CN1384885B

CN1384885B - 重组腺病毒与腺病毒库的制备方法

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Publication number: CN1384885B
Application number: CN008149038A
Authority: CN
Inventors: J-J.罗伯特
Original assignee: Aventis Pharma SA
Current assignee: Aventis Pharma SA
Priority date: 1999-10-07
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2011-06-22
Anticipated expiration: 2020-10-05
Also published as: EP1224310A1; AU7794700A; IL148493A0; HK1050211A1; CZ302282B6; US20090149349A1; FR2799472B1; KR20020057969A; HU228933B1; ZA200202481B; CZ20021215A3; ATE355385T1; KR100928105B1; HK1050211B; EP1224310B1; NZ518763A; CN1384885A; JP2003512823A; AU785431B2; IL148493A

Abstract

本发明涉及用于制备重组腺病毒的组合物与方法。腺病毒产品可以用于在试管内、在活体外或在活体内的细胞中或功能基因组中基因的转移和/或表达。更具体地，本发明涉及特别有效的腺病毒库制备方法与这些库在功能基因组中的应用。本发明还涉及构建这些腺病毒所使用的质粒。

Description

重组腺病毒与腺病毒库的制备方法

本发明涉及重组腺病毒组合物与制备方法。这些腺病毒产品可以用于在试管内、在活体外或在活体内的细胞中基因的转移和/或表达或被用于功能基因组学。更具体地，本发明涉及特别有效地用于制备腺病毒库的方法与这样一些基因库在功能基因组学中的应用。本发明还涉及构建这些腺病毒所使用的质粒，含有这些质粒的细胞，以及包含这些质粒、细胞和/或腺病毒库的试剂盒。

这些腺病毒在细胞中转移和/或表达基因方面具有某些有意义的性质。特别地，它们具有足够宽的宿主谱，能够感染休眠细胞，具有很强的克隆化能力，还不与感染细胞的基因组整合。另外，迄今为止，它们尚未与人体内严重疾病联系起来，因此也就用于在试管内或活体内将有意义的基因转移到不同的人体组织，例如肌肉(Ragot等人，《自然》，361(1993)647)，肝脏(Jaffe等人，“自然遗传学”(Naturegenetics)，1(1992)372)，神经系统(Akli等人，“自然遗传学”，3(1993)224)，肿瘤，平滑肌等之中。这些同样的性质使腺病毒载体成为一种可用于开发基因组的数据的选择工具。

功能基因组学应当被理解为致力于利用不同生物体的基因组或基因组数据以便将它们转译成功能术语这一过程的科学范畴。考虑到它们的性质，带有外生序列的腺病毒载体可以用于测定这种序列在各种试验模型中的功能。特别地，腺病毒载体能够用于在试管中或动物活体内在细胞模型中研究治疗靶(在药品工业意义或范围)。当这种序列是已知的并且已经得到表征时，这些腺病毒载体就可以用于这种靶的功能性证实过程。更广泛地，在所谓功能基因组学的情况下，转移基因的腺病毒载体能够构成用于在无需预先拥有有关这种序列性质或功能的具体信息、无需应该大量研究过许多序列的情况下鉴定真核生物试验模型中核酸序列功能的性能良好的工具。

但是，腺病毒在工业、治疗或在功能基因组学中的应用还受到限制，尤其受到这些重组病毒目前制备方法的限制。特别地，目前可被采用的方法尤其是在许多异源核酸应该加以研究时如在功能基因组学的情况下不能简单、快速与克隆化地生产结合异源核酸的腺病毒种群。确切地，本发明提供一种解决这些问题的方案。本发明事实上描述用于构建重组腺病毒的新工具和新方法。本发明具体地描述遗传构建体(质粒)、细胞和能够迅速大量生产腺病毒的方案。更具体地，本发明能够制备包含大量异源核酸的腺病毒库。

因此，本发明的一个方面在于重组腺病毒在测定核酸或蛋白的生物功能方面的应用。

本发明的另一个方面在于腺病毒在构建表达库方面的应用，其目的是分析具有未知功能和/或结构的核酸。

本发明还涉及腺病毒表达库，即包含来自任何DNA库的核酸插入片段的腺病毒种群。

本发明还涉及能够生产这样一些腺病毒，特别是这样一些库，特别有利地使用核酸库同时构建重组腺病毒的方法和工具。

腺病毒是双直链DNA病毒，其大小约36kb。它们的基因组特别地包含在每个端部的反向重复序列(ITR)、壳体化序列(Psi)、早期基因和晚期基因。在E1、E2、E3和E4区含有主要的早期基因。其中，被包含在E1区中的基因对病毒繁殖而言是不可缺少的。E4区在调节与复制腺病毒基因组时也是很重要的。主要的晚期基因被包含在L1-L5区。Ad5腺病毒基因组被完全测序并且可以在数据库上得到(具体参见Genbank M73260)。同样地，人或动物的部分、甚至全部其他腺病毒基因组(Ad2、Ad7、Ad12、CAV-2等)也已被测序。

另外，正如前面所指出的，这些腺病毒已经用于在活体内转移基因。为此，曾制备出由腺病毒得到的结合不同基因(β-gal、OTC、α-1AT、细胞分裂素、酶、生长因子等)的不同载体。每个这些构建体中，腺病毒的基因组得到修饰，以便使其在基因转移后不能复制和/或自主繁殖。于是，在现有技术中描述的构建体是缺失一个或多个区的腺病毒，所述区选自E1、E2、E3、E4、pIX、Iva2等。具体的构建体例如缺少E1区、E1和E3区、E1和E4区、E1、E4和E3区，或缺少全部腺病毒编码区(“无肠载体”)。这些载体一般包含异源核酸，曾探索该核酸在细胞中的转移或研究其转移。这种核酸可以插入该重组基因组的不同位点，缺失区的替代部位或其他部位。具体地在Levrero等人，《基因》101(1991)195；Gosh-Choudhury等人《基因》50(1986)161、WO94/12649、WO94/28152、WO94/28938、WO95/34671、WO96/10088、WO95/02697、WO95/27071等中描述过腺病毒载体实例，这些文献都被引入本文作为参考。

这些重组腺病毒是在感受态壳体化细胞系中通过转染重组病毒的DNA得到的产物。在可以具备一种带有重组病毒基因组整体的构建体时，涉及一种简单转染，或作为最常见的情况，涉及带有重组病毒基因组的不同部分的多个DNA片段的共转染。在这种情况下，该方法涉及在壳体化细胞系中不同构建体之间一个或多个同源重组步骤，以便产生重组病毒的DNA。为了实施这些方法中的一种方法或另一种方法，因此必需配置适合的构建体，这些构建体带有全部或部分人们希望产生的重组腺病毒基因组。

存在不同种在现有技术中描述的用于在试管中制备这些构建体的方法。最通用的技术在于分离病毒DNA，然后采用分子生物学的经典方法(消化、连接等)在试管中修饰该DNA。得到的构建体然后进行纯化，再用于转染壳体化细胞系。尽管如此，对于每个构建体或对于所有重组病毒DNA的操作，这种技术都要牵涉到生产病毒原种与纯化病毒DNA，因此，这种技术不适合于生产不同的原种或库。为了克服这些缺陷，曾提出使用原核生物质粒以制备供转染使用的病毒DNA。特别地，Bett等人(PNAS91(1994)8802)描述过一种在大肠杆菌中复制质粒的构建体，其中包含已修饰的腺病毒基因组(pBHG10质粒)。更确切地，这种质粒带有一种通过ITR序列拼接成环的缺失E1、E3和Psi区的腺病毒基因组，并且该基因组包含插入在腺病毒基因组188-1339区处的一部分pBR322质粒。这种质粒可以在大肠杆菌中复制，进行插入有意义基因的操作，但是，它仍然具有许多缺陷。它在生产病毒方面的应用特别地涉及拼接ITR的线性化和重组，由于这些构建体，这种重组可导致在重组腺病毒基因组中结合来自原核生物质粒的区。例如Graham(EMBOJ.3(12)(1984)2917)曾描述过这类具有同类缺陷的其他质粒。最近，曾描述过使用人工酵母染色体(YACs，Ketner等人，1994)或人工细菌染色体(Chartier等人，1996，Crouzet等人，1997，He等人，1998)尤其是基于两种质粒同源重组的新方法。这些方法尽管比以前的方法性能更为优异，但也更为复杂。YAC系统必需对酵母进行培养和操作(Ketner等人，1994)。在大肠杆菌系统中，多个步骤(其中包括某些关键步骤电转化、蔗糖选择)相继进行。特别需要指出，在所有情况下，一个或多个克隆筛选步骤，对于选择带有感染腺病毒基因组的最后克隆重组载体是必不可少的。如果这些方法能够有效地以克隆方式生产带有给定治疗基因的腺病毒原种，则这些方法就不能令人满意地用于高产率生产重组腺病毒，尤其不能用于同时生产多种结合不同核酸的重组腺病毒。

对利用腺病毒载体作为基因转移或分析系统的起到制约作用的因素在于生产这些病毒的操作复杂性和操作次数。因此，在现有技术中确实需要能够在试管内配置适合的、易于操作和可扩增的质粒，以便制备重组腺病毒基因组。同样重要的是，如此生产的基因组实际上缺少来自于该质粒的区，它们能够①诱导免疫反应，②编码抗性蛋白和③诱导病毒作为载体的能力。同时需要能够简化地、克隆化地、快速大量地产生重组腺病毒的方法。

