JP2641688B2 - ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 - Google Patents
ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法Info
- Publication number
- JP2641688B2 JP2641688B2 JP5174769A JP17476993A JP2641688B2 JP 2641688 B2 JP2641688 B2 JP 2641688B2 JP 5174769 A JP5174769 A JP 5174769A JP 17476993 A JP17476993 A JP 17476993A JP 2641688 B2 JP2641688 B2 JP 2641688B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- hsv
- promoter
- hbsag
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 title abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 9
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims abstract 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 37
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 13
- 101150087698 alpha gene Proteins 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 7
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 6
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 claims description 5
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims description 5
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 49
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 32
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 19
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 4
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 3
- 230000023445 activated T cell autonomous cell death Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 3
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006658 host protein synthesis Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000003682 DNA packaging effect Effects 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 241000700328 Herpes simplex virus (type 1 / strain F) Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010092809 exonuclease Bal 31 Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- CMPGARWFYBADJI-UHFFFAOYSA-L tungstic acid Chemical compound O[W](O)(=O)=O CMPGARWFYBADJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16641—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16643—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、異種遺伝子により発現
される蛋白質を製造する方法に関する。
される蛋白質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）のよう
なある種のウィルスによる感受性細胞の感染は、例え
ば、典型的に宿主蛋白質合成の停止をもたらす。この停
止は２段階で起こる。初期段階は恐らくウィルスの構造
蛋白によって引き起こされ、遺伝研究はこの活性がウィ
ルス増殖のために本質的でないことを示している。第２
の不可逆的抑制は、ウィルス遺伝子生産物の発現の結果
としてウィルス生殖サイクル中に起こる。アクチノマイ
シンＤによる化学的除核又はシトコラシンＢの助けによ
る物理的除核に基づく有効データは、抑制が少なくとも
部分的に翻訳レベルにおけるものであることを暗示して
いる。
なある種のウィルスによる感受性細胞の感染は、例え
ば、典型的に宿主蛋白質合成の停止をもたらす。この停
止は２段階で起こる。初期段階は恐らくウィルスの構造
蛋白によって引き起こされ、遺伝研究はこの活性がウィ
ルス増殖のために本質的でないことを示している。第２
の不可逆的抑制は、ウィルス遺伝子生産物の発現の結果
としてウィルス生殖サイクル中に起こる。アクチノマイ
シンＤによる化学的除核又はシトコラシンＢの助けによ
る物理的除核に基づく有効データは、抑制が少なくとも
部分的に翻訳レベルにおけるものであることを暗示して
いる。
【０００３】単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−１）
は、ある種の宿主遺伝子、及び特に例えば、ウィルス調
節領域の制御下に置かれかつトランスフェクションによ
って細胞中へ導入された卵白アルブミンのような異種遺
伝子を誘発することが従来知られているが、その発現は
選択的でありかつ一時的である。以前には、野生型ウィ
ルスの抑制機構がウィルスのゲノム中に導入された異種
遺伝子の持続した発現を許さないだろうと信じられてい
た。
は、ある種の宿主遺伝子、及び特に例えば、ウィルス調
