JP2003512823A

JP2003512823A - 組換えアデノウイルスおよびアデノウイルスライブラリーの調製

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Publication number: JP2003512823A
Application number: JP2001528614A
Authority: JP
Inventors: ロベール，ジヤン−ジヤツク
Original assignee: アバンテイス・フアルマ・エス・アー
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2003-04-08
Anticipated expiration: 2020-10-05
Also published as: AU785431B2; DE60033679T2; HU228933B1; BR0014489A; US20090149349A1; KR100928105B1; CA2383225A1; JP5260815B2; KR20020057969A; IL148493A; CN1384885B; BR0014489B1; AU7794700A; US8263395B2; DE60033679D1; EP1224310A1; WO2001025463A1; FR2799472A1; NZ518763A; CZ20021215A3

Abstract

(57)【要約】本発明は組換えアデノウイルスを調製するための組成物および方法に関する。得られるアデノウイルスは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏもしくはｉｎｖｉｖｏまたは機能的ゲノム学において、遺伝子を細胞中にトランスファーさせおよび／または発現させるために用いることができる。より詳細には、本発明はアデノウイルスライブラリーを作製する効率的な方法および前記ライブラリーの機能的ゲノム学における使用に関する。本発明はまた、前記アデノウイルスを構築するのに用いるプラスミドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、組換えアデノウイルスを調製するための組成物および方法に関する
。本発明により製造されるアデノウイルスは、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖ
ｏもしくはｉｎｖｉｖｏまたは機能的ゲノム学において、遺伝子を細胞中に転
移させ、および／または細胞中で発現させるために用いることができる。特に、
本発明はアデノウイルスライブラリーを製造するのに有効な方法およびそのライ
ブラリーの機能的ゲノム学における使用に関する。本発明はまた、これらのアデ
ノウイルスを構築するのに用いるプラスミド、これらのプラスミドを保有する細
胞、これらのプラスミド、細胞および／またはアデノウイルスライブラリーを含
むキットに関する。

【０００２】アデノウイルスは、遺伝子を細胞中に転移させ、および／または細胞中で発現
させるのに有利なある種の特徴を有する。特にそれらは比較的広い宿主スペクト
ルを有し、静止期の細胞に感染することが可能であり、実質的にクローニングが
可能な一方で感染した細胞のゲノム中に組み込まれない。さらに、アデノウイル
スは今日までヒトについては重大な疾病と関連がなく、このため、検討対象の遺
伝子を、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで、様々なヒトの組織、例えば
、筋肉（Ｒａｇｏｔ他、Ｎａｔｕｒｅ３６１（１９９３）６４７）、肝臓（Ｊ
ａｆｆｅ他、Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ１（１９９２）３７２）、神経
系（Ａｋｌｉ他、Ｎａｔｕｒｅｇｅｎｅｔｉｃｓ３（１９９３）２２４）、
腫瘍、平滑筋等に転移させるのに用いられてきた。これらの同じ性質によって、
アデノウイルスベクターは、ゲノム学から得られた知見を利用する選択手段とな
っている。

【０００３】機能的ゲノム学は、様々な生物のゲノムおよびゲノムから得られた知見を、そ
れを機能として発現させる目的で利用することに関する科学の領域として理解さ
れている。この特徴から見ると、外来性の配列を運ぶアデノウイルスベクターは
、様々な実験モデルにおいて、その配列の機能を決定するのに用いることができ
る。特に、アデノウイルスベクターは治療標的（医薬産業における意味であり、
または医薬産業において理解される意味）をｉｎｖｉｔｒｏの細胞モデルまた
は動物生体内（ｉｎｖｉｖｏ）において研究するのに用いることができる。こ
の配列が判明し特徴付けされると、アデノウイルスベクターを、この標的を機能
的に有効化するために用いることができる。より広く言えば、機能的ゲノム学と
称される分野において、アデノウイルス遺伝子を転移させるベクターは、真核生
物の実験モデルに関し、予めその配列の性質や機能について何らかの情報を持っ
ていなくても、その核酸配列の機能を同定する（例えば、多数の配列を全体とし
て研究しなければならないような状況が含まれる）ための強力な道具となる。

【０００４】しかし、アデノウイルスの産業および治療への利用、並びに機能的ゲノム学へ
の利用は、特に、それらの組換えウイルスを作成する現在の方法により未だ限定
されたものとなっている。特に、現在利用されている方法では、異種核酸を含む
アデノウイルスの集団を単純かつ迅速に、特に多数の異種核酸を研究しなければ
ならない場合（機能的ゲノム学ではこうしたケースがある）にそれらをクローン
として作成することができない。本発明は、具体的には、これらの問題に解決策
を提供するものである。したがって、本発明は組換えアデノウイルスを構築する
新規な道具および方法を記載する。特に本発明は、遺伝子コンストラクト（プラ
スミド）、細胞およびそれにより高品質のアデノウイルスの迅速な製造を可能と
するプロトコールを記載する。より特定して言えば、本発明は、多数の異種核酸
を含むアデノウイルスライブラリー作成を可能にする。

【０００５】本発明の一態様は、核酸またはタンパク質の生物学的機能を決定するために組
換えアデノウイルスを用いることにある。

【０００６】本発明の別の態様は、機能および／または構造が未知の核酸を分析する目的で
発現ライブラリーを構築するためにアデノウイルスを使用することにある。

【０００７】本発明はさらにアデノウイルス発現ライブラリーに関する。これは任意のＤＮ
Ａライブラリーに由来する核酸インサートを含むアデノウイルスの集団である。

【０００８】本発明はまた、これらのアデノウイルスを製造するための方法および道具、特
に、有利にも、核酸ライブラリーから同時に組換えアデノウイルスを構築する方
法および道具に関する。

【０００９】アデノウイルスは、約３６ｋｂのサイズを有する線状の２本鎖ＤＮＡウイルス
である。そのゲノムは、特に、逆方向反復配列（ＩＴＲ）を各端に有し、カプシ
ド形成配列（Ｐｓｉ）、初期遺伝子および後期遺伝子を含む。主要な初期遺伝子
はＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域に含まれる。これらの中で、Ｅ１領域に含ま
れる遺伝子はウイルスの増殖のために必要である。また、Ｅ４領域もアデノウイ
ルスゲノムの複製調節において重要である。主要な後期遺伝子はＬ１からＬ５領
域に含まれている。アデノウイルスＡｄ５のゲノムは、完全に配列が決定されて
おり、データベースでの利用が可能である（特にＧｅｎｂａｎｋＭ７３２６０
参照）。同様に、ヒトまたは他の動物のアデノウイルスゲノム（Ａｄ２、Ａｄ７
、Ａｄ１２、ＣＡＶ−２等）が全体ではないにせよ、その一部が配列決定されて
いる。

【００１０】さらに、上で指摘した通り、アデノウイルスは、遺伝子をｉｎｖｉｖｏで転
移させるのに用いられてきた。この目的のために、種々の遺伝子（β−ｇａｌ、
ＯＴＣ、α−１ＡＴ、部位カイン、酵素、成長因子等）を組み込んだ様々なアデ
ノウイルス由来のベクターが調製されてきた。これらのコンストラクトのいずれ
においても、アデノウイルスのゲノムは、自律的な複製および／または増殖がで
きないように、遺伝子転移により変更されている。したがって、従来技術に記載
されているコンストラクトは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、ｐＩＸ、ＩＶａ２等か
ら選択される１つまたは複数の領域が削除されたアデノウイルスである。具体的
には、例えば、Ｅ１領域を欠失したもの、Ｅ１およびＥ３領域を欠失したもの、
Ｅ１およびＥ４領域を欠失したもの、Ｅ１、Ｅ４およびＥ３領域を欠失したもの
、あるいは、アデノウイルスのコード領域のすべてを欠失したもの（ガットレス
（ｇｕｔｌｅｓｓ）ベクター）がある。こうしたベクターは一般に細胞に転移さ
せるか研究しようとする異種核酸を含む。この核酸は、削除領域を置換したりあ
るいはその中に組み込まれることによって組換えゲノムの様々な部位に挿入され
る。アデノウイルスベクターの例は、特にＬｅｖｒｅｒｏ他、Ｇｅｎｅ１０１
（１９９１）１９５；Ｇｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ他、Ｇｅｎｅ５０（１９
８６）１６１、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／２８
９３８、ＷＯ９５／３４６７１、ＷＯ９６／１００８８、ＷＯ９５／０２６９７
、ＷＯ９５／２７０７１等に記載されており、これらの刊行物は参照により本願
に組み込まれる。

【００１１】組換えアデノウイルスは、組換えウイルスのＤＮＡをコンピテントなカプシド
形成細胞系にトランスフェクトすることにより製造される。トランスフェクショ
ンは、組換えウイルスの全ゲノムを運ぶコンストラクトが利用できる場合は単一
トランスフェクションでよいが、より多くの場合、複数のＤＮＡ断片の同時トラ
ンスフェクションを行う。これは組換えウイルスゲノムの異なる複数の部分を供
給する。この場合、プロセスは異なるコンストラクト間での相同的組換えを１つ
または複数ステップ含み、これらのステップをカプシド形成細胞系中で行うこと
により、組換えウイルスのＤＮＡを生成する。したがって、これらの方法のいず
れかを実施するためには、製造しようとする組換えアデノウイルスのゲノムの全
部または一部を運ぶ適当なコンストラクトを入手可能である必要がある。

【００１２】従来技術は、こうしたコンストラクトをｉｎｖｉｔｒｏで調製するための様
々な方法を記載している。最も一般的に用いられてきた手法は、ウイルスＤＮＡ
を分離し、次いで、分子生物学で慣用されている方法（消化、ライゲーション等
）を用いて、それをｉｎｖｉｔｒｏで変更するものである。次いで、得られた
コンストラクトを精製し、カプシド形成細胞系をトランスフェクトするのに用い
る。しかし、この手法では、各コンストラクトまたは組換えウイルスのＤＮＡの
操作のために、ウイルスのストックを製造しウイルスＤＮＡを精製するステップ
が必要であり、従って、様々なストックやライブラリーを製造するには適してい
ない。これらの欠点を解決するため、原核生物のプラスミドを用いてウイルスＤ
ＮＡを調製しトランスフェクションに使用できるようにすることが提案されてい
る。特に、Ｂｅｔｔ他（ＰＮＡＳ９１（１９９４）８８０２）は大腸菌中で複
製され、変更されたアデノウイルスゲノムを含むプラスミド（プラスミドｐＢＨ
Ｇ１０）の構築について記載している。より正確には、このプラスミドは、Ｅ１
、Ｅ３およびＰｓｉ領域の削除されたアデノウイルスゲノムを運ぶもので、ＩＴ
Ｒ配列を互いに結合することにより環化され、プラスミドｐＢＲ３２２の一部
を含む（これは、アデノウイルスゲノムの１８８〜１３３９領域内に挿入されて
いる）。このプラスミドは大腸菌中で複製され検討対象の遺伝子中に挿入操作で
きるが、依然、問題点がある。すなわち、これを用いてウイルスを製造するため
には、特に、連続ＩＴＲを線状化し、組換えを行うことが必要となるが、この結
果、コンストラクトのせいで、原核細胞プラスミドに由来する領域が組換えアデ
ノウイルスゲノム中に組み込まれてしまう。これと同タイプで同様な問題点のあ
る他のプラスミドが、例えば、Ｇｒａｈａｍ（ＥＭＢＯＪ．３（１２）（１９８
４）２９１７）に記載されている。もっと最近では、新しい方法、特に２種のプ
ラスミドの相同的組換えに基づき、酵母人工染色体（ＹＡＣｓ、Ｋｅｔｎｅｒ他
、１９９４）あるいは細菌（Ｃｈａｒｔｉｅｒ他、１９９６、Ｃｒｏｕｚｅｔ他
、１９９７、Ｈｅ他、１９９８）を用いる方法が記載されている。これらの方法
は、以前の方法と比べ効率的ではあるが、より複雑である。ＹＡＣ系は、酵母を
培養し操作する必要がある（Ｋｅｔｎｅｒ他、１９９４）。大腸菌系は、いくつ
かの連続するステップ（その中のいくつか、具体的にはエレクトロトランスフォ
ーメーションおよびショ糖選択は重要である）を含む。特に、注意すべきは、こ
れらのいずれのケースでも、感染させるアデノウイルスゲノムを運ぶ最終的なク
ローナル組換えベクターを選択するために、クローンをスクリーニングする１つ
または複数のステップが必要であるという点である。これらの方法は、治療効果
を有する所与の遺伝子を運ぶアデノウイルスのストックの効率的かつクローンと
しての製造を可能にするとしても、組換えアデノウイルスを高収率で、特に異な
る核酸を組み込んだ多数の組換えアデノウイルスを同時に製造するために用いる
には満足の行くものではない。

【００１３】これらのウイルスを製造するために必要な操作は複雑でステップ数が多いため
、これらのアデノウイルスベクターを遺伝子の分析および転移に用いる障害とな
っている。したがって、従来技術では、組換えアデノウイルスゲノムを調製する
ためにｉｎｖｉｔｒｏでの操作および増幅が容易な利用可能な適当なプラスミ
ドが明らかに必要である。また、このようにして製造されたゲノムは、（ｉ）免
疫応答を誘導し、（ｉｉ）抵抗性タンパク質をコードし、（ｉｉｉ）ウイルスの
ベクターとしての能力を低減する可能性のあるプラスミドに由来する領域を実質
的に含まないことも重要である。さらに、多数の組換えアデノウイルスをクロー
ンとして迅速かつより簡単に生成することを可能にする方法が求められている。

【００１４】本発明は、特に、これらの問題点の解決を可能とする。すなわち、本発明は、
こうした条件に適った組換えアデノウイルスを製造するための新規な組成物およ
び方法を記載する。特に本発明の組成物および方法は、治療目的または薬学的標
的を探索するために用い得る組換えアデノウイルスをクローンとして迅速かつ効
率的に、また、高収率で製造することを可能にする。

【００１５】本発明は、特に、基本的に２種のプラスミド（特に原核生物のプラスミド）を
用いるもので、この２種のプラスミドから、宿主細胞（特に原核細胞）中での１
回の相同的組換えステップにより、完全なアデノウイルスゲノムを含み、また、
切り出しにより容易に組換えアデノウイルスを製造できるプラスミドを生成でき
る。

【００１６】したがって、概括的に言えば、本発明の方法は、以下のステップを含む。

【００１７】第１ステップとして、少なくとも１つの異種核酸を含む第１の切断型（ｔｒｕ
ｎｃａｔｅｄ）組換えアデノウイルスゲノムを含む第１のプラスミド（「シャト
ル」プラスミドと言う）、好ましくは原核生物プラスミドを構築する（クローニ
ングステップ）。この第１の切断型ゲノムは、好ましくは、ＩＴＲ、異種核酸、
アデノウイルス相同性領域、また、適宜、カプシド形成配列を含む。