本发明尤其能够克服这些缺陷。本发明事实上描述了符合这些标准的用于生产重组腺病毒的新组合物和方法。本发明的组合物和方法能够快速、有效和高产率地克隆生产可被治疗应用的或用于研究治疗靶的重组腺病毒。

本发明特别基于两种质粒(特别是原核生物)的应用，这些质粒能够在一个宿主细胞(特别是原核生物)中通过一个同源重组步骤产生一个包含完全的易于切除以便生产重组腺病毒的腺病毒基因组的质粒。

一般地，本发明的方法因此包括：

在第一个步骤中，构建第一个质粒(被称作《穿梭》)，优选地原核生物质粒，它含有第一个截短的重组腺病毒基因组，该基因组含有至少一个异源核酸(克隆步骤)。优选地，第一个截短的基因组含有ITR、异源核酸、腺病毒同源区，以及任选地壳体化序列。

在第二个步骤中，这第一个质粒与第二个质粒(称之“亲代”)接触，第二个质粒含有第二个与第一个质粒互补的截短的重组腺病毒基因组，通过同源重组能生产最后的质粒，这种质粒含有完全的重组腺病毒基因组(重组步骤)。优选地，第二个截短的腺病毒基因组含有至少一个ITR、与存在于第一个截短的腺病毒基因组中的区相同的腺病毒同源的区，和壳体化序列(如果该序列未存在于第一个截短的腺病毒基因组中)。这两个截短的腺病毒基因组还可以含有另一个有意义的核酸。

在第三个步骤中，从最后质粒切去完全的重组腺病毒基因组，再加入壳体化细胞系中，从而生产结合完全重组腺病毒基因组的重组腺病毒(腺病毒生产步骤)。

在任选的第四个步骤中，重组腺病毒用于感染：

-含有细胞的生物材料，其目的是分析核酸的性质(功能分析步骤)，

-在试管内或在活体外的细胞培养，其目的是生产用异源核酸编码的蛋白、多肽或肽，

-细胞、组织、器官或生物体，其目的是在活体内生产用异源核酸编码的蛋白、多肽或肽。

因此，本发明能够一步(同源重组)得到一种原核生物质粒，该质粒带有可用一种或多种合适酶切去的功能性(完全)腺病毒基因组。带有腺病毒序列(至少一个ITR和壳体化的序列)并且配有有意义异源核酸的第一个质粒(穿梭)，由于两个质粒的共同序列(腺病毒的同源序列)同源重组的结果，整合到带有互补腺病毒序列(至少一个第二个ITR序列)的第二个质粒(亲代)中，从而得到这个最后的质粒。这种同源重组的结果通过这种共-聚集体生产功能腺病毒基因组。

本发明方法的一个优点在于其简单性，这样允许使用多个穿梭质粒平行地进行。因此，本发明方法的第一个步骤有利地包括在穿梭质粒中核酸库的克隆化，于是产生带有功能腺病毒基因组的最后质粒库，还具有相同的结构，只是它们含有插入片段。优选地，例如在微量滴定板的加样孔中进行这个克隆化步骤，同时保持每个个性化的克隆。另外，这个步骤可自动地进行。得到的穿梭质粒库然后用于重组步骤，该库的每个穿梭质粒与亲代质粒进行接触。因此这种方法平行与同时地得到多种含有异源核酸的重组腺病毒(即病毒的表达库)。这时，为了鉴定具有所要求生物活性的克隆，可以利用生物材料对这种库进行试验(步骤4)。

如在下文将要详细说明的那样，可以使用任何类型腺病毒、原核生物与不同的核酸库实施本发明。

定义

重组腺病毒：术语重组病毒按照本发明表示其中基因组通过缺失和/或插入和/或碱基置换得到修饰的任何腺病毒。因此，更具体地涉及一般是感染的含有重组腺病毒基因组的腺病毒颗粒。根据对基因组进行的修饰，该重组病毒可以是复制缺失的，即在细胞中不能复制和/或自主繁殖。使用任何血清型腺病毒，特别是人的腺病毒(例如像Ad5、Ad2、Ad7、Ad12等C型)或动物的腺病毒(例如犬的腺病毒，例如像CAV-2)，可以制备该重组腺病毒。

腺病毒基因组：术语《腺病毒基因组》表示存在于腺病毒中的DNA分子，或其序列、样板或复制子。重组腺病毒基因组是一种其序列相应于腺病毒基因组序列的核酸，它包含一种或多种修饰。这些修饰例如包括缺失(例如缺失全部或部分E1、E2、E3、E4区等)、插入(例如插入一个或多个异源核酸)或改变密码子选择。

通过本发明的组合物和方法产生的重组腺病毒基因组，有利地是《完全》或《功能》基因组，即不需要为在所选择的壳体化细胞系中生产病毒原种而通过重组或连接提供其他的区。这样一种《完全》基因组因此有利地包括其两侧具有位于每个端部的ITR序列的至少一个壳体化序列和一个异源核酸。本发明质粒的另一个有利特点源于下述事实，即得到的完全重组腺病毒基因组未被原核质粒区间断。因此，生产的基因组基本上不含有具备上述缺陷的质粒区。另外，在本发明的质粒中，腺病毒基因组的ITR不是拼接的，这样能够得到可直接用于生产重组病毒的线性的完全重组病毒基因组。

优选地，重组腺病毒基因组至少包括多个ITR序列和一个可壳体化的序列。这些反向重复序列(ITR)构成了腺病毒的复制起源。它们位于病毒基因组端部，采用本领域技术人员已知的分子生物学常规技术，可以很容易将它们从该端部分离出来。在文献中描述过人的腺病毒(特别是Ad2和Ad5血清型腺病毒)以及犬的腺病毒(特别是CAV1和CAV2)ITR序列的核苷酸序列。例如关于Ad5腺病毒，左ITR序列相应于包括基因组第1-103个核苷酸的区。

壳体化序列(也指Psi序列)是病毒基因组的壳体化过程必不可少的。该序列位于在左ITR与E1区之间的原始腺病毒基因组中。它可以通过分子生物学的常规技术被人工合成。在文献中描述过人的腺病毒(特别是Ad2和Ad5血清型腺病毒)以及犬的腺病毒(特别是CAV1和CAV2)壳体化序列的核苷酸序列。例如关于Ad5腺病毒，功能壳体化序列是在基因组第194-358个核苷酸之间。

在本发明优选实施方式中，腺病毒基因组缺少全部或部分E1区。E1区事实上对病毒复制是很重要的，它的失活可导致生成复制缺失的病毒，即在活体内基因转移后不能自主地进行复制。采用本领域技术人员已知的任何技术，特别地在一个或多个所考虑的基因中，采用总抑制、置换、部分缺失或加入一种或多种碱基，可以将E1区或任何其他所考虑的病毒区变成非功能性的。例如采用遗传基因技术，可以很容易直接地在本发明的质粒上进行这样一些修饰。有利地，产生的腺病毒基因组在第454-3328个核苷酸(PvuII-BgIII片段)或第382-3446个核苷酸(HinfII-Sau3A片段)之间缺少一部分E1区。

截短的重组腺病毒基因组是指相应于腺病毒基因组端部的序列，即从末端(ITR)开始的序列的DNA。当两个截短的重组基因组每个都带有一个腺病毒基因组的互补部分并且它们可以采用同源重组再构成一个完全的重组腺病毒基因组时，这两个截短的重组基因组就是所述互补的。

异源核酸：术语《异源核酸》是指插入重组腺病毒基因组中的并且需要进行转移、表达或功能性研究的任何核酸。基本上涉及具有与“异源”腺病毒不同来源的核酸，例如来源于人、动物、植物、病毒(用作载体的腺病毒除外)、原核生物、低级真核生物、合成或半合成源的细胞。异源核酸的大小可以在含有它的重组腺病毒基因组不超过允许其在腺病毒颗粒中发生壳体化的最大尺寸的范围内改变(总共，40kb以下)。因此，可能涉及腺病毒的区已足够缺失时长度大于30kb的核酸。该核酸为此可以包括编码蛋白、多肽或肽的区，例如cDNA、gDNA或合成的DNA。还可能涉及未知结构的核酸，例如来自核酸库的克隆的核酸。另外，重组腺病毒基因组可以包括多个插入基因组不同位点的异源核酸。

质粒的描述

正如前面所指出的，本发明利用两种质粒(原核生物)，穿梭质粒和亲代质粒，每个包含重组腺病毒基因组的互补片段。这些质粒中至少一个具有例如在基因治疗、生产重组蛋白或功能基因组学方法方面有意义的异源核酸(或这样一种核酸的插入位点)。有利地，不处在所述基因组中的位点处在每个质粒所带有的每个截短的基因组末端(ITR序列)(左ITR，在5’位，右ITR，在3’位)的边上，以便在重组后能切除完全的基因组。这些质粒带有截短的腺病毒基因组，不可能单独产生感染的腺病毒基因组。这两个质粒中每个都具有与另一个互补的部分，以便通过共-整合作用产生最后的质粒，这时，两个ITR和至少一个未存在于所述基因组中的限制位点处在腺病毒基因组整体的两侧。存在于这些质粒中的重组腺病毒基因组片段是非完全的基因组，这种基因组不可能随后由其自身证实是感染的。这是特别有意义的，因为仅仅两种质粒的共合体就能够产生功能基因组。

