MXPA02003247A - Preparacion de adenovirus recombinantes y de bancos adenovirales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion concierne a composiciones y metodos para la preparacion de adenovirus recombinantes. Los adenovirus producidos pueden ser utilizados para la transferencia y/o la expresion de genes en celulas, in vitro, ex vivo o in vivo, o igualmente en genomica funcional. En particular, la presente invencion concierne a metodos particularmente eficaces para la produccion de bancos adenovirales y la utilizacion de tales bancos en genomica funcional. Concierne igualmente a plasmidos utilizados para la construccion de estos adenovirus.

Description

• II? *?lvo, como el músculo (Ragot y colaboradores, Nature 361 (1993) 647, el hígado (Jaffe y colaboradores, Naturs genetics 1 (1992) 372), el sistema nervioso (Akli y colaboradores, Nature genetics 3 (1993 224), los tumores, el músculo liso, etc. Estas mismas propiedades hacen del vector adenoviral, un instrumento de selección, para explotar los datos de la genómica. La genómica funcional, se entiende como el campo de las ciencias, que se ocupa de explotar los genomas o los datos VO del genoma de organismos diversos, para traducirlos en términos de función. Teniendo en cuenta sus propiedades, los vectores adenovirales que contienen una secuencia exógena, * pueden ser utilizados para determinar la función de esta secuencia en diversos modelos experimentales. En particular, 15 los vectores adenovirales podrían ser utilizados para estudiar un objetivo terapéutico (en el sentido en el que lo entiende la industria farmacéutica) , en un modelo celular m vitro o m vivo en el animal. Cuando esta secuencia es conocida y caracterizada, los vectores adenovirales pueden ** 20 servir para la validación funcional de este objetivo. Más ampliamente, en el contexto llamado genómica funcional, el vector adenoviral de transferencia de gen, podría constituir un instrumento eficiente para identificar la función de una secuencia nucleica en un modelo experimental eucapota, sin i* ir ítt* O la función de esta secuencia, comprendidas en situaciones •**en las que numerosas secuencias deben ser estudiadas en ii masa . Sin embargo, la explotación industrial, terapéutica o en genómica funcional de los adenovirus está aún limitada, particularmente por los métodos actuales de preparación de estos virus recombinantes. En particular, los métodos disponibles actualmente no permiten producir, de manera simple, rápida y clonal, poblaciones de adenovirus que 10 incorporen ácidos nucleicos heterólogos, sobre todo, cuando numerosos ácidos nucleicos heterólogos deben de ser estudiados, como es el caso en genómica funcional. La presente invención aporta precisamente, una solución a estos problemas. La presente invención describe en efecto nuevos K instrumentos y nuevos métodos para la construcción de adenovirus recombinantes . La invención describe particularmente construcciones genéticas (plásmidos) , células, y protocolos que permiten producir adenovirus con una rapidez y una calidad importantes. La invención permite 20 más particularmente, realizar bancos adenovirales que comprendan un número elevado de ácidos nucleicos heterólogos. Un aspecto de la presente invención reside pues en la utilización de adenovirus recombinantes para determinar la 25 función biológica de un ácido nucleico o de una proteína.

Otro aspecto de la invención, reside en la utilización de adenovirus para la construcción de bancos de expresión, con el objetivo de analizar ácidos nucleicos de función y de estructura desconocidos. La invención concierne igualmente a bancos de expresión adenovirales, es decir poblaciones de adenovirus que comprendan insertos nucleicos provenientes de cualquier banco de ADN. La invención se relaciona igualmente con métodos e 10 instrumentos que permitan la producción de tales adenovirus, en particular de tales bancos, en particular ventajosamente, la construcción simultánea de adenovirus recombinantes a partir de bancos de ácidos nucleicos. Los adenovirus son virus de ADN de doble hebra lineal, 15' de un tamaño de 36 kb aproximadamente. Su genoma comprende particularmente una secuencia invertida repetida (ITR) en cada extremo, una secuencia de encapsidación (Psi), genes precoces y genes tardíos. Los principales genes precoces, están contenidos en las regiones El, E2, E3 y E . Entre 20 estos, los genes contenidos en la región El son necesarios para la propagación viral. La región E4, es igualmente importante en la regulación de la replicación del genoma adenoviral. Los principales genes tardíos están contenidos en las regiones Ll a L5. El genoma del adenovirus Ad5, ha 25 sido completamente secuenciado y es accesible sobre base de datos (ver particularmente Genbank M73260) . Asimismo partes, hasta la totalidad de otros genomas adenovirales, humanos o animales (Ad2, Ad7, Adl2, CAV-2, etc.) han sido igualmente secuenciados . Por otra parte, como se indicó anteriormente, los adenovirus han sido ya utilizados para la transferencia de genes in vivo. Para este efecto, han sido preparados diferentes vectores derivados de los adenovirus, incorporando diferentes genes (ß-gal, OTC, a-IAT, citocinas, enzimas, factores de crecimiento, etc.). En cada una de estas construcciones, el genoma del adenovirus ha sido modificado, a manera de volverlo incapaz de replicación y/o de propagación autónoma, después de transferencia genética. Así, las construcciones descritas en el arte anterior son adenovirus eliminados de una o varias regiones seleccionadas entre El, E2, E3, E4, pIX, Iva2, etc. Construcciones particulares son desprovistas de la región El, de las regiones El y E3, de las regiones El y E4, de las regiones El, E4 y E3, o aún de la totalidad de las regiones codificantes del adenovirus (vector "gutless"), por ejemplo. Estos vectores contienen generalmente un ácido nucleico heterólogo, cuya transferencia en las células o el estudio son investigados. Este ácido nucleico puede ser insertado en diferentes sitios en el genoma recombinante, en lugar de las Levrero y colaboradores, Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhuíy y colaboradores, Gene 50 (1986) 161, W094/ 12649, W094/ 28152, 094/28938, 095/34671, W096/ 10088, WO95/02697, WQ 5 95/27071, etc., incorporados a la presente como referencia. Los adenovirus reco binantes son producidos por transfección del ADN del virus recombmante en una línea celular de encapsidación competente. Puede tratarse de una transfección simple, cuando se puede disponer de una 10 construcción que contenga el conjunto del genoma del virus recombinante, o, como es el caso más frecuente, de una co- transfeccion de varios fragmentos de ADN, que aportan las diferentes partes del genoma viral recombinante . En ese caso, el procedimiento implica una o varias etapas de 15 recombmación homologa entre las diferentes construcciones en la linea celular de encapsidación, para generar el ADN del virus recombinante. Para la utilización de cualquiera de estos métodos, es pues necesario, disponer de las construcciones apropiadas, que contengan el conjunto o 20 partes del genoma del adenovirus recombmante, que se desea producir. Existen diferentes métodos descritos en el arte anterior para la preparación de estas construcciones m vitro. La técnica más generalmente utilizada consiste en !t§ aislar el ADN viral, luego en modificarlo m vitro por los i *** métodos clásicos de biología molecular (digestión, ligadura, etc.). Las construcciones obtenidas son a continuación purificadas y utilizadas para transfectar las líneas de encapsidación. Sin embargo, esta técnica implica la producción de reservas de virus y la purificación de ADN viral para cada construcción o para cualquier manipulación í, del ADN del virus recombmante, y no está pues adaptada a la producción de reservas diferentes o de bancos. Para remediar estos inconvenientes, se ha propuesto utilizar plásmidos' procariotas para preparar los ADN virales utilizables para la transfección. En particular, Bett y colaboradores (PNAS 91 (1994) 8802), describe la construcción de un plasi?ido replicativo en E. coli, que contenga un genoma adenoviral modificado (plasmido pBHGlO) . Mas precisamente, este plásmido contiene un genoma adenoviral eliminado de las regiones El, E3 y Psi, circularizado por unión de las secuencias ITR, y que comprende, insertada al nivel de la región 188-1339 del genoma del adenovirus, una parte del plásmido pBR322. Este plásmido puede ser replicado en E. coli, manipulado para la inserción de genes de interés, pero presenta siempre inconvenientes. Su utilización para la producción de virus implica particularmente una linealización de las ITR juntas y una recombmación que, teniendo en cuenta las construcciones, conduce a la • *"• regiones que provienen del plásmido procar ota. ros" ^ plásmidos de este tipo y que presentan el mismo género de-, " inconvenientes, han sido descritos por ejemplo por Graham * (EMBO J. 3(12) (1984) 2917). Más recientemente han sido '•' 5 descritos, nuevos procedimientos fundados en particular en la recombinación homologa de dos plásmidos, que utilizan los cromosomas artificiales de la levadura (YACs, Ketner y colaboradores 1994) o la bacteria (Chartier y colaboradores 0' 1996, Crouzet y colaboradores 1997, He y colaboradores, 10 1998) . Estos métodos aunque más eficientes que los precedentes, son más complejos. El sistema YAC necesita el cultivo y la manipulación de levaduras (Ketner y colaboradores, 1994) . En los sistemas E. coli, varias etapas (de las cuales, ciertas críticas electrotransformación, 15 selección sacarosa) se suceden. Se observará en particular, que en todos los casos, son necesarias una o varias etapas de cribado de los clones, para seleccionar un vector recombinante final clonal, que contenga un genoma adenoviral infeccioso. Estos procedimientos, si permiten efectivamente 20 producir, de manera clonal, reservas de un adenovirus que S contenga un gen terapéutico dado, no son sin embargo, utilizables de manera satisfactoria para ia producción de adenovirus recombinantes a flujo alto, particularmente para la producción simultáneamente de múltiples adenovirus La presente invención se apoya en particular, sobre la utilización de dos plásmidos (en particular procariotas) , * capaces de generar, en una etapa de recombmación homologa en una célula huésped (en particular procariota) , un plásmido que comprenda un genoma adenoviral completo, fácilmente escindióle para producir adenovirus recombmantes. De una manera general, el procedimiento de la invención comprende pues: 0 En una primera etapa, la construcción de un primer plásmido (llamado "transportador") , de preferencia procariota, que comprenda un primer genoma adenoviral recombmante truncado, que comprenda al menos un acido nucleico heterologo (etapa de clonación) . Preferentemente, 5 el primer genoma truncado comprende una ITR, un ácido nucleico heterólogo, una región de homología adenoviral, y eventualmente una secuencia de encapsidación. En una segunda etapa, este primer plasmido es puesto en contacto con un segundo plásmido (llamado "progenitor"), que 0 comprenda un segundo genoma adenoviral recombinante truncado, complementario del primero, que permita por reco bmacion homologa, la producción de un plásmido final que comprenda un genoma adenoviral recombinante completo (etapa de recombinación) . Preferentemente, el segundo genoma S adenoviral truncado comprende al menos una ITR, una región completo es escindido del plásmido final, e introducido en - * una línea de encapsidación, para producir los adenovirus recombmantes que incorporan el genoma adenoviral • 4 recombmante completo (etapa de producción de los *$* * 10 adenovirus) . En una cuarta etapa, facultativa, los adenovirus recombmantes son utilizados para infectar: - Un material biológico que comprenda células, con el 15 objetivo de analizar las propiedades del ácido nucleico (etapa de análisis funcional) . Un cultivo celular in vitro o ex vivo, con el objetivo de producir una proteína, polipéptido o péptido codificado por el ácido nucleico heterólogo. 