【００１８】第２のステップでは、第１のプラスミドを、第２の切断型組換えアデノウイル
スゲノムを含む第２のプラスミド（「親」プラスミドと言う）に接触させる（組
換えステップ）。ここで、第２の切断型組換えアデノウイルスゲノムは、第１の
ゲノムと相補的であり、相同的組換えにより、完全な組換えアデノウイルスゲノ
ムを含む最終プラスミドを製造し得るものである。第２の切断型アデノウイルス
ゲノムは、好ましくは、少なくとも１つのＩＴＲ、アデノウイルス相同性領域（
第１のゲノム中に存在するのと同一のもの）、およびカプシド形成配列（後者は
第１のゲノムに存在しない場合）を含む。この第２の切断型アデノウイルスゲノ
ムは、検討対象とする別の核酸を含むこともできる。

【００１９】第３ステップでは、完全な組換えアデノウイルスゲノムを、最終プラスミドか
ら切り出してカプシド形成細胞系に導入し、完全な組換えアデノウイルスゲノム
を組み込んだ組換えアデノウイルスを製造する（アデノウイルス製造ステップ）
。

【００２０】第４ステップは、必要に応じて行われ、組換えアデノウイルスを用いて以下の
ものに感染させる。

【００２１】核酸の性質を分析する目的では、細胞を含む生物学的材料（機能分析ステップ
）、異種核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを製
造する目的では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏの細胞培養物、異種核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをｉ
ｎｖｉｖｏで製造する目的では、細胞、組織、器官または生物。

【００２２】このように、本発明によれば、１つのステップ（相同的組換えステップ）で、
（完全な）機能性アデノウイルスゲノムを含み、１種または２種以上の酵素で切
り出し可能な原核細胞プラスミドを得ることが可能である。この最終プラスミド
は、アデノウイルス配列（最低限、ＩＴＲおよびカプシド形成配列）を含み検討
対象とする異種核酸を含む第１のプラスミド（シャトルプラスミド）を、相補的
アデノウイルス配列（最低限、第２のＩＴＲ配列）を含む第２のプラスミド（親
プラスミド）に、これら２種のプラスミドに共通な配列（アデノウイルス相同性
配列）を介した相同的組換えイベントにより、組み込むことによって得られる。
このコアギュレートを介する相同的組換えは機能性アデノウイルスゲノムをもた
らす。

【００２３】本発明方法の利点の１つは、その単純さにある。つまり、多数のシャトルプラ
スミドを並行して用いることを可能にする点である。このように、本発明の方法
の第１ステップは、核酸ライブラリーをシャトルプラスミド中にクローニングし
、これにより最終プラスミドを生成することを含み、この最終プラスミドは、機
能的なアデノウイルスゲノムを含み、その構造はそれが含まれるインサートから
離れて同一であるという利点を有する。このクローニングステップは、好ましく
は、それぞれのクローンを分離して、例えば、マイクロタイトレーションプレー
トのウエル上にて行われる。さらに、このステップは自動化することもできる。
得られたシャトルプラスミドライブラリーは、次いで、ライブラリー中のそれぞ
れのシャトルプラスミドを親プラスミドと接触させることで、組換えステップに
用いられる。この方法によれば、同時並行でそれぞれ異種核酸を含む多数の組換
えアデノウイルス（すなわち、アデノウイルス発現ライブラリー）の製造ができ
る。次いで、このライブラリーを生物材料に対し用いて試験（ステップ４）すれ
ば、探求している生物学的活性を示すクローンの識別ができる。

【００２４】以下、詳細に説明するように、本発明は、いずれのタイプのアデノウイルスお
よび原核細胞についても用いることが可能であり、種々の核酸ライブラリーに基
づいて実施できる。

【００２５】定義・組換えアデノウイルス：組換えアデノウイルスとは、本発明の意味において
は、ゲノムが塩基の削除および／または挿入および／または置換により変更され
た任意のアデノウイルスを指す。したがって、組換えアデノウイルスは、より特
定して言えば、概ね感染性を有し組換えアデノウイルスゲノムを含むアデノウイ
ルス粒子である。ゲノムに加えられた変更によって、組換えウイルスは、複製欠
陥性、すなわち、細胞中で自律的な複製および／または増殖ができなくなる場合
がある。組換えアデノウイルスは、任意のセロタイプ（血清型）、特にヒト（例
えば、Ａｄ５、Ａｄ２、Ａｄ７、Ａｄ１２等のようなタイプＣアデノウイルス）
または動物（例えばＣＡＶ−２のようなイヌアデノウイルス）アデノウイルスか
ら調製できる・アデノウイルスゲノム：「アデノウイルスゲノム」という語は、アデノウイ
ルスもしくはその配列またはそのコピーもしくはレプリカ（複製）に存在するＤ
ＮＡ分子を指す。組換えアデノウイルスゲノムは、その配列がアデノウイルスゲ
ノムに対応する配列であるが、１または２以上の変更を含む核酸である。変更は
、例えば、削除（例えば、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４等の領域の全部または一部の
削除）、挿入（例えば、１つまたは複数の異種核酸の挿入のような）またはコド
ン使用の変更を含む。

【００２６】本発明の組成物および方法により生成する組換えアデノウイルスゲノムは、「
完全な」または「機能性」ゲノムである、つまり、選択されたカプシド形成細胞
系内においてウイルスストックを製造するために、組換えやライゲーションによ
り他の領域を加える必要がないという点で有利である。したがって、こうした「
完全な」ゲノムは、有利には、少なくとも１つのカプシド形成配列および異種核
酸を有し、ここで、カプシド形成配列と異種核酸はともにそれぞれの端部がＩＴ
Ｒ配列と隣接（ｆｌａｎｋｅｄ）している。本発明によるプラスミドの他の有利
な特徴は、得られた完全な組換えアデノウイルスゲノムが原核生物プラスミド領
域によって中断されていないという事実によるものである。この理由のために、
製造されたゲノムは、プラスミド領域を含む（このことによる不利益は上述の通
りである）ことが実質的にない。しかも、本発明によるプラスミドでは、アデノ
ウイルスゲノムのＩＴＲは、連続的ではなく、このため、組換えウイルスを製造
するのに直接用い得る完全かつ線状なウイルスゲノムを得ることができる。

【００２７】組換えアデノウイルスゲノムは、好ましくは、少なくともＩＴＲ配列およびカ
プシド形成配列を含む。逆方向反復配列（ＩＴＲ）はアデノウイルスの複製起点
をなす。これは、ウイルスゲノムの端部に位置し、そこから、当業者には知られ
た慣用の分子生物学的手法を用いて容易に分離することができる。ヒトアデノウ
イルスのＩＴＲ配列（特にセロタイプＡｄ２およびＡｄ５のもの）のヌクレオチ
ド配列は文献に記載があり、イヌアデノウイルス（特にＣＡＶ１およびＣＡＶ２
）のそれも同様である。例えば、Ａｄ５アデノウイルスにおいては、左側ＩＴＲ
配列はゲノムのヌクレオチド１から１０３を含む領域に対応する。

【００２８】カプシド形成配列（Ｐｓｉ配列とも言う）はウイルスゲノムのカプシド形成に
必要である。野生型のアデノウイルスのゲノムでは、これは左側ＩＴＲとＥ１領
域との間に位置する。これは、慣用の分子生物学的手法を用いて単離または人工
的に合成することができる。ヒトアデノウイルスのカプシド形成配列（特にセロ
タイプＡｄ２およびＡｄ５のもの）のヌクレオチド配列は文献に記載があり、イ
ヌアデノウイルス（特にＣＡＶ１およびＣＡＶ２）のそれも同様である。例えば
、Ａｄ５アデノウイルスにおいては、機能性カプシド形成配列はゲノムのヌクレ
オチド１９４〜３５８間に存在する。

【００２９】本発明の１つの好適な実施形態においては、アデノウイルスゲノムはＥ１領域
の全部または一部を欠失している。これはＥ１領域が、ウイルス複製のために不
可欠であり、その不活性化は複製欠陥性、すなわち、遺伝子をｉｎｖｉｖｏで
転移させても、自律的な複製ができないウイルスの形成につながるためである。
Ｅ１領域その他、ウイルス中の考慮される任意の他の領域は、当業者には知られ
たいずれかの方法、特に、考慮される遺伝子の全削除、置換、部分的な削除、１
つまたは複数の塩基の追加により非機能性にすることができる。こうした変更は
、本発明のプラスミドに対し、例えば遺伝子工学の手法を使って簡単に直接的に
行うことができる。有利には、生成されたアデノウイルスのゲノムはＥ１領域の
一部、ヌクレオチド４５４から３３２８（ＰｖｕＩＩ／ＢｐＩＩＩ断片）または
３８２から３４４６（ＨｉｎｆＩＩ−Ｓａｕ３Ａ断片）を欠失している。

【００３０】切断型組換えアデノウイルスゲノムとは、アデノウイルスゲノムの一端（ＩＴ
Ｒ）からの端部配列に対応するＤＮＡを指す。２つの切断型組換体ゲノムが、ア
デノウイルスゲノムの互いに補う部分を有し、相同的組換えによって完全なアデ
ノウイルスゲノムを構成する場合に、これらの組換体ゲノムは相補的であるとい
う。

【００３１】・異種核酸：「異種核酸」という語は、組換えアデノウイルスゲノムに挿入さ
れその転移、発現および機能の研究が行われる任意の核酸を指す。異種核酸は本
質的にはアデノウイルス以外（「異種」）の起源を有する核酸である。例えば、
ヒトの細胞、または動物、植物、ウイルス（アデノウイルス以外でベクターとし
て使われるもの）、原核生物、下等な真核生物、合成または半合成のものが挙げ
られる。異種核酸のサイズは、それを含む組換えアデノウイルスゲノムが、アデ
ノウイルス粒子内にカプシド形成され得る最大のサイズ（全長で４０ｋｂ未満）
を超えない限りにおいて変更可能である。従って、異種核酸は、アデノウイルス
領域が十分に削除されている場合には、３０ｋｂ以上の長さを有する核酸とする
ことができる。この点から、異種核酸は、所与のタンパク質、ポリペプチドまた
はペプチドをコードする領域、例えば、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡまたは合成ＤＮＡを
含み得る。核酸はまた未知の構造を有するもの、例えば、核酸ライブラリーに属
するクローンに由来するものでもよい。さらに、組換えアデノウイルスゲノムは
、ゲノムの異なる部位に挿入された複数の異種核酸を含んでもよい。

【００３２】プラスミドの説明上に指摘した通り、本発明は、アデノウイルスゲノムの相補的断片を互いに含
む２種類の（原核生物の）プラスミド、すなわち、シャトルプラスミドと親プラ
スミドを必要とする。これらのプラスミドの少なくとも一方は異種核酸（または
こうした核酸のための挿入部位）を含む。この異種核酸は、例えば、遺伝子治療
、タンパク質の製造、機能的ゲノムアプローチのために検討対象となる核酸であ
る。有利には、それぞれのプラスミドに含まれる切断型ゲノムそれぞれの端部（
ＩＴＲ配列）は、当該ゲノムには存在しない部位によって隣接され（左側ＩＴＲ
の場合は５’、右側ＩＴＲの場合は３’）、これにより、組換え後に完全なゲノ
ムを切り出すことができる。これらのプラスミドは、切断型アデノウイルスゲノ
ムを含んでおり、個別には感染性アデノウイルスゲノムを生成することができな
い。これらの２種の各プラスミドは、互いに相補的な部分を有しており、同時組
込みによって最終プラスミドを生成する。この最終プラスミドは、２つのＩＴＲ
および少なくとも１つの制限酵素認識部位（前記ゲノムには存在しないもの）に
よって隣接されているアデノウイルスゲノムを有する。こられのプラスミドに含
まれる組換えアデノウイルスゲノム断片は、それ自体では実質的に感染性を示さ
ない不完全なゲノムである。これは２種のプラスミドの同時組込みがなされた場
合にのみ機能性ゲノムを生成するという点で有利である。

【００３３】これらのプラスミドは、例えば、図１に描かれており、以下の記載により詳細
に説明する。これらのプラスミドは、好ましくは原核細胞プラスミドであり、大
まかに言えば、プラスミド領域とアデノウイルス領域とを有する。プラスミド領
域は、プラスミドの増殖および／または宿主細胞（特に原核宿主細胞）内での選
択を可能にする。アデノウイルス領域（切断型ゲノム）は、組換えアデノウイル
スゲノムの一部を供与するものであり、この部分は、相補的（親またはシャトル
）プラスミドのアデノウイルス領域との組換え後に、完全な組換えアデノウイル
スゲノムを再構成する。

【００３４】原核細胞内での増殖を可能にし、本発明のプラスミドで用いられる領域は、選
択された細胞内において機能性を有するものであれば、どのような複製起点を有
するものでもよい。Ｐ−不和合性（Ｐ−ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）グル
ープ（例＝ｐＲＫ２９０）に属するプラスミドに由来する複製起点でもよい。こ
れは、大腸菌ｐｏｌＡ株内での増殖が可能である。より一般的には、原核細胞内
で増殖するプラスミドに由来する複製起点であればいずれも可能である。このプ
ラスミドは、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ他、１９７７）誘導体、ｐＵＣ（Ｖ
ｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、１９８２）誘導体、または同じ不和合性グルー
プに由来する他のプラスミド（例えば、ＣｏｌＥ１またはｐＭＢ１）の誘導体で
もよい。これらのプラスミドはさらに大腸菌内で増殖する他の不和合性グループ
から選択してもよい。それらは、例えば、Ａ、Ｂ、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、Ｆ
ＩＶ、Ｈ１、Ｈ１１、Ｉ１、Ｉ２、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、ＯＦ、Ｐ、Ｑ、Ｔ、Ｕ、Ｗ
、Ｘ、Ｙ、Ｚまたは９つの不和合性グループに属するプラスミドに由来するプラ
スミドでもよい。大腸菌内では増殖しないが、他の宿主細胞内で増殖する他のプ
ラスミドを用いることもできる。こうした他の宿主細胞の例としては、Ｂ．ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕ
ｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｅｎｔ
ｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃｉｕｍまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ等が挙げら
れる。好ましくは、大腸菌内で増殖するプラスミドに由来する複製起点のものを
用いる。

【００３５】本発明のプラスミドを保有する原核細胞の選択を可能にする領域は、製品、特
に抗生物質への抵抗性を与えるいずれかの遺伝子を含む。例えば、カナマイシン
抵抗性（Ｋａｎ^ｒ）、アンピシリン抵抗性（Ａｍｐ^ｒ）、テトラサイクリン（ｔ
ｅｔ^ｒ）抵抗性またはスペクチノマイシン抵抗性を示す遺伝子など、分子生物学
で広く使用されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９）ものを挙げることがで
きる。プラスミド選択のため、抗生物質に抵抗性を示すマーカーをコードする他
の遺伝子を用いてもよい。一般に、遺伝子は、もはや有しない機能（染色体から
削除され不活性にされた遺伝子に対応する機能）をプラスミド上の遺伝子ととも
に再構成して当該機能を細菌に与える。一例としては、遺伝子は、欠損した染色
体機能を再構成するトランスファーＲＮＡの遺伝子とすることができる（Ｓｏｍ
ｏｅｓ他、１９９１）。

