KR20020057969A - 재조합 아데노바이러스의 제조방법 및 아데노바이러스뱅크 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 아데노바이러스의 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 생성되는 아데노바이러스는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 유전자를 세포 중으로 전달하고/하거나 유전자를 세포 안에서 발현시키는 데, 또는 기능성 게노믹스에 사용될 수 있다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 아데노바이러스 뱅크 생산에 특히 효율적인 방법 및 기능성 게노믹스에서 이들 뱅크의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 아데노바이러스의 작제에 사용되는 플라스미드에 관한 것이다.

Description

재조합 아데노바이러스의 제조방법 및 아데노바이러스 뱅크{RECOMBINANT ADENOVIRUSES PREPARATION AND ADENOVIRUS BANKS}

아데노바이러스는 유전자를 세포 중으로 전달하고/하거나 유전자를 세포 중에서 발현시키는 데 유리한 소정의 특성을 보인다. 특히, 이들은 비교적 광범위한 숙주 스펙트럼을 보이고, 휴지 세포를 감염시킬 수 있으며, 상당한 클로닝능을 보유하며 감염 세포의 게놈 중으로 통합되지 않는다. 또한, 이들은 지금까지로서는 인간에서 심각한 병리와 연관되어 있지 않으며 따라서 해당 유전자를 시험관내 또는 생체내에서 근육(Ragot et al., Nature 361 (1993) 647), 간(Jaffe et al.,Nature genetics 1 (1992) 372), 신경계(Akli et al., Nature genetics 3 (1993) 224), 종양, 평활근 등과 같은 각종 인간 조직 중으로 전달하는 데 사용되어 왔다. 이러한 동일 특성은 아데노바이러스를 게노믹스로부터 유래된 발견을 활용하기 위한 선택 도구로 가능케 한다.

기능성 게노믹스란 게놈 활용 또는 기능적인 용어로는 이들을 발현시키기 위한 각종 유기체의 게놈으로부터의 발견들과 관련되는 과학 분야로 이해된다. 이들 특성의 견지에서, 외생성 서열을 운반하는 아데노바이러스 벡터는 다양한 실험 모델내에서 이러한 서열의 기능 측정에 사용될 수 있다. 특히, 아데노바이러스 벡터는 동물에서의 시험관내 또는 생체내 세포 모델에서 치료 표적(어느 정도까지는 또는 제약산업에서 이해되는) 연구에 사용될 수 있다. 이러한 서열이 공지되고 특징규명되면, 아데노바이러스 벡터는 이러한 표적의 기능 확인에 사용될 수 있다. 좀더 광범위하게 말해서, 기능성 게노믹스라는 맥락에서, 아데노바이러스 유전자 전달 벡터는 다수의 서열이 대량으로 연구되어야 할 상황을 포함하여, 이러한 서열의 성질이나 기능에 대한 특정 정보를 사전에 구비하지 않고도 실험용 진핵세포 모델에서 핵산 서열의 기능을 동정하기 위한 강력한 도구를 나타낼 수 있다.

그러나, 아데노바이러스의 산업상 및 치료상의 활용, 또는 기능성 게노믹스에서의 활용은 특히 이들 재조합 바이러스의 현 제조방법에 의해 여전히 제한되고 있다. 특히, 현재 이용 가능한 방법은 기능성 게노믹스에서의 경우처럼, 특히 다수의 이종 핵산을 연구해야 할 경우에, 이종 핵산 혼입 아데노바이러스 집단을 간단하고, 신속하며 클론에 의하여 생산될 수 있게 하지는 못한다. 본 발명은 구체적으로 말해서 이러한 문제점에 대한 해결책을 제공한다. 따라서, 본 발명은 재조합 아데노바이러스 작제를 위한 신규한 도구와 신규한 방법을 설명한다. 특히, 본 발명은 양질의 아데노바이러스를 신속하게 생산케 하는 유전자 작제물(플라스미드), 세포 및 프로토콜을 설명한다. 좀더 구체적으로 말하면, 본 발명은 다수의 이종 핵산을 포함하는 아데노바이러스 라이브러리를 제조할 수 있게 한다.

따라서, 본 발명의 일 태양은 핵산이나 단백질의 생물학적 기능 측정을 위한 재조합 아데노바이러스의 용도에 있다.

본 발명의 다른 태양은 미지의 기능 및/또는 구조의 핵산 분석용 발현 라이브러리의 작제를 위한 아데노바이러스의 용도에 있다.

또한, 본 발명은 아데노바이러스 발현 라이브러리, 즉 임의 DNA 라이브러리로부터 유래하는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스 집단에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 특히 이들 아데노바이러스, 구체적으로는 이러한 라이브러리를 생산하고, 유리하게는 핵산 라이브러리로부터 재조합 아데노바이러스를 동시에 작제하기 위한 방법과 도구에 관한 것이다.

아데노바이러스는 크기가 대략 36 kb인 선형의 이본쇄 DNA 바이러스이다. 이들의 게놈은 특히, 역반복 서열(ITR)을 각각의 말단에, 캡시드화 서열(Psi), 초기 유전자 및 후기 유전자를 포함한다. 주요 초기 유전자는 E1, E2, E3 및 E4 영역에 함유되어 있다. 이들 중에서 E1 영역에 함유된 유전자가 바이러스의 증식에 요구된다. E4 영역도 아데노바이러스 게놈의 복제 조절에 중요하다. 주요 후기 유전자는 L1 내지 L5 영역에 함유되어 있다. 아데노바이러스 Ad5의 게놈은 완전히 서열분석되었으며 데이터베이스로 이용가능하다(특히, Genbank M73260 참조). 이와 마찬가지로, 전부는 아니지만 다른 인간 또는 동물 아데노바이러스 게놈(Ad2, Ad7, Ad12, CAV-2 등)의 부분도 서열분석 되었다.

추가로, 전술한 바와 같이, 아데노바이러스는 이미 생체내에서의 유전자 전달에 사용되어 왔다. 이러한 이유로, 각종 유전자(β-gal, OTC, α-1AT, 사이토카인, 효소, 성장인자 등)를 혼입하는 상이한 아데노바이러스-유래 벡터가 제조되었다. 이들 작제물 각각에서, 아데노바이러스의 게놈은 유전자 전달 뒤에 자가 복제 및/또는 증식을 할 수 없게 되도록 변형시켰다. 따라서, 선행기술에 기재되어 있는 작제물은 E1, E2, E3, E4, pIX, IVa2 등에서 선택된 하나 이상의 영역이 결실된 아데노바이러스이다. 특정 작제물은 예를 들면, E1 영역, E1과 E3 영역, E1과 E4 영역, E1, E4와 E3 영역, 또는 아데노바이러스의 모든 암호화 영역(거틀리스 gutless 벡터)이 결여되어 있다. 이들 벡터는 일반적으로 세포 중으로 전달시키거나 또는 연구를 원하는 이종 핵산을 함유한다. 이러한 핵산은 재조합 게놈내 상이한 부위 중으로 삽입될 수 있으며, 이와 동시에 결실 영역을 대치하거나 또는 타 위치 중으로 삽입될 수 있다. 아데노바이러스 벡터의 예는 구체적으로, 본원에서 참조로 인용되는 간행물인 Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Gosh-Choudhury et al., Gene 50 (1986) 161, WO94/12649, WO94/28152, WO94/28938, WO95/34671, WO96/10088, WO95/02697, WO95/27071 등에 기재되어 있다.

재조합 아데노바이러스는 재조합 바이러스의 DNA를 컴피턴트 캡시드화 세포주 중으로 형질감염시킴으로써 생산된다. 형질감염은 재조합 바이러스의 게놈 전체를 운반하는 작제물이 이용될 수 있을 때 단일 형질감염일 수 있거나, 또는 그보다 자주 있는 경우는 아니지만 재조합 바이러스 게놈의 상이한 부분을 공급하는 수개의 DNA 단편의 공형질감염일 수 있다. 이 경우에, 과정은 재조합 바이러스의 DNA를 생성하도록 캡시드화 세포주에서 상이한 작제물간의 상동 재조합의 하나 이상의 단계를 수반한다. 이들 방법 중 하나를 수행하기 위해서는, 따라서 생산하고자 하는 재조합 아데노바이러스의 게놈 전부 또는 일부를 운반하는 이용 가능한 적절한 작제물을 구축하는 것이 필요하다.

선행기술은 이들 작제물의 시험관내 다양한 제조방법을 기술하고 있다. 가장 일반적으로 사용되고 있는 기술은 바이러스 DNA를 분리한 다음 분자생물학의 통상적인 방법(분해, 연결 등)을 사용하여 시험관내에서 변형시킴에 있다. 이어서, 생성되는 작제물은 정제되어 캡시드화 세포주의 형질감염에 사용된다. 그러나, 이러한 기술은 바이러스 스톡의 생산 및 각 작제물을 위한 또는 재조합 바이러스 DNA의 각각의 조작을 위한 바이러스 DNA의 정제 단계를 수반하며 따라서, 상이한 스톡 또는 라이브러리 생산에는 적합하지 않다. 이러한 결점을 치유하기 위해, 형질감염에 사용될 수 있는 바이러스 DNA의 제조에 원핵세포 플라스미드의 사용이 제안되었다. 특히, Bett 등(PNAS 91 (1994) 8802)은 이.콜라이에서 복제하고 변형된 아데노바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드(플라스미드 pBHG10)의 작제를 기술하고 있다. 좀더 정확하게 말해서, 이러한 플라스미드는 E1, E3 및 Psi 영역이 결실되고, 함께 결합되는 ITR 서열에 의해 환형화되며 아데노바이러스 게놈의 188-1399 영역 안에 삽입되는 플라스미드 pBR322의 일부를 포함하는 아데노바이러스 게놈을 운반한다.이 플라스미드는 이.콜라이에서 복제될 수 있고 해당 유전자 삽입을 위해 조작될 수 있지만, 여전히 단점을 안고 있다. 바이러스 생산에 이의 사용은 특히, 인접 ITR의 선형화와, 작제물 때문에, 원핵세포 플라스미드로부터 유래된 영역의 재조합 아데노바이러스 게놈 중으로의 혼입을 이끄는 재조합의 수행을 수반한다. 이와 동일한 유형이고 동일한 종류의 단점을 안고 있는 타 플라스미드가 예를 들면, Graham(EMBOJ. 3(12) (1984) 2917)에 기술되었다. 특히 두 플라스미드의 상동 재조합에 기초하고, 효모 인공 염색체(YACs, Ketner et al, 1994) 또는 박테리아(Chartier et al., 1996, Crouzet et al., 1997, He et al., 1998)를 사용하는 새로운 방법이 좀더 최근에 와서 기술되었다. 비록, 기존의 방법보다는 좀더 효과적이지만, 이들 방법은 좀더 복잡하다. YAC 시스템은 효모 배양과 조작을 필수로 한다(Ketner et al., 1994). 이.콜라이 시스템은 수개의 연속 단계를 수반한다(이의 일부, 즉 전기형질전환 및 슈크로스 선별이 중요하다). 특히, 모든 경우에, 감염성 아데노바이러스 게놈을 운반하는 최종 클로날 재조합 벡터의 선별에 클론 스크리닝의 하나 이상의 단계가 요구됨이 주목될 것이다. 비록 이들 방법이 소정의 치료 유전자를 운반하는 아데노바이러스의 스톡을 효과적이고 클론에 의하여 생산 가능하게 하지만, 이들을 고 생산율로 재조합 아데노바이러스를 생산하는 데, 특히 상이한 핵산을 혼입하는 다수의 재조합 아데노바이러스를 동시 생산하는 데는 만족스럽게 사용할 수 없다.

따라서, 이들 바이러스의 생산에 요구되는 작업의 복잡성과 횟수는 유전자 전달 또는 분석 시스템으로서의 아데노바이러스 벡터 사용에 제동을 건다. 따라서,재조합 아데노바이러스 게놈 제조를 위해, 시험관내에서 조작과 증폭이 용이한 이용 가능한 적당한 플라스미드를 구축하는 것이 종래기술에서 필요함이 자명하다. 또한, 이러한 식으로 생산되는 게놈은 플라스미드로부터 유래되고 (i)면역반응을 유도할 수 있고 (ii)내성 단백질을 암호화할 수 있으며 (iii)바이러스의 벡터로서의 능력을 감소시킬 수 있는 영역이 거의 없어야 함이 중요하다. 또한, 재조합 아데노바이러스를 클론에 의하여, 신속하게 그리고 다수로 좀더 용이하게 생성되도록 할 수 있는 방법론이 필요하다.

본 발명은 특히 이러한 결점의 치유가 가능하다. 따라서, 본 발명은 이러한 기준을 충족시키는 재조합 아데노바이러스 생산을 위한 신규 조성물 및 방법을 기술한다. 특히, 본 발명의 조성물과 방법은 치료에 또는 제약학적 표적의 검색에 사용될 수 있는 재조합 아데노바이러스를 클론에 의하여, 신속하게 그리고 고 생산율로 효율적으로 생산할 수 있게 한다.

본 발명은 특히, 하나의 상동 재조합 단계로 숙주세포에서(특히 원핵세포에서), 재조합 아데노바이러스의 생산을 위해 용이하게 절단될 수 있는 완전한 아데노바이러스 게놈을 포함하는 플라스미드를 생성할 수 있는 두 플라스미드(특히 원핵세포 플라스미드)의 사용에 기초한다.

일반적으로, 따라서, 본 발명의 과정은 제 1 단계에서, 적어도 하나의 이종 핵산을 포함하는 제 1 절두형(truncated) 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 제 1 플라스미드("셔틀 벡터"로 명명), 바람직하게는 원핵세포 플라스미드를 작제하는 단계를 포함한다(클로닝 단계). 제 1 절두형 게놈은 바람직하게는 ITR, 이종핵산, 아데노바이러스 상동 영역, 및 경우에 따라 캡시드화 서열을 포함한다.

이러한 제 1 플라스미드를 제 2 단계에서, 제 1 게놈에 상보적인 제 2 절두형 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 제 2 플라스미드("모(母)(parent) 플라스미드로 명명)와 접촉시킴으로써, 상동 재조합에 의해 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 최종 플라스미드를 생성 가능케 한다(재조합 단계). 제 2 절두형 아데노바이러스 게놈은 바람직하게는 적어도 하나의 ITR, 제 1 게놈에 존재하는 것과 동일한 아데노바이러스 상동 영역, 및 캡시드화 서열(후자가 제 1 게놈에 존재하지 않을 경우)을 포함한다. 이러한 제 2 절두형 아데노바이러스 게놈은 추가로 다른 해당 핵산도 포함할 수 있다.