20 Una célula, tejido, órgano u organismo, con el objetivo de producir m vivo una proteina, polipéptido o péptido codificado por el ácido nucleico heterólogo. La presente invención permite asi obtener, en una etapa (recombinación homologa) , un plásmido procariota que utilizado en la etapa de recombinación, cada plasmido* t transportador del banco es puesto en contacto con el ¡. *• plásmido progenitor. Este procedimiento conduce así a la **** producción, en paralelo y simultáneamente, de múltiples adenovirus recombmantes que comprendan un ácido nucleico heterólogo (es decir, un banco de expresión adenoviral) . Este banco puede también ser probado sobre el material biológico (etapa 4), a fin de identificar clones que presentan una actividad biológica investigada. „ # La invención puede utilizarse con cualquier tipo de adenovirus, de células procariotas y a partir de diferentes , bancos de ácidos nucleicos, como se ilustrara en detalle en la continuación del texto. Definiciones . Adenovirus recombmante: El termino adenovirus recombmante, designa en el sentido de la invención cualquier adenovirus cuyo genoma haya sido modificado, por eliminación y/o inserción y/o substitución de bases. Se trata entonces mas particularmente, de una partícula adenoviral, generalmente infecciosa, que comprenda un genoma adenoviral recombmante. Según la o las modificaciones aportadas al genoma, el virus recombmante puede ser defectuoso para la replicacion, es decir incapaz de replicación y/o de propagación y/o de propagación autónoma en una célula. El adenovirus recombinante puede prepararse a partir de cualquier serotipo de adenovirus, particularmente de adenovirus humanos (por ejemplo del tipo C, tales como Ad5, Ad2, Ad7, Adl2, etc) o animales (tales como adenovirus caninos como por ejemplo CAV-2). . Genoma adenoviral: El término "genoma adenoviral", designa la molécula de .ADN presente en un adenovirus, o su secuencia, copia o réplica. Un genoma adenoviral recombinante, es un ácido nucleico cuya secuencia corresponda a la secuencia de un genoma de adenovirus, y comprende una o varias modificaciones. Las modificaciones comprenden por ejemplo eliminaciones (por ejemplo de todas o parte de las regiones El, E2, E3, E4, etc.), inserciones (como por ejemplo de uno o varios ácidos nucleicos heterólogos) o cambios de uso de codones. El genoma adenoviral recombinante generado por las composiciones y métodos de la invención, es ventajosamente un genoma "completo" o "funcional", es decir que no necesita la aportación de otras regiones, por recombinación o ligadura, para la producción de las reservas virales, en las líneas de encapsidación seleccionadas. Un genoma tal "completo", comprende pues, ventajosamente, al menos una secuencia de encapsidación y un ácido nucleico heterólogo, flanqueados por una secuencia ITR en cada extremo. Otra característica ventajosa de los plásmidos según la $ **£&• .. recombinante completo obtenido no está interrumpido por regiones del plásmido procariota. De este hecho, los genomas producidos no contienen esencialmente regiones del plásmido cuyos inconvenientes han sido mencionados anteriormente. Por 5 otra parte, en los plásmidos según la invención, las ITR del genoma adenoviral no están juntas, lo que permite obtener genomas virales recombinantes completos lineales, directamente utilizables para producir los virus recombinantes . 10 Preferentemente, el genoma adenoviral recombinante comprende al menos secuencias ITR y una secuencia que permite la encapsidación. Las secuencias invertidas repetidas (ITR), constituyen el origen de replicación de los adenovirus. Se localizan en los extremos del genoma viral, 5 de donde pueden ser aislados fácilmente, según las técnicas clásicas de biología molecular, conocidas por el experto en la materia. La secuencia nucleotidica de las secuencias ITR de los adenovirus humanos (en particular serotipos Ad2 y Ad5) se describen en la literatura, asi como adenovirus 0 caninos (particularmente CAVÍ y CAV2) . En lo que concierne a los adenovirus Ad5 por ejemplo, la secuencia ITR izquierda corresponde a la región que comprende los nucleótidos 1 a 103 del genoma. La secuencia de encapsidación (igualmente designada 5 secuencia Psi) , es necesaria para la encapsidacíón del genoma viral. Está localizada en el genoma de los adenovirus salvajes, entre la ITR izquierda y la región El. Puede ser aislada o sintetizada artificialmente por las técnicas clásicas de biología molecular. La secuencia nucleotídica de la secuencia de encapsidación de los adenovirus humanos (en particular serotipos Ad2 y Ad5) , se describe en la literatura, así como adenovirus caninos (particularmente CAVÍ y CAV2) . En lo que concierne al adenovirus Ad5 por -I ejemplo, una secuencia de encapsidación funcional, está comprendida entre los nucleótidos 194 y 358 del genoma. En una modalidad de realización preferida de la invención, el genoma del adenovirus está desprovisto de toda o parte de la región El. La región El es, en efecto, esencial para la replicación viral y su inactivación conduce a la formación de virus defectuosos para la replicación, es decir incapaces de replicarse de manera autónoma después de transferencia genética m vivo. La región El, o cualquier otra región viral considerada, puede ser convertida en no funcional por cualquier técnica conocida por el experto en la materia, y particularmente por supresión total, substitución, eliminación parcial, o adición de una o varias bases en el o los genes considerados. Tales modificaciones pueden ser realizadas fácilmente, directamente sobre los plásmidos de la invención, por ejemplo, por medio de técnicas de ingeniería genética. Ventajosamente, el genoma - . tfw?f del adenovirus generado, está desprovisto de una parte de la región El, comprendida entre los nucleótidos 454 a 3328 (fragmento PvuII-BglII) o 382 a 3446 (fragmento Hmfll- Sau3A) . 5 Un genoma adenoviral recombinante truncado, designa un ADN correspondiente a la secuencia de una parte terminal de un genoma adenoviral, es decir desde un extremo (ITR) . Dos genomas recombmantes truncados son llamados complementarios i*-. cuando contienen cada uno, una parte complementaria de un 10 genoma adenoviral, y que pueden reconstituir, por recombmación homologa, un genoma adenoviral recombinante completo . . Acido nucleico heterólogo: El término "acido nucleico heterólogo", designa cualquier ácido nucleico insertado en 15 el genoma adenoviral recombinante, cuya transferencia , expresión o estudio funcional son investigados. Se trata, esencialmente de un ácido nucleico que tenga un origen diferente de un adenovirus ("heterólogo") , por ejemplo que provenga de unas células humanas, animal, vegetal, viral 20 (diferentes del adenovirus utilizado como vector) , procariota, eucapota inferior, o de origen sintético o semi-sintético . El tamaño del ácido nucleico heterólogo puede variar, en la medida en la que el genoma adenoviral recombinante que lo contenga, no exceda el tamaño máximo que 25 permita su encapsidación en una partícula adenoviral (en a -""e ' total, menos de 40 kb) . Así, puede tratarse de un ácido nucleico de una extensión superior a 30 kb, cuando suficientes regiones del adenovirus hayan sido eliminadas. El ácido nucleico puede, a este respecto, comprender una 5 región que codifica para una proteína, un polipéptido o un péptido dados, por ejemplo un ADNc, un ADNg o un ADN sintético. Puede igualmente tratarse de un ácido nucleico de estructura desconocida, proveniente por ejemplo de un clon de un banco de ácidos nucleicos. Por otra parte, el genoma 10 adenoviral recombinante puede comprender varios ácidos nucleicos heterólogos, insertados en sitios diferentes del genoma . Descripción de los plásmidos Como se indicó anteriormente, la presente invención 15 recurre a dos plásmidos (procariotas) , el plásmido transportador y el plásmido progenitor, que comprendan cada uno un fragmento complementario de un genoma de adenovirus recombinante. Uno de estos plámidos al menos, posee un ácido nucleico heterólogo (o un sitio de inserción de dicho ácido 20 nucleico) , de interés para la terapia genética, la producción de una proteína recombinante o para un procedimiento de genómica funcional, por ejemplo. Ventajosamente, los extremos (secuencias ITR) , de cada uno de los genomas truncados contenidos en cada uno de los ^5" plásmidos están limitados (en 5' para la ITR izquierda y en '- genoma, para permitir la escisión del genoma completo, después de la recombinación. Estos plásmidos contienen un genoma truncado del adenovirus y no pueden generar 5 individualmente un genoma adenoviral infeccioso. Estos dos plásmidos poseen cada uno, la parte complementaria del otro, para generar, por co-mtegración, un plásmido final que posea entonces el conjunto de un genoma de adenovirus que tenga en los extremos dos ITR y por lo menos un sitio de 10 restricción no presente en dicho genoma. El fragmento de genoma de adenovirus recombmante presente en estos plásmidos, es un genoma incompleto que no puede por sí mismo manifestarse infeccioso a continuación. Esto es particularmente interesante, ya que solo el co-mtegrado de 15 los dos plásmidos es capaz de generar un genoma funcional. Tales plásmidos están representados por ejemplo sobre la figura 1, y están descritos mas en detalle en la continuación del texto. Estos plasmidos son preferentemente plasmidos procariotas, y comprenden generalmente una región 20 plasmídica y una región adenoviral. La región plasmídica permite la replicación y/o la selección del plásmido en una célula huésped, en particular en una célula huésped procariota. La región adenoviral (genoma truncado) aporta una parte del genoma adenoviral recombinante que, después de 25 recombmación con la región adenoviral del plás idb '-* a Z complementario (progenitor y transportador) , permite reconstituir el genoma adenoviral recombinante completo. La región que permite la replicación en las células procariotas, utilizada en los plásmidos de la invención, puede ser cualquier origen de replicación funcional, en las células seleccionadas. Puede tratarse de un origen de replicación procedente de un plásmido del grupo de incompatibilidad P (ejemplo = pRK290) que permite la replicación en las cepas de E. coli pol A. Más generalmente, puede tratarse de cualquier origen de replicación procedente de un plásmido que se replica en las células procariotas. Este plásmido puede ser un derivado de pBR322 (Bolivar y colaboradores, 1977), un derivado de puc (Viera y Messing, 1982) , u otros plásmidos que se derivan del mismo grupo de incompatibilidad, es decir de ColEl o de pMBl por ejemplo. Estos plásmidos pueden ser seleccionados por otra parte en otros grupos de incompatibilidad que se replican en Escherichia coli. Puede tratarse de plásmidos derivados de plásmidos que pertenecen a los grupos de incompatibilidad A, B, Fl, FU, FUI, FIV, Hl, H.11, II, 12, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z o 9 por ejemplo. Otros plásmidos pueden aún, ser utilizados, entre que no se replican en E. coli sino en otros huéspedes tales como B. Subtilis, Streptomyces, P. putida, P. aeruginosa, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, + «fs **.