【００３６】シャトルプラスミドおよび親プラスミドは、好ましくは、それぞれの要素の選
択を可能にするために、異なる複製起点および／またはマーカーを有する。

【００３７】各プラスミドに含まれるアデノウイルスウイルス領域は、本質的には切断型ア
デノウイルスゲノムの配列に対応する。こうした切断型ゲノムは、プラスミドの
両方に含まれており、相同的組換えにより、相補的な、すなわち、完全な（かつ
線状の）アデノウイルスゲノムを生成できる。さらに、切断型ゲノムは、各プラ
スミドに含まれているが、好ましくは、アデノウイルスゲノムには含まれていな
い１つまたは複数の制限酵素認識部位によって隣接され、組換えによって製造さ
れる完全な組換えアデノウイルスゲノムがこれらの部位により隣接されるように
する。

【００３８】シャトルプラスミドに存在する切断型ゲノム上に指摘した通り、シャトルプラスミドは、検討対象の核酸を受容し、これを
組換えアデノウイルスゲノムに導入するためのものである。

【００３９】シャトルプラスミドのアデノウイルス領域は、アデノウイルスゲノムの左側領
域または右側領域に対応し、その端部（ＩＴＲ配列）から２種のプラスミドの間
で相同的組換えが起こるように選ばれたアデノウイルスの相同性領域までとする
。このアデノウイルスは、さらに１つまたは複数の変更を含む。

【００４０】第１の実施形態では、シャトルプラスミドに含まれる切断型ゲノムは、最終的
な組換えアデノウイルスゲノムの左側部分に対応する。この実施形態では、切断
型ゲノムは、例えば、左側ＩＴＲからｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパ
ク質をコードする領域までに至る配列を、Ｅ１領域の全部または一部に置換によ
って挿入された異種核酸とともに含む。この実施形態では、アデノウイルス相同
性領域はｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパク質をコードする領域からな
る。

【００４１】別の実施形態では、シャトルプラスミドに存在する切断型ゲノムは、最終的な
組換えアデノウイルスゲノムの右側部分に対応する。この実施形態では、切断型
ゲノムは、例えば、右側ＩＴＲからｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパク
質をコードする領域までに至る配列を、Ｅ４またはＥ３領域の全部または一部に
置換によって挿入された異種核酸とともに含む。この実施形態では、アデノウイ
ルス相同性領域はｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパク質をコードする領
域からなる。

【００４２】さらに、本発明の一実施形態においては、相同性領域は変更されたアデノウイ
ルス配列からなる。したがって、この相同性領域は、例えば、遺伝子コードの縮
重性を利用してコドンが変更されたアデノウイルス領域からなる。こうした変更
はＷＯ９９／２５８６１に記載されており、参照により本願に組み込まれる。１
つの実施形態では、アデノウイルスの相同性領域は、縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔ
ｅ）ｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパク質をコードする領域からなる。

【００４３】アデノウイルス相同性領域は、最終的な組換えアデノウイルスゲノム（組換え
後に変更されたもの）の選択された構造によっては、ゲノムの別の領域に対応し
てもよいことが理解されるであろう。実際、親プラスミドのアデノウイルス領域
が、左側ＩＴＲ領域からＥ３領域に至るまで延び、アデノウイルス相同性ゾーン
を構成することも可能である。より一般的にいえば、アデノウイルス相同性領域
は、野生型のいずれかの領域またはシャトルプラスミドと親プラスミドとの間で
組換えが起こって最終的な組換えアデノウイルスゲノムを生成するような変更さ
れたアデノウイルスゲノムに対応する領域である。この相同性領域は、本質的に
は、シャトルプラスミドと親プラスミドとで同一である。これは、使用するコン
ストラクトのタイプによってアデノウイルスゲノムの異なる部分に対応する。

【００４４】本発明の一実施形態は、左側ＩＴＲ領域、カプシド形成配列、異種核酸、およ
び野生型または縮重ｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）タンパク質をコードする
領域からなるアデノウイルス相同性領域を含む切断型ゲノムを含むシャトルプラ
スミドにある（例えば、プラスミドｐＪＪ１およびｐＩＧ５参照）。

【００４５】さらに本発明の好ましい実施形態では、切断型アデノウイルスゲノムは、ＩＴ
Ｒの方向に、アデノウイルスゲノムには存在しない部位（例えば、ＰａｃＩ）に
よって隣接されている。

【００４６】親プラスミドに存在しない切断型ゲノム上に指摘した通り、親プラスミドは、切断型アデノウイルスゲノムを含み、こ
れは、シャトルプラスミドに含まれる切断型ゲノムを組換えによって補完し得る
。したがって、その構造は、シャトルプラスミドの構造に依存する。また、親プ
ラスミドはシャトルプラスミドが有するのとは異なる核酸を含んでいてもよい。

【００４７】したがって、シャトルプラスミドのアデノウイルス領域がアデノウイルスゲノ
ムの左側部分に対応するときは、親プラスミドに存在する切断型ゲノムは、右側
部分に対応し、これはＩＴＲからアデノウイルス相同性領域に至るまで延びる。
反対に、シャトルプラスミドのアデノウイルス領域がアデノウイルスゲノムの右
側部分に対応するときは、親プラスミドに存在する切断型ゲノムは、左側部分に
対応し、これはＩＴＲからアデノウイルス相同性領域に至るまで延びる。

【００４８】本発明の第１の実施形態においては、親プラスミドに存在する切断型ゲノムは
最終的な組換えアデノウイルスゲノムの右側部分に対応する。この実施形態では
、切断型ゲノムは、例えば、右側ＩＴＲからｐＩＸ（および／またはＩｖａ２）
タンパク質をコードする領域までに至る配列を含む。さらに、ゲノムは、例えば
、Ｅ４またはＥ３領域の全部または一部の削除のような遺伝子の変更を含んでも
よい。

【００４９】本発明の別の実施形態においては、親プラスミドに存在する切断型ゲノムは最
終的な組換えアデノウイルスゲノムの左側部分に対応する。この実施形態では、
切断型ゲノムは、例えば、左側ＩＴＲからＥ４領域に近い配列までに至る配列を
含む。さらに、ゲノムは、例えば、Ｅ１領域の全部または一部の削除のような遺
伝子の変更を含んでもよい。

【００５０】親プラスミドは、好ましくは、アデノウイルスゲノムの右側部分に対応し非機
能性Ｅ３領域を含む切断型ゲノムを含む。より好ましくは、非機能性Ｅ４領域を
含む。さらに好ましくは、Ｅ４領域のＯＲＦ３および／またはＯＲＦ６リーディ
ングフレームの全部もしくは一部の削除を含む。別の実施形態では、親プラスミ
ドはアデノウイルスゲノムの右側部分に対応し機能性Ｅ３およびＥ４領域を含む
切断型ゲノムを含む。

【００５１】ｐＯＳＥ１、ｐＯＳＥ１０−００、ｐＯＳＥ３０−００、ｐＯＳＥ１７−００
およびｐＯＳＥ３７−００（図１および４参照）は、これらのプラスミドの具体
例を示すものである。

【００５２】この実施形態では、シャトルプラスミドは、アデノウイルスゲノムの左側部分
に対応しＥ１領域の全部または一部が削除された切断型ゲノムを含む。

【００５３】本発明の意味において特に好ましい２種のプラスミドは、プラスミドｐＯＳＥ
１７−００およびプラスミドｐＩＧ５である。ｐＯＳＥ１７−００（親プラスミ
ド）はプラスミドＲＫ２の複製起点を有し、テトラサイクリン抵抗性遺伝子を含
み、さらに、Ａｄ５の３５２０塩基から始まり右側ＩＴＲまで延び、ＰａｃＩ部
位によって隣接されているアデノウイルスゲノム断片を有する。このゲノム断片
は、ＷＯ９９／２５８６１に記載されているように、非機能性Ｅ３領域とｐＩＸ
およびＩｖａ２が削除された配列を含む。ｐＩＧ５プラスミド（シャトルプラス
ミド）は、ＲＫ６の複製起点を有し、大腸菌ｐｉｒ株中では増殖ができない。ｐ
ＩＧ５は、ＩＴＲ、およびＰａｃＩ部位が先行したカプシド形成領域、所望の発
現カセットおよびｐＯＳＥ１７−００（ＷＯ９９／２５８６１に記載されている
ように、ｐＩＸおよびＩｖａ２が変更された配列）を有する。２種のプラスミド
で相同的な領域（すなわち、ＷＯ９９／２５８６１に記載されているように、ｐ
ＩＸおよびＩｖａ２が変更された配列）が存在するので、相同的組換えにより、
所望のゲノムが再構成される。

【００５４】本発明の方法は、それぞれゲノムの一部をもたらす２種のプラスミド（一方の
プラスミドはＰａｃＩ部位が先行した左側ＩＴＲ、およびウイルス性のまたは非
ウイルス性の配列のセットを含み、他方のプラスミドはウイルス性のまたは非ウ
イルス性の配列が先行し、右側ＩＴＲ、およびこれに続くＰａｃＩ部位を含み、
ウイルス性のまたは非ウイルス性の配列は計画するコンストラクトにより選択さ
れ、組換えアデノウイルスベクターは、ウイルス遺伝子の全部または一部が削除
されている）から完全な（感染性の）組換えゲノムを生成することを可能とし；
ここで、２種のプラスミドは、相同的組換えをなすのに十分で、かつ、相同的組
換えイベントを発生可能とするように配列中にオーバーラップを有する共通配列
として含む。特に本発明の方法は外来性の配列をＥ１領域に導入するために提案
された方法に匹敵する構成で、適当なプラスミドを用いてＥ４領域に導入するこ
とを可能にする。この場合、組換えが親プラスミド（左側ＩＴＲとカプシド形成
領域を有し、酵素ＰａｃＩのための制限酵素認識部位とＥ４領域近傍の切断型ア
デノウイルスゲノムが先行している）とシャトルプラスミド（親プラスミドベク
ターと同一のＥ４領域に近接した領域――これは組換えイベントに関係する――
を有し、検討対象の配列を発現するためにカセット、右側ＩＴＲおよび一意な酵
素ＰａｃＩ部位が後続している）との間で起こる。

【００５５】有利な実施形態の１つによれば、製造されるアデノウイルスゲノムは、Ｅ３お
よび／またはＥ４および／またはＩＶＡ２領域の全部または一部も欠失している
。こうした追加的な削除はベクターの安全性を増し、その能力を拡大する。好ま
しくは、アデノウイルスゲノムはＥ４領域（少なくともオープンリーディングフ
レームＯＲＦ３およびＯＲＦ６を含む）の一部を欠失している。アデノウイルス
ゲノムは、フランス国出願ＦＲ９４１３３５５（この内容は参照により本願に組
み込まれる）に記載されているように複製粒子による汚染の危険を回避するため
に改変されていてもよい。１つの特定の実施形態によれば、得られる完全な組換
えアデノウイルスゲノムは、いわゆるガットレスゲノムである。すなわち、アデ
ノウイルスのいずれのコード領域も欠くゲノムである。この実施形態においては
、プラスミドの切断型ゲノムは、一方の側においてはＩＴＲおよびカプシド形成
領域を他方の側においてはＩＴＲを有し、これは相同性領域が異種核酸自身から
なるか、各プラスミドに含まれる人工的な配列からなることを可能にする。

【００５６】この点で、各プラスミドに存在する相同性領域は、一般に、非ウイルス配列で
あり、これは人工的であっても非人工的でもよいが、相同的組換えを可能にする
ものである。

【００５７】組換えゲノムはまた、ｉｎｖｉｖｏで切り出されるカセット（ＷＯ９７／４
７７５７）または変更された遺伝子配列（ファイバーまたはペントンの遺伝子）
であって、ウイルス親和性を変更し得るものを含むことができる。さらに、製造
されるウイルスの安全性を向上するために、ウイルスのゲノム組織を変更しても
よい（ＷＯ９６／１３５９６）。

【００５８】上に指摘した通り、組換えアデノウイルスゲノムは、当該ゲノムに存在しない
１つまたは複数の制限酵素認識部位によって隣接されていることが有利である。
この部位は組換えアデノウイルスゲノムが、プラスミドから簡単かつ効率的に切
り出されるようにする。アデノウイルスのゲノム配列は知られておりその情報も
アクセス可能であるので、当業者は通常の実験により、このゲノムに存在しない
制限酵素認識部位を選択することができる。例としては、ＰａｃＩ、ＮｓｐＶお
よびＳｗａＩ（Ａｄ５の場合）、ＳｎａｂＩ（Ａｄ２の場合）等の部位を挙げる
ことができる。また、アデノウイルスゲノムの配列を変更してユニークな部位を
作ることも可能である。したがって、大腸菌中で構築されたアデノウイルス配列
において対応する制限酵素認識部位を抑圧、変更または削除すれば、他の酵素を
用いることもできる。こうした部位は、アデノウイルスゲノムの末端に直接隣接
するものでもよいし、その末端から数塩基対離れていてもよい。

【００５９】本発明によるプラスミドは、様々な起源のアデノウイルスを用いて構築できる
。したがって、構造や性質の異なる様々のアデノウイルスのセロタイプが特徴付
けされている。こうしたセロタイプの中では、ヒトのタイプ２またはタイプ５の
アデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）、または動物起源のアデノウイルス（Ｗ
Ｏ９４／２６９１４参照）。本発明の範囲内において好ましい。本発明の範囲内
において、利用できるアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス（例：Ｍａ
ｖｌ、Ｂｅａｒｄ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、ブ
タ、トリまたはサル（例：ＳＡＶ）起源のものが挙げられる。動物起源のアデノ
ウイルスは、好ましくは、イヌアデノウイルスであり、より好ましくはＣＡＶ２
アデノウイルス〔（Ｍａｎｈａｔｔａｎ株またはＡ２６／６１（ＡＴＣＣＶＲ
−８００））である。本発明のある実施形態によれば、用いられるアデノウイル
スはヒト起源のアデノウイルスである。また、他の実施形態によれば、用いられ
るアデノウイルスは動物起源のアデノウイルスである。

【００６０】ウイルスの相同的組換えおよび製造ゲノム再構築を可能にするウイルスの相同的組換えステップは、当業者には知
られた手法を用いて、プラスミドを適当な細胞（好ましくは、原核細胞）にトラ
ンスフェクトまたは同時トランスフェクトすることにより行うことができる。１
つの特定の実施形態は大腸菌中で、相同的組換えイベントを選択するためＰｏｌ
Ａ株を用いて行われる。こうしたコンストラクトは、組換えイベントを選択する
ための系なしでも調製できることは明らかである。これは、こうした組換えイベ
ントが、ミニプレパレーションを作成することにより、もしくはマーカーの損失
または獲得によりスクリーニングされ、または、（獲得されるか失われるかのジ
ャンクションに特異的である）放射性プローブを用いたスクリーニングが可能だ
からである。さらに、大腸菌中での組換えイベントを選択するためのほかの手法
も存在する。こうした手法の例としては、その増殖体が温度感受性であるプラス
ミドの利用（Ｈａｍｉｌｔｏｎ他、１９８９）、非複製性環状分子の使用（例え
ば、ＳｌａｔｅｒおよびＭａｕｒｅｒ、１９９３）、使用されるベクターが増殖
しない株の使用（ＭｉｌｌｅｒおよびＭｅｋａｌａｎｏｓ、１９８８、Ｚｅｅｆ
他、１９９４）等が挙げられる。これらの系のいずれもＰｏｌＡ株の代わりに使
用でき、ｐＢＲ３２２に由来するプラスミドもしくはその多くの誘導体、または
ＰｏｌＡ依存で増殖する他のプラスミド、または大腸菌中で増殖しない他のプラ
スミドを用いて形質転換される。