제 3 단계에서, 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 최종 플라스미드에서 절단하고 캡시드화 세포주에 도입시켜 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 혼입하는 재조합 아데노바이러스를 생성시킨다(아데노바이러스 생산단계).

임의의 제 4 단계에서, 재조합 아데노바이러스를 다음의 감염에 사용한다:

- 핵산의 특성 분석을 위해, 세포를 포함하는 생물학적 물질(기능 분석 단계).

- 이종 핵산에 의해 암호화되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 생산을 위해, 시험관내 또는 생체외 세포 배양균,

- 이종 핵산에 의해 암호화되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 생체내 생산하기 위해, 세포, 조직, 기관 또는 유기체.

따라서, 본 발명은 일 단계로(상동 재조합), 하나 이상의 적당한 효소로 절단할 수 있는 (완전한) 기능성 아데노바이러스 게놈을 운반하는 원핵세포 플라스미드를 수득 가능하게 한다. 따라서, 이러한 최종 플라스미드는 아데노바이러스 서열(최소한 ITR 서열 및 캡시드화 서열)을 운반하고 해당 이종 핵산이 제공된 제 1 (셔틀) 플라스미드를 상보성 아데노바이러스 서열(최소한 제 2 ITR 서열)을 운반하는 제 2 (모) 플라스미드 중으로, 두 플라스미드에 공통인 서열(아데노바이러스 상동 서열)을 통해 일어나는 상동 재조합에 의해 통합시킴으로써 생성된다. 이러한 상동 재조합은 상기 공동 응집체를 통해 기능성 아데노바이러스 게놈을 생성한다.

본 발명 과정의 이점 중 하나는 다수의 셔틀 플라스미드를 사용하여 병행 수행 가능케 하는 단순성이다. 따라서, 과정의 제 1 단계는 유리하게는 핵산 라이브러리를 셔틀 플라스미드에 클로닝하여, 기능성 아데노바이러스 게놈을 운반하고 구조가 이들이 함유하는 삽입체와는 별도로 동일한 최종 플라스미드의 라이브러리를 생성한다. 이러한 클로닝 단계는 바람직하게는 각각의 클론을 분리된 채로 유지하면서 예를 들면, 마이크로적정 플레이트 웰에서 수행된다. 더욱이, 이러한 단계는 자동화될 수 있다. 이어서, 생성되는 셔틀 플라스미드 라이브러리는 재조합 단계에 사용되며, 라이브러리내 각 셔틀 플라스미드는 모 플라스미드와 접촉된다. 따라서, 이러한 과정에 의해 병행하여 동시에, 이종 핵산을 함유하는 다수의 재조합 아데노바이러스(즉, 아데노바이러스 발현 라이브러리)의 생성이 유도된다. 이어서, 이 라이브러리를 생물학적 물질에 대해 시험하여(단계 4) 추구하는 생물학적 활성을 보이는 클론을 동정할 수 있다.

하기 텍스트에서 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명은 어떠한 종류의 아데노바이러스와 원핵세포로도 사용될 수 있으며 상이한 핵산 라이브러리에 터잡을 수 있다.

본 발명은 재조합 아데노바이러스의 제조를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 생산되는 아데노바이러스는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 유전자를 세포 중으로 전달하고/하거나 유전자를 세포 안에서 발현시키는 데, 또는 기능성 게노믹스(genomics)에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 아데노바이러스 라이브러리 생산에 특히 효율적인 방법 및 기능성 게노믹스에서 이들 라이브러리의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 아데노바이러스의 작제에 사용되는 플라스미드, 이들 플라스미드를 보유하는 세포 및 이들 플라스미드, 세포 및/또는 아데노바이러스 라이브러리를 포함하는 키트에 관한 것이다.

도 1: 본 발명 원리의 다이어그램. 각각이 상보 단편을 보유하는 셔틀 플라스미드 pJJ1과 모 플라스미드 pOSE1은 이.콜라이에서의 상동 재조합에 의해 공동응집체를 형성하고, 이에 따라 외생성 서열을 운반하는 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈이 생성된다. KmR: 카나마이신 내성 유전자. Tet R: 테트라사이클린 내성 유전자. RK2 Ori: 플라스미드 RK2로부터의 복제기원. RK6 Ori: 플라스미드 RK6로부터의 복제기원.

도 2: 셔틀 플라스미드에서 작제되는 cDNA 라이브러리로부터 유래되는 cDNA를 운반하는 96 재조합 아데노바이러스의 동시 생성. OSEDRAG 기술의 특성 적용.

도 3: 불완전하고 따라서 비기능성인 아데노바이러스 게놈 서열을 운반하는 본 발명에 따른 모 플라스미드를 수득하기 위한 EDRAG 기술(Crouzet et al.)의 이용. 플라스미드 pJJ301, pXL3215 및 플라스미드 pOSE17-00의 지도.

도 4: 재조합 아데노바이러스 벡터의 상이한 버전, 특히 E1 및 E3가 결실된벡터(pOSE 10-00), E1과 E3가 결실되고 syngen#2 형태로 pIX 영역이 제공되는 벡터(WO99/25861)(pOSE 17-00), E1, E3 및 E4가 결실된 벡터(pOSE 30-00) 및 E1, E3, 및 E4가 결실되고 syngen#2 형태로 pIX 영역이 제공되는 벡터(pOSE37-00)의 생성을 위해 본 발명에 의해 사용될 수 있는 모 플라스미드의 상이한 버전의 지도.

도 5: LacZ 유전자 발현 카세트를 운반하는 재조합 아데노바이러스 게놈 수득을 위한 본 발명 과정의 이용. 셔틀 플라스미드 pIG5, 모 플라스미드 pOSE17-00 및 최종 플라스미드 pAd17-01의 지도. 플라스미드 pIG5, pOSE17-00 및 pAd17-01의 지도.

도 6: 3종의 상이한 셔틀 플라스미드(pIG5: LacZ 유전자 발현 카세트 운반; 플라스미드 pIG18: 루시퍼라제 유전자 발현 카세트 운반, 및 pIG7: 발현 카세트 없음)의 도움하에 아데노바이러스 게놈의 수득을 위한 본 발명 과정의 이용. 셔틀 플라스미드와 모 플라스미드의 공형질전환으로부터 생기는 클론의 효소 분해.

도 7: 플라스미드 pAD17-01의 상이한 클론을 293 생산자 세포 중으로 형질감염시킨 후 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 본 발명 과정의 이용. 293 세포에서 증폭시킨 바이러스로부터 정제한 바이러스 DNA의 효소 분해

도 8: 셔틀 플라스미드 pTA00에서 cDNA의 1차 라이브러리에 의해 생성된 아데노바이러스 게놈의 라이브러리를 수득하기 위한 본 발명 과정의 이용. pOSE37-00으로부터 유래되는 플라스미드인 모 플라스미드 pOSE37-10을 사용하여 아데노바이러스 게놈의 라이브러리를 수득한다. 플라스미드 pTA00, pOSE37-10 및 pAd37-10의 지도.

도 9: 플라스미드 pSHExpLacZ 및 Px12689를 상동 재조합함으로써, Gateway^R시스템(LTI, 미국 매사추세츠 록빌 소재)에 적합한 발현 플라스미드, 즉 pAdGWExpLacZ의 수득.

도 10: 완전한 아데노바이러스 게놈을 운반하고, 이.콜라이에 치명적인 유전자 ccdB가 재조합 부위 attR1과 attR2에 의해 에워싸인 데스티네이션 플라스미드, 즉 pAdDEST를 수득하기 위한 소위 말하는 BP 반응의 이용.

도 11: 소위 말하는 LR 반응에 의한, 해당 삽입체를 운반하는 아데노바이러스 플라스미드 pAdExp의 수득.

일반적인 클로닝, 분자생물학 및 세포생물학 기술

세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배에서 플라스미드 DNA의 원심분리, 제한효소에 의한 분해, 겔 전기영동, 이.콜라이 중으로의 형질전환, 핵산의 침전 등과 같은 통상의 분자생물학적 방법이 문헌에 기재되어 있다(Maniatis et al., 1989).

효소는 New England Biolabs(미국 매사추세츠 베벌리 소재)에 의해 공급된다. 연결을 위해, DNA 단편을 0.8 내지 1.5% 아가로스 겔상에서 크기별로 분리하고, GeneClean(BIO101, 미국 캘리포니아 라졸라 소재)를 사용하여 정제한 다음 파지 T4 DNA 리가제 존재하에 50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP 완충액 중 14℃에서 밤새 배양시킨다.

연결된 DNA를 컴피턴트하게 만든 이.콜라이 균주 TG1 [Δ(lac proA,B),supE, thi, hsdD5/F′traD36, proA⁺, B⁺, lac1^q, lacZΔM15](Maniatis et al., 1982), 이.콜라이 Top10 균주 세포(TOP10 원 샷 키트, Invitrogen, 네덜란드) 또는 이.콜라이 polA 균주 SF800(Heffron et al., 1977)의 형질전환에 사용한다.

하기 명세를 이용하여, Maniatis 등, 1989에 기재된 바와 같이 PCR(폴리머라제 연쇄 반응) 증폭을 수행한다:

- 변성 온도 95℃, 하이브리드화 온도 55℃, 연장 온도 72℃. 이러한 사이클을 PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJ Research, 미국 매사추세츠 소재)에서 25회 반복한다.

올리고뉴클레오타이드는 GENSET(프랑스 에브리 소재)사에 의해 합성되었다. 서열 분석은 ESGS(프랑스 에브리 소재)에 의해 수행되었다.

정의

●재조합 아데노바이러스: 재조합 아데노바이러스라는 용어는 본 발명의 의미내에서, 게놈이 염기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 아데노바이러스를 말한다. 따라서, 재조합 아데노바이러스는 좀더 구체적으로 말하면, 일반적으로 감염성이고 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 아데노바이러스 입자이다. 게놈에 가해진 변형에 따라, 재조합 바이러스는 복제 결손형일 수도 있으며, 즉 세포에서의 자가복제 및/또는 증식 불능이다. 재조합 아데노바이러스는 임의의 아데노바이러스 혈청형으로부터, 특히 인간(예를 들면, Ad5, Ad2, Ad7, Ad12 등과 같은 C형 아데노바이러스) 또는 동물(개 아데노바이러스, 예를 들면 CAV-2) 아데노바이러스로부터 제조될 수 있다.

●아데노바이러스 게놈: "아데노바이러스 게놈"이란 용어는 아데노바이러스에 존재하는 DNA 분자 또는 이의 서열 또는 이의 카피 또는 레플리카를 말한다. 재조합 아데노바이러스 게놈은 서열이 아데노바이러스 게놈의 서열에 상응하고 하나 이상의 변형을 포함하는 핵산이다. 변형은 예를 들면, 결실(예를 들면, E1, E2, E3, E4 등 영역의 전부 또는 일부의 결실), 삽입(예를 들면, 하나 이상의 이종 핵산의 삽입) 또는 코돈 용법의 변화를 포함한다.

본 발명의 조성물과 방법에 의해 생성되는 재조합 아데노바이러스 게놈은 유리하게는 "완전" 또는 "기능성" 게놈, 즉 선택된 캡시드화 세포주에서 바이러스 스톡을 생성하는 데 재조합이나 연결에 의해 공급되어야 할 타 영역을 요하지 않는 게놈이다. 따라서, 이러한 "완전" 게놈은 유리하게는 적어도 하나의 캡시드화 서열 및 이종 핵산을 포함하며, 캡시드화 서열과 이종 핵산은 각 말단에서 ITR 서열에 의해 함께 플랭킹된다. 본 발명에 따른 플라스미드의 또다른 유리한 특징은 수득되는 완전 재조합 아데노바이러스 게놈이 원핵세포 플라스미드의 영역에 의해 중단되지 않는다는 사실에서 연유한다. 이러한 이유로 해서, 생성되는 게놈은 본질적으로 플라스미드의 영역을 함유하지 않으며, 이의 단점은 전술한 바 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 플라스미드에서, 아데노바이러스 게놈의 ITR은 인접성이 아니므로, 재조합 바이러스의 생산에 직접 사용될 수 있는 완전한 선형 재조합 바이러스 게놈을 수득할 수 있게 한다.

재조합 아데노바이러스 게놈은 바람직하게는 적어도 ITR 서열과 캡시드화 서열을 포함한다. 역반복 서열(ITR)은 아데노바이러스의 복제기원을 구성한다. 이들은 바이러스 게놈의 말단에 위치하고 있으며, 이로부터 당업자에 공지된 통상의 분자생물학적 기술을 이용하여 용이하게 분리해낼 수 있다. 인간 아데노바이러스(특히, 혈청형 Ad2 및 Ad5)의 ITR 서열의 뉴클레오타이드 서열은 개 아데노바이러스(특히, CAV1 및 CAV2)의 것들과 마찬가지로 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, Ad5 아데노바이러스에 있어서, 좌측 ITR 서열은 게놈의 뉴클레오타이드 1-103을 포함하는 영역에 상응한다.

캡시드화 서열(Psi 서열로도 지칭)은 바이러스 게놈의 캡시드화에 요구된다.야생형 아데노바이러스 게놈의 경우에, 이는 좌측 ITR과 E1 영역 사이에 위치되어 있다. 이는 통상의 분자생물학적 기술을 이용하여 인위적으로 분리해내거나 합성할 수 있다. 인간 아데노바이러스(특히, 혈청형 Ad2 및 Ad5)의 캡시드화 서열의 뉴클레오타이드 서열은 개 아데노바이러스(특히, CAV1 및 CAV2)의 경우처럼 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, Ad5 아데노바이러스의 경우에, 기능성 캡시드화 서열은 게놈의 뉴클레오타이드 194 내지 358 사이에 존재한다.

본 발명의 바람직한 일 태양으로서, 아데노바이러스의 게놈은 E1 영역의 전부 또는 일부를 결여한다. 이러한 이유는 E1 영역이 바이러스 복제에 필수적이고 이의 불활성화는 복제 결손형, 즉 생체내 유전자 전달 뒤에 자가복제 불능인 바이러스의 형성을 초래하기 때문이다. E1 영역, 또는 고려되는 여타 바이러스 영역도 당업자에 공지된 임의 기술을 이용하여, 특히 고려되는 유전자에서 하나 이상의 염기의 완전 결실, 치환, 부분 결실 또는 첨가에 의해 비기능성으로 만들 수 있다. 이러한 변형과정은 본 발명의 플라스미드상에서 직접, 예를 들면, 유전공학 기술에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 유리하게는, 생성되는 아데노바이러스의 게놈은 뉴클레오타이드 454 내지 3328(PvuII/BgIII 단편) 또는 382 내지 3446(HinfII-Sau3A 단편) 사이의 E1 영역 일부를 결여한다.