節領域の制御下に置かれかつトランスフェクションによ
って細胞中へ導入された卵白アルブミンのような異種遺
伝子を誘発することが従来知られているが、その発現は
選択的でありかつ一時的である。以前には、野生型ウィ
ルスの抑制機構がウィルスのゲノム中に導入された異種
遺伝子の持続した発現を許さないだろうと信じられてい
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、持
続的にかつ高レベルで目的蛋白質を生産する方法を提供
することを目的とする。
続的にかつ高レベルで目的蛋白質を生産する方法を提供
することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によると、ウィル
スのゲノムのプロモーター調節領域の制御下に異種遺伝
子がウィルスのゲノムの中に挿入され、かくしてウィル
スのゲノムが感染細胞中における異種遺伝子の発現のた
めのベクターとなる。かくして、ウィルスのゲノムは、
ウィルスのゲノムと一緒に該遺伝子の連続的増殖のため
及び宿主染色体によって指令される蛋白質合成の停止に
も拘らず適当な宿主中における異種遺伝子の持続的発現
のために有用になるように遺伝的に加工される。
スのゲノムのプロモーター調節領域の制御下に異種遺伝
子がウィルスのゲノムの中に挿入され、かくしてウィル
スのゲノムが感染細胞中における異種遺伝子の発現のた
めのベクターとなる。かくして、ウィルスのゲノムは、
ウィルスのゲノムと一緒に該遺伝子の連続的増殖のため
及び宿主染色体によって指令される蛋白質合成の停止に
も拘らず適当な宿主中における異種遺伝子の持続的発現
のために有用になるように遺伝的に加工される。
【０００６】本発明は、肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢｓＡ
ｇ）の発現のためのベクターとしてのＨＳＶ−１の使用
によって例示される。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、その発現を
可能にしかつ調節するために、ＨＳＶ遺伝子プロモータ
ー調節領域の制御下に置かれる。この構造物（ｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔ）を、次に、ウィルスゲノムのチミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）遺伝子中へ挿入する。更に、ＴＫ遺伝子中
において欠失を作って該遺伝子を不活化させる。得られ
たＤＮＡ構造物を適当なＨＳＶ−１株の無傷のＤＮＡと
コトランスフェクションさせ、ＴＫ子孫を選択する。か
かる子孫は、欠失とＨＢｓＡｇ挿入との両方を含む組換
え体を含むことが見いだされている。かかる組換え体の
培養は持続した時間にわたってＨＢｓＡｇを有効に生産
することが見いだされている。
ｇ）の発現のためのベクターとしてのＨＳＶ−１の使用
によって例示される。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、その発現を
可能にしかつ調節するために、ＨＳＶ遺伝子プロモータ
ー調節領域の制御下に置かれる。この構造物（ｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔ）を、次に、ウィルスゲノムのチミジンキナ
ーゼ（ＴＫ）遺伝子中へ挿入する。更に、ＴＫ遺伝子中
において欠失を作って該遺伝子を不活化させる。得られ
たＤＮＡ構造物を適当なＨＳＶ−１株の無傷のＤＮＡと
コトランスフェクションさせ、ＴＫ子孫を選択する。か
かる子孫は、欠失とＨＢｓＡｇ挿入との両方を含む組換
え体を含むことが見いだされている。かかる組換え体の
培養は持続した時間にわたってＨＢｓＡｇを有効に生産
することが見いだされている。
【０００７】本発明は、特異的に形質転換された遺伝子
を前以て選択することなしに大規模細胞培養において異
種遺伝子の同時導入及び同調発現を可能にする。本発明
は、通常発現されにくい遺伝子及び危険であるか又は培
養できない生物の発現を可能にする。本発明の他の目的
並びに利益は、添付図面並びに特許請求の範囲の記載と
共に以下の詳細な説明の記載に基づいて、当業者には明
らかとなるであろう。
を前以て選択することなしに大規模細胞培養において異
種遺伝子の同時導入及び同調発現を可能にする。本発明
は、通常発現されにくい遺伝子及び危険であるか又は培
養できない生物の発現を可能にする。本発明の他の目的
並びに利益は、添付図面並びに特許請求の範囲の記載と
共に以下の詳細な説明の記載に基づいて、当業者には明
らかとなるであろう。
【０００８】以下、本発明について詳細に説明する。単
純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）を本発明によってベクタ
ーへ転換するには、そのＤＮＡ中へ適当なウィルスプロ
モーターに連鎖された異種遺伝子又は非単純ヘルペスウ
ィルス遺伝子を組換えれば十分である。異種遺伝子は、
それ自身の転写終結−ポリ−アデニル化（ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ−ｐｏｌｙａ
ｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を有さねばならないかある
いは新規なかかる信号が与えられなければならない。
純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）を本発明によってベクタ
ーへ転換するには、そのＤＮＡ中へ適当なウィルスプロ
モーターに連鎖された異種遺伝子又は非単純ヘルペスウ
ィルス遺伝子を組換えれば十分である。異種遺伝子は、
それ自身の転写終結−ポリ−アデニル化（ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｉｏｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ−ｐｏｌｙａ
ｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を有さねばならないかある
いは新規なかかる信号が与えられなければならない。
【０００９】異種遺伝子は完全暗号配列を含まねばなら
ない。異種遺伝子が転写終結信号を超えて終結する場合
及び転写終結信号から下流にもう１つのプロモーターが
存在する場合には、ＨＳＶのＴＫ遺伝子の構造配列は、
ＴＫ遺伝子がそのプロモーターから発現され得ないよう
に変更されねばならない。
ない。異種遺伝子が転写終結信号を超えて終結する場合
及び転写終結信号から下流にもう１つのプロモーターが
存在する場合には、ＨＳＶのＴＫ遺伝子の構造配列は、
ＴＫ遺伝子がそのプロモーターから発現され得ないよう
に変更されねばならない。