【００６１】本願の主題の別の部分は、上に定義したプラスミドを保有する原核細胞に関す
る。こうした細胞は特に、組換えＤＮＡが導入できるベクター系が存在する任意
の細菌である。例としては、大腸菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕ
ｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔ
ｉまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細菌が挙げられる。こうした細胞は、有
利には、当業者によって知られている手法によって形質転換することにより得ら
れる。形質転換は、ＣａＣｌ_２を用いた手法（ＤａｇｅｒｔおよびＥｈｒｌｉｃ
ｈ、１９７９）またはＨａｎａｈａｎ他（１９８３）により開発された手法もし
くはこれから派生した手法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９）の任意のもの、さ
らにエレクトロトランスフォーメーション（Ｗｉｒｔｈ他、１９８９）により行
うことができる。さらに以下に示す一般的な分子生物学的な手法を参照されたい
。

【００６２】本発明の主題の別の部分は、組換えゲノムの製造方法にある。この方法によれ
ば、上記したような原核細胞を培養し、次いで、第２ステップでプラスミドを回
収する。培養は、有利には、適当な量のプラスミドを製造するのに十分な時間を
かけて行われる。プラスミドは当業者に知られたプラスミドＤＮＡの製造方法を
用いて回収できる。したがって、透明な溶解物を調製した後、塩化セシウムグラ
ジエント中での遠心分離により回収できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９）。
他の溶菌法による手法、例えば、トライトンＸ−１００を用いたもの（Ａｕｓｕ
ｂｅｌ他、１９８７）、または溶菌ステップ後に陰イオン交換カラムを用いて大
部分の染色体ＤＮＡおよびタンパク質からプラスミドＤＮＡを分離する。このよ
うにして回収したプラスミドを、次いで精製し、ウイルスゲノムの境界に位置す
る部位に対応する制限酵素の存在下に処理する。これにより、直線状の組換えア
デノウイルスゲノムが得られ、これは組換えウイルスのクローン製造に直接使用
でき、ワンステップでの生成が可能になる。

【００６３】この点で、組換えウイルスを製造する第１の方法は、製造されたウイルスを本
発明のプラスミドからコンピテントなカプシド形成細胞系、つまり、欠損ウイル
スを完全化するためにすべての機能をトランスで（ｉｎｔｒａｎｓ）保持して
いる系にトランスフェクトすることとなる。こうした機能は、好ましくは、細胞
のゲノム中に組み込まれ、これにより組換えのリスクが減少し、細胞系の増大し
た安定性が付与される。

【００６４】第２のアプローチは、適当な細胞系に、調製した組換えゲノムと１つまたは複
数のヘルパーウイルスもしくはべクターのＤＮＡをトランスフェクトさせること
からなる。この方法を用いる場合には、組換えアデノウイルスの欠損機能のすべ
てを補うコンピテントな細胞系は必要ない。これは、こうした機能のいくつかは
、ヘルパーウイルスにより補足されるからである。こうしたヘルパーウイルスは
それ自体欠損性である。

【００６５】使用できる細胞系の例としては、ヒトの胎性腎細胞系２９３（Ｇｒａｈａｍ他
、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ、３６（１９７７）５９）が挙げられる。この細胞系
は、特にそのゲノム中に、ヒトＡｄ５アデノウイルスの左側部分が組み込まれて
いる（１２％）。トランスフェクションは、有利には、上記の方法に従って得ら
れたプラスミド消化生成物を用いて直接行うことが可能で、この場合、アデノウ
イルスゲノムを精製するステップは必要ない。他の細胞系の例は、胎性網膜細胞
（ＨＥＲ）、肝細胞等から得られる細胞系である。細胞系は、Ｅ１（２９３、Ｐ
ＥＲＣ−６細胞）、Ｅ１およびＥ４（ＩＧＲＰ２）、Ｅ１およびＥ２の機能等を
補う細胞系である。これらの細胞系は文献に記載されており、当業者であれば用
いることができる。

【００６６】この方法により製造されたアデノウイルスは、当業者には知られた手法（塩化
セシウム法、クロマトグラフィー等）により単離または精製できる。これらは様
々な用途を有するが、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏ、ｅｘｖｉｖｏもしくはｉｎ
ｖｉｖｏでの治療もしくは予防のための製品の製造、またはゲノムの機能解析
（およびライブラリー組成物）等である。

【００６７】本発明の新規な方法を用いることによる利点は以下の通りである。組換体の精
製がより容易かつ高速に行え、多数の選択系（プロセス自体および非機能性親ベ
クターの構造に課される）に関連したスクリーニングステップが必要ない。

【００６８】これまでに知られている従来法とは異なり、プロセスの堅牢さが選択圧の自発
性に基づいているため、単一ステップで、機能性アデノウイルスゲノムを含む最
終プラスミドのみを選択できる。単一ステップでの新しい組換えベクターの生成
は、これまでに知られている方法と比較して必要な作業時間を実質的に減少させ
る。また、スクリーングステップが必要ないため、必要な作業量もこれまでに知
られている方法と比較して大きく減少する。さらに、スクリーニングが必要ない
ため、多数の組換えアデノウイルスベクターを、ただ１つの中間体を経由して同
時に生成する途が開かれた。

【００６９】本発明の方法の別の利点は、機能性ゲノムを含む最終プラスミドを生成するた
めに用いられる２種のプラスミドの非生存性である。これらの２種の最初のプラ
スミドは個別には機能性アデノウイルスゲノムを生成可能にする全機能を有して
いない。さらに、選択のために課された条件（抗生物質）を逃れるといった極端
な場合でも、２種のコンストラクト（所望のコンストラクトおよび最初のプラス
ミド）が組換え後に細菌株内に共存しても、一度、この混合物が真核製造細胞に
トランスフェクトされると、所望の組換えベクターの生成には何ら影響しない。
これは、相同的組換えの結果得られる所望のコンストラクトのみが、生存可能で
あり、真核製造細胞において増殖可能である一方、最初のプラスミドは生存不可
能（いずれのプラスミドにも少なくとも１つのＩＴＲが存在しない）だからであ
る。

【００７０】本発明の方法の上記の特徴は、アデノウイルスベクター構築の単純化に役立ち
、組換えベクターを高いアウトプットで生成する可能性を拓く。これは、これま
でに知られている配列を含む組換えアデノウイルスベクターの同時構築と関係し
ており、そうした配列の機能を有効にしたい、または、その機能を見出したい性
質未知の配列を含む組換えベクターの集合を同時に構築する。後者の場合、ベク
ターの集合をアデノウイルス発現ベクターという。

【００７１】遺伝子治療における応用本発明のアデノウイルスは、治療用途にも用いることができる。この目的のた
めには、異種核酸は、１つまたは複数の治療効果を有する遺伝子および／または
抗原ペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子を含むことができる。

【００７２】このようにして転移することのできる治療効果を有する遺伝子は、標的細胞内
で転写、および適宜、翻訳されることにより治療効果を有する産生物を生じるす
べての遺伝子である。

【００７３】この産生物は標的細胞に関して相同的なものであってもよい（すなわち、標的
細胞が病原性を示さない場合に、通常その標的細胞で発現する産生物）。この場
合、発現によって、例えば、細胞内での不十分な発現、または修飾の結果として
の不活性もしくは活性の弱いタンパク質の発現を補うか、あるいはそのタンパク
質を過剰に発現させることができる。治療効果のある遺伝子はさらに、安定性が
高まった、あるいは活性の変化した細胞タンパク質の変異体をコードすることも
できる。タンパク質産生物はさらに、標的細胞に関して異種であることもできる
。この場合、発現タンパク質は、例えば、細胞に不足している活性を補充もしく
は提供して、細胞が病気と戦うことができるようにすることができる。

【００７４】治療効果を有する産生物の具体例としては、酵素、血液誘導体、ホルモン、リ
ンホカイン（すなわち、インターロイキン、インターフェロン、ＴＮＦ等（ＷＯ
９３／１９１９１））、成長因子、神経伝達物質もしくはこれらの前駆体または
これらを合成するための酵素、栄養因子（すなわち、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧ
Ｆ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５等）、アポリポタン
パク質（すなわち、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ等（ＷＯ９４／２５０
７３））、ジストロフィンもしくはミニジストロフィン（ＦＲ９１１１９４７）
、腫瘍抑制遺伝子（すなわち、ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣ、ｋ−ｒｅｖ
等（ＷＯ９４／２４２９７）、凝集に関与する因子をコードする遺伝子（すなわ
ち、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ等）、自殺遺伝子（ＴＫ等）等が挙げられる。

【００７５】治療効果を有する遺伝子はさらに、標的細胞中での発現によって細胞性遺伝子
の発現や細胞性ｍＲＮＡの転写を制御可能とする遺伝子またはアンチセンス配列
であることもできる。そのような配列は、例えば、欧州特許１４０３０８号に記
載の方法に従って、標的細胞において、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的なＲＮＡ
に転写されることで、そのｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを妨害すること
ができる。

【００７６】上述のように、興味の対象となる遺伝子はさらに、ヒトにおいて免疫応答を生
じさせ得る抗原性ペプチドをコードする遺伝子であることもできる。従って、こ
の実施形態では、本発明によって、特に微生物もしくはウイルスに対してヒトを
免疫感作することができるワクチンの産生が可能となる。ワクチンは、特に、エ
プスタインバールウイルス、ＨＩＶウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス（ＥＰ１８５５
７３）または擬似狂犬病（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）ウイルス、あるいは腫瘍
に対して特異的な（ＥＰ２５９２１２）抗原性ペプチドであってもよい。

【００７７】通常、検討対象の異種核酸は、感染した細胞において、治療効果を有する遺伝
子および／または抗原ペプチドをコードする遺伝子を発現可能とする配列を含む
。こうした配列は、それが感染細胞において機能できる場合には、当然問題の遺
伝子の発現を起こさせる配列となり得る。この配列はさらに、各種由来の配列で
あってもよい（他のタンパク質の発現を起こすもの、あるいは合成の配列であっ
てもよい）。特に、配列は真核生物遺伝子もしくはウイルス遺伝子のプロモータ
ー配列であってもよい。例えば、配列は、それが感染することが望ましい細胞の
ゲノム由来のプロモーター配列であってもよい。同様に、配列は、使用されるア
デノウイルスを含むウイルスのゲノム由来のプロモーター配列であってもよい。
この点に関しては、例えばＥ１Ａ、ＭＬＰ（ＭａｊｏｒＬａｔｅＰｒｏｍｏ
ｔｏｒ；主要後期プロモーター）、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ；
部位メガロウイルス）、ＲＳＶ（ＲｏｕｓＳａｒｃｏｍａｖｉｒｕｓ；ラウ
ス肉腫ウイルス）遺伝子等のプロモーターを挙げることができる。さらに、これ
らの発現配列は、活性化、調節その他の配列を加えることで変更することができ
る。好ましくは、Ｔｅｔｏｎ／ｏｆｆまたはＴｅｔｏｆｆ／ｏｎタイプのプロ
モーター（これはテトラサイクリンによって調節可能である）またはエキダイソ
ンもしくはデキサメタゾンによって誘導可能なプロモーターを用いることができ
る。さらに、挿入された遺伝子がプロモーター配列を持たない場合には、それを
そのような配列の下流で欠陥ウイルスのゲノムに挿入することができる。さらに
、検討対象の異種核酸は、特に治療効果を有する遺伝子の上流で、治療効果を有
する合成産生物を標的細胞の分泌経路に載せるべく指示するシグナル配列を有す
ることもできる。このシグナル配列は、治療産生物の天然のシグナル配列であっ
てもよいが、他の機能性シグナル配列または人為的シグナル配列であることもで
きる。

【００７８】本発明はさらに、本発明の方法に従って製造された欠陥組換えアデノウイルス
を含有してなる医薬組成物に関するものでもある。本発明の医薬組成物は、局所
投与、経口投与、非経口投与、経鼻投与、静脈投与、筋肉投与、皮下投与、眼内
投与、経皮投与等として製剤することができる。

【００７９】好ましくは、医薬組成物は、注射剤用に医薬的に許容される補助剤を含有する
。そのような補助剤としては特に、無菌で等張性の塩水溶液（リン酸一ナトリウ
ムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもし
くは塩化マグネシウム等、またはそのような塩の混合物）、あるいは状況に応じ
て無菌水もしくは生理食塩水を加えることで注射液を調製することができる乾燥
組成物（特には凍結乾燥組成物）が挙げられる。

【００８０】注射に使用されるウイルスの用量は各種パラメータに従って、特には実施する
投与形態、問題となる病気、発現させる遺伝子あるいは所望の治療期間に従って
調整することができる。一般的に言えば、本発明による組換えアデノウイルスは
、１０^４から１０^１４ｐｆｕ、好ましくは１０^６から１０^１０ｐｆｕの用量で製
剤・投与する。ｐｆｕ（プラーク形成単位）という語は、ウイルス溶液の感染力
に対応するもので、適切な細胞培養を感染させ、一般には１５日後に感染細胞の
プラーク数を測定することで求められる。ウイルス溶液のｐｆｕ力価の測定方法
については、文献に詳細に記載されている。

【００８１】挿入する異種ＤＮＡ配列に応じて、本発明のアデノウイルスを用いて、遺伝性
疾患（異栄養症、嚢胞性線維症等）、神経変性性疾患（アルツハイマー病、パー
キンソン病、ＡＬＳ等）、癌、凝血障害もしくは異常リポタンパク質血症に関連
する病気、ウイルス感染関連の病気（肝炎、ＡＩＤＳ等）等の多数の病気の治療
または予防を行うことができる。

【００８２】組換えタンパク質を生成するための適用例本発明の方法によって、特に培養中のヒト細胞中で組換えタンパク質を生成す
ることができるアデノウイルスベクターを生成させることができる。組換えタン
パク質はヒト血清アルブミン、ヒトインターフェロン、ヒト抗体、ヒトインシュ
リン、血球因子、ＩＸ因子またはＶＩＩ因子などの因子、組織プラスミノゲン活
性剤などのトロンビン因子、さまざまな成長因子、栄養因子、サイトカイン、中
央神経系のペプチド、オピオイド、酵素およびウイルス性抗原、および植物のな
どの他の生物からのタンパク質などのタンパク質であってよい。