절두형 재조합 아데노바이러스 게놈이란 아데노바이러스 게놈 말단부(즉, 한쪽 말단(ITR)으로부터)의 서열에 상응하는 DNA를 말한다. 두 개의 절두형 재조합 게놈은 이들 각각이 아데노바이러스 게놈의 상보 부분을 운반할 때 및 이들이 상동 재조합에 의해 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 재구성할 수 있을 때 상보적이라고 말한다.

●이종 핵산: "이종 핵산"이란 용어는 재조합 아데노바이러스 게놈 중으로 삽입되고 전달, 발현 또는 기능 연구를 추구하는 핵산을 말한다. 이종 핵산은 본질적으로, 예를 들면 인간 세포로부터 유래하거나, 동물, 식물, 바이러스(벡터로 사용된 아데노바이러스 제외), 원핵세포, 하등 진핵세포, 합성 또는 반합성 기원인, 아데노바이러스와는 상이한('이종") 기원을 갖는 핵산이다. 이종 핵산의 크기는 이를 함유하는 재조합 아데노바이러스 게놈이 이를 아데노바이러스 입자에 캡시드화시킬 수 있게 하는 최대 크기를 초과하지 않는 한 다양할 수 있다(전부 40 kb 미만). 따라서, 이종 핵산은 아데노바이러스의 충분한 영역이 결실될 때 길이가 30 kb보다 큰 핵산일 수 있다. 이와 관련하여, 핵산은 소정의 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 영역, 예를 들면, cDNA, gDNA 또는 합성 DNA를 포함할 수 있다. 핵산은 또한, 예를 들면 핵산 라이브러리에 속하는 클론으로부터 유래되는 미지 구조일 수 있다. 또한, 재조합 아데노바이러스 게놈은 게놈에서 상이한 부위에 삽입되는 수개의 이종 핵산을 포함할 수 있다.

플라스미드의 설명

전술한 바와 같이, 본 발명은 두 (원핵세포) 플라스미드, 즉 셔틀 플라스미드와 모 플라스미드를 요하며, 각각은 재조합 아데노바이러스 게놈의 상보 단편을 함유한다. 이들 플라스미드 중 적어도 하나는 예를 들면 유전자 치료용, 재조합 단백질 생산용 또는 기능성 게놈 연구용에 해당하는 이종 핵산(또는 이러한 핵산을 위한 삽입 부위)를 보유한다. 유리하게는, 플라스미드 각각에 의해 운반되는 절두형 게놈 각각의 말단(ITR 서열)은 재조합 후에 완전한 게놈이 절단될 수 있도록 상기 게놈에 존재하지 않는 부위에 의해 플랭킹된다(좌측 ITR의 경우에는 5′, 우측 ITR의 경우에는 3′). 이들 플라스미드는 아데노바이러스의 절두형 게놈을 운반하며 개별적으로는 감염성 아데노바이러스 게놈을 생성할 수 없다. 이들 두 플라스미드 각각은 공동 통합에 의해, 최종 플라스미드를 생성하기 위해 다른 하나에 상보적인 부분을 보유하며, 이어서 생성된 최종 플라스미드는 두 ITR에 의해 및 상기 게놈에는 존재하지 않는 적어도 하나의 제한부위에 의해 플랭킹되는 아데노바이러스 게놈의 전부를 보유한다. 이들 플라스미드에 존재하는 재조합 아데노바이러스 게놈 단편은 그에 따라 자체로는 감염성을 입증할 수 없는 불완전 게놈이다. 이러한 점은 두 플라스미드의 공동 통합체만이 기능성 게놈을 생성할 수 있으므로 특히 유리하다.

이들 플라스미드는 예를 들면 도 1에 도시되어 있으며 하기 텍스트에서 좀더 상세히 설명된다. 이들 플라스미드는 바람직하게는 원핵세포 플라스미드이고 일반적으로 플라스미드 영역과 아데노바이러스 영역을 포함한다. 플라스미드 영역은 플라스미드로 하여금 숙주세포, 특히 원핵 숙주세포에서 복제 및/또는 선별 가능하게 한다. 아데노바이러스 영역(절두형 게놈)은 재조합 아데노바이러스 게놈의 일부를 공급하며, 이러한 부분은 상보(모 또는 셔틀) 플라스미드의 아데노바이러스 영역과의 재조합 후에 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 재구성한다.

원핵세포에서의 복제를 허용하고, 본 발명의 플라스미드에 사용되는 영역은 선발된 세포에서 기능을 띠는 복제기원일 수 있다. 이는 이.콜라이 pol A 균주에서의 복제를 허용하는 P 부적합 그룹에 속하는 플라스미드(예를 들면, pRK290)로부터 유래하는 복제기원일 수 있다. 좀더 일반적으로, 이는 원핵세포에서 복제되는 플라스미드로부터 유래되는 임의의 복제기원일 수 있다. 이러한 플라스미드는 pBR322의 유도체(Bolivar et al., 1977), pUC의 유도체(Viera and Messing, 1982) 또는 동일한 부적합 그룹, 즉 예를 들면, ColE1 또는 pMB1으로부터 유래되는 타 플라스미드의 유도체일 수 있다. 이들 플라스미드는 또한, 이.콜라이에서 복제되는 다른 부적합 그룹으로부터도 선택될 수 있다. 이들은 예를 들면, A, B, FI, FII, FIII, FIV, H1, H11, I1, I2, J, K, L, N, OF, P, Q, T, U, W, X, Y, Z 또는 9 부적합 그룹에 속하는 플라스미드로부터 유래되는 플라스미드일 수 있다. 이.콜라이에서는 복제되지 않지만 비.서브틸리스, 스트렙토마이세스, 피. 푸티다, 피.에어루지노사, 리조비움 멜리로티, 애그로박테리움 투메파시엔스, 스태필로코커스 아우레우스, 스트렙토마이세스 프리스티나스피랄리스, 엔테로코커스 파시움 또는 클로스트리디움과 같은 타 숙주에서는 복제를 하는 플라스미드를 포함한 타 플라스미드도 사용될 수 있다. 이.콜라이에서 복제하는 플라스미드로부터 유래되는 복제기원의 사용이 바람직하다.

본 발명의 플라스미드를 보유하는 원핵세포의 선별을 허용하는 영역은 특히, 산물, 구체적으로는 항생물질에 대한 내성을 부여하는 임의 유전자로 구성될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 카나마이신(Kan^r), 앰피실린(Amp^r), 테트라사이클린(tet^r) 또는 스펙티노마이신에 대한 내성을 부여하고, 분자생물학에 통용되고있는(Maniatis et al., 1989) 유전자를 들 수 있다. 항생물질 내성 마커를 암호화하는 유전자가 아닌 타 유전자가 플라스미드 선별에 사용될 수 있다. 일반적으로, 유전자는 더 이상 보유하지 않는 기능을 박테리아에 부여하는 유전자이며(이는 염색체로부터 결실되었거나 불활성으로 만든 유전자에 상응할 수 있다), 이어서 플라스미드상의 유전자는 이러한 기능을 복구한다. 일례로서, 유전자는 불충분한 염색체 기능을 복구하는 트랜스퍼 RNA에 대한 유전자일 수 있다(Somoes et al., 1991).

셔틀 플라스미드 및 모 플라스미드는 바람직하게는, 각 요소가 선별될 수 있도록 하기 위해 상이한 복제기원 및/또는 마커를 운반한다.

플라스미드 각각에 함유된 아데노바이러스 영역은 본질적으로 절두형 아데노바이러스 게놈의 서열에 상응한다. 각각의 플라스미드에 의해 운반되는 이러한 절두형 게놈은 상보적이며, 즉 상동 재조합 후에 완전한 (선형의) 재조합 아데노바이러스 게놈을 생성할 수 있다. 또한, 플라스미드 각각에 의해 운반되는 절두형 게놈은 바람직하게는 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않는 하나 이상의 제한부위에 의해 플랭킹되어, 재조합에 의해 생성되는 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈이 이들 부위에 의해 플랭킹된다.

셔틀 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈

전술한 바와 같이, 셔틀 플라스미드는 해당 핵산이 재조합 아데노바이러스 게놈 중으로 혼입된다는 견지에서 상기 핵산 수용용이다.

셔틀 플라스미드의 아데노바이러스 영역은 말단에서부터(ITR 서열) 두 플라스미드간에 상동 재조합이 일어나게 할 수 있을 선택된 아데노바이러스 상동 영역까지 이르는, 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분 또는 우측 부분에 상응한다. 이러한 아데노바이러스 게놈은 하나 이상의 유전자 변형을 추가로 포함한다.

제 1 태양으로서, 셔틀 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 최종 재조합 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분에 상응한다. 이러한 태양에서, 절두형 게놈은 예를 들면, 좌측 ITR에서부터 pIX (및/또는 Iva2) 단백질 암호화 영역에 이르는 서열을 포함하며, 이종 핵산은 E1 영역의 전부 또는 일부 대신에 삽입된다. 이러한 특정 태양에서, 아데노바이러스 상동 영역은 pIX (및/또는 Iva2) 단백질을 암호화하는 영역으로 구성된다.

다른 태양으로서, 셔틀 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 최종 재조합 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응한다. 이러한 태양에서, 이는 예를 들면, 우측 ITR에서부터 pIX (및/또는 Iva2) 단백질 암호화 영역에 이르는 서열을 포함하며, 이종 핵산은 예를 들면, E4 또는 E3 영역의 전부 또는 일부 대신에 삽입된다. 이러한 특정 태양에서, 아데노바이러스 상동 영역은 또한 pIX (및/또는 Iva2) 단백질 암호화 영역으로 이루어진다.

더욱이, 특정 일 태양에서, 상동 영역은 변형된 아데노바이러스 서열로 이루어진다. 따라서, 상동 영역은 예를 들면, 유전코드의 축퇴성을 이용하여, 코돈 용법을 변화시킴으로써 변형된 아데노바이러스의 영역으로 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 본원에 인용되는 출원 WO99/25861에 기술되어 있다. 특정의 일 태양에서, 아데노바이러스 상동 영역은 축퇴성 pIX (및/또는 Iva2) 단백질을 암호화하는 영역으로 이루어진다.

아데노바이러스 상동 영역은 (재조합 후에 생성되는) 최종 재조합 아데노바이러스 게놈의 선택된 구조에 따라 게놈의 상이한 영역에 상응할 수 있음을 이해하여야 한다. 사실, 모 플라스미드의 아데노바이러스 영역은 좌측 ITR에서부터 E3 영역에 걸쳐 뻗어 있을 수 있으며, 그것이 바로 아데노바이러스 상동 지역을 구성하는 이 영역이다. 좀더 개괄적으로, 아데노바이러스 상동 영역은 최종 재조합 아데노바이러스 게놈을 생성하도록 셔틀 플라스미드와 모 플라스미드간에 재조합이 일어나게 할 수 있는 야생형 또는 변형 아데노바이러스 게놈의 임의 영역에 상응하는 서열이다. 따라서, 이러한 상동 영역은 셔틀 플라스미드에서와 모 플라스미드에서 본질적으로 동일하다. 이는 사용되는 작제물의 유형에 따라 아데노바이러스 게놈의 상이한 부분에 상응할 수 있다.

본 발명의 특정의 일 태양은 좌측 ITR 영역, 캡시드화 서열, 이종 핵산 및 야생형 또는 축퇴성 pIX (및/또는 Iva2) 단백질을 암호화하는 영역으로 이루어지는 아데노바이러스 상동 영역을 포함하는 절두형 게놈을 포함하는 셔틀 플라스미드에 있다(참조: 예를 들면, 플라스미드 pJJ1 및 pIG5).

또한, 본 발명의 바람직한 태양에서, 절두형 아데노바이러스 게놈은 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않는 부위, 예를 들면 PacI 부위에 의해 ITR의 방향으로 플랭킹된다.

모 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈

전술한 바와 같이, 모 플라스미드는 재조합에 의해, 셔틀 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈을 완성할 수 있는 절두형 아데노바이러스 게놈을 운반한다. 따라서, 이의 구조는 셔틀 플라스미드의 구조에 의존한다. 추가로, 모 플라스미드는 또한 셔틀 플라스미드에 의해 운반되는 것과는 상이한 핵산을 함유할 수 있다.

따라서, 셔틀 플라스미드의 아데노바이러스 영역이 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분에 상응할 때, 모 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 ITR에서부터 아데노바이러스 상동 영역에 걸쳐 뻗어있는 우측 부분에 상응한다. 거꾸로, 셔틀 플라스미드의 아데노바이러스 영역이 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응하면, 모 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 ITR에서부터 아데노바이러스 상동 영역에 걸쳐 뻗어있는 좌측 부분에 상응한다.

제 1 태양에서, 모 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 최종 재조합 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응한다. 이러한 태양에서, 이는 예를 들면, 우측 ITR에서부터 pIX (및/또는 Iva2) 단백질을 암호화하는 영역에 이르는 서열을 포함한다. 더욱이, 게놈은 예를 들면, E4 또는 E3 영역의 전부 또는 일부의 전부 또는 일부 결실과 같은 유전자 변형을 포함할 수 있다.

또다른 태양에서, 모 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈은 최종 재조합 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분에 상응한다. 이러한 태양에서, 이는 예를 들면 좌측 ITR에서부터 E4 영역에 근접한 서열에 이르는 서열을 포함한다. 또한, 게놈은 예를 들면 E1 영역의 전부 또는 일부의 전부 또는 일부 결실과 같은 유전자 변형을 포함할 수 있다.

모 플라스미드는 바람직하게는 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응하고 비기능성 E3 영역을 함유하는 절두형 게놈을 운반한다. 좀더 바람직하게는, 비기능성 E4 영역을 함유한다. 한층 더 바람직하게는, E4 영역의 ORF3 및/또는 ORF6 판독 프레임의 전부 또는 일부 결실을 함유한다. 다른 특정 태양에서, 모 플라스미드는 아데노바이러스 게놈의 우측 부분에 상응하는 절두형 게놈을 운반하고 기능성 E3 및 E4 영역을 포함한다.

pOSE1, pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE17-00 및 pOSE37-00(도 1과 4 참조)은 이들 플라스미드의 특정 예를 나타낸다.