Streptomyces pristinaespiralis, enterococcus faecium o Clostridium. A título preferencial, se utilizan los orígenes de replicación procedentes de plásmidos que se replican en E. coll. 5 La región que permita la selección de las células procariotas que contengan los plásmidos de la invención, puede estar constituida particularmente por cualquier gen que confiera la resistencia a un producto, y particularmente a un antibiótico. Así, se puede citar los genes que jfi confieran una resistencia a la kanamicina (Kan1), a la ampicilina (Ap1 ) , a la tetraciclina (tet1) o a la espectinomicina, por ejemplo, que son frecuentemente utilizados en biología molecular (Maniatis y colaboradores, 1989) . La selección de plásmidos, puede hacerse por otros 15 genes, como genes que codifican para marcadores de resistencia a un antibiótico. De una manera general, se trata de un gen que da a la bacteria una función que no posee más (esta puede corresponder a un gen que ha sido eliminado sobre el cromosoma o mactivado) , el gen sobre el 20 plásmido que restablece esta función. A título de ejemplo puede tratarse de un gen de un ARN de transferencia, que restablece una función cromosómica deficiente (So oes y colaboradores, 1991) . Preferentemente, el plásmido transportador y el modificaciones genéticas. En una primera modalidad de realización, el genoma truncado presente en el plásmido transportador, corresponde a la parte izquierda del genoma adenoviral recombinante final. En esta modalidad de realización, comprende por ejemplo una secuencia que va de la ITR izquierda hasta la región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2), el ácido nucleico heterologo que es insertado en substitución de toda o parte de la región El. En esta modalidad particular de realización, la región de homología adenoviral está constituida por la región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2) . En otra modalidad de realización, el genoma truncado presente en el plásmido transportador, corresponde a la parte derecha del genoma adenoviral recombinante final. En esta modalidad de utilización, comprende por ejemplo, la secuencia que va de la ITR derecha hasta la región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2), el ácido nucleico heterologo es insertado en substitución de toda o parte de la región E4 o E3 por ejemplo. En esta modalidad particular de realización, la región de homología adenoviral está constituida por la región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2) . Por otra parte, en una modalidad particular de utilización, la región de homología está constituida por una ! í fiaste * secuencia adenoviral modificada. Así, la región de homología puede estar constituida por ejemplo por una región del adenovirus, modificada por cambio del uso de los codones, al utilizar la degeneración del código genético. Tales modificaciones han sido descritas en la solicitud WO 99/25861, incorporada a la presente como referencia. En una modalidad particular de realización, la región de homología adenoviral está constituida por una región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2) degenerada. 'i. Por supuesto que, según la estructura seleccionada del genoma adenoviral recombinante final (generado después de recombinación) , la región de homología adenoviral puede corresponder a diferentes regiones del genoma. En efecto, la región adenoviral del plásmido progenitor puede extenderse desde la ITR izquierda hasta la región E3, y es entonces esta región, que constituye ia zona de homología adenoviral. - • -> Más generalmente, la región de homología adenoviral es una secuencia que corresponda a cualquier región de un genoma adenoviral salvaje o modificado, que permite la '- recombinación entre el plásmido transportador y el plásmido progenitor, de manera de generar el genoma adenoviral recombinante final. Esta región de homología es entonces esencialmente idéntica en el plásmido transportador y en el plásmido progenitor. Puede corresponder a diferentes partes utilizada. Una modalidad de realización particular de la invención, reside en un plásmido transportador que comprenda un genoma truncado que comprenda la región ITR izquierda, la secuencia de encapsidación, el ácido nucleico heterólogo y una región de homología adenoviral constituida por una región que codifica para la proteína pIX (y/o Iva2) salvaje o degenerada (es decir plásmidos pJJl y pIG5, por ejemplo) . Por otra parte, en una modalidad preferida de la invención, el genoma adenoviral truncado tiene en su extremo, del lado de la ITR, un sitio no presente en el genoma adenoviral, por ejemplo Pací. Genoma truncado presente en el plásmido progenitor El plásmido progenitor, como se indicó anteriormente, contiene un genoma adenoviral truncado, capaz de completar, por recombinación, el genoma truncado presente en el plásmido transportador. Su estructura es entonces dependiente de la estructura del plásmido transportador. Por otra parte, el plásmido progenitor puede igualmente contener un ácido nucleico, diferente del contenido en el plásmido transportador . Así, cuando la región adenoviral del plásmido transportador corresponde a la parte izquierda de un genoma adenoviral, el genoma truncado presente en el plásmido áf¡r genoma adenoviral, y contiene una región E3 no funcional. Más preferentemente, contiene una región E4 no funcional. Aún más preferentemente, contiene una eliminación de toda o * parte de las fases 0RF3 y/o 0RF6 de la región E4. En otra modalidad de realización particular, el plásmido progenitor contiene un genoma truncado que corresponda a la parte derecha del genoma adenoviral, y contiene las regiones E3 y E4 funcionales. Ejemplos particulares de tales plásmidos están representados por pOSEl, pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE17-00 y pOSE37-00 (ver las figuras 1 y 4) . En esta modalidad de utilización, el plasmado transportador lleva un genoma truncado que corresponde a la parte izquierda del genoma adenoviral, y contiene una eliminación de toda o parte de la región El. Dos plasmidos particularmente preferidos en el sentido de la invención son el plasmido pOSE17-00 y el plásmido # pIG5. pOSE17-00 (plásmido progenitor), comprende el origen de replicacion del plásmido RK2, el gen de resistencia a la < tetraciclma y posee un fragmento del genoma adenoviral, que comienza en la base 3520 del Ad5 hasta la ITR derecha que tiene en el extremo un sitio Pací. Este fragmento de genoma posee una región E3 no funcional y una secuencia modificada en pIX e Iva2, como se describe en la solicitud WO 99/25861. pir-. pIG5 posee las regiones ITR y de encapsidación precedidas de un sitio Pací, el "cassette" de expresión deseado y una región homologa de pOSE17-00 (una secuencia modificada en pIX e Iva2 como se describe en la solicitud WO 99/25861) . El genoma deseado es así reconstruido por recombinación homologa, gracias a la presencia de la región homologa entre los dos plásmidos (es decir, la secuencia modificada en pIX e Iva2, como se describe en la solicitud 10 WO 99/ 25861) . El procedimiento de la invención permite así, generar un genoma recombinante completo (infeccioso) a partir de dos plásmidos que aportan cada uno una parte del genoma (un plásmido que contenga la secuencia ITR izquierda precedida 15 de un sitio Pací y un conjunto de secuencias virales o no virales y un plásmido que contenga , precedido de secuencias virales o no virales, la ITR derecha, seguida de un sitio Pací, la selección de las secuencias virales o no virales dependen de la selección de la construcción planificada, 20 vector adenovirus recombinante eliminado por toda o parte de los genes virales) ; los dos plásmidos que presentan secuencias comunes suficientes para la realización de la recombinación homologa y que presentan una sobreposición en una secuencia que permita el evento de recombinación 25 homologa. En particular, el método permite en un esquema' comparable al presentado para la introducción de secuencias exógenas en la región El, introducir secuencias exógenas en la región E4 con la ayuda de los plásmidos apropiados. En ese caso, la reco bmación tiene lugar entre un plásmido progenitor (que posea las regiones ITR izquierda y de encapsidación precedidas de un sitio de restricción para la enzima Pací y de un genoma adenoviral truncado en proximidad de la región E4) y un plásmido transportador (que posee una secuencia próxima de la región E4 idéntica al vector progenitor -que estará impicada el evento de recombmación- ^ ** seguido por el "cassette" de expresión de la secuencia de interés, luego de la región ITR derecha y de un sitio Pací único) . Según una modalidad de realización particularmente ventajoso, el genoma del adenovirus producido está igualmente desprovisto de toda o parte de la región E3 y/o E4 y/o IVA2. Estas eliminaciones suplementarias permiten acrecentar la seguridad del vector y aumentar su capacidad. Preferentemente, el genoma adenoviral está desprovisto de una parte de la región E4 que comprenda al menos las fases 0RF3 y 0RF6. El genoma adenoviral puede igualmente ser modificado como se describe en la solicitud FR 94/13355, incorporada a la presente como referencia, a manera de evitar los riesgos de contaminación por partículas de replicación. En una modalidad particular, el genpma recombmante adenoviral completo, obtenido es un genoma llamado "gutless", es decir desprovisto de cualquier región codificadora del adenovirus. En esta modalidad de realización, el genoma truncado de los plásmidos contiene por una parte, una ITR y la región de encapsidacion y por otra parte, una ITR, la región de homología que pueda estar constituida por el ácido nucleico heterologo mismo o por una secuencia artificial, incluida en cada plásmido. A este respecto, la región de homología presente en cada plásmido puede, de una manera general, ser una secuencia no viral, artificial o no, que permita la recombmación homologa. El genoma recombmante puede igualmente contener "cassettes" escmdibles m vivo (WO 97/47757) o secuencias genéticas modificadas (genes de la fibra o del penton) que permitan modificar el tropismo del virus. Ademas, la organización genomica del virus puede igualmente ser modificada para mejorar la seguridad de los virus producidos (WO 96/13596) . Como se indicó anteriormente, el genoma de adenovirus recombmante tiene venta osamente en sus extremos uno o varios sitios de restricción ausentes de dicho genoma. Este o estos sitios permiten escindir de manera simple y eficaz el genoma adenoviral recombinante del plásmido. Siendo la secuencia genómica del adenovirus conocida y accesible, el o A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Según una modalidad particular de realización de la invención, el adenovirus utilizado es un adenovirus de origen humano. Según otra modalidad ventajosa, el adenovirus es un adenovirus de origen animal. Recombinación homologa y producción de los virus La etapa de recombinación homologa (que permite la reconstrucción del genoma completo) , puede realizarse según las