这些质粒如图1表示并且将在下文更详细地被说明。这些质粒优选地是原核生物质粒，并且一般地包含一个质粒区和一个腺病毒区。该质粒区能在宿主细胞中，特别是在原核生物宿主细胞中复制和/或选择质粒。腺病毒区(截短的基因组)带有一部分重组腺病毒基因组，在与互补(亲代或穿梭)质粒的腺病毒区重组后，这部分重组腺病毒基因组能够重新构成完全的重组腺病毒基因组。

允许在原核生物细胞中复制的在本发明质粒中所使用的区可以是处在选择的细胞中的任何功能性复制源。可以涉及来自不相容性组P的质粒的复制源(实例＝DRK290)，它允许在大肠杆菌polA菌株中复制。更一般地，可以涉及来自在原核生物细胞中复制的质粒的任何复制源。这种质粒可以是一种pBR322衍生物(Boliver等人，1977)，一种puc衍生物(Viera和Messing，1982)或由同一不相容组得到的其他质粒，即例如CoIE1或pMB1。另外，这些质粒可以选自在大肠杆菌上复制的其他不相容组中。可能涉及由例如属于不相容组A、B、F1、FII、FIII、FIV、H1、H11、I1、I2、J、K、L、N、OF、P、Q、T、U、W、X、Y、Z或9的质粒得到的质粒。也可以使用其他的质粒，其中不是在大肠杆菌中，而是在其他宿主如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、链霉菌属、恶臭假单胞菌(P.putida)、绿脓杆菌(P.aeruginosa)、苜蓿根瘤菌(Rhizobiummeliloti)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、金黄色葡萄球菌(staDhylococcus aureus)、始旋链霉菌、屎肠球菌或梭状芽胞杆菌中复制的这些质粒。优选地，使用来自在大肠杆菌中复制的质粒的复制源。

能选择含有本发明质粒的原核生物细胞的区尤其是可以由任何赋予产物、特别是抗生素以抗生的基因构成。因此，例如可以列举赋予卡那霉素(Kan^r)、氨苄青霉素(Amp^r)、四环素(tet^r)或壮观霉素以抗性的在分子生物学中经常使用的基因(Maniatis等人，1989)。可以用除编码抗生素抗性标记物的基因外的其他基因选择质粒。一般地，可以涉及一种基因，该基因赋予细菌以一种它不再具有的功能(这可以相应于染色体上已缺失或变得失活的基因)，在该质粒上的基因重建这种功能。作为实例，可以涉及转移的RNA基因，它重建缺少的染色体功能(Somoes等人，1991)。

优选地，穿梭质粒和亲代质粒带有能选择每个元素的不同复制和/或标记源。

在每个质粒中包含的腺病毒区基本上相应于截短的腺病毒基因组的序列。这些每个质粒带有的截短的基因组是互补的，即同源重组后能产生完全的重组腺病毒基因组。另外，每个质粒带有的截短的基因组边上优选地具有一个或多个不存在于腺病毒基因组中的限制位点，以便在采用重组生产的完全重组腺病毒基因组边上具有这些位点。

在穿梭质粒中存在的截短的基因组

上述穿梭质粒用于接纳有意义的核酸，以便将它加入重组腺病毒基因组中。

穿梭质粒的腺病毒区相应于从其端(一个ITR序列)直到所选择腺病毒同源区，腺病毒基因组的左部分或右部分，这样能在两个质粒之间进行同源重组。另外，这种腺病毒基因组包含一种或多种遗传修饰。

在第一种实施方式中，存在于穿梭质粒中的截短的基因组相应于最后重组腺病毒基因组的左部分。在这种实施方式中，例如，它包含从左ITR直到pIX(和/或Iva2)蛋白编码区的序列，插入异源核酸，置换全部或部分E1区。在这种特定实施方式中，由pIX(和/或Iva2)蛋白编码区构成腺病毒同源区。

在另外一种实施方式中，存在于穿梭质粒中的截短的基因组相应于最后重组腺病毒基因组的右部分。在这种实施方式中，例如，它包含从右ITR直到pIX(和/或Iva2)蛋白编码区的序列，插入异源核酸，置换全部或部分例如E4或E3区。在这种特定实施方式中，由pIX(和/或Iva2)蛋白编码区也构成腺病毒同源区。

另外，在一种具体实施方式中，用修饰的腺病毒序列构成同源区。于是，例如通过借助变换编码子选择修饰的腺病毒区，同时采用遗传编码变性，可以构成同源区。在专利申请WO99/25861中描述过这样一些修饰，该文件作为参考文献引用于本文。在一种特别的实施方式中，由变性的pIX(和/或Iva2)蛋白编码区构成腺病毒同源区。

应当理解，根据(重组后产生的)最后重组腺病毒基因组的选定结构，腺病毒同源区可以相应于不同的基因组区。事实上，亲代质粒的腺病毒区可以从左ITR扩展直到E3区为止，这时，正是这个区构成了腺病毒同源段。更一般地，腺病毒同源区是一个相应于原始或修饰腺病毒基因组的区域整体的序列，这样允许在穿梭质粒与亲代质粒之间重组，以便产生最后的重组腺病毒基因组。这种同源区因此在穿梭质粒中和在亲代质粒中是基本相同的。根据使用的构建类型，这种区可以对应于腺病毒基因组的不同部分。

一种本发明的具体实施方式在于一种穿梭质粒，它包含的截短的基因组包括左ITR区、壳体化序列、异源核酸和由原始或变性pIX(和/或Iva2)蛋白编码区构成的腺病毒同源区(参见例如pJJ1和pIG5质粒)。

另外，在本发明的优选方式中，在截短的腺病毒基因组侧边上，ITR一侧带有不存在于腺病毒基因组(例如Pacl)中的位点。

存在于亲代质粒中的截短的基因组

上述亲代质粒带有一个能通过重组互补存在于穿梭质粒中的截短的基因组的截短的腺病毒基因组。它的结构因此依赖于穿梭质粒的结构。另外，亲代质粒还可以含有一种与穿梭质粒所带有的核酸不同的核酸。

因此，穿梭质粒的腺病毒区对应于腺病毒基因组的左部分时，存在于亲代质粒中的截短的基因组对应于其右部分，从ITR扩展直到腺病毒同源区为止。反之亦然，当穿梭质粒的腺病毒区对应于腺病毒基因组的右部分时，存在于亲代质粒中的截短的基因组对应于其左部分，从ITR扩展直到腺病毒同源区为止。

在第一种实施方式中，存在于亲代质粒中的截短的基因组对应于最后重组腺病毒基因组的右部分。在这种实施方式中，例如，它包含从右ITR直到pIX(和/或Iva2)蛋白编码区的序列。另外，该基因组可以包含多个遗传修饰，例如像全部或部分E4或E3区的缺失。

在另一种实施方式中，存在于亲代质粒中的截短的基因组对应于最后重组腺病毒基因组的左部分。在这种实施方式中，例如，它包含从左ITR直到接近E4区序列的序列。另外，该基因组可以包含多个遗传修饰，例如像全部或部分E1区的缺失。

优选地，亲代质粒带有一个对应于腺病毒基因组右部分的截短的基因组，并包含一个非功能的E3区。更优选地，它包含一个非功能的E4区。还更优选地，它包含全部或部分E4区的ORF3和/或ORF6相的缺失。在另一种特定实施方式中，亲代质粒带有一个对应于腺病毒基因组右部分的截短的基因组，并包含功能区E3和E4。

这样一些质粒的特别实例可用pOSE1、pOSE10-00、pOSE30-00、pOSE17-00和pOSE37-00表示(参见图1和4)。

在这种实施方式中，穿梭质粒带有一个对应于腺病毒基因组左部分的截短的基因组，并包含全部或部分E1区的缺失。

两个本发明意义上的特别优选的质粒是pOSE17-00质粒和pIG5质粒。pOSE17-00(亲代质粒)包含RK2质粒复制源，四环素抗性基因，和具有从Ad5的第3520碱基开始直到其边上具有Pacl位点的右ITR的腺病毒基因组的片段。这个基因组片段具有一个非功能的E3区和一个如申请WO99/25861中描述的在pIX和Iva2的修饰序列。pIG5质粒(穿梭质粒)具有RK6复制源，不能在pir-大肠杆菌菌株中被复制。pIG5具有ITR区和处在Pacl位点前面的壳体化区，所要求的表达盒和pOSE17-00的同源区(如申请WO99/25861中描述的在pIX和Iva2的修饰序列)。借助在两个质粒之间存在的同源区，通过同源重组，于是可以再构建所要求的基因组(即如申请WO99/25861中描述的在pIX和Iva2的修饰序列)。