이러한 태양에서, 셔틀 플라스미드는 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분에 상응하고 E1 영역의 전부 또는 일부의 결실을 함유하는 절두형 게놈을 운반한다.

본 발명의 의미내에서 특히 바람직한 두 플라스미드는 플라스미드 pOSE17-00 및 플라스미드 pIG5이다. pOSE17-00(모 플라스미드)은 플라스미드 RK2의 복제기원 및 테트라사이클린 내성 유전자를 포함하고, Ad5의 염기 3520에서 시작하여 PacI 부위에 의해 플랭킹되는 우측 ITR에까지 계속되는 아데노바이러스 게놈의 단편을 보유한다. 이러한 게놈 단편은 출원 WO99/25861에 기술된 바와 같이, pIX와 Iva2가 변형된 서열 및 비기능성 E3 영역을 보유한다. pIG5 플라스미드(셔틀 플라스미드)는 RK6 복제기원을 보유하고 이.콜라이 pir- 균주에서 복제 불능이다. pIG5는 PacI 부위에 의해 선행되는 ITR과 캡시드화 영역, 목적하는 발현 카세트 및 pOSE17-00(pIX와 Iva2가 변형되는 서열, 출원 WO99/25861에 기재)에 상동성인 영역을 보유한다. 목적하는 게놈은 따라서 두 플라스미드간에 상동성인 영역(즉, pIX와 Iva2가 변형되는 서열, 출원 WO99/25861에 기재)의 존재로 인한 상동 재조합에 의해 재구성된다.

따라서, 본 발명의 방법은 각각이 게놈의 일부를 공급하는 두 플라스미드로부터 완전한 (감염성) 재조합 게놈을 생성시킬 수 있게 한다(PacI 부위와 바이러스 또는 비바이러스 서열의 세트에 의해 선행되는 좌측 ITR 서열을 운반하는 일 플라스미드와, 바이러스 또는 비바이러스 서열이 선행하고, 우측 ITR, 그 뒤에 PacI 부위를 운반하는 일 플라스미드. 바이러스 또는 비바이러스 서열의 선택은 계획된 작제물, 즉 바이러스 유전자의 전부 또는 일부가 결실된 재조합 아데노바이러스 벡터의 선택에 좌우된다); 두 플라스미드는 상동 재조합 달성에 충분하고 상동 재조합이 일어나게 할 수 있는 서열에서 중첩을 보이는 서열을 공통으로 보유. 특히, 본 방법은 외생성 서열을 E1 영역 중으로 도입하기 위해 제시된 것과 필적하는 배치로, 외생성 서열을 적당한 플라스미드를 사용하여 E4 영역 중으로 도입되게 할 수 있다. 이 경우에, (효소 PacI에 대한 제한부위에 의해 및 E4 영역에 인접한 절두형 아데노바이러스 게놈에 의해 선행되는 좌측 ITR과 캡시드화 영역을 보유하는) 모 플라스미드와, (모 벡터와 동일하고

- 재조합에 관련될 것이며,

- 뒤에 해당 서열 발현 카세트가, 이어서 그 뒤에는 우측 ITR 영역과 고유한 PacI 부위가 따르는 E4 영역에 근접한 서열을 보유하는) 셔틀 플라스미드간에 재조합이 일어난다.

하나의 특별히 유리한 태양에 따라, 생성되는 아데노바이러스의 게놈은 또한 E3 및/또는 E4 및/또는 IVA2 영역의 전부 또는 일부를 결여한다. 이러한 추가 결실은 벡터의 안전성을 증가시키고 이의 능력을 확대시킨다. 바람직하게는, 아데노바이러스 게놈은 적어도 ORF3 및 ORF6 개방 판독 프레임을 포함하는 E4 영역의 일부를 결여한다. 복제 입자에 의한 오염 위험성을 피하기 위해, 아데노바이러스 게놈은 또한 본원에서 참조로 인용되는 출원 FR 9413355에 기재된 바와 같이 변형시킬 수 있다. 특정의 일 태양에서, 생성되는 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈은 소위 말하는 거틀리스 게놈, 즉 아데노바이러스의 암호화 영역을 결여하는 게놈이다. 이러한 태양에서, 플라스미드의 절두형 게놈은 한편으로는 ITR과 캡시드화 영역을 포함하고, 다른 한편으로는 ITR을 포함하며, 상동 영역은 각 플라스미드에 포함되는 이종 핵산 자체 또는 인공 서열로 이루어질 수 있다.

이와 관련하여, 각 플라스미드에 존재하는 상동 영역은 일반적으로, 인공 서열이거나 비인공 서열이고, 상동 재조합이 일어나게 할 수 있는 비바이러스 서열일 수 있다.

재조합 게놈은 또한, 생체내에서 절단되는 카세트(WO97/47757) 또는 바이러스의 주성(tropism)이 변화될 수 있게 하는 변형된 유전자 서열(섬유 또는 펜톤 유전자)도 포함할 수 있다. 또한, 바이러스의 게놈 구성도 생성되는 바이러스의 안전성 향상을 위해 변형시킬 수 있다(WO96/13596).

전술한 바와 같이, 재조합 아데노바이러스 게놈은 게놈에 존재하지 않는 하나 이상의 제한부위에 의해 유리하게 플랭킹된다. 이러한 부위는 재조합 아데노바이러스 게놈이 플라스미드로부터 간단하고 효율적으로 절단될 수 있게 한다. 아데노바이러스의 게놈 서열은 알려져 있고 이용 가능하므로, 당업자는 일상적인 실험을 이용하여 이러한 게놈에 존재하지 않는 제한부위를 선택할 수 있다. PacI, NspV및 SwaI(Ad5의 경우) 또는 SnabI(Ad2의 경우) 부위가 예시될 수 있다. 또한, 아데노바이러스 게놈의 서열을 변형시킴으로써 특정 부위를 고유하게 만들 수 있다. 따라서, 이.콜라이에서 작제되는 아데노바이러스 서열에서 상응하는 제한부위가 억제, 변형 또는 결실되면 다른 효소도 사용될 수 있다. 부위는 아데노바이러스 게놈의 말단에 바로 인접하여 위치될 수 있거나 말단에서 소수의 염기쌍에 의해 이격될 수 있다.

본 발명에 따른 플라스미드는 다양한 기원의 아데노바이러스를 사용하여 작제될 수 있다. 따라서, 구조와 특성이 다소 다양한 각종 아데노바이러스 혈청형이 특징규명되었다. 이들 혈청형 중에서, 인간 2형 또는 5형 아데노바이러스(Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(출원 WO 94/26914 참조)를 사용하는 것이 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있고 예로 들 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 쥐(예를 들면: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이(예를 들면: SAV) 기원의 아데노바이러스이다. 동물 기원의 아데노바이러스는 바람직하게는 개 아데노바이러스, 더욱 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스[예를 들면, 맨해튼 스트레인 또는 A26/61(ATCC VR-800)]이다. 본 발명의 특정 태양에 따라, 사용되는 아데노바이러스는 인간 기원의 아데노바이러스이다. 다른 유리한 태양에 따라, 아데노바이러스는 동물 기원의 아데노바이러스이다.

바이러스의 상동 재조합 및 생산

플라스미드를 적절한 세포, 바람직하게는 원핵세포 중으로 형질감염 (또는공형질감염)시킴으로써 (완전한 게놈이 재구성되게 할 수 있는) 상동 재조합 단계를 수행하는 데에는 당업자에 공지된 기술이 사용될 수 있다. 특정의 일 태양에서, 상동 재조합은 상동 재조합을 선별하기 위해 polA 균주를 사용하여 이.콜라이에서 수행된다. 이러한 작제물은 재조합 선별 시스템의 부재하에 제조될 수 있음이 자명하다. 이러한 이유는 이들 재조합이 미니 제조물의 제조에 의해, 또는 마커의 손실이나 획득에 의해 스크리닝될 수 있거나, 또는 수득되거나 손실되는 연접부에 특이적인 방사능 탐침 사용을 위해 스크리닝될 수 있기 때문이다. 추가로, 이.콜라이내 상동 재조합 선별을 위한 타 기술도 존재한다. 언급될 수 있는 것들로는 복제가 온도-감수성인 플라스미드의 사용(Hamilton et al., 1989), 비-복제성 환상 분자의 사용(예를 들면, Slater and Maurer, 1993에 의해 기술), 사용된 벡터가 복제하지 않는 균주의 사용(Miller and Mekalanos, 1988, Zeef et al., 1994) 등이 있다. 이러한 시스템은 polA 균주 대신 사용될 수 있고 pBR322로부터 유래된 플라스미드, 또는 이의 다수 유도체, 또는 복제가 PolA-의존형인 타 플라스미드, 또는 이.콜라이에서 복제하지 못하는 플라스미드로 형질전환된다.

본 출원 주제의 다른 파트는 상기 정의된 플라스미드를 보유하고 있는 원핵세포에 관한 것이다. 세포는 특히, 재조합 DNA가 도입될 수 있는 벡터 시스템이 존재하는 박테리아일 수 있다. 언급될 수 있는 예로는 이.콜라이, 살모넬라 티피무리움, 바실러스 서브틸리스, 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 에어루지노사, 애그로박테리움 투메파시엔스, 리조비움 멜리로티 또는 스트렙토마이세스 속의 박테리아가 있다. 이들 세포는 유리하게는 당업자에 공지된 기술을 이용하여 형질전환에 의해수득된다. 형질전환은 특히, CaCl₂를 사용하는 형질전환 기술에 의해(Dagert and Ehrlich, 1979), 또는 Hanahan 등(1983)에 의해 개발된 기술에 의해 또는 그로부터 파생된 기술에 의해(Maniatis et al., 1989), 및 전기형질전환에 의해(Wirth et al., 1989) 수행될 수 있다. 아울러 하기의 일반 분자생물학 기술 참조.

본 발명 주제의 또다른 파트는 재조합 아데노바이러스 게놈의 생산방법에 있다. 이러한 방법에 따라, 전술한 바와 같은 원핵세포를 배양하고 이어서 플라스미드를 제 2 단계에서 회수한다. 배양은 유리하게는 적당량의 플라스미드 생산에 충분히 긴 시간 동안 수행된다. 플라스미드는 플라스미드 DNA 제조를 위한 당업자에 공지된 여타 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 따라서, 투명한 용해질을 제조한 다음 세슘 클로라이드 구배에서 원심분리함으로써 회수될 수 있다(Maniatis et al., 1989). 예를 들면, 트리톤 X-100을 사용하는 용해(Ausubel et al., 1987), 또는 대부분의 염색체 DNA와 단백질로부터 플라스미드 DNA의 용해 및 분리 단계 후 음이온 교환 칼럼을 사용하는 다른 방법에 호소하는 타 기술을 사용하는 것도 가능하다. 이어서, 이렇게 하여 회수된 플라스미드는 정제되고 바이러스 게놈과 경계를 이루는 부위에 상응하는 제한효소의 존재하에 처리될 수 있다. 이렇게 함으로써 재조합 바이러스의 클론 생산에 직접 사용될 수 있는 선형 재조합 아데노바이러스 게놈이 하나의 단일 단계로 생성될 수 있게 된다.

이와 관련하여, 재조합 바이러스 제조를 위한 제 1 방법은 본 발명의 플라스미드로부터 생산된 바이러스 게놈을 컴피턴트 캡시드화 세포주, 즉 결손형 바이러스를 상보화하는 데 요구되는 모든 기능을 트랜스로 운반하는 세포주 중으로 형질감염시키는 데 있다. 이러한 기능은 바람직하게는 세포의 게놈 중으로 통합되어, 재조합 위험을 감소시키고 세포주에 증가된 안정성을 부여하게 된다.

제 2 방법은 적절한 세포주 중으로, 제조된 재조합 게놈과 하나 이상의 헬퍼 바이러스 또는 플라스미드의 DNA를 공형질감염시키는 데 있다. 이 방법이 사용될 경우, 재조합 아데노바이러스의 모든 결손 기능을 상보할 수 있는 컴피턴트 세포주가 꼭 필요한 것은 아니다. 왜냐하면 이러한 기능 중 일부는 헬퍼 바이러스에 의해 상보되기 때문이다. 이러한 헬퍼 바이러스는 그 자체로는 결손형이다.

사용될 수 있고 특별히 언급될 수 있는 세포주로는 인간 배아 신장 세포주 293(Graham et al., J. Gen. Virol, 36 (1977) 59)이 있다. 이 세포주는 특히 자신의 게놈 중으로 통합된, 인간 Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측 부분(12%)을 함유한다. 형질감염은 유리하게는, 아데노바이러스 게놈의 어떠한 정제 단계도 없이, 전술한 방법에 따라 수득된 플라스미드 분해 산물을 사용하여 직접 수행될 수 있다. 타 세포주의 예로는 배아 망막 세포(HER), 간 세포 등으로부터 생성되는 세포주가 있다. 세포주는 E1(293, PERC-6 세포), E1 및 E4(IGRP2), 및 E1 및 E2 기능 등을 상보하는 세포주일 수 있다. 이들 세포주는 선행기술에 기술되어 있고 당업자에 의해 이용될 수 있다.

이러한 방식으로 생산되는 아데노바이러스는 당업자에 공지된 기술(세슘 클로라이드, 크로마토그래피 등)을 이용하여 분리 또는 정제할 수 있다. 이들은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 치료 또는 예방 제품의 생산과 같은 다양한 적용에,또는 게놈 (및 라이브러리의 조성)을 기능적으로 분석하는 데 사용될 수 있다.

신규 과정을 이용하는 이점은 다음과 같다: 더욱 용이하게, 그리고 더 큰 속도로 및 과정과 비기능성 모 벡터의 구조에 부과되는 다수의 선별 시스템과 결부된 스크리닝 단계에 대한 요구 없이 재조합체의 생성.

공지의 기술된 과정과는 상반되게, 과정의 확고함은 단일 단계로, 기능성 아데노바이러스 게놈을 운반하는 유일한 최종 플라스미드의 선별을 유도하는 도태압의 동시성에 기초한다. 단일 단계로 새로운 재조합 벡터의 생성은 공지의 과정과 비교하여 필요한 작업시간을 상당히 감소시킨다. 스크리닝 단계가 필요하지 않으므로, 요구되는 작업량은 공지의 과정에 비해 상당히 감소된다. 더욱이, 스크리닝의 불필요성은 하나의 단일 단계 중간체를 통한 다수의 재조합 아데노바이러스 벡터의 동시 생성의 길을 열어 놓았다.