técnicas conocidas por el experto en la materia, por transfección (o co-transfección) de los plásmidos en una célula apropiada, de preferencia una célula procariota. En una modalidad particular de realización, la recombinación homologa es efectuada en E. coli utilizando una cepa poIA a fin de seleccionar los eventos de recombinación homologa. Es evidente que estas construcciones pueden también ser realizadas en ausencia de sistemas que permitan seleccionar eventos de recombinación. En efecto, tales eventos de recombinación pueden ser cribados por minipreparación, pérdida o adquisición de un marcador, o bien cribado con la ayuda de sondas radioactivas específicas para las uniones obtenidas o perdidas. Además, existen otras técnicas que permiten seleccionar eventos de recombinación homologa en E. coli. Entre éstas, citamos la utilización de plásmidos termosensibles para su replicación (Hamilton y íß no replicativas (descrita por ejemplo por Slater y Maurer, 1993), la utilización de cepas en las cuales el vector tilizado no se replica (Miller y Mekalanos, 1988, Zeef y colaboradores, 1994), etc. Todos estos sistemas pueden ser 5 utilizados en el lugar de cepas poIA y de una transformación con un plásmido derivado de pBR322, o sus numerosos derivados, u otros plásmidos para replicación poIA- dependiente o bien plásmidos que no se replican en Escherichia coli. 0 Otro objeto de la presente solicitud concierne a cualquier célula procariota, que contenga un plásmido tal como el definido anteriormente. Puede tratarse, en particular de cualquier bacteria para la cual exista un sistema de vector en el que el ADN recombinante puede introducirse. Citemos por ejemplo Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium meliloti, o las bacterias del género Streptomyces. Estas células se obtienen ventajosamente por transformación según las técnicas conocidas por el experto en la materia. La transformación puede particularmente efectuarse por la técnica de transformación al CaCl? (Dagert y Ehrlich, 1979) , o la ajustada por Hanahan y colaboradores (1983) o cualquier técnica derivada de ésta (Maniatis y colaboradores, 1989) , así como por electrotransformación (Wirth y colaboradores, 1989) . Ver igualmente las técnicas generales de Biologie Moléculaire posteriores. ^ Otro objeto de la presente invención, reside en un procedimiento de producción de genomas de adenovirus recombmantes. Según este procedimiento, células procariotas tales como las descritas anteriormente, son cultivadas luego, en una segunda etapa, los plásmidos son recuperados. Ventajosamente, el cultivo se realiza durante un tiempo suficientemente largo para producir cantidades apropiadas de plásmido. El plásmido puede ser recuperado por cualquier técnica conocida por el experto en la materia para la preparación de ADN plasmidico. Asi, puede ser recuperado por preparación de un lisado claro, seguido de una centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio (Maniatis y colaboradores, 1989) . Pueden utilizarse otras técnicas, recurriendo a otros métodos de lisis que utilizan el tritón X-100, por ejemplo (Ausubel y colaboradores, 1987), o bien una columna de intercambio de aniones, después de la etapa de lisis y de separación del ADN plasmídico en comparación con la mayoría del ADN cromosómico y proteínas. Los plásmidos así recuperados pueden ser purificados a continuación y tratados en presencia de la enzima de restricción correspondiente a los sitios están en los extremos del genoma viral. Esto permite, en una sola etapa generar un genoma de adenovirus recombinante lineal, ^5**. directamente utilizable para la producción clonal de virus *- recombmantes. « A este respecto, un primer método para preparar los virus recombmantes, consiste en transfectar el genoma viral producido a partir de los plasmidos de la invención en una linea celular de encapsidación competente, es decir que lleva en trans todas las funciones necesarias para la complementacion del virus defectuoso. Estas funciones están preferentemente integradas en el genoma de la célula, lo que reduce los riesgos de recombmacion, y confiere una estabilidad acrecentada a la linea celular. Un segundo procedimiento consiste en co-transfectar, en una linea celular apropiada el genoma recombinante preparado y el .ADN de uno o de varios virus o plasmidos auxiliares ("helper") . Según este método, no es necesario disponer de una linea celular competente capaz de complementar todas las funciones defectuosas del adenovirus recombmante. Una parte de estas funciones es en efecto complementada por el o los virus auxiliares. Este o estos virus son ellos mismos defectuosos . Entre las lineas celulares utilizables, se puede citar particularmente la linea de riñon embrionario humano 293 (Graham y colaboradores, J. Gen. Virol. 36 (1977)59). Esta linea contiene particularmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma del adenovirus humano Ad5 (12 %) .

La transfección puede realizarse ventajosamente directamente con el producto de digestión del plás ido obtenido según el procedimiento descrito anteriormente, sin etapa de Í purificación del genoma adenoviral. Otras líneas son por , 5 ejemplo, líneas producidas a partir de células embrionarias de retina (HER) , de células de hígado, etc. Puede tratarse de líneas que complementan las funciones El (293, células PERC-6), El y E4 (IGRP2), El y E2, etc. Tales líneas han sido descritas en el arte anterior y son utilizables por el •10 experto en la materia. Los adenovirus así producidos pueden ser aislados o purificados por las técnicas conocidas por el experto en la materia (cloruro de cesio, cromatografía, etc.). Pueden ser utilizadas en diferentes aplicaciones como, la producción de 15 productos terapéuticos o profilácticos m vitro, ex vivo o m vivo, o igualmente para el análisis funcional del genoma (y la constitución de bancos) . Los beneficios de la utilización del nuevo procedimiento son los siguientes: Una simplificación y una 20 mayor rapidez, en la generación del recombmante, y la no necesidad de una etapa de cribado, unida a los sistemas de selección múltiples impuestos al procedimiento y a la estructura de un vector progenitor no funcional. Contrariamente a los procedimientos conocidos j descritos, la robustez del procedimiento está basado en la .- 's^-?? simultaneidad de las presiones de selecciones, que conducen en una sola etapa a la selección del único plásmido final que contenga el genoma adenoviral funcional. La generación de un nuevo vector recombmante en una sola etapa, reduce 5 considerablemente el tiempo de trabajo necesario en comparación con los procedimientos conocidos. Cualquier etapa de cribado es inútil, la cantidad de trabajo necesario es considerablemente aligerado, en comparación con los procedimientos conocidos. Además, la no necesidad de 0 cribado, abre la vía hacia la generación simultánea de numerosos vectores adenovirales por un mismo interviniente. Otra ventaja del procedimiento de la invención, reside en el aspecto no viable de dos plásmidos reclutados para la generación del plásmido final que contiene el genoma 5 funcional. Ninguno de los dos plásmidos iniciales posee serparada ente el conjunto de las funciones que le permitan generar un genoma adenoviral funcional. También, en el caso extremo de una fuga en las selecciones impuestas (antibióticos), si dos tipos de construcciones (ia © construcción deseada y los plásmidos iniciales) debían coexistir después de la recombinación en la cepa bacteriana, este resultado no tendría incidencia sobre la generación del vector recombinante deseado, una vez que esta mezcla sea transfectada en la célula eucariota productora. En efecto, **** homologa es viable y se amplifica en la célula eucariota productora, siendo no viables los plásmidos iniciales (ausencia de al menos una región ITR por cada plasmido) . Las características citadas anteriormente del § procedimiento de la invención, concurren a una simplificación de la construcción de vectores adenovirales y abren la posibilidad de generación al flujo de vectores recombinantes . Puede tratarse de construir simultáneamente vectores adenovirales recombinantes que contengan secuencias 0 conocidas de las cuales se quiere validar la función, o de un conjunto de vectores recombmantes que contengan secuencias de naturaleza desconocida, de las cuales se quiere descubrir la función. En este último caso se habla de bancos de expresión adenovirales . En una aplicación de terapia genética Los adenovirus pueden ser utilizados en aplicaciones terapéuticas. Con este objetivo, el ácido nucleico heterólogo puede contener uno o varios genes terapéuticos y/o uno o varios genes que codifican para peptidos antigenicos . Los genes terapéuticos que pueden ser así transferidos, son cualesquier gen, cuya transcripción y eventualmente la traducción en la célula objetivo, generen productos que tengan un efecto terapéutico. Puede tratarse de un producto homólogo, en comparación con la célula objetivo (es decir un producto que es normalmente expresado en la célula objetivo cuando ésta no presenta ninguna patología) . En ese caso, la expresión permite por ejemplo subsanar una expresión insuficiente en 5 la célula o en la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa en razón de una modificación, o aún sobre expresar la proteína mencionada. El gen terapéutico puede también codificar para un mutante de una proteína celular, que tenga una estabilidad acrecentada, una actividad 10 modificada, etc. El producto puede igualmente ser heterólogo en comparación con la célula objetivo. En ese caso, una proteína expresada puede por ejemplo completar o aportar una actividad deficiente en la célula que le permita luchar contra una patología. 15 Entre los productos terapéuticos, se puede citar más particularmente las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas: interleucinas, interferones, TNF, etc. (WO 93/19191), los factores de crecimiento, los , neurotransmisores o sus precursores o enzimas de síntesis, 20 * los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; las apolipoproteínas; ApoAl, ApoAIV, ApoE, etc. (WO 94/25073), la distrofina o una minidistrofína (FR 9111947), los genes supresores de tumores: p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc. (WO 94/24297), los genes que 2$ codifican para factores implicados en la coagulación: factores VII, VIII, IX, los genes suicidas (TK, etc), etc. •»>"" El gen terapéutico puede igualmente ser un gen o una "» secuencia antisentido, cuya expresión en la célula objetivo permita controlar la expresión de genes o la transcripción 5 de ARNm celulares. Tales secuencias pueden por ejemplo ser transcritas, en la célula objetivo, en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear así su traducción en proteína, según la técnica descrita en la patente EP 140 308. Como se indicó anteriormente, el ácido nucleico de 10 interés puede igualmente contener uno o varios genes que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar en el hombre una respuesta inmunitaria. En esta modalidad particular de utilización, la invención permite entonces la realización de vacunas que permiten inmunizar al hombre, 15 particularmente contra microorganismos o virus. Puede tratarse particularmente de péptidos antigéncios específicos del virus de Epstem barr, del virus HIV, del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, o aún específicos de tumores (EP 259 212) . 