【００１０】異種遺伝子をウィルス中へ組換えるために
は、遺伝子が所望の位置で組換わる相同フランキング
（flanking) 配列と所望の組換え体を選択するためのシ
ステムとを有することが必要である。この場合には、フ
ランキング配列はウィルスＴＫ遺伝子の領域の部分から
なりかつ、不活性ＴＫ遺伝子の選択が行われつゝあるの
で、ＴＫ遺伝子によって特異的に又は主として燐酸化さ
れる任意のヌクレオチド同族体（例えば薬剤）を組換え
体ＴＫウィルスの選択に用いることができる。
は、遺伝子が所望の位置で組換わる相同フランキング
（flanking) 配列と所望の組換え体を選択するためのシ
ステムとを有することが必要である。この場合には、フ
ランキング配列はウィルスＴＫ遺伝子の領域の部分から
なりかつ、不活性ＴＫ遺伝子の選択が行われつゝあるの
で、ＴＫ遺伝子によって特異的に又は主として燐酸化さ
れる任意のヌクレオチド同族体（例えば薬剤）を組換え
体ＴＫウィルスの選択に用いることができる。
【００１１】ＨＳＶの場合には、ＴＫ遺伝子は、非常に
低い頻度で起こる組換え体の選択を許すので、異種遺伝
子の挿入のための高度に望ましい位置である。また、Ｈ
ＳＶゲノム内のＴＫ遺伝子の位置は、異種遺伝子の挿入
前に（既知の方法で）変えることができる。
低い頻度で起こる組換え体の選択を許すので、異種遺伝
子の挿入のための高度に望ましい位置である。また、Ｈ
ＳＶゲノム内のＴＫ遺伝子の位置は、異種遺伝子の挿入
前に（既知の方法で）変えることができる。
【００１２】しかし、異種遺伝子の挿入はＴＫ遺伝子に
おいてなされる必要はなく、挿入は任意の有効な非致死
部位又は非必須的領域において行うことができ、かつＨ
ＳＶゲノム中の別の選択マーカーの使用によって選択さ
れ得る。ＨＳＶ遺伝子は、α、β及びγと称せられる３
つの主要群を形成し、その発現は対等に調節されかつカ
スケード形式で連続的に制御される。ほとんどのα遺伝
子及び一部分のβ遺伝子では、プロモーター及び調節領
域が転写開始部位から上流にあることが知られている。
特に、α遺伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ＩＣＰ）Ｎ
ｏ．０、４、２７又は２２を指定する遺伝子〕のプロモ
ーター調節領域を、他の遺伝子の５′転写非暗号及び暗
号配列へ融合することによって作られるキメリック（ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃ）遺伝子はそれぞれα遺伝子又はβ遺伝
子として調節される。
おいてなされる必要はなく、挿入は任意の有効な非致死
部位又は非必須的領域において行うことができ、かつＨ
ＳＶゲノム中の別の選択マーカーの使用によって選択さ
れ得る。ＨＳＶ遺伝子は、α、β及びγと称せられる３
つの主要群を形成し、その発現は対等に調節されかつカ
スケード形式で連続的に制御される。ほとんどのα遺伝
子及び一部分のβ遺伝子では、プロモーター及び調節領
域が転写開始部位から上流にあることが知られている。
特に、α遺伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ＩＣＰ）Ｎ
ｏ．０、４、２７又は２２を指定する遺伝子〕のプロモ
ーター調節領域を、他の遺伝子の５′転写非暗号及び暗
号配列へ融合することによって作られるキメリック（ｃ
ｈｉｍｅｒｉｃ）遺伝子はそれぞれα遺伝子又はβ遺伝
子として調節される。
【００１３】従って、本発明によれば、一端にウィルス
遺伝子のプロモーター調節領域がありかつ他端に適当な
転写終結信号があるその完全な構造配列を含む異種遺伝
子がＨＳＶゲノム中へ永久的に組込まれたＤＮＡ構造物
が調製される。かかる構造物は、ウィルスのゲノム中に
おいて異種遺伝子を永続化させる能力及び組換えウィル
スのゲノムを担持するウィルスで感染された細胞中にお
いて異種遺伝子を発現する能力を有する。
遺伝子のプロモーター調節領域がありかつ他端に適当な
転写終結信号があるその完全な構造配列を含む異種遺伝
子がＨＳＶゲノム中へ永久的に組込まれたＤＮＡ構造物
が調製される。かかる構造物は、ウィルスのゲノム中に
おいて異種遺伝子を永続化させる能力及び組換えウィル
スのゲノムを担持するウィルスで感染された細胞中にお
いて異種遺伝子を発現する能力を有する。
【００１４】本発明の典型的な実施の態様 α−及びβ−調節HBsAg を担持するＨＳＶ−１ベクター
の遺伝子工学 本発明の典型的な実施の態様において、HBsAg 指定遺伝
子の５′転写非暗号領域の構造領域の構造配列及び２５
塩基対を、HBsAg 遺伝子の５′転写非暗号及び暗号領域
のＨＳＶ−１遺伝子のそれぞれのプロモーター調節領域
へ融合することによって、ＨＳＶ−１ゲノムのウィルス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のＩＣＰ４のαプロモ
ーター又はβプロモーターの制御下に置く。このキメリ
ック構造物を、次に、フランキング（flanking) 配列に
よる相同組換えによってＴＫ遺伝子の５′転写非暗号領
域中へ挿入する。キメリック（chimeric) 遺伝子を担持
する組換え体で感染された細胞は、少なくとも１２時
間、細胞外媒質中へHBsAg を生産し、排出することが見
いだされる。
の遺伝子工学 本発明の典型的な実施の態様において、HBsAg 指定遺伝
子の５′転写非暗号領域の構造領域の構造配列及び２５
塩基対を、HBsAg 遺伝子の５′転写非暗号及び暗号領域
のＨＳＶ−１遺伝子のそれぞれのプロモーター調節領域
へ融合することによって、ＨＳＶ−１ゲノムのウィルス
チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のＩＣＰ４のαプロモ
ーター又はβプロモーターの制御下に置く。このキメリ
ック構造物を、次に、フランキング（flanking) 配列に
よる相同組換えによってＴＫ遺伝子の５′転写非暗号領
域中へ挿入する。キメリック（chimeric) 遺伝子を担持
する組換え体で感染された細胞は、少なくとも１２時
間、細胞外媒質中へHBsAg を生産し、排出することが見
いだされる。
【００１５】発現の一時的なパターンとα−プロモータ
ー調節領域へ連鎖したHBsAg がα遺伝子として調節され
るという観察とは、ウィルス中へ挿入されたHBsAg 遺伝
子キメラがウィルス遺伝子として調節されることを示
す。ＨＳＶ−１のＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列は公表
されている。ワグナー(wagner)ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. Vol.78．1441−1445頁（1981）及びマック
ナイト（McKnight)、 Nucleic Acids Res. Vol. 8.