본 발명 과정의 다른 이점은 기능성 게놈을 운반하는 최종 플라스미드의 생성을 위해 보충되는 두 플라스미드의 자생불능이라는 측면에 있다. 두 초기 플라스미드 중 어느 것도 기능성 아데노바이러스 게놈을 생성케 할 수 있을 모든 기능을 따로따로 보유하지 않는다. 또한, 부과된 선별(항생물질)에서의 탈출이라는 극한 상황에서, 및 박테리아 균주에서의 재조합 후 작제물의 두 유형(목적 작제물 및 초기 플라스미드)을 공존시켰을 경우, 이러한 결과는 일단 상기 혼합물이 진핵세포 생산자 세포 중으로 형질감염되면 목적 재조합 벡터의 생성에 어떠한 영향도 미치지 않을 것이다. 그 이유는 상동 재조합으로 생기는 목적 작제물만이 자생성이고, 진핵세포 생산자 세포에서 증식하기 때문이며, 초기 플라스미드는 자생불능이다(각플라스미드에 적어도 하나의 ITR 영역의 부재).

본 과정의 전술한 특징은 아데노바이러스 벡터의 작제를 단순화하는 쪽으로 기여하고 높은 생산율로 재조합 벡터의 생산 가능성을 열어 놓았다. 이러한 점은 기능 확인을 원하는 공지 서열을 운반하는 재조합 아데노바이러스 벡터의 동시 작제 또는 기능 발견을 원하는 알려지지 않은 성질의 서열을 운반하는 재조합 벡터 세트의 동시 작제에 관계될 수 있다. 이러한 후자의 경우에, 벡터 세트는 아데노바이러스 발현 카세트로서 언급된다.

유전자 치료 적용

아데노바이러스는 치료 적용에 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 이종 핵산은 하나 이상의 치료 유전자 및/또는 항원 펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다.

이러한 식으로 전달될 수 있는 치료 유전자는 전사 및, 경우에 따라 표적 세포에서의 해독이 치료 효과가 있는 산물을 생성하는 모든 유전자이다.

산물은 표적 세포에 대하여 상동성인 산물(즉, 표적 세포가 어떠한 병리도 보이지 않을 때 이러한 표적 세포에서 정상적으로 발현되는 산물)일 수 있다. 이 경우에, 발현은 예를 들면, 세포에서의 불충분한 발현 또는 변형에 기인하여 불활성이거나 약 활성을 띠는 단백질의 발현을 벌충하거나, 단백질을 과발현시킬 수 있다. 치료 유전자는 또한 증가된 안정성, 변형된 활성 등을 지닌 세포 단백질의 돌연변이체를 암호화할 수 있다. 산물은 또한 표적 세포에 대해 이종성일 수 있다. 이 경우에, 발현 단백질은 예를 들면, 세포에서는 결핍되어 있는 활성을 상보하거나 공급할 수 있어서, 세포로 하여금 병리에 대항할 수 있게 한다.

좀더 구체적으로 언급될 수 있는 치료 산물은 효소, 혈액 유도체, 호르몬, 림포카인:인터류킨, 인터페론, TNF 등(WO93/19191), 성장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체나 이들의 합성효소, 트로픽 인자: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 등; 아포지방단백질: ApoAI, ApoAIV, ApoE 등(WO94/25073), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 9111947), 종양-억제 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(WO94/24297), 응고 관련 인자의 암호화 유전자: 인자 VII, VIII 및 IX, 자살 유전자(TK 등) 등이다.

치료 유전자는 또한 표적 세포에서의 발현이 세포 유전자의 발현 또는 세포 mRNA의 전사를 조절할 수 있게 하는 유전자 또는 안티센스 서열일 수 있다. 이러한 성질의 서열은 특허 EP 140 308에 기재된 기술에 따라, 예를 들면, 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보적인 RNA로 전사될 수 있고 이에 따라 mRNA의 단백질로의 해독을 차단할 수 있다.

전술한 바와 같이, 해당 핵산은 또한 인간에서 면역반응을 생성할 수 있는 항원 펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 특정 태양에서, 따라서 본 발명은 특히 미생물이나 바이러스에 대한 인간 면역용 백신을 제조할 수 있게 한다. 백신은 특히, 엡스타인 바 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185 573), 위광견병 바이러스, 또는 종양(EP 259 212) 특이성 항원 펩타이드일 수 있다.

통상적으로, 해당 핵산은 또한 치료 유전자 및/또는 항원 펩타이드 암호화유전자를 감염 세포에서 발현케 할 수 있는 서열을 포함한다. 이들 서열은 이들이 감염 세포에서 기능을 발휘할 수 있을 때 고려중인 유전자의 발현을 본래 담당하는 서열일 수 있다. 이들 서열은 또한, 상이한 기원의 서열(타 단백질의 발현을 담당하는 서열, 또는 심지어 합성 서열)일 수도 있다. 특히, 서열은 진핵세포 또는 바이러스 유전자에 대한 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, 서열은 감염시키고자 하는 세포의 게놈으로부터 유래되는 프로모터 서열일 수 있다. 이와 마찬가지로, 서열은 사용되는 아데노바이러스를 포함하여 바이러스 게놈으로부터 유래되는 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들면, E1A, MLP(주요 후기 프로모터), CMV(사이토메갈로바이러스), RSV(라우스 육종 바이러스) 유전자 등의 프로모터가 이와 관련하여 언급될 수 있다. 또한, 발현을 위한 이들 서열은 활성화용, 조절용 서열 등을 첨가함으로써 변형시킬 수 있다. 바람직하게는, 테트라사이클린에 의해 조절될 수 있는 Tet 온/오프 또는 오프/온 타입의 프로모터, 또는 엑디손 또는 덱사메타손에 의해 유도될 수 있는 프로모터를 사용하는 것도 가능할 것이다. 또한, 삽입된 유전자가 발현용 서열을 포함하지 않을 때, 이는 그러한 서열의 다운스트림에 있는 결손형 바이러스의 게놈 중으로 삽입될 수 있다. 최종적으로, 해당 핵산은 또한, 특히 치료 유전자의 업스트림에, 합성된 치료 산물을 표적 세포의 분비 경로로 지시하는 시그널 서열을 포함할 수 있다. 이러한 시그널 서열은 치료 산물의 천연 시그널 서열일 수 있지만, 여타 기능성 시그널 서열 또는 인공 시그널 서열일 수 있다.

본 발명은 또한 이러한 과정에 따라 제조된 하나 이상의 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 투여용 등으로 조제될 수 있다.

바람직하게는, 약학 조성물은 주사 제형용으로 약학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이들 부형제는 특히, 멸균 등장 생리식염수(인산일나트륨 또는 인산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이러한 염들의 혼합물) 용액 또는 경우에 따라 멸균수나 생리식염수의 첨가로 주사액을 구성케 할 수 있는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다.

주사용으로 사용되는 바이러스의 용량은 다양한 파라미터에 따라, 특히 사용되는 투여 방식, 관련 병리, 발현시킬 유전자 또는 추구하는 치료기간에 따라 조정될 수 있다. 일반적으로 말해서, 본 발명에 따른 재조합 아데노바이러스는 10⁴내지 10¹⁴pfu, 바람직하게는 10⁶내지 10¹⁰pfu 용량 형태로 투여될 수 있다. 용어 pfu(플라크 형성 단위)는 바이러스 용액의 감염력에 상응하며 적절한 세포 배양균을 감염시키고 통상적으로 15일 후에 감염 세포의 플라크 수를 측정함으로써 측정된다. 바이러스 용액의 pfu 역가 측정 기술은 문헌에 잘 서류화되어 있다.

삽입되는 이종 DNA 서열에 따라, 본 발명의 아데노바이러스는 유전병(영양실조, 낭포성 섬유증 등), 신경퇴행성 질환(알츠하이머병, 파킨슨병, ALS 등), 암, 응고 장애 또는 지방단백질혈증이상과 결부된 병리, 바이러스 감염과 결부된 병리(간염, AIDS 등) 등을 포함한 다수의 병리 치료나 예방에 사용될 수 있다.

재조합 단백질의 생산 적용

본 발명 과정은 재조합 단백질을 특히 인간 세포에서 배양으로 생산할 수 있게 하는 아데노바이러스 벡터의 생성을 가능케 한다. 재조합 단백질은 인간 혈청 알부민, 인간 인터페론, 인간 항체, 인간 인슐린, 조혈인자, 인자 IX 또는 인자 VII와 같은 인자, 조직 플라스미노겐 활성자와 같은 혈전용해 인자, 각종 성장인자, 트로픽 인자, 사이토카인, 중추신경계의 펩타이드, 오피오이드, 효소 및 바이러스 항원과 같은 단백질, 및 또한 식물 단백질과 같은 기타 유기체로부터의 단백질일 수 있다.

기능성 게놈 적용:

전술한 바와 같은 동일한 제조 도구를 이용하여, 과정은 제약산업에서 이해되는 의미로 신규 표적의 확인 또는 발견을 위한 적용에 활용된다.

본 발명은 또한, 기술된 방법을 이용하는 조성물의 활용에 관한 것이다. 구체적으로는, 그 밖에도, 어떤 종이든 간에 핵산을 수득하여, 이를 본 발명의 의미내에 있는 제 1 셔틀 플라스미드 중으로 통합시킬 수 있고 다양한 자동화 방법을 이용한 하나 또는 다수의 재조합 아데노바이러스 생산에 상기 플라스미드를 사용할 수 있게 하는 제조방법에 관한 것이다. 이어서, 이러한 재조합 아데노바이러스는 이들이 운반하는 서열의 기능적인 능력을 평가하기 위한 다수의 시험관내 및 생체내 모델에 사용할 수 있다. 생성된 재조합 아데노바이러스에 의해 운반되는 서열의 기능적인 능력은 당업자에 이용 가능한 다수의 기능 시험 중 하나를 이용하여 평가될 수 있다.

따라서, 본 발명의 주제 중 일부는 하기 단계를 포함하는 아데노바이러스 발현 라이브러리의 제조방법에 있다:

- 전술한 셔틀 벡터에서 1차 라이브러리의 작제,

- 본 발명에 따른 모 플라스미드의 존재하에, 1차 라이브러리로 박테리아 배양균의 형질전환,

- 생성되는 플라스미드, 또는 효소 분해 절단에 의한 완전한 아데노바이러스 게놈의 아데노바이러스-생산 세포 중으로의 도입.

- 경우에 따라, 세포를 포함하는 생물학적 물질을 감염시켜 라이브러리내 클론의 분석.

따라서, 본 과정은 본 발명을 적용하고 실험 모델에서 아데노바이러스 라이브러리를 사용하기에 앞서 본 발명의 셔틀 플라스미드에서 핵산의 1차 라이브러리를 제조하는 제 1 단계를 포함한다. 이러한 특성의 1차 라이브러리는 당업자에 공지된 분자생물학적 방법을 이용하여 본 발명의 플라스미드(셔틀 플라스미드)에 구성될 수 있다. 특히, 1차 라이브러리는 하기 작업을 연달아 수행함으로써 작제될 수 있다: a)세포 집단으로부터 mRNA (또는 전체 RNA)의 수득, b)분리시킨 mRNA 집단에 상보적인 DNA의 제조, c)경우에 따라, cDNA 분자가 강력한 프로모터의 조절하에 또는 좀더 구체적으로는 조절성 프로모터의 조절하에 배치되는 핵산 라이브러리의 제조, 및 d)cDNA 분자 (또는 발현 카세트)의 본 발명 셔틀 플라스미드 중으로의 혼입.

따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 벡터 또는 셔틀 플라스미드 중으로 클로닝되는 핵산 라이브러리에 관한 것이다.

제 2 단계에서, 본 발명에서 기술한 바와 같이 셔틀 플라스미드의 1차 라이브러리를 모 플라스미드와 함께 공형질전환시키면 기능성 아데노바이러스 게놈을 운반하는 플라스미드의 라이브러리가 생성된다. 이러한 단계는 플라스미드를 박테리아 중으로 동시에 공형질전환시키거나 순차적인 형질감염을 수행함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 모 플라스미드는 우선 박테리아 중으로 도입될 수 있고, 이어서 셔틀 플라스미드는 추후 형질감염된다.

제 3 단계에서, 플라스미드 (또는 절단된 기능성 재조합 게놈)을 트랜스 상보 세포 중으로 형질감염시킴으로써, 재조합 아데노바이러스의 라이브러리를 생성될 수 있게 한다. 생성되는 플라스미드를 분리 및/또는 정제하고 재조합 게놈을 아데노바이러스 게놈을 절단하지 않는 적당한 효소로 처리하여 절단하는 것이 바람직하다.

제 4 단계에서, 선택된 세포 집단 (또는 생물학적 물질)을 재조합 아데노바이러스의 라이브러리의 도움하에 감염시키면 라이브러리내 클론의 생물학적 또는 기능적 특성을 분석할 수 있게 된다. 이를 위해, 선택되고 감염된 세포 집단을, 핵산이 발현되고 따라서 추구하는 표현형이 세포 집단의 연구로 동정될 수 있게 하는 조건하에 둘 수 있다. 이어서, 표현형을 유도하는 벡터로 복귀될 수 있고 따라서 추구하는 표현형을 부여한 DNA를 특징규명할 수 있다.

기능적인 능력의 연구를 더욱 확고히 하기 위해, 클론을 유리하게는 풀(pool) 형태로가 아닌 별도로 처리한다. 따라서, 셔틀 플라스미드내 1차 라이브러리 클론을 마이크로플레이트에서, 모 절두형 아데노바이러스 플라스미드를 이미 보유하고 있는 박테리아 중으로 개별적으로 형질전환시킨다. 마이크로플레이트에서 도태압(항생물질)하에 증식시켜 생성되는 DNA 분자를 정제하고 선택된 효소(예를 들면, PacI)를 사용하여 게놈을 절단한 후 진핵세포 생산자 세포 중으로 형질감염시킨다. 이러한 성질의 과정을 도 2에 다이어그램으로 나타내었다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 라이브러리 제조방법의 바람직한 태양에 따라, Life Technologies, Inc.(LTI, 미국 매사추세츠 록빌 소재)가 개발하고, 특히, 예를 들면 상보적인 DNA 라이브러리로부터 또는 당업자에 익히 공지되어 있는 각종 방법론을 이용하여 특징규명되고 선별된 서열 그룹으로부터 유래되는 삽입체를 운반하고 있는 아데노바이러스 세트를 동시 생성할 수 있게 하는 Gateway^R클로닝 기술을 사용할 수 있다.

