, LRRIQ1, LUC7L, MECR, MRPL12, POLR3E, PWP2, RPL7A, SERPINH1, SLC47A2, SMYD2, STAB1, TTK, WNT3, IFNGR1, IFNGR2, IL-10R2, IFNκ, IFNΩ, IL-1RB e XPO1.
12. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela característica de produção ser produção de vírus e a segunda modificação genética aumentar a expressão do gene e/ou proteína SIAT1 no ovo, em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética e em que os vírus produzidos pelo ovo aumentaram a imunogenicidade em comparação com vírus produzidos pelo ovo isogênico.
13. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela característica de produção ser a produção de vírus e a segunda modificação genética aumentar a quantidade de ácido siálico ligado a α- 2,6 e diminuir a quantidade de ácido siálico ligado a α-2,3 no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética, e em que os vírus produzidos pelo ovo têm imunogenicidade aumentada em comparação com vírus produzidos pelo ovo isogênico.
14. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela característica de produção ser a produção de vírus e a segunda modificação genética aumentar a expressão de uma proteína antimicrobiana no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética, e em que o ovo tem capacidade para produzir mais vírus do que o ovo isogênico.
15. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela ave ser uma galinha.
16. OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por ser macho.
17. AVE TRANSGÊNICA, caracterizada por compreender: i) uma primeira modificação genética no cromossomo
Z que codifica um marcador detectável em um ovo produzido pelo aviário; e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética.
18. AVE TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por ser fêmea.
19. AVE TRANSGÊNICA, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por ser macho.
20. AVE TRANSGÊNICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19, caracterizada por ter um ou mais dos recursos definidos em qualquer uma das reivindicações 2 a
15.
21. OVO OU PROGÊNIE AVIÁRIA, caracterizado por ser produzido pelo aviário transgênico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 20.
22. OVO AVIÁRIO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por ser um ovo macho que tem produção de vírus aumentada em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética.
23. MÉTODO PARA DETECTAR UM OVO AVIÁRIO MACHO, caracterizado por compreender: i) obter um ovo aviário produzido pelo cruzamento de uma fêmea aviária transgênica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 18 ou 20, com um aviário macho que carece da primeira modificação genética, e ii) triar o ovo pelo marcador, em que o ovo é macho se tiver o marcador.
24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23,
caracterizado pelo macho na etapa i) não ser transgênico.
25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelo marcador ser uma proteína fluorescente e o marcador ser triado através da exposição do ovo a um primeiro comprimento de onda de luz e avaliar a fluorescência em um segundo comprimento de onda de luz.
26. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo método ser usado para classificação de alto volume por gênero de ovos aviários.
27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado por ser automatizado.
28. MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO caracterizado por compreender o cruzamento de uma ave fêmea conforme definida em qualquer uma das reivindicações 17 a 19 com uma ave macho.
29. MÉTODO PARA REPLICAR UM VÍRUS, caracterizado por compreender; 1) obter um ovo aviário conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, 2) inocular o ovo com o vírus, e 3) incubar o ovo por um período de tempo predeterminado para replicar o vírus.
30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pela segunda modificação genética reduzir a expressão de um gene antiviral no ovo em comparação com um ovo isogênico que carece da segunda modificação genética.
31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 ou 30, caracterizado por compreender adicionalmente colheita do vírus replicado ou partículas do mesmo a partir do ovo.
32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pela colheita compreender a obtenção do fluido alantoico a partir do ovo.
33. VÍRUS PRODUZIDOS PELO USO DE OVO AVIÁRIO caracterizado por ser conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, e/ou por usar o método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 32.
34. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA caracterizado por compreender; 1) replicar um vírus pelo uso do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 32, 2) colher os vírus replicados ou partículas do mesmo a partir do ovo, e 3) preparar uma composição de vacina a partir do vírus colhido.
35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pela etapa 2) ou pela etapa 3) compreenderem inativar o vírus.
36. COMPOSIÇÃO DA VACINA PRODUZIDA PELO USO DO MÉTODO caracterizada por ser de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 ou 35.
37. MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, OU UMA AVE PRODUZIDA PELO OVO, caracterizado por compreender i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou aviário que carece da segunda modificação genética, sendo que o método compreende o cruzamento de uma ave macho, que é heterozigoto para as modificações genéticas, com uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z para produzir um ovo ou ave macho a partir do mesmo que seja homozigoto para as modificações genéticas.
38. MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, OU UMA AVE PRODUZIDA PELO OVO, caracterizado por compreender i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética, sendo que o método compreende o cruzamento de uma ave macho, que é homozigoto para as modificações genéticas, com uma ave fêmea que carece das modificações genéticas para produzir um ovo ou ave fêmea a partir do mesmo que compreenda as modificações genéticas no cromossomo Z.
39. MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, OU UMA AVE PRODUZIDA PELO OVO, caracterizado por compreender i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética, sendo que o método compreende o cruzamento de uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z com uma ave macho que carece da modificações genéticas para produzir um ovo ou ave macho a partir do mesmo que seja heterozigoto para as modificações genéticas, em que um ovo ou ave fêmea do mesmo, produzido a partir do cruzamento, carece das modificações genéticas.
40. MÉTODO PARA PRODUZIR UM OVO AVIÁRIO TRANSGÊNICO, OU UMA AVE PRODUZIDA PELO OVO, caracterizado por compreender i) uma primeira modificação genética em um cromossomo Z que codifica um marcador detectável em um ovo aviário, e ii) uma segunda modificação genética no mesmo cromossomo Z que modifica uma característica de produção no ovo, e/ou ave produzida pelo ovo, em comparação com um ovo isogênico ou ave que carece da segunda modificação genética, 1) cruzar uma ave macho que é heterozigoto para as modificações genéticas com uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z para produzir uma ave macho que seja heterozigoto para as modificações genéticas, 2) cruzar a ave macho produzida pela etapa 1) com uma ave fêmea que carece das modificações genéticas para produzir uma ave fêmea que compreende as modificações genéticas no cromossomo Z, e 3) cruzar a ave fêmea produzida pela etapa 2) com uma ave macho que carece das modificações genéticas para produzir um ovo ou ave macho a partir do mesmo que seja heterozigoto para as modificações genéticas, em que um ovo ou ave fêmea a partir do mesmo, produzido a partir do cruzamento, carece das modificações genéticas.
41. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 ou 40, caracterizado pelas aves fêmeas produzidas pelo método serem usadas para a indústria de ovos e os ovos machos produzidos pelo método serem usados na indústria de vacinas.
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