20 Generalmente, el ácido nucleico de interés comprende igualmente secuencias que permiten la expresión del gen terapéutico y/o del gen, que codifica para el péptido antigénico en la célula infectada. Puede tratarse de las secuencias que son naturalmente responsables de la expresión 25 del gen considerado, cuando estas secuencias son '* *** ^ susceptibles de funcionar en la célula infectada. Puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o también sintéticas) . Particularmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras procedentes del genoma de la célula que se desea infectar. Asimismo, puede tratarse de secuencias promotoras originarias del genoma de un virus, que comprende el adenovirus utilizado. A este respecto, se 10. puede citar por ejemplo los promotores de los genes ElA, MLP ("Major Late Promoter") , CMV (Cytomegalovirus) , RSV ("Rous Sarcoma Virus), etc. Además, estas secuencias de expresión pueden ser modificadas por adición de secuencias de activación, de regulación, etc. Preferentemente, se podrá 15 utilizar promotores regulables por la tetraciclina del tipo Tet on/off u off/on, o mducible por ecdisona o dexametasona. Por otra parte, cuando el gen insertado no contenga secuencias de expresión, puede ser insertado en el genoma del virus defectuoso de 3' a 5' de una secuencia tal. 20 Finalmente, el ácido nucleico de interés puede igualmente contener, en particular 5' a 3' del gen terapéutico, una secuencia señal que dirija el producto terapéutico intetizado en las vías de secreción de la célula objetivo. Esta secuencia señal puede ser la secuencia señal natural 25 del producto terapéutico, pero puede igualmente tratarse de cualquier otra secuencia señal funcional, o de una secuencia,- señal artificial. La presente invención concierne igualmente a cualquier composición farmacéutica que comprenda uno o varios adenovirus recombinantes preparados según este procedimiento. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser formuladas en vista de una administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, infraocular, transdérmica, etc. Preferentemente, la composición farmacéutica contiene vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Puede tratarse en particular, de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc. o de las mezclas de dichas sales), estériles isotónicas, o de composiciones secas, particularmente liofilizadas que, por adición según el caso, de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de solutos inyectables. Las dosis de virus utilizados para la inyección pueden ser adaptadas en función de diferentes parámetros, y particularmente en función del modo de administración • utilizado, de la patología involucrada, del gen a expresar, o aún de la duración del tratamiento investigado. De una humanos, de la insulina humana, de factores he atopoyéticos, de factores tales como el factor IX o VII, de factores trombolíticos tal como el activador plasminógeno tisular, diversos factores de crecimiento, factores tróficos, citocmas, péptidos del sistema nervioso central, de opioides, de enzimas, de antígenos virales pero también proteínas de otros organismos diferentes como la de plantas. En una aplicación de genómica funcional: Con la ayuda de los mismos instrumentos de fabricación citados anteriormente, el procedimiento es explotado en una aplicación de validación o de descubrimiento de nuevos objetivos, en el sentido comprendido por la industria farmacéutica. La presente invención concierne igualmente a cualquier explotación de una composición que utiliza el método descrito. En particular, de 5' a 3', cualquier preparación que permita la obtención y la integración de ácido nucleico, cualquiera que sea su naturaleza en un primer plásmido transportador en el sentido de la invención así como la utilización de dichos plásmidos, para generar uno o múltiples adenovirus recombinantes, por los métodos diversos de automatización. Estos adenovirus recombinantes pueden entonces ser utilizados en múltiples modelos in vitro e m vivo para evaluar la funcionalidad de las secuencias que contienen. La funcionalidad de las secuencias contenidas en los adenovirus recombmantes generados, puede ser evaluada por medio de alguna de las numerosas pruebas funcionales f * ~% disponibles para el experto en la materia. Un objeto de la invención reside entonces igualmente en un procedimiento de preparación de bancos de expresión adenovirales, que comprenda las etapas siguientes: - la construcción de un banco primario en un vector transportador, tal como el descrito anteriormente, - la transformación de un cultivo bacteriano con dicho banco primario, en presencia de un plásmido progenitor según la invención, - la introducción de los plásmidos obtenidos, o de los genomas adenovirales completos después de escindirlos por digestión enzimática en una célula productora de adenovirus. - eventualmente, la infección de un material biológico que comprenda células, a fin de analizar los clones del banco . Este procedimiento comprende pues una primera etapa de preparación de un banco primario de ácidos nucleicos en el plásmido transportador de la invención, antes de aplicar la invención y de utilizar el banco adenoviral en un modelo experimental. La constitución de un banco primario tal, en el plásmido de la invención (plásmido transportador) puede ser realizada por los métodos de biología molecular í ?« una célula transcomplementante, lo que permite generar m? ^ «* banco de adenovirus recombmantes. Preferentemente, IQ ? ' G plásmidos son aislados y/o purificados, y los genomaá*- A* recombmantes son escindidos por tratamiento con la enzima 5 (o las enzimas) apropiadas, que no cortan el genoma adenoviral . En la cuarta etapa, la infección de una población celular seleccionada (o de un material biológico) con la ayuda del banco de adenovirus recombmantes, permite 10 analizar las propiedades biológicas o funcionales de los clones del banco. Para esto, la población celular seleccionada e infectada, puede ser colocada en condiciones que permitan la expresión del acido nucleico y así, identificar un fenotipo investigado por el estudio de la 15 población celular. Es posible, a continuación, volver al vector inductor y así, caracterizar el ADN que confiere el fenotipo investigado. Venta osamente, para permitir estudios de funcionalidad más sólidos, los clones son tratados separadamente y no en 20 grupo. Los clones del banco primario en el plásmido transportador son transformados así individualmente en microplacas en la bacteria que posea ya el plásmido adenoviral truncado progenitor. Por crecimiento en microplaca ba o presión de selección (antibióticos), los ADN Jf producidos son purificados y transfectados en la célula . eucariota productora después de escindir los genomas por- medio de la enzima seleccionada (por ejemplo Pací) . Ü» procedimiento tal se esquematiza en la figura 2. Según una modalidad de realización preferida del procedimiento de preparación de bancos adenovirales de expresión de la presente invención, se puede utilizar la tecnología de clonación Gateway®, que ha sido desarrollada por Life Technologies, Inc. (LTI, Rockville, MA, USA), y permite particularmente generar simultáneamente un conjunto de adenovirus portadores de insertos procedentes por ejemplo, de un banco de ADN complementario o de un grupo de secuencias caracterizadas y seleccionadas por diferentes metodologías bien conocidas por el experto en la materia. La tecnología de clonación Gateway®, que es entre otras, descrita en la patente US 5,888,732, permite transferir insertos entre por ejemplo dos vectores plasmídicos, en el momento de una reacción m vitro, gracias a reacciones de reco binación al nivel de los sitios específicos attL, attR, attB y attP, del bacteriófago lambda (?; de Escherichia coll. La inserción de un gen no necesita más la presencia de sitios de restricción apropiados en el seno del vector, sino solamente la presencia de secuencias cortas de recombmación llamadas secuencias att. El sistema de clonación Gateway® consiste por una parte en efectuar una reacción llamada LR, en el curso de la cual un clon de Entrada, que contenga un inserto de interés rodeado por los sitios attL, recombina con un clon Destino, ißti que contenga sitios attR, a fin de generar un clon de Expresión. El inserto de interés que está contenido en el clon Entrada, es entonces transferido en un vector de Expresión, que provenga del clon Destino, que contenga los sitios attB. El sistema Gateway® consiste, por otra parte en efectuar la reacción inversa, que es designada reacción BP, en el curso de la cual el clon de Expresión que contiene un inserto de interés rodeado de los sitios de recombinación attB, recombina con un vector Donador que contiene los sitios attP, para dar el clon de Entrada, que contiene los sitios attL. Mas particularmente, se puede modificar según una primera estrategia, un plásmido transportador por ejemplo •* pJJl, tal como el descrito precedentemente, a fin de generar un plásmido compatible con el sistema Gateway®, que posee los sitios att apropiados. Según este primer procedimiento, los * sitios att son, de preferencia introducidos entre el promotor (CMV) y el sitio de poliadenilación de SV40 del "cassette" de expresión del plásmido transportador. El plásmido así obtenido es designado plásmido Destino, según la terminología de la tecnología Gateway®, y puede a continuación entrar en reacción con los clones Entrada de la terminología Gateway . En consecuencia, cualquier inserto pAdDEST, puede reaccionar con cualquier clon de Entrada para generar un plásmido de Expresión portador del genoma adenoviral: pAdExp como se describe posteriormente en el t Ejemplo 6 y en la figura 11. "• \ 5 La invención representa así un nuevo método para validar o identificar una secuencia asociada a un efecto fisiológico o genético que induzca un fenotipo característico. Puede tratarse mas particularmente de un gen , que provoque un defecto genético, o de un gen que podría ser 0 indicador o característico de una anomalía genética. En una aplicación de validación o de determinación de J* la función de una o varias secuencias en el marco de una , actividad de genomica funcional, las secuencias pueden ser «, t de cualquier naturaleza, en particular las citadas 5 anteriormente, pero igualmente provenir de poblaciones de cualquier secuencia de naturalezas desconocidas y múltiples. Estas secuencias pueden ser yuxtapuestas en diferentes i , "cassettes" para ser ulteriormente introducidas en el genoma adenoviral deseado. Estas secuencias pueden ser procedentes de cualquier tipo celular viviente o producidas artificialmente por diferentes procedimientos como la síntesis de novo, la mutagénesis, la combinación de secuencias, etc. Un gran número de bancos pueden utilizarse como fuente incluidas por ejemplo en YACs o BACs) , bancos de ADNc, ^ bancos de ADN sintéticos, que estos bancos sean normalizados * o no y preparados a partir de diferentes tejidos vivientes para la expresión en el sentido o antisentido, de secuencias generadas al azar, que tengan el poder de generar peptidos ; * variados, secuencias degeneradas a partir de una secuencia conocida, de una secuencia mosaico de secuencias conocidas, 10 etc. En particular, las secuencias primarias a estudiar, pueden generar antisentidos o elementos de supresión genética. Se trata de secuencias que al expresarse, pueden mactivar un gen particular en el sistema biológico 15 estudiado. Puede tratarse de una pbozíma. Las secuencias utilizadas para formar el banco, pueden provenir de diferentes procesos de síntesis. En particular, la simulación de una evolución molecular dirigida, que utiliza la recombmacion, permite generar una diversidad de 20 genes al utilizar mecanismos identificados de la evolución (Curr. Op. In Biotech. 