특히, 특허 US 5,888,732에 기술되어 있는 Gateway^R클로닝 기술은 예를 들면, 이.콜라이의 람다(λ) 박테리오파지의 특정 부위 attL, attR, attB 및 attP에서의 재조합 반응에 기인한 시험관내 반응 동안 두 플라스미드 벡터 사이에 삽입체를 전달할 수 있게 한다. 유전자의 삽입은 att 서열로 불리는 짧은 재조합 서열의 존재만을 요구하지 벡터내 적절한 제한부위의 존재를 더 이상 요구하지 않는다.

Gateway^R클로닝 시스템은 한편으로는 소위 LR 반응이라는 것을 수행함에 있으며, 이러한 반응 동안, attL 부위에 의해 에워싸인 해당 삽입체를 함유하는 엔트리(Entry) 클론은 attR 부위를 함유하는 데스티네이션(Destination) 클론과 재조합되어 발현(Expression) 클론을 생성한다. 이어서, 엔트리 클론에 의해 운반되는 해당 삽입체는 데스티네이션 클론으로부터 유래되고 attB 부위를 함유하는 발현 벡터 중으로 전달된다. 다른 한편으로, Gateway^R시스템은 BP 반응으로 지칭되는 역반응을 수행함에 있으며, 이 반응 동안 attB 재조합 부위에 의해 에워싸인 해당 삽입체를 함유하는 발현 클론은 attP 부위를 함유하는 도너(Donor) 벡터와 재조합하여 attL 부위를 함유하는 엔트리 클론을 생성한다.

좀더 구체적으로 말해서, 1차 전략에 따르면, Gateway^R시스템에 적합하고 적당한 att 부위를 보유하는 플라스미드를 생성하기 위하여, 전술한 바와 같이 셔틀 플라스미드, 예를 들면 pJJ1를 변형시킬 수 있다. 이러한 제 1 방법에 따라, att 부위는 바람직하게는 셔틀 플라스미드의 발현 카세트의 프로모터(CMV)와 SV40 폴리아데닐화 부위 사이에 도입된다. 생성되는 플라스미드는 Gateway^R기술의 용어에 따라 데스티네이션 플라스미드로 지칭되며, 이어서 Gateway^R기술의 엔트리 클론과의 반응에 들어갈 수 있다. 결과적으로, DNA 라이브러리 또는 선택된 서열 그룹으로부터 유래되고, 엔트리 클론 또는 벡터 중으로 클로닝되는 삽입체를 본 발명의 범위내에서 셔틀 플라스미드 중으로 전달시켜, 상응하는 아데노바이러스 벡터의 생성을 위한 발명에 사용될 수 있는 발현 셔틀 플라스미드를 생성할 수 있다.

2차 전략에 따라, 완전한 아데노바이러스 플라스미드를 Gateway^R기술에 적합하게 변형시킨다. 따라서, Gateway^R클로닝 시스템에 기술된 반응을 수행할 수 있도록 하기 위해 아데노바이러스 게놈-운반 플라스미드 중으로 적절한 att 부위를 도입하는 것이 관건이다. 바람직하게는, att 부위는 프로모터와 폴리아데닐화 서열 사이에 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 대신 도입된다. 따라서, 이러한 전략은 엔트리 클론에 애초에 존재하였던 다양한 삽입체를 함유하는 아데노바이러스 게놈-운반 플라스미드를 생성할 수 있게 한다. 이들 삽입체는 상보 DNA 라이브러리, 완전히 같은 계통의 유전자를 나타내는 삽입체, 또는 여타 기원의 삽입체를 생성시킴으로써 유도될 수 있다. 아데노바이러스 게놈-운반 플라스미드가 생성되는데, 이 플라스미드는 변형되고 att 서열을 보유하고 있으며 Gateway^R기술 의미내의 데스티네이션 클론이며; 이 플라스미드는 pAdDEST로 명명된다(실시예 6, 도 10). 이렇게 하여 수득된 데스티네이션 클론, 즉 pAdDEST는 엔트리 클론과 반응하여 아데노바이러스 게놈을 운반하는 발현 플라스미드: 이하 실시예 6과 도 11에 기술된 pAdExp를 생성할 수 있다.

따라서, 본 발명은 특징적인 표현형을 유도하는 생리학적 또는 유전적 효과를 수반하는 서열을 확인 또는 동정하는 신규 방법을 나타낸다. 서열은 좀더 구체적으로 말해서, 유전적 결함을 일으키는 유전자 또는 유전적 이상의 징표 또는 특징을 보일 수 있는 유전자일 수 있다.

기능성 게놈 활성의 맥락내에서 하나 이상의 서열의 기능을 확인하거나 측정하는 적용에서, 서열은 임의의 종, 특히 전술한 서열일 수 있지만, 이들은 또한 미지의 다중다양한 성질의 서열 집단에서 유래될 수 있다. 이들 서열은 상이한 카세트에 병치시켜 추후에 목적하는 아데노바이러스 게놈 중으로 도입시킬 수 있다.

이들 서열은 어떠한 유형의 생세포로부터도 유도될 수 있거나 신합성, 돌연변이유발, 서열의 병합 등과 같은 다양한 방법에 의해 인위적으로 생산될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 게놈 DNA 라이브러리(예를 들면, YAC 또는 BAC 중의 라이브러리를 포함하여- 특히, 염색체 영역의 라이브러리), cDNA 라이브러리 및 합성 DNA 라이브러리를 포함하여(이에 한정되지 않음) 다수의 라이브러리가 뉴클레오타이 서열원으로 사용될 수 있으며, 이들 라이브러리는 표준화되거나 되지 않으며 센스 또는 안티센스 발현을 위한 상이한 생조직으로부터, 무작위로 생성되고 각종 펩타이드를 생성할 수 있는 서열로부터, 공지 서열로부터 제조된 축퇴성 서열로부터, 공지 서열의 모자이크 서열로부터 제조된다.

특히, 연구될 1차 서열은 유전자 억제를 위한 안티센스 분자 또는 요소를 생성할 수 있다. 이들은 발현될 때 연구 중의 생물학적 시스템에서 특정 유전자를 불활성화시킬 수 있는 서열이다. 서열은 리보자임 서열일 수 있다.

라이브러리 생성에 사용되는 서열은 다양한 합성 과정으로부터 유래될 수 있다. 특히, 재조합을 이용하는 조절된 분자상 진화의 시뮬레이션은 확인된 진화 메커니즘을 이용하여 다양한 유전자를 생성시킬 수 있게 한다(Curr. Op. in Biotech. 1997, 8: 724-733).

라이브러리 생성에 사용된 서열은 또한 인간 게놈으로부터의 데이터로부터 기록되는 데이터베이스의 생물학적 정보 분석으로부터 추론될 수 있다. 이들 서열은 다양한 방법(EST, 마이크로어레이, DNA 칩, 차등 표시) TIBtech 1996, 14 p294-298; Nature Biotechnology 1998, 16, p27-31)에 의해 수득되는 유전자 발현 분석을 이용하여 선택될 수 있다.

특히, 과정은 랜덤화 펩타이드 서열의 발현을 위한 아데노바이러스 라이브러리를 생성 가능하게 한다. 이어서, 이는 해당 단백질과 결합할 수 있는 랜덤 펩타이드 서열의 선별과 동정을 촉진한다. 랜덤 서열의 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리를, 펩타이드가 단백질의 표면에 제시되도록 천연 또는 합성 단백질의 가요성 루프에 상응하는 (폴리링커) 부위 중으로 도입시킨다. 이들 펩타이드를 세포내로(Colas et al., 1996, Nature 380: 548-550) 또는 세포 표면에(Tramonto et al., 1994, J. Mol. Recognit. 7:9-24) 제시하는 것이 관건일 수 있다. 최종적으로, 펩타이드는 분비 시그널을 발현 카세트 중으로 삽입시킴으로써 세포 외측에 제시될 수 있다(Rice et al., 1992, PNAS 89, 5467-5471).

하나 이상의 해당 서열을 벡터 중으로 통합시킬 수 있다.

결국은 서열(발현 카세트)의 조합 평가 또는 해당 서열과 또다른 해당 유전자, 예를 들면 마커 유전자와의 공발현이 관건일 수 있다. 이어서, 폴리시스트론 서열을 사용할 것인지 아니면 해당 서열의 것과는 상이한 아데노바이러스 게놈 중의 소정 위치에 발현시킬 서열을 배치할 지가 결정될 수 있다. 각종 폴리시스트론 서열이 사용될 수 있다. IRES 요소는 둘 이상의 개방 판독 프레임이 하나의 단일 mRNA로부터 효율적으로 해독될 수 있게 한다. 좀더 구체적으로는, 하나의 개방 판독 프레임은 해당 단백질(cDNA 라이브러리로부터 유래)을 암호화하는 반면에, 나머지 하나의 개방 판독 프레임은 GFP와 같은 마커를 암호화한다.

과정은 효소 활성과 결부된 절단/통합 시스템을 사용할 수 있게 한다. 이러한 시스템은 CRE-Lox 시스템(Baubonis et al., Nucl. Acids Res. 21:2025-2029), FLP 리컴비나제-FRT 시스템(Dang et al., Dev. Gent. 13; 367-375), 모락셀라 라쿠나타 Piv 시스템(Lenic et al., 1994, J. Bacteriol. 176-4160) 또는 람다 인티그라제 시스템(Kwon et al., 1997 Science 276, 126)일 수 있다. 좀더 구체적으로 말해서, cDNA를 발현하는 서열 또는 카세트는 아데노바이러스 게놈의 Cre-lox 시스템에 의해 절단되는 복제성 에피솜 벡터에 부착되어 분열하는 감염 세포에 전달될 것이다(WO97/47757).

과정은 DNA-단백질 상호작용의 검출을 촉진한다. 이어서, 라이브러리는 DNA에 결합할 수 있는 서열 집단에 상응한다. 이들 서열은 DNA에 자연적으로 결합할 수 있는 단백질로부터 파생되는 폴리펩타이드 또는 인공 폴리펩타이드이다. 주어진 DNA 서열에 가장 특이성을 보이는 서열이 추구된다.

과정은 단백질-단백질 상호작용을 검출할 수 있게 한다. 아데노바이러스 벡터의 공감염능을 이용한다. LacZ 상보시험이 바람직하게 사용된다(PNAS 1997, 94, 8405-8410). 세포 시스템을 먼저 작제물과 cDNA 라이브러리로 공감염시킨다.

본 발명의 아데노바이러스 발현 라이브러리 분석을 위해 크고 다양한 횟수의 기능 시험이 실행될 수 있다.

예를 들면, 발현이 추구하는 세포 표현형을 이끄는 라이브러리로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열의 동정에 있는 상보 시험을 이용할 수 있다. 좀더 구체적으로말해서, 아데노바이러스 발현 라이브러리를 이용하여 표현형 특징이 불충분한 인간 세포를 감염시킬 수 있다. 이어서, 감염 세포의 분석 및 추구하는 표현형 특징을 보이는 세포의 정확한 위치 결정. 표현형 특징의 외형을 담당하는 바이러스에 의해 운반된 cDNA의 분석. 또한, 안티센스 활성 또는 기능 넉 아웃(knock-out)으로부터 생기는, 감염 후 표현형 특징의 소멸을 측정할 수 있다.

과정은 생물학적 시스템에서의 화학 분자의 작용 방식에 대한 연구를 촉진한다. 아데노바이러스 발현 라이브러리를 이용하여 약제의 작용에 반응하는 생물학적 시스템의 세포를 감염시킨다. 감염 후, 약제의 효과는 불변, 증가 또는 억제될 수 있다. 뒤의 두 경우에서, 바이러스 게놈에 의해 운반된 cDNA 분자의 분석은 화학 화합물의 효과에 연루된 세포내 및/또는 세포외 경로의 발견을 촉진한다.

따라서, 본 발명의 과정은 다음에 대해 실행될 수 있다:

- 증식과 아포톱시스의 정지 과정에서 p53의 효과를 우회할 수 있게 하는 핵산(표적)의 검색

- 사이토카인의 동정

- 세포 과정에 영향을 주는 합성 펩타이드의 동정

- 세포외로 펩타이드를 제시할 수 있는 분자의 검색

- 특이적 종양 억제제를 보이지 않는 종양 세포에 대한 표적의 동정

- 전이 과정에 연루된 유전자의 동정.

본 발명은 또한

- 제 1 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함하는 셔틀 플라스미드, 및

- 제 2 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함하는 모 플라스미드를 포함하고,

두 플라스미드가 두 절두형 아데노바이러스 게놈간의 상동 재조합에 의해, 게놈에 존재하지 않는 하나 이상의 제한부위에 의해 플랭킹되는 완전한 선형 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 최종 플라스미드를 생성할 수 있는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 설명을 위한 것이지 제한적이지 않는 하기 실시예로 좀더 완전하게 기술될 것이다.

실시예 1:모 플라스미드의 작제

본 실시예는 부적합 그룹 P에 속하고 이.콜라이에서 복제하는 플라스미드 중의, 5′부분에서 절두되고 E1 및 E3 영역이 결실되며, 3′부분이 고유 제한부위에 의해 플랭킹되는 인간 5형 아데노바이러스 게놈의 수득방법을 설명한다.

본 발명에 따른 플라스미드는 상이한 방식으로 작제될 수 있다. 바람직한 방법에 따르면, 플라스미드 pOSE17-00는 플라스미드 pXL3215 및 pJJ301을 사용하여 EDRAG 방법(FR 2,730,504)에 따라 작제된다. 플라스미드 pXL3215는 AD 게놈(E1 및 E3 영역에서 보다 적은 두 결실)을 함유하고 E1 영역에서 RSV 프로모터의 조절하에LacZ 유전자 발현 카세트를 보유한다. 플라스미드 pXL 3215는 플라스미드 pXL2689의 유도체이고 플라스미드 RK2로부터의 복제기원과 테트라사이클린 내성 유전자를 함유한다(J. Crouzet PNAS, 1997).