5949−5964頁（1980）を参照されたい。ＴＫ遺伝子の領
域内の単一の Bgl II 部位は、TK遺伝子の５′転写され
るが翻訳されない領域内にある。この部位における欠失
は該部位から上流に位置する領域のプロモーター機能に
影響を与えない。
ー調節領域へ連鎖したHBsAg がα遺伝子として調節され
るという観察とは、ウィルス中へ挿入されたHBsAg 遺伝
子キメラがウィルス遺伝子として調節されることを示
す。ＨＳＶ−１のＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列は公表
されている。ワグナー(wagner)ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. Vol.78．1441−1445頁（1981）及びマック
ナイト（McKnight)、 Nucleic Acids Res. Vol. 8.
5949−5964頁（1980）を参照されたい。ＴＫ遺伝子の領
域内の単一の Bgl II 部位は、TK遺伝子の５′転写され
るが翻訳されない領域内にある。この部位における欠失
は該部位から上流に位置する領域のプロモーター機能に
影響を与えない。
【００１６】本発明において、ＨＳＶ−１ゲノム中への
異種遺伝子の挿入及びＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の一部分の
欠失のために有用な適当な方法は、モカルスキー(Mocar
ski)ら、セル（Cell) 、Vol. 22. 243−255 頁（198
0）；ポスト（Post) らProc.Natl. Acad. Sci. USA.
Vol.77．No. ７、4201−4205頁（1980）；ポスト（Pos
t）ら、セル（Cell) 、Vol. 24. 555−565 頁（198
1）；ポスト（Post）ら、セル（Cell) 、Vol. 25. 227
−232 頁（1981）、並びにヨーロッパ特許公告第74,808
号（１９８３年３月２３日）に記載されている。上記刊
行物の記載は参照文として本明細書に含まれるものとす
る。
異種遺伝子の挿入及びＨＳＶ−１ＴＫ遺伝子の一部分の
欠失のために有用な適当な方法は、モカルスキー(Mocar
ski)ら、セル（Cell) 、Vol. 22. 243−255 頁（198
0）；ポスト（Post) らProc.Natl. Acad. Sci. USA.
Vol.77．No. ７、4201−4205頁（1980）；ポスト（Pos
t）ら、セル（Cell) 、Vol. 24. 555−565 頁（198
1）；ポスト（Post）ら、セル（Cell) 、Vol. 25. 227
−232 頁（1981）、並びにヨーロッパ特許公告第74,808
号（１９８３年３月２３日）に記載されている。上記刊
行物の記載は参照文として本明細書に含まれるものとす
る。
【００１７】特に、βＴＫ調節HBsAg 及びαＩＣＰ４調
節HBsAg の両方をＴＫ遺伝子の５′転写非暗号領域を中
断する該遺伝子のBgl II部位中へ挿入する。このキメリ
ック（chimeric）断片を、次に、無傷のＨＳＶ ＤＮＡ
とコトランスフェクション（cotransfection) し、フラ
ンキング配列による相同組換えによって生産されたHBsA
g 担持ＴＫ−組換え体を、ＴＫ＋ウィルス子孫を不活化
する BuDR の存在下においてＴＫ−細胞について平板培
養することによって選択する。
節HBsAg の両方をＴＫ遺伝子の５′転写非暗号領域を中
断する該遺伝子のBgl II部位中へ挿入する。このキメリ
ック（chimeric）断片を、次に、無傷のＨＳＶ ＤＮＡ
とコトランスフェクション（cotransfection) し、フラ
ンキング配列による相同組換えによって生産されたHBsA
g 担持ＴＫ−組換え体を、ＴＫ＋ウィルス子孫を不活化
する BuDR の存在下においてＴＫ−細胞について平板培
養することによって選択する。
【００１８】HBsAg 遺伝子担持ＤＮＡ断片は、該遺伝子
に対するその末端３′において、ＴＫプロモーターの代
わりになりかつＴＫ＋表現型を保持するプロモーターを
含むように思われるので、該遺伝子のコード配列内の S
ac I部位における小欠失によってキメリック構造物中の
ＴＫ遺伝子を不活化することが必要である。この方法
は、β−プロモーター調節HBsAg を含むＨＳＶの作製を
可能にするが、以下これを詳述する。
に対するその末端３′において、ＴＫプロモーターの代
わりになりかつＴＫ＋表現型を保持するプロモーターを
含むように思われるので、該遺伝子のコード配列内の S
ac I部位における小欠失によってキメリック構造物中の
ＴＫ遺伝子を不活化することが必要である。この方法
は、β−プロモーター調節HBsAg を含むＨＳＶの作製を
可能にするが、以下これを詳述する。
【００１９】更に、α−調節HBsAg の発現をβ−調節HB
sAg 組換えウィルスの発現と区別するため、ＨＳＶ−１
のα４遺伝子のプロモーター調節領域をHBsAg 遺伝子含