使用每个都提供一部分基因组的两种质粒(一种质粒带有在Pacl位点前面的左ITR序列和全部病毒或非病毒序列，一种质粒在病毒或非病毒序列前面带有右ITR，接着Pacl位点，病毒或非病毒序列的选择取决于选择计划的构建体、全部或部分病毒基因所缺失的重组腺病毒载体)，本发明的方法于是能产生完全(感染的)重组基因组；这两个质粒具有足以实施同源重组的共同序列，在能得到同源重组的序列中还存在重迭。特别地，在与用于在E1区中加入外源序列所给出的方案类似的模式中，该方法能够借助适合的质粒在E4区中加入外源序列。在这种情况下，在亲代质粒(具有左ITR区和在Pacl酶的限制位点前面的壳体化区以及在E4区附近的截短的腺病毒基因组区)与穿梭质粒(具有与亲代载体相同的会被用于重组过程中的E4区的近序列、有意义序列表达盒、然后右ITR区和唯一的Pacl位点)之间发生重组。

根据一种特别有利的实施方式，产生的腺病毒基因组也缺少全部或部分E2和/或E4和/或IVA2区。这些补充的缺失能够增加载体的安全性并且提高其能力。优选地，该腺病毒基因组缺少一部分E4区，该区包含至少ORF3和ORF6相。该腺病毒基因组还可以如申请FR9413355中描述的那样进行修饰，该文件作为参考文献引入本文中，以便避免通过复制颗粒被污染的可能性。在具体方式中，得到的完全重组腺病毒基因组是所述的《gutless》基因组，即缺少腺病毒编码区整体的基因组。在这种实施方式中，这些质粒的截短的基因组，一方面包含ITR和壳体化区，另一方面包含ITR、由异源核酸本身或由人工序列构成的在每个质粒中包含的同源区。

为此，在每个质粒中存在的同源区一般可以是人工或非人工的允许进行同源重组的非病毒序列。

重组基因组还可以包含在活体内可切去的盒(WO97/47757)或能修饰病毒向性的已修饰遗传序列(纤维或腺病毒亚单位基因)。另外，还可以修饰病毒的基因组组织，以改善所生产病毒的安全性(WO96/13596)。

如上所述，有利地在重组腺病毒基因组侧边上具有一个或多个不存在于所述基因组中的限制位点。这个或这些位点能简单有效地切去质粒的重组腺病毒基因组。腺病毒的基因组序列是已知的并且可以得到，本领域技术人员可以通过一般经验选择不存在于这个基因组中的限制位点。作为实例，可以列举Pacl，NspV和Swal(对于Ad5)或SnabI(在Ad2中)位点。还可以通过修饰腺病毒基因组序列使某些位点变成专一的。于是，如果在大肠杆菌中构建的腺病毒序列中删除、修饰或缺失相应的限制位点，则可以使用其他的酶。这些位点可以直接地定位在腺病毒基因组端部附近，或以几个碱基对相间隔。

使用不同源的腺病毒可以构建本发明的质粒。事实上曾表征过其结构与性质略有改变的不同血清型腺病毒。在这些血清型中，在本发明的范围内宁可使用2型或5型人的腺病毒(Ad2或Ad5)或动物源腺病毒(参见申请WO94/26914)。在本发明范围内可使用的动物源腺病毒中，可以列举犬、牛、鼠(实例：Mavl，Beard等人，《病毒学》(Virology)75(1990)81)、羊、猪、禽或猴(实例：SAV)源腺病毒。优选地，动物源腺病毒是犬的腺病毒，更优选地，CAV2腺病毒[例如曼哈顿菌株或A26/61(ATCCVR-800)]。根据本发明一种特定实施方式，使用的腺病毒是人源腺病毒。根据另外一种有利的方式，腺病毒是动物源腺病毒。

同源重组与病毒制备

根据本领域技术人员已知的技术，在适合的细胞、优选原核生物细胞中，通过转染(或共-转染)质粒，可以实施同源重组步骤(能够重新构建完全基因组)。在一种特定实施方式中，为了选择这些同源重组的结果，使用polA菌株，在大肠杆菌中进行同源重组。明显地，在不存在能够选择重组结果的系统时也可以生产这些构建体。事实上，通过小量制备、损失或采集标记物，或使用专门的放射性探测器筛选获得或失去的接合，可以筛选这样一些重组结果。此外，还有一些其他的技术能选择大肠杆菌中同源重组的结果。在这些技术中，可列举使用热敏质粒用于它们的复制(Hamilton等人，1989)，使用非复制的环状分子(例如Slater和Maurer描述的，1993)，使用其中使用的载体不被复制的菌株(Miller和Mekalanos，1988，Zeef等人，1994)等。所有这些系统都可被用于替代DolA菌株和借助由pBR322得到的质粒或其许多衍生物，或与PolA复制相关的其他质粒或在大肠杆菌中不被复制的质粒完成的转变。

本发明的另一个目的涉及所有含有上述质粒的原核细胞。特别地涉及其中具有一个可加入重组DNA的载体系统的所有细菌。例如可以列举大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella，tyDhimurium)、枯草芽孢杆菌、恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌、根癌土壤杆菌、苜蓿根瘤菌或链霉菌属细菌。有利地，根据本领域技术人员已知的技术，采用转化可得到这些细胞。特别地，采用CaCl₂转化技术(Dagert和Ehrlich，1979)，或由Hanahan等人(1983)提出的技术以及采用电转化技术(Wirth等人，1989)可以进行这种转化。还可参见下面分子生物学的一般技术。

本发明另外一个目的在于重组腺病毒基因组的生产方法。根据这种方法，首先培养上述原核生物细胞，然后在第二步，回收质粒。有利地，培养时间应足够长，以便产生适当量的质粒。可以采用本领域技术人员任何已知的技术回收质粒，以制备质粒DNA。于是，通过制备清澈溶胞产物，接着在氯化铯梯度下离心可以回收质粒DNA(Maniatis等人，1989)。可以使用其他技术，例如使用tritonX-100(Ausubel等人，1987)，或使用在溶胞和质粒DNA与大多数染色体DNA和蛋白分离后的阴离子交换柱的其他溶胞法。然后，在与处在病毒基因组边上的位点相应的限制酶存在下，可以纯化和处理这样回收的质粒。这样可以一步产生线性重组腺病毒基因组，它可直接用于克隆生产重组病毒。

为此，制备重组病毒的第一种方法在于使用本发明的质粒在感受态壳体化细胞系，即带有缺失病毒互补所需的任何反式功能的细胞系中转染生产的病毒基因组。这些功能优选地整合在该细胞的基因组中，这样降低了重组的危险，使该细胞系具有增加的稳定性。

第二种方法在于在适合的细胞系中共转染制得的重组基因组和一个或多个病毒或辅助质粒的DNA。根据这种方法，配置能够补充重组腺病毒的任何缺失功能的感受态细胞系是不必要的。这些功能中一部分功能事实上是由一个或多个辅助病毒补充的。这个或这些辅助病毒本身是缺失的。

在可使用的细胞系中，具体可以列举293人胚胎的肾细胞系(Graham等人，J.Gen.Virol.36(1977)59)。这种细胞系具体地含有整合在其基因组中的Ad5人的腺病毒基因组的左部分(12％)。有利地，使用按照上述方法所得质粒的消化产物，无需腺病毒基因组纯化步骤，便可直接地进行转染。其他细胞系例如是使用胚胎视网膜细胞(HER)、肝脏细胞系等得到的细胞系。还涉及补充E1(293，PERC-6细胞)，E1和E4(IGRP2)，E1和E2等功能的细胞系。在现有技术中已描述可被本领域技术人员使用的细胞系。

采用本领域技术人员已知的技术(氯化铯，色谱等)可以分离与纯化如此得到的腺病毒。它们可以被用于不同的用途，如生产在试管内、在活体外或在活体内治疗或预防疾病的产品，还可应用于分析基因组的功能(以及构建库)。

新方法的应用优点如下：简化并更加快速产生重组体，不需要与强加于该方法和非功能亲代载体结构的复杂选择系统相关的筛选步骤。

与所述已知方法相反，该方法的稳定性基于选择压力的同时性，这种同时性可导致以唯一的一步选择唯一一种带有功能腺病毒基因组的最后质粒。以唯一的一步产生新重组载体可明显缩短与已知方法相比所需要的工作时间。由于所有筛选步骤都是无用的，所以与已知方法相比，需要的工作量明显地减轻。此外，不需要筛选开辟了一种采用同样的参与条件可同时产生许多重组腺病毒载体的方法。

本发明方法的另一个优点在于为产生带有功能基因组的最后质粒使用两种质粒的不可行方面。两种初始质粒中任何一种都不具有分别能使它产生功能腺病毒基因组的所有功能。另外，在强制选择(抗生素)时出现遗漏这种极端情况下，如果两类构建体(希望的构建体和初始质粒)在重组后共存于细菌菌株中，一旦这种转染的混合物处在产生的真核生物细胞中，这个结果对产生所希望的重组载体没有影响。事实上，由同源重组得到的希望的唯一构建体是可行的，并在产生的真核生物细胞中增扩，原始质粒是不可行的(对于每个质粒，至少一个ITR区也没有)。

上述本发明方法特征可归并为简化构建腺病毒载体和开辟了没有重组载体时产生其重组载体的可能性。涉及同时构建带有人们希望使其功能发挥效用的已知序列的重组腺病毒载体，或同时构建带有希望发现该功能的未知性质的序列的所有重组载体。在后一种情况下，谈到腺病毒表达库。