플라스미드 pJJ301은 RK6 복제기원을 보유하고 이.콜라이 pir- 균주에서 복제 불능이다. 플라스미드 pJJ301은 카나마이신 내성 유전자를 보유한다. 플라스미드 pJJ301은 pOSE17-00에 의해 운반된 아데노바이러스 게놈의 개시부와 상동성인 영역을 보유한다. 이 영역은 syngen#2으로 명명되고 WO99/25861에 기술되어 있는 pIX 영역의 특수 버전이다. 이 서열의 업스트림에, 플라스미드 pXL3215내의 완전한 아데노바이러스 게놈의 업스트림에 있는 영역과 상동성인 서열이 삽입된다. 플라스미드 pXL3215와 pJJ301간의 이중 재조합은 pOSE17-00을 생성한다. 이러한 플라스미드 pOSE17-00은 본 발명 과정의 의미내 모 플라스미드에 상응하며 도 3에 다이어그램으로 도시되었다.

다른 모 플라스미드(pOSE 10-00, pOSE30-00, pOSE37-00)를 동일한 도식을 이용하여 작제함으로써, E1 및 E3 영역(야생형 pIX 영역 버전에서 또는 축퇴성 pIX 버전에서(WO99/25861))이 결실된 아데노바이러스 게놈 또는 E1, E3 및 E4 영역(야생형 pIX 영역 버전에서 또는 축퇴성 pIX 버전에서(도 4))이 결실된 아데노바이러스 게놈이 생성된다.

실시예 2:셔틀 플라스미드의 작제

본 실시예는 Pac I 제한부위에 의해 선행되는, 인간 5형 아데노바이러스 게놈의 5′영역(ITR 영역 및 캡시드화 영역)을 운반하는 셔틀 플라스미드의 수득방법을 설명한다.

상기 플라스미드는 RK6 복제기원을 보유하고 pir 단백질을 트랜스 상보할 수 없는 이.콜라이에서 복제 불능이다. 이 플라스미드 pIG5는 pOSE17-00에 존재하는 서열(pIX Iva2 영역의 일부에 상응하는 서열)과 상동성인 서열을 선행하는 LacZ 발현 카세트를 함유한다. 이러한 플라스미드는 본 발명의 의미내에서 셔틀 플라스미드로 지칭되고; 카나마이신 내성 유전자를 보유한다(도 5).

실시예 3:기능성 재조합 아데노바이러스 게놈의 생산

본 실시예는 이.콜라이에서 복제되고 LacZ 유전자 발현 카세트를 운반하는 P 부적합 그룹의 플라스미드내, E1 및 E3 영역이 결실되고 말단부에서 PacI 제한부위에 의해 플랭킹되는 기능성 인간 5형 아데노바이러스 게놈의 수득방법을 기술한다.

선택된 통합 전략은 이.콜라이 균주내 pOSE17-00과 pIG5간의 상동 재조합을 수행하는 것이다. 플라스미드 pOSE17-00을 이.콜라이 균주 JM83 Rec⁺LacZ^-의 세포 중으로 도입시킨다. 이에 따라, 테트라사이클린 내성 클론으로부터 유래된 세포를 컴피턴트하게 만들고, 플라스미드 pIG5로 형질전환시킨 다음 테트라사이클린과 카나마이신의 존재하에 LB 배지에 확산한다. 플라스미드 pIG5가 JM83 균주에서 복제되지 않는다고 가정하면, 테트라사이클린과 카나마이신에 대한 내성 획득은 두 플라스미드간에 발생하는 상동 재조합에 의해서만 일어날 수 있다. 이러한 결과는 두 플라스미드가 Ad5 게놈의 pIX 영역을 공통으로 보유하기 때문에 일어날 수 있다. 생성되는 플라스미드는 PacI 부위에 의해 플랭킹된 재조합 아데노바이러스 벡터의완전한 게놈을 보유한다. 효소 PacI과 HindIII, EcoRI 또는 PacI과 DraI에 의한 분해는 예상된 플라스미드 구조가 수득되었는 지를 검토할 수 있게 한다. 기능성 아데노바이러스 게놈을 운반하는 이러한 최종 플라스미드는 pAd17-01로 지칭된다(도 5).

동일한 방식으로, 플라스미드 pIG5와 플라스미드 pOSE37-00은 E1, E3 및 E4가 결실되고 syngen#2 형태로 pIX 영역이 제공되는 완전한 아데노바이러스 게놈을 운반하는 플라스미드를 생성한다(WO99/25861).

또한, 동일 전략을 이용하여 발현 카세트를 운반하거나 운반하지 않는 동일 계통의 다른 재조합 게놈을 작제하는 것도 가능하다. pIG7과 pIG18이 사용되고 pIG5로부터 유래된다: pIG7은 어떠한 발현 카세트도 보유하지 않는 반면에 pIG18은 루시퍼라제 유전자 발현 카세트를 보유한다. 발현 카세트가 박테리아 염색체의 게놈 서열과 서열 상동성을 보이지 않는 한, 클론의 100%가 양성일 것으로 예상된다. 도 6에 도시된 바와 같이, 이들 실험 말미에 분석한 클론의 100%가 사실상 예상된 뉴클레오타이드 구조를 보이는 것으로 판명되었다(도 6).

pAd17-01을 PacI로 분해시키며, 이에 따라 재조합 아데노바이러스의 게놈이 방출된다. 이러한 분해의 산물은 그 자체로 아데노바이러스의 E1 기능을 트랜스 상보하는 포유동물 세포(293 세포)의 형질감염에 사용될 수 있다.

실시예 4:재조합 아데노바이러스의 생산

재조합 아데노바이러스 클론은 (i)하나 이상의 유전자를 이들 유전자의 발현을 위한 적당한 조절 시그널과 함께 함유하는 단편을 연구 대상 포유동물 세포에삽입하거나, (ii)아데노바이러스 게놈의 특정 단편을 결실시키거나 이들 두 사건을 병합함으로써 이.콜라이에서 작제될 수 있으며, 이어서 생산자 세포를 형질감염시킨 후 그러한 재조합 바이러스의 스톡을 수득할 수 있다.

플라스미드 pAd17-01은 형질전환된 컴피턴트 이.콜라이 DH5 세포의 배양균으로부터 정제된다. 아데노바이러스 게놈은 효소 PacI의 존재하에 분해함으로써 방출된다. 분해산물은 재조합 아데노바이러스의 생산에 직접 사용된다. 이를 위해서, 293 세포주의 세포를 Effectene(Qiagen, 독일)의 존재하에 형질감염시키며, pAd17-01 분해로부터 산물이 수득된다. 재조합 아데노바이러스를 293 세포주에서 증폭시키면, 역가가 대략 10¹⁰pfu/ml인 미정제 재조합 아데노바이러스를 함유하는 배양 상등액이 생성된다.

바이러스 DNA의 상사는 증폭된 바이러스로부터 유래된 DNA를 정제한 후 효소 분해에 의해 증명된다(도 7).

이어서, 바이러스 입자는 공지기술을 이용하여 세슘 클로라이드 구배상에서 원심분리에 의해(특히, Graham et al., Virology 52 (1973) 456 참조), 또는 크로마토그래피에 의해 정제된다. 아데노바이러스는 -80℃에서 20% 글리세롤 중에 보관될 수 있다.

실시예 5:아데노바이러스 발현 라이브러리의 작제

RK6 복제기원이 제공된 셔틀 플라스미드를 셔틀 플라스미드의 1차 라이브러리 수득에 사용하며, 이어서 이 라이브러리는 상동 재조합에 의해, RK2 복제기원을보유하는 플라스미드내 재조합 아데노바이러스 게놈의 라이브러리 수득에 사용될 것이다. 이어서, 재조합 아데노바이러스 게놈의 이러한 플라스미드 라이브러리를 트랜스 상보 생산자 세포에 형질감염시켜 재조합 아데노바이러스의 라이브러리를 수득할 것이다.

일련의 단계를 도 2에 다이어그램으로 도시하였으며, 아데노바이러스 발현 라이브러리 수득에 사용된 플라스미드 구조를 도 8에 도시하였다.

실시예 5.1.:셔틀 벡터내 cDNA 라이브러리의 제조

셔틀 벡터(LacZ 유전자가 절단되고 다중 클로닝 부위, 특히 XhoI 및 EcoRI 부위로 대치된 pIG5의 유도체)내 라이브러리를 제조하기 위해, 세슘 구배-정제된 벡터 10 내지 20 ㎍을 37℃에서 90분간, ㎍당 효소 XhoI과 EcoRI 5U로 분해시킨다. 분해물을 아가로스 겔(1% Seakem GTG)상에 로딩하고 선형화된 벡터를 TAE 완충액에서 전기영동에 의해 분리시킨다. UV 테이블상에서 가시화 한 뒤에 벡터에 상응하는 밴드를 절단한다. 벡터를 아가로스(Qiaquick DNA Cleanup System, Quiagen, 독일)로부터 용출시키고 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제하고 에탄올로 침전시킨다. EcoR1 및 Xho1으로 분해시킨 시험 삽입체의 연결 후에, 이 벡터는 대략 5백만 클론/㎍을 생성하며 백그라운드는 10% 미만이다.

cDNA 분자의 제조: mRNA-풍부 RNA 집단을 이용하여 cDNA를 합성한다. 첫 번째 본쇄는 Superscript II 트랜스크립타제(Stratagene) 및 5′위치에 XhoI 부위의 서열을 보유하는 oligodT 프라이머를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 합성된다. 두 번째 본쇄는 RNAse H 및 이.콜라이 DNA의 존재하에 이.콜라이 DNA 폴리머라제 I 효소를 사용하여 합성된다. 두 번째 본쇄에 의해 생성되는 말단을 T4 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 충진시킨다.

cDNA 분자를 전술한 바와 같이(Soares et al., PNAS, 91:9228-9232) Biogel A50M을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피에 의해 크기별로 분별한다. 크기별로 분별된 cDNA 분자를 시판 EcoRI 어댑터(Stratagene)에 연결한 다음 EcoRI으로 분해시켜 (5′) EcoRI 및 (3′) XhoI 말단이 제공된 cDNA 단편을 생성시킨다. 연결되지 않은 어댑터는 세파로스 CL4B 칼럼(Pharmacia)상에서의 크로마토그래피로 제거한다. 어댑터를 운반하는 cDNA 분자를 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 인산화시키고 T4 DNA 리가제를 사용하여 16℃에서 48시간까지의 기간 동안, 전술한 바와 같이 제조된(10 내지 20 ㎕ 부피 중의 벡터 600 ng + 삽입체 300 ng) 셔틀 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위 중으로 연결시킨다. 라이브러리를 RK6 복제기원을 갖는 플라스미드의 복제를 허용하는 pir.116+ 균주 중으로 전기투공함으로써 증폭시키며, 이어서 이 균주를 직경이 150 mm인 100개의 디쉬 중의 아가 LB 배지 + 카나마이신상에 확산한다. 5백만 클론의 라이브러리가 수득된다. 이어서, 셔틀 플라스미드 중의 1차 cDNA 라이브러리를 Soares 등(1994)에 의해 기술된 프로토콜에 따라 표준화시킨다. 이어서, 클론의 서브세트를 클론의 발현 프로필을 측정할 수 있게 하는 기술, 예를 들면 AND 칩(Amersham, Molecular Dynamics, Affymetrix)을 사용하여 선별 단계에 투입할 수 있다.

셔틀 플라스미드 중의 표준화 cDNA 라이브러리로부터 유래된 선별 클론을 웰당 클론 하나의 비율로 96-딥(deep) 웰 마이크로플레이트에 배치한다. 이들 클론을적절한 항생물질(카나마이신)의 존재하에 액체 배지(LB)에서 증폭시킨다. 96 배양 샘플의 뱃치내 각 클론으로부터의 DNA를 Quiagen 로봇(Quiagen Biorobot 9600) 및 Quiaprep 96 Turbo Biorobot 키트(Quiagen, 독일)를 동시에 사용하여 제조한다. DNA 샘플을 TEx1 50 ㎕에 취한다. 96 플라스미드 DNA 샘플을 각각의 소위 1차 플레이트에 배치한다.

실시예 5.2.:cDNA 분자를 운반하는 기능성 아데노바이러스 게놈의 플라스미드 라이브러리의 제조

RK2 플라스미드(pOSE37-00)에 의해 운반된 모 아데노바이러스 게놈을 통상적인 형질전환에 의해 JM83 균주에 도입시킨다. 플라스미드를 보유하는 이 균주(JM83xpOSE37-00)의 배양균을 100 mM CaCl₂에서의 연속 세척을 포함하는 표준 기술에 의해 컴피턴트하게 만든다.

컴피턴트 세포(JM83xpOSE37-00)를 웰당 40 ㎕의 비율로 96-딥 웰 마이크로플레이트에 분포시킨다. 각 셔틀 플라스미드의 DNA를 이러한 균주 중으로 형질전환시켜 기능성 아데노바이러스 게놈을 생성하는 상동 재조합을 달성한다. 이어서, 소위 1차 플레이트로부터 유래된 DNA 5 ㎕를 레이아웃(layout)에 부착된 채로 컴피턴트 세포 40 ㎕에 첨가한다. 플레이트를 1분간 42℃로 되게 한 다음 2분간 얼음 위에 다시 둔다. 두 적당한 항생물질(카나마이신 및 테트라사이클린)을 함유하는 배지 1 ml를 웰마다 가한다. 세포를 먼저 6시간 동안 증식시킨 후 이 1차 증식물 50 ㎕를 사용하여, 웰당 두 적당한 항생물질(카나마이신 및 테트라사이클린)을 함유하는 배지(LB) 1 ml가 제공되는 새로운 96-딥 웰 플레이트에 시딩한다. 이어서, 배양을 14시간 지속한다.

상기 후자의 증식으로부터 생기는 플라스미드 DNA를 Quiagen 로봇(Quiagen Biorobot 9600) 및 R.E.A.L. Prep 96 Biorobot 키트를 사용하여 정제하고, 여기에 이소프로판올에서의 침전에 앞서 Qiawell 96 Ultra Biorobot Kit(Quiagen, 독일)로부터 유도된 Quiawell 분리단계가 부가된다. DNA를 TEx1 50 ㎕에 취한다.

이어서, 각각의 DNA 20 ㎕(대략 0.4 ㎍)을 레이아웃에 부착된 채로 새로운 96-웰 마이크로플레이트의 웰에 전달한다. 이 DNA를 효소 PacI로 분해시켜 바이러스 게놈을 절단한다. 반응 혼합물 10 ㎕(Ne1 완충액 3 ㎕, H₂0 6 ㎕, PacI 1 ㎕(2.5 U))를 웰당 DNA 20 ㎕에 가한다. 반응을 37℃에서 1시간 30분간 수행한다. 플레이트를 원심분리시키고 후속 단계용으로 사용될 때까지 -20℃에서 동결시킨다.