【００８３】機能的なゲノムの適用例前述の調製ツールと同じものを使用して、製薬産業に理解される意味において
、新規の標的を立証または発見するための適用例でこの方法が利用される。

【００８４】本発明は、記載の方法を使用する組成物のあらゆる利用にも関する。さらにそ
れだけではなく、どんな性質のものであれ核酸を得て本発明の意味の範囲内の第
１のシャトルプラスミドに組み込むこと、さまざまな自動化の方法を使用して１
つまたは多数の組換えアデノウイルスを生成させるために前記プラスミドを使用
することを可能にする、あらゆる調製に関する。したがってこれらの組換えアデ
ノウイルスを、それらが保有する配列の機能的能力を評価するために、ｉｎｖ
ｉｔｒｏおよびｉｎｖｉｖｏモデルで多数使用することができる。当業者が利
用可能な多数の機能的試験の１つを使用して、生成された組換えアデノウイルス
によって保有される配列の機能的能力を評価することができる。

【００８５】したがって本発明の主題の一部は、アデノウイルスの発現ライブラリーを作製
するための方法中にも存在し、この方法は以下のステップを含む。

【００８６】前述のシャトルベクター中にプライマリーライブラリーを構築するステップ、本発明の親プラスミドの存在下で前記プライマリーライブラリーを用いて細菌
培養物を形質転換するステップ、結果として生じるプラスミド、または後に酵素による消化によって切断される
完全なアデノウイルスゲノムをアデノウイルス生成細胞に導入するステップ、適切な場合は、細胞を含む生物学的物質を感染させてライブラリー中のクロー
ンを分析するステップ。

【００８７】したがってこの方法は、本発明を適用し実験モデルのアデノウイルスライブラ
リーを使用する前に、本発明のシャトルプラスミド中で核酸のプライマリーライ
ブラリーを作製する第１のステップを含む。当業者に知られる分子生物学的な方
法を使用して、本発明のプラスミド（シャトルプラスミド）中にこの性質のプラ
イマリーライブラリーを構成することができる。詳細には、以下の操作を連続的
にを行うことによって、プライマリーライブラリーを構築することができる。ａ
）細胞群からｍＲＮＡ（またはＲＮＡ全体）を得る、ｂ）単離したｍＲＮＡ群と
相補的なＤＮＡを作製する、ｃ）適切な場合は、強力なプロモーターの制御下、
特に調節可能なプロモーターの制御下で、ｃＤＮＡ分子が配置されている核酸ラ
イブラリーを作製する、ｄ）ｃＤＮＡ分子（または発現カセット）を本発明のシ
ャトルプラスミド中に取り込ませる。

【００８８】したがって本発明は、前に記載したベクターまたはシャトルプラスミドにクロ
ーン化される核酸ライブラリーにも関する。

【００８９】第２のステップでは、本発明に記載するようにシャトルプラスミドのプライマ
リーライブラリーと親プラスミドの同時形質転換によって、機能的なアデノウイ
ルスゲノムを保有するプラスミドのライブラリーが結果として生じる。同時にプ
ラスミドを細菌に同時形質転換させること、または連続的なトランスフェクショ
ンを行うことによって、このステップを行うことができる。このようにして、親
プラスミドを最初に細菌に導入することができ、次いでシャトルプラスミドがそ
の後トランスフェクトされる。

【００９０】第３のステップでは、プラスミドまたは切断した機能的組換えゲノムがトラン
ス相補的な細胞にトランスフェクトされ、これによって組換えアデノウイルスの
ライブラリーを生成させることができる。結果として生じるプラスミドを単離お
よび／または精製すること、アデノウイルスゲノムを切断しない適切な酵素（酵
素群）を用いた処理によって組換えゲノムが切断されることが好ましい。

【００９１】第４のステップでは、組換えアデノウイルスのライブラリーによって選択した
細胞群（または生物学的物質）を感染させることにより、ライブラリー中のクロ
ーンの生物学的または機能的性質を分析することが可能になる。このため、選択
され感染させられる細胞群は核酸の発現が可能な条件下に置くことができ、した
がってその細胞群を研究することによって所望の表現型が同定される。したがっ
て、表現型を誘導するベクターに戻って所望の表現型を与えるＤＮＡを特徴付け
ることが可能である。

【００９２】機能的能力の研究をより確固たるものにするために、１つのプール中でではな
く別々にクローンを処理することが有利である。したがって、シャトルプラスミ
ド中のプライマリーライブラリーのクローンはミクロプレート中で、親の切断型
アデノウイルスプラスミドを既に有している細菌に独立に形質転換される。選択
した酵素（たとえばＰａｃＩ）を使用してゲノムを切断した後に、ミクロプレー
ト中において淘汰圧（抗生物質）下での生育によって生成されるＤＮＡ分子を精
製し、真核生物の生産者細胞にトランスフェクトする。この性質の方法を略図に
よって図２に示す。

【００９３】本発明のアデノウイルス発現ライブラリーを作製するための方法の好ましい実
施形態によると、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（ＬＴＩ、Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって開発されたＧａｔｅｗａｙ（登録商
標）クローニング技術を使用することが可能であり、特にこの技術によって、挿
入体を保有する１組のアデノウイルスを同時に生成することが可能であり、この
挿入体はたとえば相補的ＤＮＡライブラリー、または当業者によく知られるさま
ざまな方法を使用して特徴付けられ選択された配列のグループに由来する。

【００９４】米国特許第５，８８８，７３２号中に特に記載されるＧａｔｅｗａｙ（登録商
標）クローニング技術によって、大腸菌のラムダ（λ）バクテリオファージの特
定部位ａｔｔＬ、ａｔｔＲ、ａｔｔＢおよびａｔｔＰにおける組換え反応による
ｉｎｖｉｔｒｏでの反応中に、たとえば２つのプラスミド間に挿入体を移動さ
せることができる。遺伝子の挿入にはベクター中の適切な制限部位の存在はもは
や必要ではなく、ａｔｔ配列と呼ばれる短い組換え配列の存在のみが必要とされ
る。

【００９５】一方Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステムは、ＬＲ反応と呼ばれ
る反応を行うことにあり、この反応中にａｔｔＬに囲まれる当該の挿入体を含む
エントリー（Ｅｎｔｒｙ）クローンが、ａｔｔＲ部位を含むデスティネーション
（Ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ）クローンと組換わり、発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
）クローンが生成される。次いでエントリークローンによって保有されている当
該の挿入体を、デスティネーションクローンに由来しａｔｔＢ部位を含む発現ベ
クターに移動させる。一方Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムは、ＢＰ反応と
指定される逆の反応を行うことにあり、この反応中にａｔｔＢ組換え部位に囲ま
れる当該の挿入体を含む発現クローンが、ａｔｔＰ部位を含むドナー（Ｄｏｎｏ
ｒ）ベクターと組換わり、ａｔｔＬ部位を含むエントリークローンが与えられる
。

【００９６】さらに具体的には、第１の戦略によれば、シャトルプラスミド、たとえば前に
記載したｐＪＪ１を改変して、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムと適合性が
あり適切なａｔｔ部位を有するプラスミドを生成させることが可能である。この
第１の手法によれば、シャトルプラスミドの発現カセットのプロモーター（ＣＭ
Ｖ）とＳＶ４０ポリアデニル化部位の間に、ａｔｔ部位が導入されることが好ま
しい。結果として生じるプラスミドは、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の術語
に従って、デスティネーションプラスミドと呼ばれ、次いでＧａｔｅｗａｙ（登
録商標）技術のエントリークローンとの反応に入ることができる。その結果、Ｄ
ＮＡライブラリーまたは選択された配列のグループに由来し、エントリークロー
ンまたはベクターにクローン化されるあらゆる挿入体を、本発明の意味の範囲内
のシャトルプラスミド中に移動させ、対応するアデノウイルスベクターを生成す
るために本発明において使用することができる発現シャトルプラスミドを与える
ことができる。

【００９７】第２の戦略によれば、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術に適合させるために完
全なアデノウイルスプラスミドを改変する。したがって、それは適切なａｔｔ部
位をアデノウイルスゲノムを保有するプラスミド中に導入して、Ｇａｔｅｗａｙ
（登録商標）クローニングシステム中に記載される反応を行うのを可能にするこ
とである。アデノウイルスゲノムのＥ１領域の代わりにプロモーターとポリアデ
ニル化配列の間に、ａｔｔ部位が導入されることが好ましい。したがってこの戦
略によって、元来はエントリークローン中に存在したさまざまな挿入体を含む、
アデノウイルスゲノム保有プラスミドを生成することが可能である。これらの挿
入体は作製される相補的なＤＮＡライブラリー、１つおよび同じファミリーの遺
伝子を示す挿入体、または任意の他の起源の挿入体に由来するものであってよい
。アデノウイルスゲノムを保有するプラスミドが生成され、そのプラスミドは改
変されａｔｔ配列を有しており、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の意味の範囲
内のデスティネーションクローンである。このプラスミドはｐＡｄＤＥＳＴで示
される（実施例６、図１０）。このようにして得られるデスティネーションクロ
ーン、すなわちｐＡｄＤＥＳＴを任意のエントリークローンと反応させて、アデ
ノウイルスゲノム、実施例６および図１１において以下に記載するｐＡｄＥｘｐ
を保有する発現プラスミドを生成することができる。

【００９８】したがって本発明は、特徴的な表現型を誘導する生理学的または遺伝学的効果
と関係のある配列を、立証または同定するための新規な方法である。さらに具体
的には、その配列は遺伝的欠陥を生み出す遺伝子、または遺伝的異常の指標また
は特徴である遺伝子であってよい。

【００９９】機能的ゲノム活性のコンテクスト内で、１つまたは複数の配列の機能を立証ま
たは判定するための適用例では、配列は任意の性質のもの、特に前述の配列であ
ってよいが、知られていない非常にさまざまな性質の任意の配列の群に由来する
ものであってもよい。これらの配列は、後に所望のアデノウイルスゲノム中に導
入されるために、異なるカセット中に並列していてもよい。

【０１００】これらの配列は任意のタイプの生きている細胞から誘導するか、または新生経
路、突然変異誘発、配列の組み合わせなどのさまざまな方法によって人工的に生
成させることができる。

【０１０１】本発明のコンテクスト内で、多数のライブラリーをヌクレオチド配列の源とし
て使用することができる。ライブラリーにはゲノムＤＮＡライブラリー（たとえ
ばＹＡＣまたはＢＡＣ中のライブラリーを含めた、特に染色体領域のライブラリ
ー）、ｃＤＮＡライブラリーおよび合成ＤＮＡライブラリーがあり、これらのラ
イブラリーは標準化されている（またはされていない）か、あるいはセンスまた
はアンチセンス発現用の異なる生体組織、ランダムに生成されさまざまな性質を
生み出すことができる配列、知られている配列から作製した縮重配列、知られて
いる配列のモザイク配列などから作製されるが、これらだけには限られない。

【０１０２】詳細には、研究されるプライマリー配列は遺伝子抑圧用のアンチセンス分子ま
たは要素を生成することができる。これらは、発現されると研究中の生物学的系
内の特定の遺伝子を不活性化させることができる配列である。この配列はリボザ
イム配列であってよい。

【０１０３】さまざまな合成方法から、ライブラリーを作製するために使用する配列を誘導
することができる。詳細には、組換えを使用する制御された分子進化のシミュレ
ーションによって、同定されている進化のメカニズムを使用して、さまざまな遺
伝子を生成させることができる（Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎＢｉｏｔｅｃｈ．１９
９７、８：７２４−７３３）。

【０１０４】ヒトゲノムからのデータを記録しているデータベースの生物学的情報の分析か
ら、ライブラリーを作製するために使用する配列を誘導することもできる。さま
ざまな方法（ＥＳＴ、ミクロ配列、ＤＮＡチップ、ディファレンシャルディスプ
レイ）によって得られる遺伝子発現の分析を使用して、これらの配列を選択する
ことができる。ＴＩＢｔｅｃｈ１９９６、１４ｐ２９４−２９８；Ｎａｔｕ
ｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９８、１６、ｐ２７−３１。

【０１０５】詳細には、この方法によってランダムなペプチド配列の発現用のアデノウイル
スライブラリーを生成することができる。したがってこのことは、当該のタンパ
ク質に結合することができるランダムなペプチド配列の選択および同定を容易に
する。ランダムな配列のオリゴヌクレオチドのライブラリーが天然または合成タ
ンパク質の柔軟なループに対応する（ポリリンカー）部位に導入され、その結果
ペプチドがタンパク質の表面に現れる。このことはこれらのペプチドが細胞内で
（Ｃｏｌａｓ他、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ３８０：５４８−５５０）、または
細胞の表面に（Ｔｒａｍｏｎｔｏ他、１９９４、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ
．７：９−２４）現れたということであってよい。最後に、分泌シグナルを発現
カセットに挿入することによって、ペプチドが細胞の外側に現れてもよい（Ｒｉ
ｃｅ他、１９９２、ＰＮＡＳ８９、５４６７−５４７１）。

【０１０６】１つまたは複数の当該の配列をベクター中に組み込むことができる。

【０１０７】配列（発現カセット）の組み合わせを評価すること、または当該の配列を他の
当該の遺伝子、たとえばマーカー遺伝子と同時発現させることが最終的に問題と
なる可能性がある。したがって、ポリシストロン配列を使用するため、または発
現される配列を当該の配列のゲノムと異なるアデノウイルスゲノム中の位置に配
置するために、それを決定することができる。さまざまなポリシストロン配列を
使用することができる。ＩＲＥＳ要素によって、２つ以上のオープンリーディン
グフレームを１つのｍＲＮＡから効率的に翻訳することができる。特に、１つの
オープンリーディングフレームは当該のタンパク質（ｃＤＮＡライブラリーから
誘導される）をエンコードしているが、もう１つのオープンリーディングフレー
ムはＧＥＰなどのマーカーをエンコードしている。

【０１０８】この方法によって、酵素活性に関係がある切断／組み込みシステムを使用する
ことが可能になる。このシステムはＣＲＥ−Ｌｏｘシステム（Ｂａｕｂｏｎｉｓ
他、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：２０２５−２０２９）、ＦＬＰリコ
ンビナーゼ−ＦＲＴシステム（Ｄａｎｇ他、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｔ．１３；３６７−
３７５）、ＭｏｒａｘｅｌｌａｌａｃｕｎａｔａＰｉｖシステム（Ｌｅｎｉ
ｃ他、１９９４、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７６−４１６０）またはラムダイ
ンテグラ−ゼシステム（Ｋｗｏｎ他、１９９７Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６、１２
６）であってよい。より具体的には、ｃＤＮＡを発現している配列またはカセッ
トが複製しているエピソームベクターに結合し、アデノウイルスゲノムのＣＲＥ
−ｌｏｘシステムによって切断され、分裂している感染細胞に運ばれるはずであ
る（ＷＯ９７／４７７５７）。