在基因治疗的应用中

可以在治疗应用中使用腺病毒。为此，异源核酸可以包含一个或多个治疗基因和/或编码抗原肽的基因。

可以如此转染的治疗基因是在其靶细胞中转录和任选地翻译产生具有治疗作用的产物的任何基因。

可以涉及对靶细胞同源的产物(即靶细胞没有任何病变时，在该细胞中正常表达的产物)。在这种情况下，例如该表达能够克服在细胞中表达不足，或能减缓因修饰而失活或低活性的蛋白质表达，或过表达所述蛋白质。该治疗基因还可以编码细胞蛋白的突变体，具有增加的稳定性，修饰的活性等。该产物对靶细胞还可以是异源的。在这种情况下，表达的蛋白质例如可以在能使其抗病变的细胞中补充或带来不足的活性。

在治疗产品中，更特别地可以列举酶、血液衍生物、激素、淋巴因子：白细胞介素、干扰素、TNF等(WO93/19191)，生长因子，神经传递素或其前体，或合成酶，营养因子：BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；Apo载脂蛋白：ApoAI、ApoAIV、ApoE等(WO94/25073)，肌营养不良蛋白或微肌营养不良蛋白(FR9111947)，肿瘤抑制剂基因：p53、Rb、RaplA、DCC、k-rev等(WO9424297)，凝结中涉及因素的编码基因：VII、VIII、IX因子，自杀基因(TK等)等。

治疗基因还可以是一种其在靶细胞中的表达能控制基因表达或细胞mRNA转录的基因或反义序列。根据专利EP140308描述的技术，这样一些序列例如可以在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，还能阻断它们翻译成蛋白质。

如上所述，有意义的核酸还可以包含一个或多个能在人体中产生免疫反应的抗原肽编码基因。在这种特定实施方式中，因此本发明可以制造能使人免疫，特别是对微生物或病毒免疫的疫苗。尤其涉及EB病毒、HIV病毒、B型肝炎病毒(EP185573)、假怒病毒的特效抗原肽或肿瘤特效抗原肽(EP259212)。

一般地，有意义的核酸还包含能表达治疗基因和/或在感染细胞中抗原肽编码基因的序列。涉及当序列能在感染细胞中起作用时自然地负责表达所考虑的基因的序列。还涉及不同源的序列(负责表达其他蛋白或甚至合成蛋白)。特别地，涉及真核生物基因或病毒的启动子序列。例如，涉及来自希望感染的细胞的基因组的启动子序列。同样地，涉及来自病毒，其中包括使用的病毒的基因组的启动子序列。为此，例如可以列举E1A、MLP(主要晚期启动子)、CMV(细胞巨化病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)等基因的启动子。另外，通过加入活化序列、调节序列等可以修饰这些表达序列。优选地，可以使用通过Tet on/off或off/on型四环素调节的或通过蜕皮素或地塞米松诱导的启动子。另外，插入的基因不包含表达序列时，该基因可以在该序列的下游在缺失的病毒基因组中插入。最后，有意义的核酸还可以特别地在治疗基因上游包含将合成的治疗产品引入靶细胞分泌路径中的信号序列。这种信号序列可以是治疗产品的自然信号序列，但也可以涉及任何其他功能性信号序列或人工信号序列。

本发明还涉及所有含有一种或多种根据本发明方法制备的重组腺病毒的药物组合物。本发明的药物组合物可以配制成局部、口服、肠胃道外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、经皮用药的组合物。

优选地，该药物组合物含有在药学上可接受的注射配方载体。具体地可以涉及盐溶液(磷酸一钠、磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这样一些盐的混合物)，灭菌液、等渗液或干组合物，特别是冻干组合物，根据情况，通过加入灭菌水或生理血清能将它们配制成可注射液。

注射使用的病毒剂量可以根据不同的参数，具体地根据采用的给药方式、相关疾病、待表达基因或所要求的治疗时间加以修正。一般地，本发明的重组腺病毒配制与服用剂量形式为10⁴-10¹⁴pfu，优选地10⁶-10¹⁰pfu。术语pfu(蚀斑形成单位)相应于病毒溶液的感染能力，通过感染适当细胞培养物并且一般在15天后测量感染细胞蚀斑数确定。病毒溶液的pfu效价测定技术在文献中已得到详细记载。

根据插入的异源DNA序列，本发明的腺病毒可以用于治疗或预防许多疾病，其中包括遗传疾病(营养障碍、囊性纤维化等)，神经变性疾病(阿尔茨海默病、帕金森氏病、脊萎缩性侧索硬化等)，癌、与凝固紊乱或与异常脂蛋白血症相关的病、与病毒感染(肝炎、爱滋病等)相关的病等。

在重组蛋白的生产应用中

本发明的方法能产生腺病毒载体，这些载体尤其能在培养的人细胞中生产重组蛋白。这可能涉及如人的血清白蛋白之类蛋白，人的干扰素，人抗体、人胰岛素、造血因子、如IX或VII因子之类的因子、溶解血栓的因子如组织血纤溶酶原激活物、各种生长因子、营养因子、细胞分裂素、中枢神经系统肽、类鸦片、酶、病毒抗原，但也可能涉及其他生物蛋白如植物蛋白。

在功能基因组的应用中

借助前面列举的同样生产工具，在制药业所包含的意义上，可以利用这种方法进行证实应用与发现新目标。

本发明还涉及使用所描述的方法开发组合物。特别地，在下游，整个制备过程能获得并且将任何性质核酸结合在本发明意义上的第一个穿梭质粒中，以及应用所述质粒通过各种自动化方法产生一种或多种重组腺病毒。这些重组腺病毒这时可以用于在试管内和活体内的多种模式中，以便评价它们带有的序列功能性。所产生重组腺病毒带有的序列功能性可以通过本领域技术人员了解的许多功能试验之一进行评价。

因此，本发明的目的还在于一种腺病毒表达库的制备方法，该方法包括下述步骤：

-在上述穿梭载体中构建原始库，

-在本发明亲代质粒存在下，使用所述原始库转化细菌培养物，

-将得到的质粒或在采用酶消化切去后完全的腺病毒基因组加入腺病毒生产细胞中，

-任选地，为了分析库的克隆，感染包含细胞的生物材料。

因此，这种方法包括第一个步骤，该步骤是在应用本发明和在试验模式中使用腺病毒库之前，在本发明的穿梭质粒中制备核酸原始库。采用本领域技术人员已知的分子生物学方法，可以在本发明质粒(穿梭质粒)中构建这样一种原始库。特别地，采用下述的一系列操作步骤可以构建该原始库：a)使用一个细胞群体得到mRNA(或全部RNA)；b)制备已分离mRNA群体的互补DNA；c)任选地制备核酸库，其中cDNA处于强启动子控制之下，或更特别地处于可调节启动子控制之下；d)将cDNA(或表达盒)加入本发明穿梭质粒中。

因此，本发明还涉及在载体，即上述穿梭质粒中克隆的核酸库。

在第二个步骤中，本发明中描述的穿梭质粒的原始库与亲代质粒共-转化，能得到带有功能腺病毒基因组的质粒库。可以通过在这些细菌中同时转化这些质粒，或者通过相继转染完成这个步骤。于是，亲代质粒可以首先被加入这些细菌中，然后转染穿梭质粒。

在第三个步骤中，质粒(或已切除功能重组基因组)在反式互补细胞中进行转染，这样能产生重组腺病毒库。优选地，得到的质粒进行分离和/或纯化，重组基因组通过用一种或多种适当的酶处理进行切除，但是，不切腺病毒基因组。

在第四个步骤中，使用重组腺病毒库感染所选择细胞群体(或生物材料)，能分析该库克隆的生物学性质或功能性质。为此，所选择的感染细胞群体置于能表达核酸的条件下，于是通过研究该细胞群体可鉴定所寻求的表型。然后，可以再回到诱导载体，并且因此而表征赋予所寻求表型的DNA。

有利地，为了能研究更强的功能，可以分开或不分开地在库中处理这些克隆。于是，在穿梭质粒中的原始库克隆在已经具有亲代截短的腺病毒质粒的细菌中以微斑单独转化。由于在选择压力下微斑增加(抗生素)，在用选择的酶(例如Pacl)切除基因组后，在生产的真核生物细胞中，纯化和转染所生产的DNA。这种方法示于图2。

根据本发明腺病毒表达库制备方法的一种优选实施方式，可以使用

克隆技术，该技术为Life Technologi e(LTI，Rockvill，MA，USA)所研制，特别地，能同时产生全部携带插入子的腺病毒，它们例如来自互补DNA库或采用本领域技术人员熟知的不同方法表征和选择的序列组。

在专利US5888732中特别描述过的

克隆技术借助重组反应在试管中反应时，能例如将处于两个质粒载体之间的插入子转移至大肠杆菌lambda噬菌体(λ)的attL、attR、attＢ和attP特定位点。这种基因插入不再需要在载体中有合适的限制位点存在，而只需要有所谓att序列的短重组序列存在。

一方面，

克隆系统在于进行所述LR反应，在这个反应过程中，为了产生Expression克隆，含有在attL位点周围的有意义插入子的Entrée克隆与含有attR位点的Destination克隆重组。Entrée克隆所带的有意义插入子这时转移到来自含有attB位点的Destination克隆的Expression载体中。另一方面，

克隆系统一方面在于其逆反应，该反应表示为BP反应，在这个反应过程中，为了得到含有attL位点的Entrée克隆，含有在attB重组位点周围有意义插入子的Expression克隆与含有attP位点的Donneur载体重组。