有ＤＮＡ断片に結合を含む作製を行った。このキメリッ
ク遺伝子をＴＫ遺伝子のBglII部位中にクローニング
し、コトランスフェクションによって無傷のウィルスＤ
ＮＡと組換えてウィルスを生産させた。この詳細及び結
果を以下詳しく示す。
sAg 組換えウィルスの発現と区別するため、ＨＳＶ−１
のα４遺伝子のプロモーター調節領域をHBsAg 遺伝子含
有ＤＮＡ断片に結合を含む作製を行った。このキメリッ
ク遺伝子をＴＫ遺伝子のBglII部位中にクローニング
し、コトランスフェクションによって無傷のウィルスＤ
ＮＡと組換えてウィルスを生産させた。この詳細及び結
果を以下詳しく示す。
【００２０】次に、図１−図５を参照しながら、肝炎Ｂ
型表面抗原（HBsAg ）のための挿入コード配列を含む２
種の組換え単純ヘルペスウィルスの作製及び該ウィルス
からのこの蛋白質の発現を詳細に説明する。
型表面抗原（HBsAg ）のための挿入コード配列を含む２
種の組換え単純ヘルペスウィルスの作製及び該ウィルス
からのこの蛋白質の発現を詳細に説明する。
【００２１】キメリックβ−ＴＫプロモーター調節HBsA
g を含むＨＳＶ−１組換え体の作製及び発現 ＨＳＶ−１株Ｆ〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕（ＡＴＣＣ受託番
号ＶＲ７３３）の Bam HI Q断片を担持するプラスミド
pRB 103（ＡＴＣＣＳ受託番号３９７１８）から Bal 3
１エキソヌクレアーゼ消化により、特異的な SacＩ部位
において約２００個の塩基対を除去してＴＫ遺伝子を不
活化することによってプラスミドpRB ３２２２を作製し
た。この作製においては、HBsAg のための開始コドンが
Xho Ｉ部位から２５塩基対下流にかつＴＫ遺伝子のプロ
モーター領域に近接して置かれる。従って、β−調節遺
伝子は、βＴＫ遺伝子から誘導される転写開始部位から
約８０塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（下記）
中のHBsAg のための開始コドンは、αＩＣＰ４遺伝子か
ら誘導される転写開始コドンから約６０塩基対であっ
た。
g を含むＨＳＶ−１組換え体の作製及び発現 ＨＳＶ−１株Ｆ〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕（ＡＴＣＣ受託番
号ＶＲ７３３）の Bam HI Q断片を担持するプラスミド
pRB 103（ＡＴＣＣＳ受託番号３９７１８）から Bal 3
１エキソヌクレアーゼ消化により、特異的な SacＩ部位
において約２００個の塩基対を除去してＴＫ遺伝子を不
活化することによってプラスミドpRB ３２２２を作製し
た。この作製においては、HBsAg のための開始コドンが
Xho Ｉ部位から２５塩基対下流にかつＴＫ遺伝子のプロ
モーター領域に近接して置かれる。従って、β−調節遺
伝子は、βＴＫ遺伝子から誘導される転写開始部位から
約８０塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（下記）
中のHBsAg のための開始コドンは、αＩＣＰ４遺伝子か
ら誘導される転写開始コドンから約６０塩基対であっ
た。
【００２２】プラスミド pCP 1 0（ＡＴＣＣ受託番号３
９７１７）のＤＮＡを Xho I 及びBgl II で開裂し、
得られた消化物を５％ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動にかけた。Xho I − Bgl II 断片（約1.７ kb:HBsA
g のためのコード配列を含んでいる）を、次に、ポリア
クリルアミドゲルから精製し、ＤＮＡ断片の末端をＴ４
DNAポリメラーゼで充填し、 Bgl II リンカーに結合さ
せ、Bgl IIで開裂しかつ pRB３２２の Bal II 部位中に
クローニングした。
９７１７）のＤＮＡを Xho I 及びBgl II で開裂し、
得られた消化物を５％ポリアクリルアミドゲル中で電気
泳動にかけた。Xho I − Bgl II 断片（約1.７ kb:HBsA
g のためのコード配列を含んでいる）を、次に、ポリア
クリルアミドゲルから精製し、ＤＮＡ断片の末端をＴ４
DNAポリメラーゼで充填し、 Bgl II リンカーに結合さ
せ、Bgl IIで開裂しかつ pRB３２２の Bal II 部位中に
クローニングした。
【００２３】ＴＫプロモーター調節領域に対する正しい
転写配向（ Bam HI DNA 制限パターンから決定される）
でHBsAg 遺伝子を含むここに得られたプラスミドを本明
細書中では pRB３２２３（ＡＴＣＣ受託番号３９７１
６）と称する。組換えプラスミド pRB３２２３を Pvu I
I で直線化し、このプラスミド0.１−0.５μg を、次
に、うさぎ皮膚細胞中へ0.５μg のＨＳＶ−１（Ｆ）Ｄ
ＮＡとコトランスフェクションし、得られた組換えウィ
ルスのプラーク精製をルイエチャン（Ruyechan) らのJ.