【０１０９】この方法によって、ＤＮＡ−タンパク質相互作用の検出が容易になる。したが
ってライブラリーは、ＤＮＡに結合することができる配列の群に対応する。これ
らの配列は、元来ＤＮＡに結合することができるタンパク質に由来するポリペプ
チド、または人工的なポリペプチドのいずれかである。所与のＤＮＡ配列に最も
特異的な配列が求められる。

【０１１０】この方法によって、タンパク質−タンパク質相互作用を検出することができる
。アデノウイルスベクターの同時感染する能力が使用される。ＬａｃＺ相補性試
験を行うことが好ましい（ＰＮＡＳ１９９７、９４、８４０５−８４１０）。
細胞系は第１の構築体およびｃＤＮＡライブラリーと同時感染する。

【０１１１】本発明のアデノウイルス発現ライブラリーを分析するために、非常にさまざま
な数の機能性試験を行うことができる。

【０１１２】たとえば、その発現が所望の細胞表現型につながるライブラリーに由来するヌ
クレオチド配列を同定することにある、相補性試験を使用することができる。よ
り具体的には、アデノウイルス発現ライブラリーを使用して、表現型形質に異常
があるヒト細胞を感染させることができる。したがって感染した細胞の分析およ
びその細胞の特定によって、所望の表現型形質が示される。ウイルスによって保
有されるｃＤＮＡの分析は、表現型形質の出現を担っている。アンチセンス活性
または機能的ノックアウトが原因である、感染後の表現型形質の消失を測定する
ことも可能である。

【０１１３】この方法は、生物学的な系における化学分子の作用の形態の研究を容易にする
。アデノウイルス発現ライブラリーを使用して、薬剤の作用に応答する生物学的
な系の細胞を感染させる。感染後、薬剤の効果が変わらない、増大する、または
阻害される可能性がある。後者の２つの場合、ウイルスゲノムによって保有され
ているｃＤＮＡ分子を分析することによって、化学的化合物の影響を伴なう細胞
内および／または細胞外経路の発見が容易になる。

【０１１４】したがって本発明の方法は、以下のことのために行うことができる。

【０１１５】成長およびアポトーシス停止のプロセスにおけるｐ５３の影響を避けることが
できる核酸（標的）を探すこと、サイトカインを同定すること、細胞プロセスに影響を与える合成ペプチドを同定すること、細胞外でペプチドであることができる分子を探すこと、いかなる特異的な腫瘍抑制も示さない腫瘍細胞の標的を同定すること、転移のプロセスに関する遺伝子を同定すること。

【０１１６】本発明は、第１の切断型アデノウイルスゲノムを含むシャトルプラスミド、第２の切断型アデノウイルスゲノムを含む親プラスミド、を含むキットにも関し、２つの切断型アデノウイルスゲノム間の相同的組換え
によってこの２つのプラスミドを生成することができ、前記ゲノム中に存在しな
い１つまたは複数の制限部位の側面に位置する完全な線状の組換えアデノウイル
スゲノムを含む最終的なプラスミドも含む。

【０１１７】以下の実施例によって、本発明をより完全に記載する。これらの実施例は例示
的なものであり、制限的なものであるとみなすべきではない。

【０１１８】図の説明図１は本発明の原理を示す図である。それぞれ相補的な断片を有するシャトル
プラスミドｐＪＪ１および親プラスミドｐＯＳＥ１は、大腸菌中の相同的組換え
によって凝集体を形成し、これによって外来性の配列を保有する完全な組換えア
デノウイルスゲノムが生成する。ＫｍＲ：カナマイシン耐性の遺伝子。Ｔｅｔ
Ｒ：テトラサイクリン耐性の遺伝子。ＲＫ２Ｏｒｉ：プラスミドＲＫ２からの
複製の起点。ＲＫ６Ｏｒｉ：プラスミドＲＫ６からの複製の起点。

【０１１９】図２は、シャトルプラスミド中で構築されたｃＤＮＡライブラリーに由来する
ｃＤＮＡを保有する、９６の組換えアデノウイルスの同時生成を示す図である。
ＯＳＥＤＲＡＧ技術の性質を適用する。

【０１２０】図３は、本発明による親プラスミドを得るためのＥＤＲＡＧ技術（Ｃｒｏｕｚ
ｅｔ他）の使用を示す図である。このプラスミドは不完全体を保有し、してがっ
て非機能的なアデノウイルスゲノム配列である。プラスミドｐＪＪ３０１、ｐＸ
Ｌ３２１５およびプラスミドｐＯＳＥ１７−００のマップを示す。

【０１２１】図４は、親プラスミドの異なる形のマップを示す図である。本発明によってこ
のプラスミドを使用して、異なる形の組換えアデノウイルスベクター、特にＥ１
およびＥ３が欠失しているベクター（ｐＯＳＥ１０−００）、Ｅ１およびＥ３が
欠失しておりその同一遺伝子＃２の形のｐＩＸ領域を備えるベクター（ＷＯ９９
／２５８６１）（ｐＯＳＥ１７−００）、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４が欠失している
ベクター（ｐＯＳＥ３０−００）、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４が欠失しておりその同
一遺伝子＃２の形のｐＩＸ領域を備えるベクター（ｐＯＳＥ３７−００）を生成
することができる。

【０１２２】図５は、ＬａｃＺ遺伝子を発現するためのカセットを保有する組換えアデノウ
イルスゲノムを得るための、本発明の方法の使用を示す図である。シャトルプラ
スミドｐＩＧ５、親プラスミドｐＯＳＥ１７−００および最終プラスミドｐＡｄ
１７−０１のマップを示す。プラスミドｐＩＧ５、ｐＯＳＥ１７−００およびｐ
Ａｄ１７−０１のマップを示す。

【０１２３】図６は、３つの異なるシャトルプラスミドによってアデノウイルスゲノムを得
るための、本発明の方法の使用を示す図である（ｐＩＧ５：ＬａｃＺ遺伝子を発
現するためのカセットを保有する、プラスミドｐＩＧ１８：ルシフェラーゼ遺伝
子を発現するためのカセットを保有する、ｐＩＧ７：いかなる発現カセットも有
していない）。シャトルプラスミドおよび親プラスミドの同時形質転換から生じ
たクローンの酵素による消化を示す。

【０１２４】図７は、アデノウイルスベクターを得て、その後プラスミドｐＡｄ１７−０１
の異なるクローンを２９３の生産者細胞にトランスフェクションするための本発
明の方法の使用を示す図である。２９３細胞中で増幅したウイルスから精製した
ウイルスＤＮＡの酵素による消化を示す。

【０１２５】図８は、シャトルプラスミドｐＴＡ００中のｃＤＮＡのプライマリーライブラ
リーによって生じた、アデノウイルスゲノムのライブラリーを得るための本発明
の方法の使用を示す図である。ｐＯＳＥ３７−００に由来するプラスミドである
親プラスミドｐＯＳＥ３７−１０を使用して、アデノウイルスゲノムのライブラ
リーを得る。プラスミドｐＴＡ００、ｐＯＳＥ３７−１０およびｐＡｄ３７−１
０のマップを示す。

【０１２６】図９は、発現プラスミド、すなわちｐＡｄＧＷＥｘｐＬａｃＺの獲得を示す図
である。プラスミドｐＳＨＥｘｐＬａｃＺおよびＰｘ１２６８９を相同的に組換
えることによって、これはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）システム（ＬＴＩ、Ｒｏ
ｃｋｅｖｉｌｌｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）と適合する。

【０１２７】図１０は、デスティネーションプラスミド、すなわちｐＡｄＤＥＳＴを得るた
めのいわゆるＢＰ反応の使用を示す図である。このプラスミドは完全なアデノウ
イルスゲノムを保有しており、大腸菌にとって致死的であり組換え部位ａｔｔＲ
１およびａｔｔＲ２によって囲まれている遺伝子ｃｃｄＢを有している。

【０１２８】図１１は、いわゆるＬＲ反応による、当該の挿入体を保有するアデノウイルス
プラスミドｐＡｄＥｘｐの獲得を示す図である。

【０１２９】一般的なクローニング、分子生物学的および細胞生物学的技法塩化セシウム−臭化エチジウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、制限
酵素による消化、ゲル電気泳動、大腸菌への形質転換、核酸の沈殿などの従来型
の分子生物学的方法は文献中に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９
）。

【０１３０】ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）によって
酵素が提供された。連結のために、０．８〜１．５％アガロースゲル上でその大
きさに従ってＤＮＡ断片を分離させ、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１、Ｌａ
ＪｏｌｌａＣＡ）を使用して精製し、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下
で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭＭｇｃｌ_２、１０ｍＭ
ＤＴＴ、２ｍＭＡＴＰバッファー中において１４℃で一晩インキュベートした
。

【０１３１】コンピテントにした大腸菌菌株ＴＧ１〔Δ（ｌａｃｐｒｏＡ、Ｂ）、ｓｕｐ
Ｅ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ^＋、Ｂ^＋、ｌａｃｌ^ｑ、
ｌａｃＺΔＭ１５〕（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２）、大腸菌Ｔｏｐ１０菌株
細胞（Ｔｏｐ１０ＯｎｅＳｈｏｔｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｎｅｔ
ｈｅｒｌａｎｄｓ）または大腸菌ｐｏｌＡ菌株ＳＦ８００（Ｈｅｆｆｒｏｎ他、
１９７７）を形質転換するために、連結したＤＮＡを使用する。

【０１３２】以下の列挙事項：変性温度９５℃、ハイブリダイゼーション温度５５℃、延長
温度７２℃を使用して、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８９に記載されるようにＰ
ＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅も行った。ＰＴＣ−２００Ｐｅｌｔｉｅｒ
ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｓｓａｃｈｕ
ｓｅｔｔｓ、ＵＳ）中で、このサイクルを２５回繰り返した。

【０１３３】ＧＥＮＳＥＴ社（Ｅｎｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）によって、オリゴヌクレオチドが
合成された。ＥＳＧＳ社（Ｅｎｒｙ、Ｆｒａｎｃｅ）によって、配列決定が行わ
れた。

【０１３４】実施例実施例１：親プラスミドの構築この実施例では、非適合型グループＰに属し大腸菌中で複製するプラスミド中
での、ヒトタイプ５アデノウイルスゲノムの獲得を記載し、このゲノムはその５
’部分が切断されＥ１およびＥ３領域が欠失しており、その３’部分は独特な制
限部位の側面に位置する。

【０１３５】本発明によるプラスミドは、いくつかの異なる方法で構築することができる。
好ましい方法によれば、プラスミドｐＸＬ３２１５およびｐＪＪ３０１を使用し
てＥＤＲＡＧ法（ＦＲ２，７３０，５０４）に従い、プラスミドｐＯＳＥ１７−
００が構築される。プラスミドｐＸＬ３２１５はＡＤゲノムすべて（Ｅ１および
Ｅ３領域中の２箇所の欠失がない）を含み、Ｅ１領域中でＲＳＶプロモーターの
制御下でＬａｃＺ遺伝子を発現するためのカセットを有する。プラスミドｐＸＬ
３２１５はプラスミドｐＸＬ２６８９の誘導体であり、プラスミドＲＫ２からの
複製の起点およびテトラサイクリン耐性遺伝子を含む（Ｊ．ＣｒｏｕｚｅｔＰ
ＮＡＳ、１９９７）。

【０１３６】プラスミドｐＪＪ３０１は複製のＲ６Ｋ起点を有し、大腸菌ｐｉｒ−菌株中で
複製することはできない。プラスミドｐＪＪ３０１はカナマイシン耐性遺伝子を
有する。プラスミドｐＪＪ３０１は、ｐＯＳＥ１７−００によって保有されてい
るアデノウイルスゲノムの起点と相同性がある領域を有する。この領域は、同一
遺伝子＃２と呼ばれ（ＷＯ９９／２５８６１）に記載されるｐＩＸ領域の特別な
形である。

【０１３７】この配列の上流には、プラスミドｐＸＬ３２１５中の完全なアデノウイルスゲ
ノムの上流の領域と相同性がある配列が挿入される。プラスミドｐＸＬ３２１５
とｐＪＪ３０１の間の二重組換えによって、ｐＯＳＥ１７−００が生じる。この
プラスミドｐＯＳＥ１７−００は本発明の意味の範囲内の親プラスミドに対応し
、図３中で図式的に示される。

【０１３８】同じスキームを使用して、他の親プラスミド（ｐＯＳＥ１０−００、ｐＯＳＥ
３０−００、ｐＯＳＥ３７−００）が構築されており、これによってＥ１および
Ｅ３領域が欠失しているアデノウイルスゲノムが生成する（野生型ｐＩＸ領域形
または縮重ｐＩＸ形（ＷＯ９９／２５８６１）、またはＥ１、およびＥ３および
Ｅ４領域が欠失しているアデノウイルスゲノム（野生型ｐＩＸ領域形または縮重
ｐＩＸ領域形（図４）））。

【０１３９】実施例２：シャトルプラスミドの構築この実施例では、ヒトタイプ５アデノウイルスゲノムの５’領域（ＩＴＲ領域
およびタンパク質外殻で包まれた領域）を保有するシャトルプラスミドの獲得を
記載し、この領域はＰａｃＩ制限部位に先行する。

【０１４０】前記プラスミドは複製のＲＫ６起点を有し、大腸菌中で複製することはできず
、ｐｉｒタンパク質についてトランス相補することができない。前記プラスミド
ｐＩＧ５はＬａｃＺを発現するためのカセットを含み、これはｐＯＳＥ１７−０
０中に存在する配列（ｐＩＸＩｖａ２領域の一部分に対応する配列）と相同的
な配列に先行する。このプラスミドは本発明の意味の範囲内でシャトルプラスミ
ドと呼ばれ、カナマイシン耐性遺伝子を有する（図５）。

【０１４１】実施例３：機能的組換えアデノウイルスゲノムの生成この実施例では、大腸菌中で複製するＰ非適合型グループでありＬａｃＺ遺伝
子を発現するためのカセットを保有するプラスミド中での、ヒトタイプ５アデノ
ウイルスゲノムの獲得を記載し、このゲノムはＥ１およびＥ３領域が欠失してお
り、その末端がＰａｃＩ制限部位の側面に位置する。

【０１４２】選択する組み込み戦略は、大腸菌菌株中でｐＯＳＥ１７−００とｐＩＧ５の間
の相同的な組換えを行う戦略である。大腸菌菌株ＪＭ８３Ｒｅｃ^＋ＬａｃＺ⁻の
細胞に、プラスミドｐＯＳＥ１７−００を導入した。次に、テトラサイクリン耐
性クローンに由来する細胞に反応能を与え、プラスミドｐＩＧ５を用いて形質転
換し、次いでテトラサイクリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢ培地上に拡散
させた。プラスミドｐＩＧ５がＪＭ８３菌株中で複製しないとすれば、テトラサ
イクリンおよびカナマイシン耐性の獲得は、２つのプラスミド間で起こる相同的
な組換えによってのみもたらすことができる。２つのプラスミドはＡｄ５ゲノム
のｐＩＸ領域を共通に有しているので、このことは起こりうる。結果として生じ
るプラスミドは、ＰａｃＩ部位の側面に位置する組換えアデノウイルスベクター
の完全なゲノムを有している。酵素ＰａｃＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化
すると、ＥｃｏＲＩまたはＰａｃＩおよびＤｒａＩによって、予期したプラスミ
ド構造が得られたかどうかチェックすることが可能である。機能的アデノウイル
スゲノムを保有するこの最終プラスミドを、ｐＡｄ１７−０１と指定した（図５
）。