1997, 8: 724-733). Las secuencias utilizadas para formar los bancos, pueden también provenir del análisis bio-mformatico de los bancos de datos que recensan los datos del genoma humano. expresión genética obtenidos por diferentes métodos (EST/ Microarrays, DNA chips, differential display) TIBtech 1996, vjfcí, 14 p294-298; Nature Biotechnology 1998, 16, p27-31. En particular, el procedimiento permite generar un t?» banco adenoviral de expresión de secuencias de péptidos aleatorizados . Permite entonces facilitar la selección y la identificación de la secuencia de péptidos aleatorios capaces de unirse a una proteína de interés. Un banco de oligonucleótidos de la secuencia aleatoria es introducido en> un sitio ("polylmker") correspondiente a una desviación flexible de una proteína natural o sintética, para que los péptidos estén presentes en la superficie de la proteína. Puede tratarse de presentar estos péptidos de manera mtracelular (Colas y colaboradores, 1996, Nature 380: 548- 550) o en la superficie de la célula (Tramonto y colaboradores, 1994, J. Mol. Recognit. 7: 9-24). Finalmente los péptidos pueden estar presentes en el exterior de la célula al insertar una señal de secreción en el "cassette" de expresión (Rice y colaboradores, 1992, PNAS 89, 5467- 5471) . Una o varias secuencias de interés pueden estar integradas en el vector. Puede tratarse de evaluar al final, una combinación de secuencias ("cassette" de expresión) o de co-expresar la secuencia de ínteres con otro gen de interés, por ejemplo un ! t " gen marcador. Se puede entonces decidir, ya sea utilizar secuencias policistrónicas, o bien colocar la o las secuencias a expresar en una localización diferente de la secuencia de interés en el seno del genoma adenoviral. Las secuencias policistrónicas utilizables son variadas. Los elementos IRES permiten la traducción eficaz de dos o más fases abiertas de lectura, a partir de un solo ARNm. Más particularmente, una fase de lectura codificada para la proteína de interés (proveniente de un banco de ADNc) la otra fase de lectura para un marcador como la GFP. El procedimiento permite utilizar los sistemas de escisión/integración, unidos a una actividad enzimática. Puede tratarse de un sistema CRE-Lox (Baubonis y colaboradores, Nucí. Acids Res. 21: 2025-2029) del sistema- FLP recombinasa-FRT (Dang y colaboradores, Dev. Gent . 13; 367-375) del sistema Piv de Moraxella lacunata (Lenic y colaboradores, 1994, J. Bacteriol. 176- 4160) o del sistema de la mtegrasa lambda (Kwon y colaboradores 1997 Science 276, 126) . Más particularmente, una secuencia o el "cassette" de expresión del ADNc está junto a un vector episomal replicativo, es escindida por el sistema Cre-lox del genoma adenoviral y será transmitida a las células infectadas que se dividirán (WO 97/ 47757) . El procedimiento facilita la puesta en evidencia de las interacciones ADN-proteínas. El banco corresponde entonces a * * una población de secuencias capaces de unirse con el ADN. Se trata de polipéptidos procedentes de proteínas capaces de fijarse naturalmente al ADN o de polipéptidos artificiales. Se incestiga la secuencia más específica de una secuencia de ADN dada. El procedimiento permite la puesta en evidencia de interacciones Proteínas-Proteínas. Se utiliza la capacidad de co-mfección del vector adenoviral. Preferentemente, es empleada la prueba de complementación LacZ (PNAS 1997, 94, 8405-8410) . El sistema celular es co-mfectado por la primera construcción y los bancos de ADNc. Las pruebas de funcionalidades que puedan ser utilizadas para analizar el banco de expresión adenoviral de la invención son numerosos y variados. Se puede utilizar por ejemplo pruebas de complementación que consisten en identificar la secuencia nucleotidica procedente del banco cuya expresión condujo a un fenotipo celular investigado. Mas particularmente, el banco adenoviral de expresión permite infectar una célula humana deficiente por una característica fenotípica. Análisis de las células infectadas y marcado de referencia de las células que exhiben entonces la característica fenotípica investigada. Análisis del ADNc contenido en el virus responsable de la aparición de la característica fenotípica. Se puede igualmente medir la desaparición de una característica fenotípica después de la infección resultante de una actividad antisentido o de un "kock-out" funcional. El procedimiento facilita el estudio de la modalidad e ;* acción de una molécula química en un sistema biológico. El <& 5 banco de expresión adenoviral sirve para infectar las células del sistema biológico que responda a la acción del fármaco. Después de infección, el efecto del fármaco puede no estar modificado, aumentado o inhibido. En los dos últimos casos, el análisis de los cDNA contenidos en los 10 genomas virales, facilita el descubrimiento de las vías mtracelulares y/o extracelulares implicadas en el efecto del compuesto químico. El procedimiento de la invención puede asi ser utilizado para 15 - la investigación de ácidos nucleicos (objetivo) que permitan contornear los efectos de p53 en el proceso de detención de crecimiento y de apoptosis. - la identificación de citocinas - la identificación de péptidos sintéticos que afecten 20 les procesos celulares - la investigación de moléculas capaces de efectuar una presentación extracelular de péptidos - la identificación de objetivos para células tumorales que no presenten supresores de tumores específicos. "replicación del plásmido RK2. RK6 Ori: Origen de replicación del plásmído RK6. t Figura 2, Generación simultánea de 96 adenovirus • recombmantes que contengan cDNA procedentes de un banco e r cDNA construido en el plásmido transportador. Aplicación de las propiedades de la tecnología OSEDRAG. Figura 3, Obtención del plásmido progenitor al término de la invención que contenga una secuencia de genom " adenoviral incompleta y entonces no funcional por la tecnología EDRAG (Crouzet y colaboradores) . Mapa de los plásmidos pJJ301, pXL3215 y del plásmido pOSE17-00. Figura 4, Mapas de diferentes versiones de plásmidos progenitores utilizables por la invención para generar diferentes versiones de vectores adenovirales recombmantes, en particular vectores eliminados en El y E3 (pOSE 10-00), vectores eliminados en El y E3 y provistos de la región pIX bajo su forma simiana # 2 (WO 99/25861)- (pOSE17-00) , vectores eliminados en El, E3 y E4 (pOSE 30-00) y vectores eliminados en El, E3 y E4 y provistos de la región pIX ba o su forma simiana # 2 (pOSE37-00) . Figura 5, Obtención con la ayuda del procedimiento de la invención de un genoma adenoviral recombinante que lleva un "cassette" de expresión del gen LacZ. Mapa del plásmido transportador pIG5 y del plásmido progenitor pOSE17-00 y del plás ido final pAdl7-01. Mapa de los plásmidos pIG5, pOSE17- 00 y pAdl7-01. Figura 6, Obtención con la ayuda del procedimiento d i **. la invención de genomas adenovirales con la ayuda de tres ^ T plásmidos transportadores diferentes (pIG5: portador de un 5 "cassette" de expresión del gen LacZ; plasmido pIG18: portador de un "cassette" de expresión para el gen luciferasa y pIG7: sin "cassette" de expresión). Digestión f enzimática de los clones resultantes de la co-transformación _ del plásmido transportador y del plasmido progenitor. *^ JO Figura 7, Obtención con la ayuda del procedimiento de la invención de los vectores adenovirales después de la transfeccion de diferentes clones del plásmido pAD17-01, en la célula productora 293. La digestión enzimatica de los ADN virales purificados a partir de los virus amplificados en la 15 célula 293. Figura 8, Obtención con la ayuda del procedimiento de la invención de un banco de genomas adenovirales generados por un banco primario de ADNc en el plásmido transportador pTAOO. El banco de genomas adenovirales se obtiene gracias 20 al plasmido progenitor pOSE37-10, que es un plásmido « derivado de pOSE37-00. Mapa de los plasmidos pTAOO, pOSE37- 10 y pAd37-10. Figura 9, Obtención de un plásmido de expresión pAdGWExpLacZ compatible con el sistema Gateway® (LTI, 25 Rockeville, MA, USA) por recombmación homologa de los plásmidos pSHExpLacZ y PxI2689. „'< ? Figura 10, Obtención por medio de una reacción llamada BP de un plásmido Destino pAdDEST que contiene un genoma adenoviral completo, el gen ccdB letal para E coli , rodeado 5 de los sitios de recombinación attRl y attR2. Figura 11, Obtención del plásmido adenoviral portador de un inserto de interés pAdExp por medio de la reacción llamada LR. Técnicas generales de clonación, de biología molecular, 10 de biología celular. Los métodos clásicos de biología molecular tales como la centrifugación de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio-bromuro de etidio, las digestiones por las enzimas de restricción, la electroforesis sobre gel, la 15 transformación en E.coli, la precipitación de los ácidos nucleicos etc, son descritas en la literatura (Maniatis y colaboradores, 1989) . Las enzimas han sido proporcionadas por New-England Biolabs (Beverly, MA) . Para las ligaduras los fragmentos de 20 ADN son separados según su tamaño sobre geles de agarosa de 0.8 a 1.5 %, purificados por GeneClean (BI0101, LaJolla CA) , e incubados de noche a 14 °C en 50 mM de un tampón Tps-HCl pH 7.4, 10 mM de MgCl , 10 mM de DTT, 2 mM de ATP, en presencia de ADN ligasa del fago T4. 25 Los ADN ligados, son utilizados para transformar la *cepa convertida en competente E.coli TGl [?