Virol., Vol. 29, 677 − 697頁（1979) に記載のよう
にして行った。得られたＴＫ−組換えウィルスを、次
に、チミン欠損混合物１９９を含むが３％の子牛血清と
４０μg ／ml BuDR （ブロモウラシルデオキシリボシ
ド）を補充した培地の存在下で１４３ＴＫ−細胞系につ
いて選択した。
転写配向（ Bam HI DNA 制限パターンから決定される）
でHBsAg 遺伝子を含むここに得られたプラスミドを本明
細書中では pRB３２２３（ＡＴＣＣ受託番号３９７１
６）と称する。組換えプラスミド pRB３２２３を Pvu I
I で直線化し、このプラスミド0.１−0.５μg を、次
に、うさぎ皮膚細胞中へ0.５μg のＨＳＶ−１（Ｆ）Ｄ
ＮＡとコトランスフェクションし、得られた組換えウィ
ルスのプラーク精製をルイエチャン（Ruyechan) らのJ.
Virol., Vol. 29, 677 − 697頁（1979) に記載のよう
にして行った。得られたＴＫ−組換えウィルスを、次
に、チミン欠損混合物１９９を含むが３％の子牛血清と
４０μg ／ml BuDR （ブロモウラシルデオキシリボシ
ド）を補充した培地の存在下で１４３ＴＫ−細胞系につ
いて選択した。
【００２４】予想通り、得られたＴＫ−子孫は、 Sac
１部位における欠失のみを組換えた組換え体（Ｒ３２２
２と称す）と、該欠失とHBsAg 遺伝子挿入の両方を組換
えたもう１つの組換え体とを含んでいた。後者の組換え
体をＲ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２０８６）と称
す。組換えウィルスＤＮＡを Eco RI 制限エンドヌクレ
アーゼで消化することによって、組換えウィルスＲ 322
3 をＲ 3222 から区別した。これらのウィルスのそれぞ
れのＤＮＡ組織をサザーンブロット分析によって更に確
認した。
１部位における欠失のみを組換えた組換え体（Ｒ３２２
２と称す）と、該欠失とHBsAg 遺伝子挿入の両方を組換
えたもう１つの組換え体とを含んでいた。後者の組換え
体をＲ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号ＶＲ２０８６）と称
す。組換えウィルスＤＮＡを Eco RI 制限エンドヌクレ
アーゼで消化することによって、組換えウィルスＲ 322
3 をＲ 3222 から区別した。これらのウィルスのそれぞ
れのＤＮＡ組織をサザーンブロット分析によって更に確
認した。
【００２５】下記表１及び図２は、組換えウィルスＲ 3
223 によるHBsAg の発現及び分泌を示す。２５cm3 フラ
スコ中でベロ（Vero) 細胞をＲ 3223 （２ pfu／細胞）
に１時間暴露した後、１％子牛血清を補充した維持混合
物199 から培地中で３７℃において培養した。表１中に
示した時間において、１つのフラスコ中の維持培地５ml
を取り、細胞を、毎回燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）(0.1
5 Ｍ NaCl 、8.２mMNa2HPO4 、1.５mM KH2PO4、2.５mM
KCl) ５mlずつで３回洗浄し、１mlのＰＢＳ中に採り、
３回凍結−融解し、エッペンドルフ（Eppendorf)ミクロ
遠心機で遠心した。
223 によるHBsAg の発現及び分泌を示す。２５cm3 フラ
スコ中でベロ（Vero) 細胞をＲ 3223 （２ pfu／細胞）
に１時間暴露した後、１％子牛血清を補充した維持混合
物199 から培地中で３７℃において培養した。表１中に
示した時間において、１つのフラスコ中の維持培地５ml
を取り、細胞を、毎回燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）(0.1
5 Ｍ NaCl 、8.２mMNa2HPO4 、1.５mM KH2PO4、2.５mM
KCl) ５mlずつで３回洗浄し、１mlのＰＢＳ中に採り、
３回凍結−融解し、エッペンドルフ（Eppendorf)ミクロ
遠心機で遠心した。
【００２６】細胞溶解質を含む上澄液を、次に、ＰＢＳ
で容量５mlにした。２００μl の培地と感染細胞とを含
む部分を、次に、商標アウスザイム（AUSZYME)IIで発売
されているアボット・ラボラトリーズのエリザ診断用キ