【０１４３】同様にして、プラスミドｐＩＧ５およびプラスミドｐＯＳＥ３７−００が、Ｅ
１、およびＥ３およびＥ４が欠失しておりその同一遺伝子＃２の形のｐＩＸ領域
を備える完全なアデノウイルスゲノムを有するプラスミドを生成する（ＷＯ９９
／２５８６１）。

【０１４４】同じ戦略を使用して、発現カセットを保有する（または保有しない）同じファ
ミリーの他の組換えゲノムを構築することも可能である。ｐＩＧ７およびｐＩＧ
１８が使用され、これらはｐＩＧ５に由来する。ｐＩＧ７はいかなる発現カセッ
トも有していないが、ｐＩＧ１８はルシフェラーゼ遺伝子を発現するためのカセ
ットを有している。発現カセットが細菌染色体のゲノム配列と配列相同性を示さ
ない限り、クローンは１００％陽性であると考えられる。図６中に示すように、
これらの実験の終期に分析したクローンは１００％、予期したヌクレオチド構造
を実際に示すこととなった（図６）。

【０１４５】ＰａｃＩを用いてｐＡｄ１７−０１を消化し、これによって組換えアデノウイ
ルスのゲノムが切り離された。アデノウイルスのＥ１機能に関してトランス相補
的であるホ乳類細胞（２９３細胞）をトランスフェクトするためなどに、この消
化による生成物を使用することができる。

【０１４６】実施例４：組換えアデノウイルスの生成（ｉ）１つまたは複数の遺伝子およびこれらの遺伝子を発現するための適切な
調節シグナルを含む断片を、研究中のホ乳類細胞に挿入すること、（ｉｉ）アデ
ノウイルスのゲノムのある断片を欠失させること、またはこれら２つのことを組
み合わせることによって、組換えアデノウイルスクローンを大腸菌中で構築する
ことができ、したがって生産者細胞がトランスフェクトされた後に、このような
組換えウイルスのストックを得ることが可能である。

【０１４７】プラスミドｐＡｄ１７−０１を、形質転換され反応能力のある大腸菌ＤＨ５細
胞の培養物から精製する。酵素ＰａｃＩの存在下で消化することによって、アデ
ノウイルスゲノムを切り離す。組換えアデノウイルスを生成するために、この消
化産物を直接使用する。このため、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅ
ｒｍａｎｙ）の存在下で、消化されるｐＡｄ１７−０１から得られる産物を用い
て２９３細胞株の細胞をトランスフェクトする。この組換えアデノウイルスを２
９３細胞株中で増幅させ、約１０^１０ｐｆｕ／ｍｌのタイターを有する未精製組
換えアデノウイルスを含む培養上澄み液がその結果生じる。

【０１４８】増幅したウイルスに由来するＤＮＡを精製した後、酵素による消化によってウ
イルスＤＮＡの適合性を確認する（図７）。

【０１４９】次いで知られている技法（特にＧｒａｈａｍ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（１９
７３）４５６を参照のこと、すなわちクロマトグラフィによる）を使用する、塩
化セシウム勾配上での遠心分離によって、ウイルス粒子を精製する。２０％グリ
セロール中において−８０℃で、アデノウイルスを保存することができる。

【０１５０】実施例５．アデノウイルス発現ライブラリーの構築次に使用するシャトルプラスミドのプライマリーライブラリーを相同的な組換
えによって得るため、複製のＲＫ２起点を有するプラスミド中で組換えアデノウ
イルスゲノムのライブラリーを得るために、複製のＲＫ６起点を備えるシャトル
プラスミドを使用する。次いで組換えアデノウイルスゲノムのこのプラスミドラ
イブラリーをトランス相補的な生産者細胞中にトランスフェクトして、組換えア
デノウイルスのライブラリーを得る。

【０１５１】一連のステップを図２に図式的に示し、アデノウイルス発現ライブラリーを得
るために使用するプラスミド構造を図８に示す。

【０１５２】実施例５．１シャトルベクター中でのｃＤＮＡライブラリーの作製シャトルベクター（ｐＩＧ５の誘導体であり、その中ではＬａｃＺ遺伝子が切
断されマルチクローニングサイト、特にＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩ部位に置き換
えられている）中にライブラリーを作製するために、セシウム勾配精製したベク
ター１０〜２０μｇを、３７℃で９０分間、１μｇあたり５Ｕの酵素ＸｈｏＩお
よびＥｃｏＲＩを用いて消化する。その消化物をアガロースゲル（１％Ｓｅａ
ｋｅｍＧＴＧ）上に載せ、線状化したベクターをＴＡＥバッファー中において
電気泳動によって分離する。ベクターに対応するバンドを切断し、次にＵＶテー
ブル上で視覚化する。アガロースからベクターを溶離させ（Ｑｉａｑｕｉｃｋ
ＤＮＡＣｌｅａｎｕｐＳｙｓｔｅｍ、Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、
フェノール／クロロホルム抽出によって精製し、次にエタノールを用いて沈殿さ
せる。ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化した試験挿入体の連結後、このベ
クターは１μｇあたり約５００万個のクローンを生じ、バックグラウンドは１０
％未満である。

【０１５３】ｃＤＮＡ分子の作製：ｍＲＮＡが豊富なＲＮＡ群を使用して、ｃＤＮＡを合成
する。ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩトランスクリプターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）および５’端にＸｈｏＩ部位の配列を有するオリゴｄＴプライマーを使用
して、標準的なプロトコルに従って第１の鎖を合成する。ＲＮＡｓｅＨおよび
大腸菌ＤＮＡリガーゼの存在下で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ酵素を使用して
、第２の鎖を合成する。第２の鎖によって生じた末端を、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼの作用によって充填する。

【０１５４】前に記載した（Ｓｏａｒｅｓ他、ＰＮＡＳ、９１：９２２８−９２３２）Ｂｉ
ｏｇｅｌＡ５０Ｍを使用するゲル濾過クロマトグラフィによって、ｃＤＮＡ分
子をサイズ分別する。サイズ分別したｃＤＮＡ分子を市販のＥｃｏＲＩアダプタ
ー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結させ、次いでＥｃｏＲＩを用いて消化して（
５’）ＥｃｏＲＩおよび（３’）ＸｈｏＩ端を備えるｃＤＮＡ断片を作製する。
ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でのクロマトグ
ラフィによって、連結していないアダプターを取り除く。アダプターを保有して
いるｃＤＮＡ分子をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用してリン酸化し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを使用し１６℃で４８時間かけて、前述のように作製した（１０
〜２０μｌの体積中にベクター６００ｎｇおよび挿入体３００ｎｇ）シャトルベ
クターのＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に連結させる。ライブラリーをｐｉｒ．
１１６＋菌株中にエレクトロポレーションすることによってライブラリーを増幅
させ、これによって複製のＲＫ６起点を有するプラスミドの複製が可能になり、
次いで直径１５０ｍｍの１００個のディッシュ中のカナマイシンを含む寒天ＬＢ
培地上にこの菌株を拡散させる。５００万個のクローンのライブラリーを得る。
次いでシャトルプラスミド中のプライマリーｃＤＮＡライブラリーを、Ｓｏａｒ
ｅｓ他．１９９４によって記載されるプロトコルに従って標準化する。クローン
の発現プロファイルを判定することができる技術を使用して、たとえばＡＮＤチ
ップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、Ａｆｆｙｍ
ｅｔｒｉｘ）を使用して、次いでクローンのサブセットを選択ステップにかける
ことができる。

【０１５５】シャトルプラスミド中の標準化したｃＤＮＡライブラリーに由来する選択した
クローンを、９６穴ウエルのミクロプレート中に１ウエルあたり１クローンの割
合で配置する。適切な抗生物質（カナマイシン）の存在下で、これらのクローン
を液体培地（ＬＢ）中で増幅させる。Ｑｕｉａｇｅｎｒｏｂｏｔ（Ｑｕｉａｇ
ｅｎＢｉｏｒｏｂｏｔ９６００）およびＱｕｉａｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂ
ｏＢｉｏｒｏｂｏｔｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して
、９６の培養サンプルのバッチ中のそれぞれのクローンからのＤＮＡを同時に作
製する。ＤＮＡサンプルを５０μｌのＴＥｘｌ中に取り出す。９６のプラスミド
ＤＮＡサンプルを、それぞれのいわゆる主要プレート中に配置する。

【０１５６】実施例５．２ｃＤＮＡ分子を保有する機能的アデノウイルスゲノムのプラス
ミドライブラリーの作製ＲＫ２プラスミド（ｐＯＳＥ３７−００）によって保有されている親アデノウ
イルスゲノムを、従来の形質転換によってＪＭ８３菌株に導入する。プラスミド
（ＪＭ８３ｘｐＯＳＥ３７−００）を宿しているこの菌株の培養物に、１００ｍ
ＭのＣａＣｌ_２中での連続的な洗浄を含む標準的な技法によってコンピテントに
する。

【０１５７】コンピテント細胞（ＪＭ８３ｘｐＯＳＥ３７−００）を、９６穴ウエルのミク
ロプレート中に１ウエルあたり４０μｌの割合で分布させる。それぞれのシャト
ルプラスミドのＤＮＡをこの菌株に形質転換して、機能的アデノウイルスゲノム
を生成する相同的な組替え体を得る。次いでいわゆる主要プレートから誘導され
るＤＮＡ５μｌを、レイアウトに付着させながら反応能力のある細胞４０μｌに
加える。プレートを１分間かけて４２℃にし、次いで氷上に２分間置いた。２つ
の適切な抗生物質（カナマイシンおよびテトラサイクリン）を含む培地（ＬＢ）
１ｍｌを、ウエル毎に加える。最初に細胞を６時間生育させ、その後この第１の
成長体５０μｌを使用して、ウエル毎に２つの適切な抗生物質（カナマイシンお
よびテトラサイクリン）を含む培地（ＬＢ）１ｍｌを備える、新しい９６穴ウエ
ルのプレートに植え付ける。次いで１４時間培養を続ける。

【０１５８】Ｑｕｉａｇｅｎｒｏｂｏｔ（ＱｕｉａｇｅｎＢｉｏｒｏｂｏｔ９６００
）およびＲ．Ｅ．Ａ．Ｌ．Ｐｒｅｐ．９６Ｂｉｏｒｏｂｏｔｋｉｔを使用し
て、この後者の成長から生じるプラスミドＤＮＡを精製し、イソプロパノール中
での沈殿の前に、これにＱｕｉａｗｅｌｌ９６ＵｌｔｒａＢｉｏｒｏｂｏ
ｔｋｉｔに由来するＱｕｉａｗｅｌｌ分離ステップを加える（Ｑｕｉａｇｅｎ
、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＤＮＡを５０μｌのＴＥｘｌ中に取り出す。

【０１５９】次いでそれぞれのＤＮＡ（約０．４μｇ）２０μｌを、レイアウトに付着させ
ながら新しい９６ウエルのプレートに移す。このＤＮＡを酵素ＰａｃＩを用いて
消化して、ウイルスゲノムを切断する。反応混合物１０μｌ（Ｎｅｌバッファー
３μｌ、Ｈ２０６μｌ、ＰａｃＩ１μｌ（２．５Ｕ））に、ウエル当たり２
０μｌのＤＮＡを加える。反応は３７℃で１時間３０分かけて行う。プレートを
遠心分離にかけて、次のステップのために使用するまで−２０℃で凍結させる。

【０１６０】アデノウイルスゲノムを切断するためにウイルスＤＮＡはＰａｃＩを用いて消
化しなければならず、次いでトランス相補的な真核細胞へトランスフェクトして
ウイルスライブラリーを生成する。

【０１６１】実施例５．３アデノウイルス発現ライブラリーの獲得ＰａｃＩで消化したＤＮＡサンプルを保有する９６ウエルのプレートを周囲温
度にする。Ｅｎｈａｎｃｅｒ２μｌおよびＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｅｆｆｅｃｔｅ
ｎｅＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ、Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）５０μｌを、それぞれのウエル中に存在するＰａｃＩで消化したＤＮＡ
３０μｌに加える。次いでトランスフェクトする混合物を９６ウエルまたは４８
ウエルプレートのウエルに分布させるか、またはＩＧＲＰ２細胞（ＷＯ９６／２
２３７８）を１ｃｍ^２当たり１０^５個の細胞の割合で植え付ける。

【０１６２】トランスフェクションから１４日後、ウエル当たり培養上澄み５０〜７５μｌ
を取り除き、新鮮に植え付けたトランス相補的な細胞の新しいプレートを感染さ
せるための接種原として使用する。この増幅ステップを３〜５回繰り返して、ウ
エルのそれぞれにおいて得られるウイルスのタイターの相同性を保証する。ウエ
ルのそれぞれにおいて得られるタイターは、１ｍｌ当たり５×１０^８と５×１０ ^９の間のウイルス粒子である。プレートを遠心分離にかけて、−２０℃で凍結さ
せる。

【０１６３】適切な生物学的系において、これらのウイルスを直接使用することができる。
細胞モデルをライブラリーを用いて感染させた後、機能的分析を決定し次いで行
う。使用する細胞モデルに応じて、プロアポトーシス、アンチアンギオゲニンま
たはアンチアポトーシス活性を探求することがより好ましい。ライブラリーの構
築中のクローン、したがってウイルスのレイアウトによって、機能的活性と関係
があるヌクレオチド配列に戻すこと、これによって新しい標的を定義することが
容易になる。

【０１６４】実施例６アデノウイルスゲノムを有しており、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって市
場に出されているＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングシステムと適合性が
あるプラスミドの構築プラスミドｐＳＨＥｘｐｌａｃＺを生成させる；これはｐＩｇ５タイプのシャ
トルベクター中にＣＭＶプロモーター、ａｔｔＢ１部位、ＬａｃＺ遺伝子、ａｔ
ｔＢ２部位およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を有する（図２）。このプラスミ
ドを得るために、ＬａｃＺ遺伝子に対応し、プラスミドｐＳＶ４０−ｌａｃＺ（
Ｐｒｏｍｅｇａ）に由来するｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＤｒａＩを用い
て消化し、ｐＥＮＴＲ１ＡのＸｍｎＩおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し、（このこ
とはＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって米国特許第５，８８８，７３
２号中に記載されている）、これによってプラスミドｐＥＮＴＲ−ＬａｃＺが生
成する。ｐＥＮＴＲ−ＬａｃＺとｐＤｅｓｔ１２．２の間のＬＲタイプの反応（
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニング技術）によって、ｐＥｘｐＬａｃＺ（
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の名称）が与えられる。サブクローニングの２
ステップが、ｐＳＨＥｘｐｌａｃＺの最終的な単離を容易にした：ｐＥｘｐｌａ
ｃＺのＮｃｏＩ／ＡｓｅＩ断片を、ｐＣＡ３５０（ｐＩＧ５の誘導体）のＡｓｅ
ＩとＮｃｏＩの間に挿入し、これによってプラスミドｐＳＨＥｘｐＬａｃＺが生
成する。最後に、ｐＳＥｘｐＬａｃＺのＰａｃＩ／ＳａｌＩ断片を、プラスミド
ｐＩＧ７（ｐＩＧ５の誘導体）のＰａｃＩとＳａｌＩ部位の間に挿入する。最終
的に、配列：ＣＭＶプロモーター、ａｔｔＢ１部位、ＬａｃＺ遺伝子、ａｔｔＢ
２部位およびＳＶ４０ポリアデニル化部位が、ＣＭＶ−ＬａｃＺカセットの代わ
りに、シャトルプラスミドｐＩＧ５中に位置する（実施例２）。このようにして
得たプラスミドをｐＳＨＥｘｐＬａｃＺと指定し、これを図９に示す。