(lac proA, B) , SUpE, thi , hsdl>5/F' traD36, proA\ B+, laclq, lacZ?M15] (Mamatis y colaboradores, 1982), la cepa E.coli ToplO células (equipo One Shot TOP10, Invitrogen, Holanda) o bien la cepa E.coli 5 polA SF800 (Heffron y colaboradores, 1977) . La amplificación por PCR, ("Polymerasa Cham Reaction") , ha sido igualmente realizada según Maniatis y colaboradores, 1989, con las especificaciones siguientes: -Temperatura de desnaturalización 95 °C, temperatura de 10 hibridación 55 °C, temperatura de alargamiento 72 °C. Este ciclo ha sido repetido 25 veces en un Ciclizador Térmico Peltier PTC-200 (MJ Research, Massachusetts, US) . Los oligonucleótidos han sido sintetizados por la sociedad GENSET (Evry, France) . La secuenciación se efectuó 15 por la sociedad ESGS (Evry, Francia) . EJEMPLOS #• Ejemplo 1. Construcción de plasmidos progenitores Este ejemplo describe la obtención de un genoma denoviral truncado en su parte 5' y eliminado por la región 20 El y E3, adenovirus humano del tipo 5, y que tiene en su extremo un sitio de restricción único en su parte 3' en un Plasmido del grupo de incompatibilidad P que se replica en E.coli . Los plasmidos según la presente invención pueden ser 21 construidos de maneras diferentes. Según un método preferido, se construye el plásmido pOSE17-00 según la metodología EDRAG (FR2, 730, 504) con la ayuda de los plásmidos pXL3215 y pJJ301. El plásmido pXL3215 contiene la totalidad del genoma del AD (menos dos eliminaciones en las regiones El y E3) , y posee un "cassette" de expresión del gen LacZ, dirigido por el promotor RSV en la región El. El plásmido pXL 3215 es un derivado del plásmido pXL2689 y contiene el origen de replicación del plásmido RK2, el gen de resistencia a la tetraciclina (J. Crouzet PNAS, 1997) . El plásmido pJJ301 posee un origen de replicación RK6 y no puede replicarse en cepas E.coli pir-. El plásmido pJJ301 posee el gen de resistencia a la Kanamicina. El plásmido pJJ301, posee una región homologa al principio del genoma adenoviral contenido en pOSE17-00. Se trata de una versión particular de la región pIX llamada simiana # 2 que es descrita en (WO 99/25861) . De 5' a 3' de esta secuencia está insertada una secuencia homologa en la región de 5' a 3 del genoma adenoviral completo en el plásmido pXL3215. La doble recombmación de los plásmidos pXL3215 y pJJ301 da nacimiento a pOSE17-00. Este plásmido pOSE17-00, corresponde a un plásmido progenitor en el sentido del procedimiento de la invención y está esquematizado en la Figura 3. Otros plásmidos progenitores (pOSE 10-00, pOSE30-00, pOSE37-00) , han sido construidos sobre el mismo esquema que permita generar genomas adenovirales eliminados en la región v El y E3 (en versión región pIX salvaje o versión pIX degenerada (WO 99/25861) o genomas adenovirales eliminados en la región El, E3 y E4 (en versión región pIX salvaje o versión pIX degenerada (Figura 4) . Ejemplo 2. Construcción de plásmidos transportadores Este ejemplo describe la obtención de un plásmido transportador que contiene la región 5' del genoma adenoviral (región ITR y de encapsidación) , adenovirus humano del tipo 5, precedido de un sitio de restricción Pací. El plásmido mencionado posee un origen de replicación RK6 y es incapaz de replicarse en E. coli, que no puede transcomplementar para la protema pir . El plásmido mencionado pIG5 contiene un "cassette" de expresión LacZ que ^ preceda a una secuencia homologa a una secuencia presente en pOSE17-00 (secuencia correspondiente a una parte de la región pIX Iva2) . Este plasmido es llamado un plásmido transportador en el sentido de la invención, posee un gen de resistencia para la kanamicma (Figura 5) . Ejemplo 3. Producción de un genoma adenoviral recombmante funcional Este ejemplo describe la obtención de un genoma adenoviral funcional, eliminado en las regiones El y E3, adenovirus humano del tipo 5, y que tiene en sus extremos ' por un sitio de restricción Pací en un plásmido del grupo de incompatibilidad P que &? replica en E.coli y que contiene un "cassette" de expresión del gen LacZ. La estrategia de integración retenida es la reocmbinación homologa en la cepa E.coli entre pOSEl7-00 y 5 PIG5. El plásmido pOSE17-00 ha sido introducido en células de la cepa E.coli JM83 Rec+ lacZ-. A su vez las células procedentes de un clon tetraciclina resistente han sido hechas competentes, transformadas por el plásmido pIG5, luego extendidas sobre medio LB en presencia de tetraciclina 10 y de kanamicina. Siendo dado que el plásmido pIG5 no se replica en la cepa JM83, la adquisición de las resistencias a la tetraciclina y a la kanamicina puede producirse solo por un evento de recombinación homologa entre los dos plásmidos. En efecto, éstos tienen en común la región pIX 15 del genoma del Ad5. El plásmido resultante posee el genoma completo del vector adenoviral recombinante que tiene en su extremo un sitio Pací. Digestiones por medio de las enzimas Pací e HidlII, EcoRI o aún Pací y Dral, permiten controlar la obtención de la estructura plasmídica esperada. Este 20 plásmido final que contenga un genoma adenoviral funcional, ha sido denominado pAdl7-01 (Figura 5) . De la misma manera, el plásmido pIG5 y el plásmido pOSE37-00 dan nacimiento a un plásmido que contiene un genoma adenoviral completo eliminado en El, E3, E4 y 2f*_ provistos de una región pIX bajo su forma simiana # 2 (WO * 99/ 25861) . Por otra parte, según la misma estrategia, es posible construir otros genomas recombinantes de la misma familia que contengan o no un "cassette" de expresión. Se utilizaron PIG7 y pIGld y se derivan de pIG5:pIG7, no tienen "cassette" de expresión, pIG18 posee un "cassette" de expresión del gen Luciferasa. En la medida en la que el "cassette" de expresión no presente homología de secuencia con la secuencia genómica del cromosoma bacteriano, se espera que 100 % de los clones sean positivos. Como se ilustra en la figura 6, 100 % de los clones analizados procedentes de-cestas experiencias manifestaron, presentar en efecto, las estructuras nucleotidicas esperadas (Figura 6) . PAdl7-01 ha sido digerido por Pací, que libera el genoma del adenovirus recombinante. El producto de esta digestión puede ser utilizado como tal, para la transfección . de células de mamíferos transcomplementantes (células 293) para las funciones El del adenovirus. Ejemplo 4. Producción de adenovirus recombinantes Clones de adenovirus recombinantes pueden construirse en Escherichia coli, por (i) inserciones de fragmentos que contengan uno o varios genes con señales de regulación apropiadas para expresar estos genes en las células de mamíferos estudiados, o (ii) por eliminación de ciertos fragmentos del genoma del adenovirus, o aún por la después de transfección de células productoras, puedf " 7", obtenerse una reserva de dicho virus recombmante. El plásmido pAdl7-01 es purificado a partir de un cultivo de células E. coli DH5 competentes transformadas. El genoma adenoviral es liberado por digestión en presencia de la enzima Pací. El producto de digestión es utilizado directamente para producir los adenovirus recombmantes. ' Para esto, las células de la línea 293 son transfectadas por 40 el producto de digestión de pAdl7-01, en presencia de Efecteno (Quagen, Alemania) . El adenovirus recombmante es s amplificado en la línea celular 293, lo que conduce a un sobrenadante de cultivo que contiene el adenovirus recombinante no purificado que tiene un título de 15 aproximadamente 1010 pfu/ml. La conformidad del ADN viral, es verificada por * digestión enzimática después de purificación del ADN que procede de los virus amplificados (Figura 7) . Las partículas virales son a continuación purificadas 20 por centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio según las técnicas conocidas (ver particularmente Graham y colaboradores, Virology 52 (1973) 456) , o por cromatografía) . El adenovirus puede conservarse a -80 °C en glicerol al 20 °. 25 - Ejemplo 5. Construcción de bancos adenovirales de ***t , expresión. Se utiliza el plásmido transportador provisto del origen de replicación RK6, para obtener un banco primario de plásmidos transportadores que servirá, vía la recombmación homologa, para obtener un banco de genomas de adenovirus recombmantes en el plásmido que posee el origen de replicación RK2. Este banco de plásmidos de genomas de adenovirus recombmantes, será transfectado en la célula productora transcomplementante, para obtener un banco de adenovirus recombmantes . El conjunto de las etapas es esquematizado en la Figura 2 y las estructuras plasmídicas que permiten la obtención del banco adenoviral de expresión son representadas en la figura 8. Ejemplo 5.1. Preparación del banco de ADNc en el vector transportador Para la preparación del banco en el vector transportador (un derivado de pIG5 en el que el gen LacZ ha sido escindido y reemplazado por sitios múltiples de clonación, en particular los sitios Xhol y EcoRI), 10-20 µg de vector purificado por gradiente de ces o son digeridos por 5 U/µg de las enzimas Xhol y EcoRI durante 90 minutos a 37 °C. La digestión es depositada sobre un gel de agarosa Seake GTG al 1 o), y el vector linealizado es separado por electroforesis en tampón TAE. La banda correspondiente al Asg í.íy vector es recortada después de visualización sobre el tablero de UV. El vector es eluído de la agarosa (Qiaquick DNA Cleanup System, Quiagen, Alemania) y purificado por una extracción fenol/cloroformo, seguida de una precipitación con etanol. Este vector permite obtener, después de ligación de un inserto de prueba digerido por EcoRl y Xhol, aproximadamente 5 millones de clones/µg con una interferencia inferior a 10 0 Preparación de los ADNc: La síntesis de ADNc se obtiene 10 a partir de una población de ARN enriquecida con mRNA. La síntesis de la primera hebra se hace siguiendo los protocolos clásicos al utilizar la transcriptasa Superscript II (Stratagéne) con la ayuda de un primer oligo dT que posea la secuencia de un sitio Xhol en 5' . La 15 síntesis de la segunda hebra se efectúa por medio de la enzima ADN polimerasa I de E.coli, en presencia de RNAsa H y de la ligasa ADN de E.coli. Los extremos generados por la segunda hebra son llenados por la acción de la polimerasa ADN T4. 20 Los ADNc son fraccionados según el tamaño, por cromatografía por filtración sobre gel con la ayuda de Bíogel A50M como se describió precedentemente (Soares y colaboradores, PNAS, 91: 9228-9232). Los ADNc fraccionados por el tamaño son ligados a adaptadores comerciales EcoRI (Stratagéne) , luego son digeridos por EcoRI para crear preparación del ADN de cada clon, es efectuada simultáneamente para 96 muestras de cultivo con la ayuda del robot Quiagen (Quiagen Biorobot 9600) y del equipo Quiaprep 96 Turno Biorobot (Quiagen, Alemania) . Los ADN se toman de nuevo en 50 µl de TExl, 96 muestras de ADN plasmídico son ordenadas por placa llamada primaria. Ejemplo 5.2. Preparación del banco plasmidico de genomas adenovirales funcionales que contengan los ADNc. 10 El genoma adenoviral progenitor contenido en un plásmido RK2 (pOSE37-00) es introducido por transformación clasica en la cepa JM83. Un cultivo de esta cepa provisto del plásmido (JM83xpOSE37-00) es vuelto competente por las técnicas estándares por lavados sucesivos en CaCl2 100 mM. 15 A razón de 40 µl por pocilio, las células competentes ( M83xpOSE37-00) son distribuidas en una microplaca de 96 pocilios profundos. El ADN de cada plásmido transpotador es transformado en esta cepa, para obtener el evento de recombmacion homologa que genera el genoma adenoviral 20 funcional. 