ットで、メーカーが推奨する方法により、下記のように
してHBsAg の存在を検定した。組換え体及び親ウィルス
〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕感染細胞からの細胞外培地及び溶
解質をHBsAg に対するモルモット抗体を塗布したビーズ
と混合した。培養後、HBsAg に対するペルオキシダーゼ
結合抗体と反応させた。HBsAg の存在は、４９２nmにお
いて分光光度計で測定された。
で容量５mlにした。２００μl の培地と感染細胞とを含
む部分を、次に、商標アウスザイム（AUSZYME)IIで発売
されているアボット・ラボラトリーズのエリザ診断用キ
ットで、メーカーが推奨する方法により、下記のように
してHBsAg の存在を検定した。組換え体及び親ウィルス
〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕感染細胞からの細胞外培地及び溶
解質をHBsAg に対するモルモット抗体を塗布したビーズ
と混合した。培養後、HBsAg に対するペルオキシダーゼ
結合抗体と反応させた。HBsAg の存在は、４９２nmにお
いて分光光度計で測定された。
【００２７】表１から分るように、感染後５時間のよう
な早期に、HBsAg が感染細胞溶解質中に検出されたが、
培地中には検出されなかった。感染後８時間では、感染
細胞溶解質中及び細胞外培地中の両方にHBsAg が検出さ
れた。感染後１２時間では、細胞外培地から多量のHBsA
g が回収された。しかし、感染細胞中のHBsAg 量は感染
後のより早期に検出された量とほぼ同じであった。
な早期に、HBsAg が感染細胞溶解質中に検出されたが、
培地中には検出されなかった。感染後８時間では、感染
細胞溶解質中及び細胞外培地中の両方にHBsAg が検出さ
れた。感染後１２時間では、細胞外培地から多量のHBsA
g が回収された。しかし、感染細胞中のHBsAg 量は感染
後のより早期に検出された量とほぼ同じであった。
【００２８】感染細胞中に蓄積されるHBsAg 量は、感染
後８時間又はそれ以前において、ＨＳＶ−１（Ｆ）感染
細胞の溶解質及び培地で得られるバックグラウンド値よ
り約１５倍高いピーク値に達し、それ以後はあまり増加
しなかった。細胞外培地中に検出されるHBsAg の量は時
間と共に増加し、HBsAg が分泌されて感染細胞の外部に
蓄積されることを示している。
後８時間又はそれ以前において、ＨＳＶ−１（Ｆ）感染
細胞の溶解質及び培地で得られるバックグラウンド値よ
り約１５倍高いピーク値に達し、それ以後はあまり増加
しなかった。細胞外培地中に検出されるHBsAg の量は時
間と共に増加し、HBsAg が分泌されて感染細胞の外部に
蓄積されることを示している。
【００２９】α−調節HBsAg とβ−調節HBsAg との蓄積
のパターンは類似しており、α−調節ＴＫ遺伝子及びβ
−調節ＴＫ遺伝子を担持するウィルスによって発現され
るこれら遺伝子の蓄積の速度論も類似しているという観
察と一致している。HBsAg は、野生型〔ＨＳＶ−１
（Ｆ）〕ウィルス感染細胞中又は細胞外培地中には検出
されなかった。HBsAg 遺伝子を担持するワクチニアウィ
ルスで感染した細胞中でもHBsAg が分泌されるという観
察が示された。
のパターンは類似しており、α−調節ＴＫ遺伝子及びβ
−調節ＴＫ遺伝子を担持するウィルスによって発現され
るこれら遺伝子の蓄積の速度論も類似しているという観
察と一致している。HBsAg は、野生型〔ＨＳＶ−１
（Ｆ）〕ウィルス感染細胞中又は細胞外培地中には検出
されなかった。HBsAg 遺伝子を担持するワクチニアウィ
ルスで感染した細胞中でもHBsAg が分泌されるという観
察が示された。
【００３０】
【表１】 表 １ 組換えウィルス及び親ウィルスで感染させた細胞中に おけるα−調節HBsAg 及びβ−調節HBsAg の発現 ─────────────────────────────────── 感染後 ＨＳＶ−１（Ｆ） Ｒ３２２３ Ｒ３２２５ の時間 ────────────────────────────── 培地 細胞 培地 細胞 培地 細胞 溶解質 溶解質 溶解質 ─────────────────────────────────── ４ 0.08* 0.07 0.42 0.57 0.58 0.56 ８ 0.08 0.07 3.69 0.95 3.31 1.06 12 0.09 0.07 6.33 1.26 5.06 1.20 ─────────────────────────────────── ＊ 光学密度単位