【０１６５】ＥＤＲＡＧ法（ＦＲ２，７３０，５０４）に従い、プラスミドｐＳＨＥｘｐＬ
ａｃＺおよびｐＸＬ２６８９を使用して、ｐＡｄＧＷＥｘｐＬａｃＺと指定され
Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）システムと適合性があるプラスミドを次いで構築す
る。

【０１６６】Ｃｒｏｕｚｅｔ他（ＰＮＡＳ１９９７）によって記載されるプラスミドｐＸＬ
２６８９は、プラスミドＲＫ２の起点、テトラサイクリン耐性の遺伝子、および
Ｅ１およびＥ３の欠失体を有する感染性アデノウイルスゲノムを有する。プラス
ミドｐＸＬ２６８９とｐＳＨＥｘｐＬａｃＺの組換えによってプラスミドｐＡｄ
ＧＷＥｘｐＬａｃＺが生じ、これはアデノウイルスゲノム、およびＣＭＶプロモ
ーター、ａｔｔＢ１部位、ＬａｃＺ遺伝子、ａｔｔＢ２部位およびＳＶ４０ポリ
アデニル化部位を含む挿入体を保有している（図９）。

【０１６７】このようにして得られるプラスミドｐＡｄＧＷＥｘｐＬａｃＺは、大腸菌ファ
ージラムダの２箇所のａｔｔＢ組換え部位の間に、ＬａｃＺによって表される当
該の遺伝子を含み、ａｔｔＰ部位、カナマイシン耐性の遺伝子（Ｋｎ^Ｒ）および
大腸菌にとって致死的な遺伝子ｃｃｄＢを保有するＧａｔｅｗａｙ（登録商標）
システム（ｐＤＯＮＲ２０１）のドナーベクターと反応する。Ｇａｔｅｗａｙ（
登録商標）クローニング技術において使用される術語に従ってＢＰ反応と呼ばれ
る、この反応から生じるプラスミドをｐＡｄＤＥＳＴ（指定プラスミド）と指定
し、これを図１０に示す。

【０１６８】最後に、ａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２部位のために、プラスミドｐＡｄＤＥＳ
ＴはＧａｔｅｗａｙ（登録商標）システムのエントリークローンと反応し、この
クローンはいわゆるＬＲ反応によるａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２組換え部位によ
って囲まれた当該の挿入体を保有する。結果として生じるプラスミドをｐＡｄＥ
ｘｐと指定し、これは完全なアデノウイルスゲノムおよび当該の挿入体を保有し
ている（図１１）。

【表１】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の原理を示す図である。

【図２】シャトルプラスミド中で構築されたｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡ
を保有する、９６の組換えアデノウイルスの同時生成を示す図である。

【図３】本発明による親プラスミドを得るためのＥＤＲＡＧ技術（Ｃｒｏｕｚｅｔ他）
の使用を示す図である。

【図４】親プラスミドの異なる形のマップを示す図である。

【図５】ＬａｃＺ遺伝子を発現するためのカセットを保有する組換えアデノウイルスゲ
ノムを得るための、本発明の方法の使用を示す図である。

【図６】３つの異なるシャトルプラスミドによってアデノウイルスゲノムを得るための
、本発明の方法の使用を示す図である（ｐＩＧ５：ＬａｃＺ遺伝子を発現するた
めのカセットを保有する、プラスミドｐＩＧ１８：ルシフェラーゼ遺伝子を発現
するためのカセットを保有する、ｐＩＧ７：いかなる発現カセットも有していな
い）。

【図７】アデノウイルスベクターを得て、その後プラスミドｐＡｄ１７−０１の異なる
クローンを２９３の生産者細胞にトランスフェクションするための本発明の方法
の使用を示す図である。

【図８】シャトルプラスミドｐＴＡ００中のｃＤＮＡのプライマリーライブラリーによ
って生じた、アデノウイルスゲノムのライブラリーを得るための本発明の方法の
使用を示す図である。

【図９】発現プラスミド、すなわちｐＡｄＧＷＥｘｐＬａｃＺの獲得を示す図である。

【図１０】デスティネーションプラスミド、すなわちｐＡｄＤＥＳＴを得るためのいわゆ
るＢＰ反応の使用を示す図である。

【図１１】いわゆるＬＲ反応による、当該の挿入体を保有するアデノウイルスプラスミド
ｐＡｄＥｘｐの獲得を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 35/76 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA04 DA02 EA02 EA04 GA11 HA11 HA17 4B063 QA08 QQ13 QQ41 QQ79 QR33 QR79 QR80 QS38 4B065 AA26X AA90X AA95X AB01 AC20 BA02 CA44 CA46 4C087 AA03 BC83 CA09 CA12 CA20

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アデノウイルスの製造方法であって、ａ）少なくとも１つの異種核酸を含む第１の切断型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）組
換えアデノウイルスゲノムを含む第１のプラスミド（「シャトル」プラスミドと
言う）、好ましくは原核生物プラスミドを構築するステップ、ｂ）この第１のプラスミドを、第１のゲノムと相補的な第２の切断型組換えア
デノウイルスゲノムを含む第２のプラスミド（「親」プラスミドと言う）と接触
させて、相同的組換えにより、完全な組換えアデノウイルスゲノムを含む最終プ
ラスミドの製造を可能にするステップ、およびｃ）線状の完全な組換えアデノウイルスゲノムを最終プラスミドから切り出し
て、カプシド形成細胞系に導入し、完全な組換えアデノウイルスゲノムを組み込
んだ組換えアデノウイルスを製造するステップを含む前記方法。
【請求項２】製造された組換えアデノウイルスを用いて、核酸の性質を分析する目的では、細胞を含む生物学的材料に；異種核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを製
造する目的では、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｅｘｖｉｖｏの細胞培養物に；およ
び異種核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをｉ
ｎｖｉｖｏで製造する目的では、細胞、組織、器官または生物に；感染させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ステップａ）において、第１の切断型ゲノムが、ＩＴＲ、異
種核酸、アデノウイルス相同性領域、また、適宜、カプシド形成配列を含むこと
を特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】前記ＩＴＲが、アデノウイルスゲノムには存在しない制限酵
素認識部位により隣接されていることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】ステップａ）において、第２の切断型アデノウイルスゲノム
が、少なくとも１つのＩＴＲ、第１の切断型アデノウイルスゲノム中に存在する
のと同一のアデノウイルス相同性領域、および後者が第１の切断型アデノウイル
スゲノムに存在しない場合はカプシド形成配列を含むことを特徴とする請求項１
または２に記載の方法。
【請求項６】前記ＩＴＲが、アデノウイルスゲノムには存在しない制限酵
素認識部位により隣接されていることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】アデノウイルス発現ライブラリーの作製を目的とする、請求
項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】アデノウイルスＩＴＲ、異種核酸（またはこうした核酸のた
めの挿入部位）およびアデノウイルス相同性配列を含む切断型アデノウイルスゲ
ノムを含み、前記アデノウイルスＩＴＲがアデノウイルスゲノムには存在しない
制限酵素認識部位により隣接されていることを特徴とするシャトルプラスミド。
【請求項９】前記切断型ゲノムが、５’→ ３’の方向に、アデノウイル
スＩＴＲ、アデノウイルスカプシド形成部位、異種核酸（またはこうした核酸の
ための挿入部位）およびアデノウイルス相同性配列を含むことを特徴とする、請
求項８に記載のプラスミド。
【請求項１０】前記アデノウイルス相同性配列が、野生型または縮重アデ
ノウイルスタンパク質ｐＩＸをコードする配列の全部または一部を含むことを特
徴とする、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】前記切断型ゲノムが、左側ＩＴＲからｐＩＸおよび／また
はＩｖａ２タンパク質をコードする領域の末端まで、アデノウイルスゲノム配列
を含み、この領域において、Ｅ１領域の全部または一部を欠失しており、そこへ
異種核酸が挿入されていることを特徴とする、請求項１０に記載のプラスミド。
【請求項１２】前記切断型ゲノムが、５’→ ３’の方向に、アデノウイ
ルス相同性配列、異種核酸およびアデノウイルスＩＴＲを含むことを特徴とする
、請求項８に記載のプラスミド。
【請求項１３】前記アデノウイルス相同性配列がアデノウイルスｐＩＸタ
ンパク質をコードする配列の全部または一部を含むことを特徴とする、請求項１
２に記載のプラスミド。
【請求項１４】前記切断型ゲノムが、ｐＩＸタンパク質をコードする領域
から右側ＩＴＲまで、アデノウイルスゲノム配列を含み、この領域がアデノウイ
ルス配列に加えてまたはアデノウイルス配列に置換して挿入されている異種核酸
を含むことを特徴とする、請求項１２または１３に記載のプラスミド。
【請求項１５】ｐＩＸタンパク質をコードする領域が野生型アデノウイル
ス配列に対応することを特徴とする、請求項１０、１１、１３または１４のいず
れか一項に記載のプラスミド。
【請求項１６】ｐＩＸタンパク質をコードする領域が縮重型のアデノウイ
ルス配列に対応することを特徴とする、請求項１０、１１、１３または１４のい
ずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１７】異種核酸が生物学的生成物をコードすることを特徴とする
、請求項８から１６のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１８】異種核酸が核酸ライブラリーからのクローンであることを
特徴とする、請求項８から１６のいずれか一項に記載のプラスミド。
【請求項１９】さらに抗生物質抵抗性遺伝子および複製起点を含み、好ま
しくはプラスミドｐＪＪ１またはｐＩＧ５であることを特徴とする、請求項９に
記載のプラスミド。
【請求項２０】請求項８から１９のいずれか一項に記載のプラスミド中に
クローン化された核酸ライブラリー。
【請求項２１】請求項８から１９のいずれか一項に記載のシャトルプラス
ミド中に存在する切断型組換えアデノウイルスゲノムと相補的である切断型組換
えアデノウイルスゲノムを含むことを特徴とする親プラスミド。
【請求項２２】さらに抗生物質抵抗性遺伝子および複製起点を含み、好ま
しくはプラスミドｐＯＳＥ１、ｐＯＳＥ１０−００、ｐＯＳＥ３０−００、ｐＯ
ＳＥ１７−００またはｐＯＳＥ３７−００であることを特徴とする、請求項２１
に記載のプラスミド。
【請求項２３】請求項８から１９および２１から２２のいずれか一項に記
載のプラスミドを１つまたは複数保有することを特徴とする、請求項２１に記載
のプラスミド。
【請求項２４】アデノウイルスライブラリーの作製方法であって、請求項８から１９のいずれか一項に記載のシャトルベクター中にプライマリー
ライブラリーを構築すること、請求項２１または２２に記載の親プラスミドの存在下、細菌培養物を前記プラ
イマリーライブラリーを用いて形質転換すること、およびｃ）得られたプラスミドまたは、酵素消化により切り出して得た完全なアデノ
ウイルスゲノムを、アデノウイルス産生細胞に導入することを含む前記方法。
【請求項２５】ライブラリー中の核酸の性質を分析する目的で、細胞を含
む生物学的材料に感染させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】プライマリーライブラリーが、ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡまたは
合成ＤＮＡのライブラリーから調製されることを特徴とする、請求項２４または
２５に記載の方法。
【請求項２７】プライマリーライブラリーが、ランダムまたはセミランダ
ムなオリゴヌクレオチドのライブラリーから調製されることを特徴とする、請求
項２４または２５に記載の方法。
【請求項２８】プライマリーライブラリーが、ＤＮＡに結合可能な配列の
ライブラリーから調製されることを特徴とする、請求項２４または２５に記載の
方法。
【請求項２９】ライブラリー中のクローンを個別に処理することを特徴と
する、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】プライマリーライブラリー中のクローンを個別に、マイク
ロプレートにおいて、細菌培養物にトランスフェクトさせることを特徴とする、
請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】細菌培養物が親プラスミドを保有するものであることを特
徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】ライブラリー中のクローンの機能の研究を目的とする、請
求項２４から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】遺伝子の探索を目的とする、請求項２４から３１のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項３４】ｃＤＮＡライブラリーに由来する核酸インサートを含むア
デノウイルスからなることを特徴とする、請求項２６に記載の方法によって得る
ことができるアデノウイルス発現ライブラリー。
【請求項３５】ｇＤＮＡライブラリーに由来する核酸インサートを含むア
デノウイルスからなることを特徴とする、請求項２６に記載の方法によって得る
ことができるアデノウイルス発現ライブラリー。
【請求項３６】合成ＤＮＡライブラリーに由来する核酸インサートを含む
アデノウイルスからなることを特徴とする、請求項２６に記載の方法によって得
ることができるアデノウイルス発現ライブラリー。
【請求項３７】ランダムまたはセミランダムなオリゴヌクレオチドのライ
ブラリーに由来する核酸インサートを含むアデノウイルスからなることを特徴と
する、請求項２７に記載の方法によって得ることができるアデノウイルス発現ラ
イブラリー。
【請求項３８】ＤＮＡに結合可能な配列のライブラリーに由来する核酸イ
ンサートを含むアデノウイルスからなることを特徴とする、請求項２８に記載の
方法によって得ることができるアデノウイルス発現ライブラリー。
【請求項３９】核酸またはタンパク質の生物学的機能を決定するための、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる組換えア
デノウイルスの使用。
【請求項４０】機能および／または構造が未知の核酸を分析するために発
現ライブラリーを構築することを目的とする、請求項１から６のいずれか一項に
記載の方法によって得ることができるアデノウイルスの使用。
【請求項４１】第１の切断型アデノウイルスゲノムを含むシャトルプラス
ミドと、第２の切断型アデノウイルスゲノムを含む親プラスミドとを含み、これら２種のプラスミドが、２種の切断型アデノウイルスゲノム間の相
同的組換えにより、線状の完全な組換えアデノウイルスゲノムであって前記ゲノ
ム中には存在しない１つまたは複数の制限酵素認識部位によって隣接されたゲノ
ムを含む最終プラスミドを生成し得るものであるキット。