5 µl de ADN procedente de la placa llamada primaria se añaden entonces a los 40 µl de células competentes respetando el orden. La placa es llevada a 42 °C durante 1 min, luego puesta de nuevo sobre hielo durante 2 mm. 1 mi de medio (LB) que contenga los dos antibióticos 25 adaptados (Kanamicma, Tetraciclina) , se añade por pocilio. crecimiento sirven para sembrar una nueva placa de 9éT¿«r ' pocilios profundos, provistos de 1 mi de medio (LB) que v contenga los dos antibióticos adaptados (Kanamicma, ^ 5 Tetraciclma) . El cultivo se mantiene 14 horas. "- El ADN plasmídico que resulta de este crecimiento, ef t ís purificado con la ayuda del robot Quiagen (Quiagen Biorobot" , w 9600) y del equipo R.E.A.L Prep 96 Biorobot, al cual sß añade una etapa de separación Quiawell procedente del . » 0 equipo Qiawell 96 Ultra Biorobot Kit, antes de la precipitación en isopropanol (Quiagen, Alemania) . El ADN es tomado de nuevo en 50 µl de TExl. Se transportaron entonces 20 µl de cada ADN (aproximadamente 0.4 µg) a un pocilio de una nueva microplaca 15 de 96 pocilios respetando el orden. Este ADN es digerido por la enzima Pací para escindir el genoma viral. Se añaden 10 µl de mezcla reaccionante (3 µl de tampon Nel, 6 µl de H¿0, 1 µl (2.5 U) de Pací), por pocilio, a los 20 µl de .ADN. La reacción se efectúa a 37 °C durante 1 hora 30 mm. La placa , 20 es centrifugada y congelada a -20 °C hasta la etapa siguiente. El ADN viral debe ser digerido por Pací para escindir el genoma adenoviral, luego es transfectado en las células eucariotas transcomplementantes, para generar el banco . ** *f Ejemplo 5.3. Obtención del banco adenoviral de expresión. La placa de 96 pocilios que contenga los ADN por Pací es llevada a temperatura ambiente. Los 30 µl de ADN digerido por Pací de cada pocilio reciben 2 µl de Mejorador y 15 µl de efecteno ("Effectene Transfection Reagent", Quiagen, Alemania) . La mezcla transfectante es entonces distribuida en pocilios de una placa de 96 o 48 pocilios en donde han v sido sembradas células IGRP2 (WO 96/22378) a razón de 10 ?O células por cpr 14 dias después de la transfección, se muestrean 50-75 µl/pocillo de sobrenadante del cultivo y, sirven de inoculo para infectar una nueva placa de células transcomplementantes recientemente sembradas. Esta etapa de 15 amplificación se renueva 3-5 veces para asegurar una homogeneidad de los títulos virales obtenidos en cada uno de los pocilios. El título obtenido en cada uno de los pocilios está comprendido entre 5xl08 y 5xl09 partículas virales por mi. La placa se centrífuga y congela a -20 °C. 0 Estos virus pueden ser utilizados directamente sobre el sistema biológico apropiado. Después de infección del modelo celular por el banco, se determina y se utiliza un análisis funcional. Se investiga más preferentemente una actividad pro-apoptósica, anti-angiogénica o anti-apoptósica según el 5 modelo celular utilizado. El ordenamiento de los clones, luego de los virus en el momento de la construcción del banco permite volver fácilmente a la secuencia nucleotídica unida a una actividad funcional y definir así un nuevo objetivo. ;5 Ejemplo 6. Construcción de un plásmido portador de un genoma adenoviral compatible con el sistema de clonación -"-.. Gateway® comercializado por Life Technologies (LTI, Rockville, MA, USA) . El plásmido pSHExplacZ es generado, posee el promotor 10 CMV, el sitio attBl, el gen LacZ, el sitio attB2, y el sitio de poliadenilación de SV40 en un vector transportador de tipo pIG5 (Figura 2) . Para obtener este plásmido, el cDNA del gen LacZ que provenga del plásmido pSV40-LacZ (Promega) . .. es digerido por HindIII y Dral e insertado en los sitios XS X nl y EcoRV de pENTR-lA descritos por Life Technologies en (US 5,888,732) dando el plásmido pENTR-LacZ. Una reacción de tipo LR ("Gateway® cloning technology") , entre pENTR-LacZ y pDestl2.2 da pExpLacZ (denominación de la tecnología Gateway ) . Dos etapas de sub-clonación han facilitado la 20' obtención final de pSHExpLacZ: el fragmento Ncol/Asel de pExpLacZ es insertado en Asel y Ncol de pCA350 (derivado de pIG5) , generando el plásmido pSExpLacZ. Finalmente, el fragmento Pací/Salí de pSExpLacZ es insertado en Pacl/Saíl attB2, y sitio de poliadenilación de SV40, se encuentran en lugar y colocación del "cassette" CMV-LacZ del plásmido p$í transportador pIG5 (Ejemplo 2) . El plásmido así obtenido es designado pSHExpLacZ y está representado en la Figura 9. Un plásmido designado pAdGWExpLacZ compatible con el sistema Gateway®, es a continuación construido según la metodología EDRAG (FR 2,730,504) con la ayuda de los plás idos pSHExpLacZ y pXL2689. El plásmido pXL2689 que es descrito por Crouzet y 10 colaboradores (PNAS 1997), posee el origen del plásmido RK2, el gen de resistencia a la tetraciclma, y un genoma adenoviral infeccioso que presenta eliminaciones en El y E3. La recombmación de los plasmidos pXL2689 y pSHExpLacZ da nacimiento al plásmido pAdGWExpLacZ portador del genoma 15 adenoviral y del inserto que comprende el promotor CMV, el sitio attBl, el gen LacZ, el sitio attB2, y el sitio de poliadenilación de SV40 (Figura 9) . El plásmido pAdGWExpLacZ asi obtenido, comprende un gen de interés representado por LacZ entre los dos sitios de 0 recombmación attB del fago lambda de E.coli, y reacciona con un vector llamado donador del sistema Gateway® (pDONR201) que contenga los sitios attP, un gen de resitencia a la kanamicma (KnR),y el gen ccdB que es letal para E.coli. El plasmido que resulta de esta reacción llamado BP, según la 5 denominación de la tecnología de clonación Gateway®, es * Jf* ' designado pAdEST (plásmido Destino) y está representado en la figura 10. Finalmente, el plásmido pAdEST reacciona gracias a los sitios attRl y attR2 con un clon llamado de entrada del sistema Gateway® que contenga un inserto de interés rodeado de los sitios de recombinación attLl y attL2, por una reacción llamada LR. El plásmido así obtenido es designado pAdExp, y contiene un genoma adenoviral completo así como el inserto de interés (figura 11) . 10 Referencias Bibliográficas: Ausubel y colaboradores, 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Wiley and Sons, New York. Bolívar y colaboradores, 1977. Gene 2: 95. Crouzet y colaboradores, 1997, PNAS 94, 1414-1419. 15 Dagert y colaboradores, 1979, Gene, 6, 23-28. Ditta y colaboradores, 1980. Plasmid, 13, 149-154. Ghosh-Choudhurry y colaboradores 1986. Gene, 50, 161- 171 Hamilton y colaboradores, 1989, J. Bacteriol. 171:4617- 20 4622 Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol.. 166:557. Heffron y colaboradores, 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 702-706. Maniatis T., y colaboradores 1982. Molecular Cloning: A 25 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ney York.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguiente? reivindicaciones : 5 1. Procedimiento de producción de adenovirus caracterizado porque comprende: - a) la construcción de un primer plásmido (llamado "transportador") , de preferencia procariota que comprenda un primer genoma adenoviral recombinante truncado, que 10 comprenda al menos un ácido nucleico heterólogo. - b) la puesta en contacto de este primer plásmido con un segundo plásmido (llamado "progenitor") , que comprenda un segundo genoma adenoviral recombinante truncado, complementario del primero, que permita, por recombinación, 15 homologa, la producción de un plásmido final que comprenda un genoma adenoviral recombinante completo, y - c) la escición del genoma adenoviral recombinante completo lineal, a partir del plásmido final e introducirlo en una línea de encapsidación, para producir los adenovirus x2? recombinantes que incorporan el genoma adenoviral recombinante completo. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: - - la infección, por medio de los adenovirus 2t5 recombinantes producidos: 12. Plásmido según la reivindicación 8, caracterizado porque el genoma truncado comprende, en la orientación 5' - >3' , una secuencia de homología adenoviral, un ácido ^ nucleico heterólogo y una ITR adenoviral. 13. Plásmido según la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de homología adenoviral comprende toda o parte de una secuencia que codifica para la proteína pIX adenoviral . , "**, 14. Plásmido según la reivindicación 12 o 13, «* caracterizado porque el genoma truncado comprende la secuencia de un genoma adenoviral, desde la región que codifica a la proteína pIX hasta la ITR derecha, esta región que contiene el ácido nucleico heterólogo, insertado además , o en reemplazo de secuencias adenovirales. 15. Plásmido según alguna de las reivindicaciones 10, 11, 13 o 14, caracterizado porque la región que codifica a "*** la proteína pIX corresponde a una secuencia adenoviral de s tipo salvaje. 16. Plásmido según alguna de las reivindicaciones 10, 11, 13 o 14, caracterizado porque la región que codifica a la proteína pIX corresponde a una secuencia adenoviral de tipo degenerado. 17. Plásmido según cualquiera de las reivindicaciones 8 ' a 16, caracterizado porque el ácido nucleico heterólogo codifica para un producto biológico. - la construcción de un banco primario en un vector transportador según alguna de las reivindicaciones 8 a 19. - la transformación de un cultivo bacteriano con el*' banco primario mencionado, en presencia de un plámsido progenitor según la reivindicación 21 o 22, y - la introducción de los plásmidos obtenidos, o de los genomas adenovirales completos obtenidos después de ser escindidos por digestión enzimática, en una célula productora de adenovirus. 25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque comprende además: - la infección de un material biológico que comprenda células a fin de analizar los clones del banco. 26. Procedimiento según la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el banco primario está preparado a partir de un banco de ADNc, de ADNg o de ADN sintéticos. 27. Procedimiento según la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el banco primario es realizado a partir de oligonucleótidos aleatorios o semi-aleatorios . 28. Procedimiento según la reivindicación 24 o 25, caracterizado porque el banco primario es realizado a partir de un banco de secuencias capaces de unir el .ADN. 29. Procedimiento según alguna de las reivindicaciones 24 a 28, caracterizado porque los clones del banco son tratados separadamente. ' * ». r - RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a composiciones y, métodos para la preparación de adenovirus recombmantes. Los adenovirus producidos pueden ser utilizados para la transferencia y/o la expresión de genes en células, in vitro, ex vivo o m vivo, o igualmente en genómica funcional. En particular, la presente invención concierne a métodos particularmente eficaces para la producción de bancos adenovirales y la utilización de tales bancos en 10 genómica funcional. Concierne igualmente a plasmidos utilizados para la construcción de estos adenovirus. <, v * 2tí 5