更确切地，根据第一个策略，为了使用拥有合适att位点的

系统产生相容的质粒，可以修饰如前面所描述的穿梭质粒，例如pJJ1。根据这第一种方法，att位点优选地被导入启动子(CMV)与穿梭质粒表达盒的SV40聚腺苷酸化位点之间。根据

技术命名法，如此得到的质粒被称作Destination质粒，然后参与同

技术的Entrée克隆反应。结果，所有来自DNA库或在载体中克隆的选定序列组，即Entrée克隆的所有插入子可以转移到本发明意义上的穿梭质粒中，得到了在本发明中可使用的Expression穿梭质粒，以产生相应的腺病毒载体。

根据第二个策略，修饰完全的腺病毒质粒，以便与技术相配合。因此，涉及到为了能实现在

克隆系统中所描述的反应，将合适的att位点加入带有腺病毒基因组的质粒中。优选地，att位点被加入启动子与聚腺苷酸化序列之间的腺病毒基因组E1区。这种策略于是能产生带有腺病毒基因组的质粒，它们包含在Entrée克隆中原本存在的各种插入子。可能涉及来自互补DNA库生产的插入子，涉及代表同一组或任何其他来源的基因的插入子。产生一种带有腺病毒基因组的修饰的和具有att序列的质粒，该质粒是技术意义上的Destination克隆，并且被称作pAdDEST(实施例6，图10)。如此得到的Destination克隆，pAdDEST可以与所有的Entrée克隆反应，得到带有腺病毒基因组的Expression质粒：如下面实施例6和图11中描述的pAdExp。

因此，本发明涉及一种新方法，该方法可用于证实或鉴定与能诱导特征表型的生理或遗传作用相关的序列。更具体地涉及引起基因缺陷的基因，或可以是遗传异常提示或是具有遗传异常特征的基因。

在功能基因组的活性范围内证实或确定一个或多个序列功能的应用过程中，这些序列可以是任何性质的，特别是前面列举的那些序列，但还可以来自具有多个未知性质的任何序列群体。这些序列可以并置于不同的盒中，以便最终被加入所希望的腺病毒基因组中。

这些序列可以来自任何活细胞类型或来自采用例如novo合成、突变形成、序列组合等不同方法人工生产的任何细胞类型。

大量的库都可以用作本发明范围内的核苷酸序列源，其中包括(但不限于)基因组DNA库(特别是染色体区-例如包括在YACs或BACs中的染色体区)，cDNA库，合成的DNA库，这些库已标准化或未标准化，并可用不同的活组织制备，以便同义或反义表达随机产生的具有产生各种肽能力的序列、用已知序列变性的序列、已知序列的嵌合性序列等。

特别地，待研究原始序列可以产生反义序列或遗传抑制元素。涉及其表达可以使被研究的生物系统中特定基因失活的序列。可以涉及核酶。

用于形成该库的序列可以来自不同的合成方法。特别地，模拟利用重组的定向分子变化能够通过利用这一变化的鉴定机理产生基因多样性(Curr.Op.in Biotech.1997，8：724-733)。

形成这些库所使用的序列还可以来自收集人的基因组数据的数据库的生物信息分析。采用通过不同方法所得到的基因表达分析，可以选择序列(EST，Microarrays，DNA碎片，差示显示，TIBtech1996，14第294-298页；《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，1998，16，第27-31页)。

特别地，该方法能产生随机化肽序列表达的腺病毒库。这时该方法能有助于选择和鉴定可与有意义蛋白相连的随机肽的序列。随机序列的寡核苷酸库加入相应于天然或合成蛋白的软环位点(多接头)，以便肽存在于蛋白表面。可以涉及在细胞内(Colas等人，1996，《自然》，380：548-550)或在细胞表面(Tramonto等人，1994，J.Mol.Recognit.7：9-24)存在这些肽。最后，这些肽可以存在于细胞外部，同时将分泌信号插入表达盒中(Rice等人，1992，PNAS89，5467-5471)。

一种或多种有意义的序列可以与载体整合在一起。

可以涉及最后评价序列组合(表达盒)，或与其他有意义的基因，例如标记基因一起共-表达有意义的序列。这时可以决定使用多顺反子序列，或把一种或多种在有意义序列中不同定位的待表达序列放在腺病毒基因组中。可使用的多顺反子序列是各种各样的。只使用一个RNAm，IRES元素就能有效翻译两个或多个开放的解读相。更特别地，解读相编码有意义的蛋白(来自cDNA库)，另一个解读相编码标记物，例如GFP。

该方法能使用与酶活性相关的切除/整合系统。可能涉及CRE-Lox系统(Baubonis等人，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)，21：2025-2029)，FRT-重组酶的FLP系统(Dang等人，Dev.Gent.13；367-375)，Moraxella lacunata的Piv系统(Lenic等人，1994，J.细菌学.176-4160)，λ整合酶的系统(Kwon等人，1997，《科学》，276，126)。更特别地，cDNA序列或表达盒与复制游离基因载体结合，而该载体可用腺病毒基因组的Cre-lox系统切除，并且转移到被分裂的感染细胞中(WO97/47757)。

该方法有利于证明DNA蛋白的相互作用。该库这时相应于能与DNA连接的序列群体。这涉及来自蛋白的多肽，该蛋白能自然地在DNA上固定或固定人工多肽。寻求一定DNA序列的最特效的序列。

该方法能证明蛋白-蛋白的相互作用。利用腺病毒载体的共感染能力。优选地，使用LacZ互补试验(PNAS，1997，94，8405-8410)。采用该原始构建体和该cDNA库共感染细胞系统。

可以用于分析本发明腺病毒表达库的功能试验是很多的，也是各种各样的。

例如可以使用互补试验，该试验在于鉴定来自于其表达得到所需细胞表型的库的核苷酸序列。更特别地，腺病毒表达库能感染表型特征不足的人的细胞。对这些感染细胞进行的分析和鉴别显示所寻求的表型特征。分析负责显现表型特征的病毒所携带的cDNA。还可以在由抗原活性或功能剔除造成的感染后测量表型特征消失。

该方法促进研究在生物系统中化学分子的作用方式。腺病毒表达库用于感染对药物作用有反应的生物系统细胞。在感染后，药物的效果可能没有变化，也可能增加或受到抑制。在这后两种情况下，分析被病毒基因组所携带的cDNA有助于发现在化学化合物的作用下所牵涉的细胞内和/或细胞外的途径。

于是可以将本发明方法用于：

-在生长停止和编程性细胞死亡的过程中，寻找能够避免p53产生作用的核酸(靶)，

-鉴定细胞分裂素；

-鉴定对细胞突产生不利影响的合成肽；

-寻找能进行肽细胞外表达的分子；

-鉴定肿瘤细胞用的靶，这些细胞不具有特定肿瘤的抑制基因；

-鉴定在转移过程中涉及的基因。

本发明还涉及试剂盒，其中包括：

-包含第一个腺病毒的截短的基因组的穿梭质粒；

-包含第二个腺病毒的截短的基因组的亲代质粒；

这两个质粒通过在两个腺病毒的截短的基因组之间的同源重组能产生最后的质粒，该质粒包含完全的线性重组腺病毒的基因组，在其边上有一个或多个未处在所述基因组中的限制位点。

通过下述应被视作说明性的和非限制性的实施例可更完全地描述本发明。，

附图说明

图1本发明原理的说明示意图。DJJ1穿梭质粒和DOSE1亲代质粒每个都具有互补片段，它们通过在大肠杆菌中同源重组生成共-聚集体，产生一种带有外源性序列的重组腺病毒的完全基因组。

KmR：卡那霉素抗性基因。TetR：四环素抗性基因。RK2起点：RK2质粒复制起点。RK6起点：RK6质粒复制起点。

图2同时产生96个重组腺病毒，它们带有来自在穿梭质粒中构建的cDNA库的cDNA。OSEDRAG技术性能的应用。

图3得到本发明的亲代质粒，它带有由EDRAG技术(Crouzet等人)提供的非完全的，因此非功能的腺病毒基因组序列。pJJ301质粒、pXL3215质粒和pOSE17-00质粒图。

图4本发明可使用的不同版本的亲代质粒图，用于产生不同版本的重组腺病毒载体，特别是E1和E3(pOSE10-00)缺失载体(pOSE10-00)，装有呈2#同质基因个体群形式的pIX区的E1和E3缺失载体(WO99/25861)-(pOSE17-00)，E1、E3和E4(pOSE30-00)缺失载体。装有呈2#同质基因个体群形式的pIX区的E1、E3和E4缺失载体(pOSE37-00)。

图5使用本发明方法，得到带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒基因组。pIG5穿梭质粒和pOSE17-00亲代质粒和pAd17-01最后质粒图。pIG5、pOSE17-00和pAd17-01质粒图。

图6采用本发明方法，使用三种不同的穿梭质粒得到腺病毒基因组(pIG5：带有LacZ基因的表达盒；pIG18质粒：带有荧光素酶基因的表达盒，以及pIG7：无表达盒)。克隆的酶消化过程由穿梭质粒和亲代质粒共转化完成。