아데노바이러스 게놈을 절단하기 위해서는 바이러스 DNA를 PacI으로 분해시켜야 하며, 이어서 바이러스 라이브러리 생성을 위해 트랜스 상보 진핵세포에 전달한다.

실시예 5.3.:아데노바이러스 발현 라이브러리의 수득

PacI-분해 DNA 샘플을 운반하는 96-웰 플레이트를 주위온도가 되게 한다. 인핸서 2 ㎕ 및 Effectene(Effectene Transfection Reagent, Quiagen, 독일) 50 ㎕를 각각의 웰에 존재하는 PacI-분해 DNA 30 ㎕에 가한다. 이어서, 형질감염 혼합물을 96-웰 또는 48-웰 플레이트의 웰에 분배하거나 IGRP2 세포(WO 96/22378)를 cm²당10⁵세포의 비율로 시딩한다.

형질감염 14일 후, 웰당 배양 상등액 50 내지 75 ㎕를 제거하여 새로 시딩한 트랜스 상보 세포의 새로운 플레이트를 감염시키기 위한 접종액으로 사용한다. 이러한 증폭 단계는 각각의 웰에서 수득한 바이러스 역가에서 균질성을 보장하도록 3 내지 5회 반복된다. 각각의 웰에서 수득된 역가는 ml당 5 x 10⁸내지 5 x 10⁹바이러스 입자이다. 플레이트를 원심분리시키고 -20℃에서 동결시킨다.

이들 바이러스는 적당한 생물학적 시스템상에서 직접 사용될 수 있다. 세포 모델을 라이브러리로 감염시킨 후, 기능 분석을 결정하여 수행되었다. 좀더 바람직하게는, 사용되는 세포 모델에 따라 프로아폽토시스, 항맥관형성 또는 항아폽토시스 활성이 추구된다. 라이브러리의 작제 동안 클론의 레이아웃, 및 이어서 바이러스의 레이아웃은 기능 활성과 결부되는 뉴클레오타이드 서열에 대한 작업을 용이하게 하고 따라서 새로운 표적을 규정하기 용이하게 한다.

실시예 6:아데노바이러스 게놈을 운반하고 Life Technologies(LTI, 미국 매사추세츠 록빌 소재)가 판매하는 Gateway^R클로닝 시스템에 적합한 플라스미드의 작제

플라스미드 pSHExplacZ가 생성되며; 이는 pIG5 타입의 셔틀 벡터내에 CMV 프로모터, attB1 부위, LacZ 유전자, attB2 부위 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 보유한다(도 2). 이러한 플라스미드를 수득하기 위해, 플라스미드 pSV40-lacZ(Promega)로부터 유래된 LacZ 유전자에 상응하는 cDNA를 HindIII와 DraI로 분해시키고 LifeTechnologies(US 5,888,732)에 의해 기술되는 pENTR1A의 XmnI 및 EcoRV 부위 중으로 삽입시켜, 플라스미드 pENTR-LacZ을 생성시킨다. pENTR-LacZ과 pDest12.2 간의 LR 타입의 반응(Gateway^R클로닝 기술)은 pExpLacZ(Gateway^R기술로 지칭)을 생성한다. 서브클로닝의 두 단계는 pSHExpLacZ의 최종 분리를 촉진한다: pExpLacZ의 NcoI/AseI 단편은 pCA350(pIG5의 유도체)내 AseI와 NcoI 사이에 삽입되어, 플라스미드 pSExpLacZ을 생성한다. 최종적으로, pSExpLacZ의 PacI/SalI 단편을 플라스미드 pIG7(pIG5의 유도체)의 PacI 부위와 SalI 부위 사이에 삽입시킨다. 결국에, 서열: CMV 프로모터, attB1 부위, LacZ 유전자, attB2 부위 및 SV40 폴리아데닐화 부위가 셔틀 플라스미드 pIG5내 CMV-LacZ 카세트 대신 위치된다(실시예 2). 따라서, 수득되는 플라스미드는 pSHExpLacZ으로 명명되고 도 9에 도시되었다.

이어서, Gateway^R시스템에 적합한 pAdGWExpLacZ으로 명명된 플라스미드를 EDRAG 방법(FR 2,730,504)에 따라 플라스미드 pSHExpLacZ과 pXL2689를 사용하여 작제한다.

Crouzet 등(PNAS 1997)에 의해 기술되고 있는 플라스미드 pXL2689는 플라스미드 RK2의 기원, 테트라사이클린 내성 유전자 및 E1 및 E3 결실을 보유하는 감염성 아데노바이러스 게놈을 보유한다. 플라스미드 pXL2689와 pSHExpLacZ의 재조합은 아데노바이러스 게놈과, CMV 프로모터, attB1 부위, LacZ 유전자, attB2 부위 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 포함하는 삽입체를 운반하는 플라스미드 pAdGWExpLacZ를 생성한다(도 9).

이렇게 하여 수득되는 플라스미드 pAdGWExpLacZ은 이.콜라이 파지 람다의 두 attB 재조합 부위 사이에 LacZ로 표시되는 해당 유전자를 포함하고, attP 부위, 카나마이신 내성 유전자(Kn^R) 및 이.콜라이에 치명적인 유전자 ccdB를 운반하는 Gateway^R시스템(pDONR201)의 도너 벡터와 반응한다. Gateway^R클로닝 기술에 사용되는 용어에 따라 BP 반응으로 명명되는 상기 반응으로부터 생기는 플라스미드를 pAdDEST(데스티네이션 플라스미드)로 명명하고 도 10에 도시하였다.

최종적으로, attR1 및 attR2 부위로 인하여, 플라스미드 pAdDEST는 소위 말하는 LR 반응에 의해, attL1 및 attL2 재조합 부위에 의해 에워싸인 해당 삽입체를 운반하는 Gateway^R시스템의 엔트리 클론과 반응한다. 생성되는 플라스미드를 pAdExp로 명명하며 완전한 아데노바이러스 게놈 및 해당 삽입체를 운반한다(도 11).

참조문헌:

Claims (41)

1. a)적어도 하나의 이종 핵산을 함유하는 제 1 절두형 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는, 제 1 플라스미드("셔틀" 플라스미드로 지칭), 바람직하게는 원핵세포 플라스미드를 작제하고,

   b)이러한 제 1 플라스미드를 제 1 게놈에 상보적인 제 2 절두형 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 제 2 플라스미드("모" 플라스미드로 지칭)와 접촉시켜, 상동 재조합에 의해, 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 최종 플라스미드를 생성할 수 있으며,

   c)최종 플라스미드로부터 완전한 선형 재조합 아데노바이러스 게놈을 절단한 다음 이를 캡시드화 세포주 중으로 도입시켜 완전한 재조합 아데노바이러스 게놈을 혼입하는 재조합 아데노바이러스를 생성하는 단계를 포함하는 아데노바이러스의 생산방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   - 생산된 재조합 아데노바이러스를 사용하여:

   - 핵산의 특성 분석을 위해, 세포를 포함하는 생물학적 물질;

   - 이종 핵산에 의해 암호화되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 생산을 위해, 시험관내 또는 생체외 세포 배양균,

   - 이종 핵산에 의해 암호화되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 생체내 생산을 위해, 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 감염시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 a)에서, 제 1 절두형 게놈이 ITR, 이종 핵산, 아데노바이러스 상동 영역 및, 경우에 따라 캡시드화 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, ITR이 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않는 제한부위에 의해 플랭킹됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계 a)에서, 제 2 절두형 아데노바이러스 게놈이 적어도 하나의 ITR, 제 1 절두형 아데노바이러스 게놈에 존재하는 것과 동일한 아데노바이러스 상동 영역, 및 후자가 제 1 절두형 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않을 경우 캡시드화 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, ITR이 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않는 제한부위에 의해 플랭킹됨을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 아데노바이러스 발현 라이브러리 생산을 위한 방법.
8. 아데노바이러스 ITR, 이종 핵산 (또는 이러한 핵산을 위한 삽입부위) 및 아데노바이러스 상동 서열을 포함하는 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함하고, 아데노바이러스 ITR이 아데노바이러스 게놈에 존재하지 않는 제한부위에 의해 플랭킹됨을 특징으로 하는 셔틀 플라스미드.
9. 제 8 항에 있어서, 절두형 게놈이 5′→3′배향으로, 아데노바이러스 ITR, 아데노바이러스 캡시드화 부위, 이종 핵산 (또는 이러한 핵산을 위한 삽입부위) 및 아데노바이러스 상동 서열을 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
10. 제 9 항에 있어서, 아데노바이러스 상동 서열이 야생형 또는 축퇴성 아데노바이러스 단백질 pIX를 암호화하는 서열의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
11. 제 10 항에 있어서, 절두형 게놈이 좌측 ITR에서부터 pIX 및/또는 Iva2 단백질을 암호화하는 영역의 말단에 이르는 아데노바이러스 게놈의 서열을 포함하고, 이 영역이 E1 영역의 전부 또는 일부를 결여하며, 여기에 이종 핵산이 삽입됨을 특징으로 하는 플라스미드.
12. 제 8 항에 있어서, 절두형 게놈이 5′→3′배향으로, 아데노바이러스 상동서열, 이종 핵산 및 아데노바이러스 ITR을 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
13. 제 12 항에 있어서, 아데노바이러스 상동 서열이 아데노바이러스 pIX 단백질을 암호화하는 서열의 전부 또는 일부를 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 절두형 게놈이 아데노바이러스 서열에 부가하여, 또는 이 대신에 삽입된, 이종 핵산을 함유하는 pIX 단백질 암호화 영역에서부터 우측 ITR에 이르는 아데노바이러스 게놈의 서열을 포함함을 특징으로 하는 플라스미드.
15. 제 10 항, 제 11 항, 제 13 항 또는 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, pIX 단백질 암호화 영역이 야생형 아데노바이러스 서열에 상응함을 특징으로 하는 플라스미드.
16. 제 10 항, 제 11 항, 제 13 항 또는 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, pIX 단백질 암호화 영역이 축퇴형의 아데노바이러스 서열에 상응함을 특징으로 하는 플라스미드.
17. 제 8 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산이 생물학적 산물을 암호화함을 특징으로 하는 플라스미드.
18. 제 8 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 핵산이 핵산 라이브러리로부터의 클론임을 특징으로 하는 플라스미드.
19. 제 9 항에 있어서, 항생물질 내성 유전자 및 복제기원을 추가로 포함하고 바람직하게는 플라스미드 pJJ1 또는 pIG5임을 특징으로 하는 플라스미드.
20. 제 8 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드 중으로 클로닝되는 핵산 라이브러리.
21. 제 8 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 셔틀 플라스미드에 존재하는 절두형 게놈에 상보적인 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함함을 특징으로 하는 모 플라스미드.
22. 제 21 항에 있어서, 항생물질 내성 유전자 및 복제기원을 추가로 포함하고 바람직하게는 플라스미드 pOSE1, pOSE10-00, pOSE30-00, pOSE17-00 또는 pOSE37-00임을 특징으로 하는 플라스미드.
23. 제 8 항 내지 제 19 항 및 제 21 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 플라스미드를 보유함을 특징으로 하는 세포.
24. - 제 8 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 따른 셔틀 벡터에서 1차 라이브러리를 작제하고,

    - 제 21 항 또는 제 22 항에 따른 모 플라스미드의 존재하에, 1차 라이브러리로 박테리아 배양균을 형질전환시킨 다음,

    - 생성되는 플라스미드, 또는 효소 분해에 의한 절단 후에 수득되는 완전한 아데노바이러스 게놈을 아데노바이러스-생산 세포 중으로 도입시키는 단계를 포함하는 아데노바이러스 라이브러리의 생산방법.
25. 제 24 항에 있어서,

    - 세포를 포함하는 생물학적 물질을 감염시켜 라이브러리내의 클론을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 1차 라이브러리가 cDNA, gDNA 또는 합성 DNA의 라이브러리로부터 제조됨을 특징으로 하는 방법.
27. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 1차 라이브러리가 랜덤 또는 세미-랜덤 올리고뉴클레오타이드의 라이브러리로부터 제조됨을 특징으로 하는 방법.
28. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 1차 라이브러리가 DNA를 결합시킬 수 있는 서열의 라이브러리로부터 제조됨을 특징으로 하는 방법.
29. 제 24 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 라이브러리내 클론이 별도로 처리됨을 특징으로 하는 방법.
30. 제 29 항에 있어서, 1차 라이브러리의 클론을 마이크로플레이트에서, 박테리아 배양균 중으로 개별적으로 형질감염시킴을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 박테리아 배양균이 모 플라스미드를 보유함을 특징으로 하는 방법.
32. 제 24 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 라이브러리내 클론의 기능 연구를 위한 방법.
33. 제 24 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 검색을 위한 방법.
34. cDNA 라이브러리로부터 유래되는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스로 이루어짐을 특징으로 하는, 제 26 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 발현 라이브러리.
35. gDNA 라이브러리로부터 유래되는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스로 이루어짐을 특징으로 하는, 제 26 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 발현 라이브러리.
36. 합성 DNA 라이브러리로부터 유래되는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스로 이루어짐을 특징으로 하는, 제 26 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 발현 라이브러리.
37. 랜덤 또는 세미-랜덤 올리고뉴클레오타이드 라이브러리로부터 유래되는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스로 이루어짐을 특징으로 하는, 제 27 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 발현 라이브러리.
38. DNA를 결합시킬 수 있는 서열의 라이브러리로부터 유래되는 핵산 삽입체를 포함하는 아데노바이러스로 이루어짐을 특징으로 하는, 제 28 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스 발현 라이브러리.
39. 핵산 또는 단백질의 생물학적 기능 측정을 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 재조합 아데노바이러스의 용도.
40. 미지의 기능 및/또는 구조의 핵산 분석용 발현 라이브러리의 작제를 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 아데노바이러스의 용도.
41. - 제 1 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함하는 셔틀 플라스미드, 및

    - 제 2 절두형 아데노바이러스 게놈을 포함하는 모 플라스미드를 포함하고,

    두 플라스미드가 두 절두형 아데노바이러스 게놈간의 상동 재조합에 의해, 게놈에 존재하지 않는 하나 이상의 제한부위에 의해 플랭킹되는 완전한 선형 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 최종 플라스미드를 생성할 수 있는 키트.