图7使用本发明方法，在293生产细胞中转染pAD17-01质粒的不同克隆后得到腺病毒载体。使用在293细胞中扩增的病毒，酶消化纯化的病毒DNA。

图8使用本发明方法，得到由在pTA00穿梭质粒中DNAc原始库产生的腺病毒基因组库。该腺病毒基因组库是借助pOSE37-10亲代质粒得到的，该质粒是一种由pOSE37-10得到的质粒。pTA00、pOSE37-10和pAd37-10质粒图。

图9通过pSHExpLacZ和Px12689质粒同源重组，得到一种。与系统(LTI，Rockeville，MA，USA)相容的pAdGWExpLacZ表达质粒。

图10通过所述BP反应，得到带有完全腺病毒基因组的pAdDESTDestination质粒，处在attR1和attR2重组位点周围的大肠杆菌的ccdB致死基因。

图11通过所述LR反应得到带有有意义的pAdExp插入子的腺病毒质粒。

克隆化、分子生物学、细胞生物学的一般技术

在文献(Maniatis等人，1989)中描述过分子生物学的一般方法，例如氯化铯-溴乙非啶梯度质粒DNA离心、用限制酶消化、凝胶电泳、大肠杆菌中转化、核酸沉淀等。

New-England Biolabs(Beverly，MA)提供这些酶。对于结扎法，根据它们的尺寸，使用0.8-1.5％琼脂糖凝胶分离DNA片段，再用GeneClean(BIO101，LaJollaCA)纯化，并在50mMris-HClpH7.4、10mM MgCl₂、10mM DTT、2mM ATP的缓冲液中，在T4噬菌体的DNA连接酶存在下，于14℃培养一夜。

连接的DNA用于转化被赋予感受态的菌株，TG1大肠杆菌[△(lac proA，B)，supE，thi，hsdD5/F＇traD36，proA ⁺，B ⁺，lacl ^q，lacZ△M15](Maniatis等人，1982)，Top10大肠杆菌细胞(TOP10 One Shot试剂盒，Invitrogen，荷兰)或SF800polA大肠杆菌菌株(Heffron等人，1977)。

根据Maniatis等人，1989的方法，还采用PCR(聚合酶链反应)，按照下述条件进行扩增：变性温度95℃，杂化温度55℃，伸长温度72℃。在PTC-200Peltier Thermal Cycler(MJ Research，马萨诸塞州，美国)中重复进行25次这个循环。

GENSET公司(Evry，法国)合成寡聚核苷酸。ESGS公司(Evry，法国)测序。

实施例

实施例1：构建亲代质粒

这个实施例说明在大肠杆菌中复制的不相容组P的质粒里，得到在其5’部分截短的和E1和E3区缺失的腺病毒基因组，5型人的腺病毒，该基因组边上具有在其3’部分唯一的限制位点。

本发明的质粒可以以不同的方式进行构建。根据一种优选的方法，根据EDRAG方法(FR2730504)，使用pXL3215和pJJ301质粒构建pOSE17-00质粒。pXL3215质粒含有所有AD基因组(在E1和E3区中两个以下的缺失)，还具有在E1区由RSV启动子引导的LacZ基因表达盒。pXL3215质粒是pXL2689质粒的衍生物，含有RK2质粒的复制起点，四环素抗性基因(J.CrouzetPNAS，1997)。

pJJ301质粒具有RK2复制起点，不可能在大肠杆菌pir菌株中复制。pJJ301质粒具有卡那霉素抗性的基因。pJJ301质粒具有处在由pOSE17-00携带的腺病毒基因组开端的同源区。涉及在WO99/25861中描述的被称作2#种群的pIX区特定版本。在这个序列的上游，插入一个在pXL3215质粒中在完全腺病毒基因组上游区里的同源序列。pXL3215质粒和pJJ301质粒双重组导致pOSE17-00产生。这个pOSE17-00质粒相应于本发明意义上的亲代质粒，如图3所示。

以能产生在E1和E3区中缺失的腺病毒基因组(原始的pIX区版本或变性的pIX区版本)(WO99/25861)，或在E1、E3和E4区中缺失的腺病毒基因组(原始的pIX区版本或变性的pIX区版本)同样的流程，构建其他亲代质粒(pOSE10-00、pOSE30-00、pOSE37-00)(图4)。

实施例2：构建穿梭质粒

这个实施例描述了带有腺病毒基因组5＇区(ITR和壳体化区)的穿梭质粒，在PacI限制位点前的5型人的腺病毒。

所述质粒具有RK6复制起点，并且无法在大肠杆菌中被复制，对于pir蛋白，该大肠杆菌不能反式互补。所述pIG5质粒含有处在与pOSE17-00中存在的序列同源的序列(相应于一部分pIX Iva2区的序列)之前LacZ表达盒。这个质粒称之本发明意义上的穿梭质粒。它具有卡那霉素抗性的基因(图5)。

实施例3：生产功能的重组腺病毒基因组

这个实施例说明在大肠杆菌中复制的并带有LacZ基因表达盒的不相容组P的质粒里，得到E1和E3区缺失的功能腺病毒基因组，5型人的腺病毒，在该基因组边上在其端部有PacI限制位点。

预定的整合策略是在大肠杆菌菌株中在pOSE17-00与PIG5之间的同源重组。pOSE17-00质粒加入JM83Rec⁺lacZ^-大肠杆菌菌株的细胞中。在其循环后，来自有四环素抗性克隆的细胞已变成感受态的，被pIG5质粒转化，然后在四环素和卡那霉素存在下展开在LB介质上。如果pIG5质粒不在JM83菌株中复制，对四环素和卡那霉素的抗性只能通过在两个质粒之间同源重组获得。事实上，它们共同地具有Ad5基因组的pIX区。得到的质粒具有重组腺病毒载体的完全基因组，该基因组边上有PacI位点。用PacI和HindIII、EcoRI或PacI和Dral酶消化能控制获得期望的质粒结构。这种带有功能腺病毒基因组的最后质粒命名为pAd17-01(图5)。

同样地，pIG5质粒和pOSE37-00质粒导致一种质粒产生，它带有E1、E3、E4缺失的并装有呈2#同质基因个体群形式的pIX区的完全腺病毒基因组(WO99/25861)。

另外，根据同样的策略，有可能由带有或不带有表达盒的同一组构建其它重组基因组。使用pIG7和pIG18，并且它们可由pIG5得到：pIG7没有表达盒，而pIG18有一个荧光素酶基因表达盒。在表达盒不存在与细菌染色体基因组序列同源的序列的条件下，100％克隆预计是阳性的。正如图6中所说明的，由这些试验得到的100％分析克隆事实上显示出具有所预料的核苷酸结构(图6)。

用释放重组腺病毒基因组的PacI消化pAd17-01。对于腺病毒E1官能，这种消化产物可以原样用于转染反式互补哺乳动物细胞(293细胞)。

实施例4：生产重组腺病毒

采用下述方法可以在大肠杆菌中构建重组腺病毒克隆：①将含有一种或多种基因的片段借助适用于表达这些基因的调节信号插入研究的哺乳动物细胞中；②缺失某些腺病毒基因组的片段，或这两种方式的组合，然后在转染生产的细胞后，可以得到这种重组腺病毒的原种。

由转化的感受态的DH5大肠杆菌细胞培养物，纯化pAd17-01质粒。在PacI酶存在下，通过消化作用释放腺病毒基因组。消化的产物直接用于生产重组腺病毒。为此，在Effectene(Qiagen，德国)存在下，采用pAd17-01消化产物转染293细胞系的细胞。重组腺病毒在293细胞系中扩增，这样得到一种培养物的上清液，它含有效价约10¹⁰pfu/毫升的未纯化的重组腺病毒。

在来自扩增病毒的DNA经纯化后采用酶消化，可证明病毒DNA的相似性(图7)。

然后，根据已知的技术(具体参见Graham等人，《病毒学》，52(1973)456)，采用氯化铯梯度离心法或采用色谱法纯化病毒颗粒。腺病毒可以保存在-80℃，20％甘油中。

实施例5：构建腺病毒的表达库

使用装有RK6复制起点的穿梭质粒以得到穿梭质粒原始库，通过同源重组，该库可用来获得一个在具有RK2复制起点的质粒中重组腺病毒基因组的库。这个重组腺病毒基因组的质粒库在生产的反式互补细胞中转染得到重组腺病毒库。

在图2绘出所有步骤，图8示出了能得到腺病毒表达库的质粒结构。

实施例5.1：制备在穿梭载体中的DNAc库

为了制备在穿梭载体中的cDNA库(pIG5的衍生物，其中LacZ基因被切去，用多个克隆位点，具体地XhoI和EcoRI位点替换)，10-20微克用氯化铯梯度纯化的载体，用5U/微克XhoI和EcoRI酶于37℃消化90分钟。把这种消化物放在琼脂糖凝胶(1％Seakem GTG)上，在TAE缓冲液中，采用电泳分离线性载体。与载体相应的库在紫外光表上显色后显现轮廓。从琼脂糖洗下载体(Qiaquick DNA Cleanup System，Quiagen，德国)，再用苯酚/氯仿提取，然后在乙醇中沉淀进行纯化。在用XhoI和EcoRI消化的试验插入子连接后，这种载体能得到约5百万克隆/微克，背景噪声低于10％。

cDNA的制备：使用富含mRNA的RNA群体，可合成cDNA。根据通常的方案，使用superscriptII转录酶(Stratagene)，借助具有在5＇的Xhol位点的序列的引物oligo dT，合成第一链。在H RNAse和大肠杆菌的DNA连接酶存在下，使用大肠杆菌的聚合酶的DNA酶，合成第二链。通过DNA T4聚合酶的作用填平由第二股产生的端部。

如上所述，借助Biogel A50M，采用凝胶过滤色谱，根据大小分离cDNA(Soares等人，PNAS，91：9228-9232)。根据大小分离的cDNA用EcoRI市售适配体连接(Stratagene)，然后用EcoRI消化，产生了装有EcoRI(5＇)和Xhol(3＇)端的cDNA片段。再用Sepharose CL4B柱(Pharmacia)色谱除去未连接的适配体。使用T4聚核苷酸激酶，使带有适配体的cDNA磷酸化，再在如前面所述制备的穿梭载体的EcoRI、Xhol位点，使用DNA T4连接酶于16℃将它们连接起来，历时多达48小时(在10-20微升中600纳克载体+300纳克插入子)。该库在pir 116+菌株中采用电穿孔法进行扩增，该菌株能复制装有RK6复制起点的质粒，然后涂在100个于Agar-LB与卡那霉素的介质中直径150毫米的盒上获得5百万克隆的库。然后，根据Soaes等人(1994)描述的方案，让在穿梭质粒中的cDNA原始库进行标准化。依靠能测定克隆表达曲线的技术，例如像使用DNA芯片(Amersham，MolecularDynamics，Affymetrix)，进行克隆亚组的选择步骤。

在96个深加样孔的微量培养板中，根据每个孔的克隆，排序选自穿梭质粒中标准化的cDNA库的克隆。这些克隆在经过适配的抗生素(卡那霉素)存在下在液体介质(LB)中进行扩增。使用Quiagen机器人(Quiagen Biorobot 9600)和Quiaprep 96 Turbo Biorobot试剂盒(Quiagen德国)，对96个培养试样同时都制备了每个克隆的DNA。DNA重新放入50微升Texl中。使用所述的原始板排序96个质粒DNA试样。

实施例5.2：带有cDNA的功能腺病毒基因组的质粒库的制备

由RK2(pOSE37-00)质粒带有的亲代腺病毒基因组，采用通常的转化法加入JM83菌株中。装有质粒(JM83xpOSE37-00)的这种菌株培养物，采用标准的技术，通过100mM氯化钙相继洗涤而呈现感受态。

按照每个孔40微升，将感受态细胞(JM83 xpOSE37-00)分配在96个深孔微板里。每个穿梭质粒的DNA在这种菌株中转化，得到产生功能腺病毒基因组的同源重组结果。这时，将5微升来自所述原始培养板的DNA添加到40微升感受态的细胞中，同时保持其排列。该板升温到42℃达1分钟，然后再放在冰上达2分钟。每个孔添加1毫升含有两种适用抗生素(卡那霉素，四环素)的介质(LB)。在第一次培养6小时后，50微升该培养物用于接种新培养板，该培养板有96个深孔，装有1毫升含有两种适用抗生素(卡那霉素，四环素)的介质(LB)。维持培养14小时。

由这种培养物得到的质粒DNA，使用Quiagen机器人(QuiagenBiorobot 9600)和R.E.A.L.Prep 96 Biorobot试剂盒进行纯化，该试剂盒随后在异丙醇中沉淀之前添加一个Quiawell分离步骤，它来自Quiawell 96 Ultra Biorobot试剂盒(Quiagen德国)。DNA重新放入50微升Texl中。

20微升每个DNA(约0.4微克)这时转移到96个孔新微量培养板的孔中，同时保持其排列。使用PacI酶消化这种DNA，以切除病毒基因组。每个孔，往20微升DNA添加10微升反应混合物(3微升Nel缓冲液，6微升水，1微升(2.5U)PacI)。该反应于37℃进行1小时30分钟。该板经离心后，于-20℃冻干直到后续步骤。

应使用PacI消化病毒DNA，以切除病毒基因组，然后在反式互补的真核生物细胞中转染，产生病毒库。

实施例5.3：得到腺病毒表达库

带有由PacI消化的DNA的96孔培养板被调节到室温。每个孔中30微升由PacI消化的DNA接受2微升Enhancer和15微升effectene(Effectene Transfect ion Reagent，Quiagen Al lemagne)。转染的混合物这时分配到96孔或48孔培养板的孔中，或按照10¹⁰细胞/厘米²接种IGRP2细胞(WO96/22378)。

在转染14天后，取出50-75微升培养液上清液/孔作为接种物，感染新接种的反式互补细胞的新培养板。这个增扩步骤重复进行3-5次，以保证在每个孔中所得到的病毒效价均匀性。在每个孔中所得到的效价是每毫升5×10⁸-5×10⁹病毒颗粒。该板经离心后在-20℃冻干。

这些病毒可以直接用于适当的生物学系统。在用库感染细胞模式后，测定并进行功能分析。更优选地，根据所使用的细胞模式，研究编程性细胞死亡原、抗血管生成或抗编程性细胞死亡活性。构建库时克隆加病毒的排列能很容易再上升到与功能活性相关的核苷酸序列，于是确定了新的靶。

实施例6：构建一种带腺病毒基因组的质粒，该基因组与由LifeTechnologies销售的克隆系统(LTI，Rockeville，MA，USA)是相容的。

产生pSHExplacZ质粒。它具有在pIG5型穿梭载体中的CMV启动子，attB1位点，LacZ基因，attB2位点，以及SV40的聚腺苷酸化位点(图2)。为了得到这个质粒，用HindIII和DraI消化来自pSV40-lacZ(Promega)质粒的lacZ基因的DNA，再插入在US5888732中由Life Technologies所描述的pENTR-1A的Xmnl和EcoRV位点中，得到pENTR-lacZ质粒。pENTR-lacZ与pDest12.2之间的LR类反应克隆技术)得到pExplacZ(技术命名)。两个亚克隆步骤有可能最后得到pSHExplacZ：pExplacZ的NcoI/Asel片段插入pCA350(由pIG5得到)的AseI和NcoI，产生pSExplacZ质粒。最后，pSExplacZ的PacI/SaII片段插入pIG7质粒(由pIG5得到)的PacI/SaII。最后，重新将序列：CMV启动子，attB1位点，LacZ基因，attB2位点，以及SV40的聚腺苷酸化位点置于pIG5穿梭质粒的CMV-LacZ盒的位置(实施例2)。这样得到的质粒表示为pSHExplacZ，并且示于图9中。

然后，根据EDRAG方法(FR2730504)，使用pSHExplacZ和pXL2689质粒，构建一种与

系统相容的表示为pAdGWExplacZ的质粒。

Crouzet等人(PNAS，1997)所描述的pXL2689质粒具有RK2质粒起点，四环素抗性基因和在E1和E3区有缺失的感染腺病毒。pXL2689和pSHExplacZ质粒重组得到pAdGWExplacZ质粒，带有腺病毒基因组和插入子，它含有CMV启动子，attB1位点，LacZ基因，attB2位点，以及SV40的聚腺苷酸化位点(图9)。

这样得到的pAdGWExplacZ质粒含有一个用LacZ表示的有意义的基因，它在两个大肠杆菌λ噬菌体的attB重组位点之间，并且与所述系统给予体载体(pDONR201)反应，该载体带有attP位点，卡那霉素抗性基因(K_n ^R)和对大肠杆菌是致死的ccdB基因。根据

克隆技术的命名，由这个所述BP反应得到的质粒表示为pAdDEST(Destination质粒)，是于图10所示。

最后，pAdDEST质粒借助attR1和attR2位点与系统的所述开端克隆反应，该克隆通过所述LR反应带有在attL1和attL2重组位点周围的有意义的插入子。如此得到的质粒表示为pAdExp，带有完全腺病毒基因组以及有意义的插入子(图11)。

参考文献：

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Claims

1.腺病毒的体外生产方法，该方法包括：

-a)构建被称作穿梭的第一质粒，优选地原核生物质粒，它含有被截短的含有至少一个异源核酸的第一重组腺病毒基因组；

-b)使该第一质粒与被称作亲代的第二质粒接触，第二质粒含有与第一质粒互补的被截短的第二重组腺病毒基因组，通过同源重组能够生产含有完全的重组腺病毒基因组的最后质粒；以及

-c)从最后质粒切除线性的完全重组腺病毒基因组，再将其加入壳体化细胞系中，以生产出掺入了整个重组腺病毒基因组的重组腺病毒。

2.权利要求1的方法，该方法还包括：

使用生产的重组腺病毒感染：

-在试管内或在活体外的细胞培养物，其目的是生产异源核酸所编码的蛋白、多肽或肽。

3.权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤a)中，被截短的第一基因组含有ITR、异源核酸、腺病毒同源区，以及任选地壳体化序列。

4.权利要求3的方法，其特征在于在ITR边上具有不存在于腺病毒基因组中的限制位点。

5.权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤a)中，被截短的第二重组腺病毒基因组合有至少一个ITR、与存在于被截短的第一重组腺病毒基因组中的区相同的腺病毒同源的区，和壳体化序列，如果该序列未存在于被截短的第一重组腺病毒基因组中。

6.权利要求5的方法，其特征在于在ITR边上具有不存在于腺病毒基因组中的限制位点。