【００３１】図２は、上記のようにして得られた分泌HB
sAg を特徴付るために行った研究の結果を示す。ベロ細
胞を、Ｒ 3223 により、２ pfu／細胞で感染させた。感
染後１２時間において、維持培地９mlを採り、ベックマ
ンＳＷ４１ローター（Beckman SW41 rotor) で、４℃に
おいて２０時間、３6,０００rpm で遠心した。得られた
ペレットを同培地0.５ml中に懸濁した後、２００μl
を、1.１−1.５ｇ／mlの同密度 CsCl 密度勾配の上に重
層し、ベックマンＳＷ４１ローターで、２５℃におい
て、３６時間、３6,000rpmで遠心した。遠心分離管の底
部から分画（0.５ml）を集め、ＰＢＳで１：１０に希釈
した。各分画を、表１に関して上で詳述したようにして
HBsAg の存在を分析した。
sAg を特徴付るために行った研究の結果を示す。ベロ細
胞を、Ｒ 3223 により、２ pfu／細胞で感染させた。感
染後１２時間において、維持培地９mlを採り、ベックマ
ンＳＷ４１ローター（Beckman SW41 rotor) で、４℃に
おいて２０時間、３6,０００rpm で遠心した。得られた
ペレットを同培地0.５ml中に懸濁した後、２００μl
を、1.１−1.５ｇ／mlの同密度 CsCl 密度勾配の上に重
層し、ベックマンＳＷ４１ローターで、２５℃におい
て、３６時間、３6,000rpmで遠心した。遠心分離管の底
部から分画（0.５ml）を集め、ＰＢＳで１：１０に希釈
した。各分画を、表１に関して上で詳述したようにして
HBsAg の存在を分析した。
【００３２】図２から分かるように、密度1.１７ｇ／cm
2 の所にHBsAg が集まった。血清中で、HBsAg は１８〜
２５nmの直径を有する球形粒子を形成することが知られ
ている〔デーン（Dane) ら、ランセット（Lancet)、 Vo
l. 1、 695頁、1970〕。図３から分かるように、寸法が
デーン（Dane) 粒子に似ている（即ち、１８−２５nm）
粒子がビーク分画の電子顕微鏡検査で検出（２％タング
ステン酸で負に染色）され、かくして分泌HBsAg の特性
を確認した。
2 の所にHBsAg が集まった。血清中で、HBsAg は１８〜
２５nmの直径を有する球形粒子を形成することが知られ
ている〔デーン（Dane) ら、ランセット（Lancet)、 Vo
l. 1、 695頁、1970〕。図３から分かるように、寸法が
デーン（Dane) 粒子に似ている（即ち、１８−２５nm）
粒子がビーク分画の電子顕微鏡検査で検出（２％タング
ステン酸で負に染色）され、かくして分泌HBsAg の特性
を確認した。
【００３３】次に、HBsAg のためのコード配列を担持す
る組換えＨＳＶ−１ウィルスプラスミドの調製及びその
蛋白質を発現するためのベクターとしての該プラスミド
の有効な使用について詳述する。図１〜図３の作製にお
いて、HBsAg 断片をウィルスのβプロモーター領域の制
御下に置いた。
る組換えＨＳＶ−１ウィルスプラスミドの調製及びその
蛋白質を発現するためのベクターとしての該プラスミド
の有効な使用について詳述する。図１〜図３の作製にお
いて、HBsAg 断片をウィルスのβプロモーター領域の制
御下に置いた。
【００３４】αＩＣＰ４−HBsAg 遺伝子を含むＨＳＶ−
１組換え体の作製及び発現 以下、組換えＨＳＶ−１プラスミドと、それぞれがαプ
ロモーターの制御下にあるHBsAg コード配列及び遺伝子
を担持する組換えウィルスとの作製を説明する。図４は
キメリックαＩＣＰ４−HBsAg 遺伝子を含む組換え単純
ヘルペスウィルスの作製を示す。この作製は、ＨＳＶ−
１のα４遺伝子のプロモーター調節領域の、上記HBsAg
遺伝子含有ＤＮＡ断片への結合を含む。特に、pRB 103
からのＨＳＶ−１（Ｆ）ＴＫ遺伝子を含む Bam HI Q 断
片をプラスミド pRB 1 4のXho Ｉ部位中へ挿入する。プ
ラスミド pRBは、pRB 322 （ＡＴＣＣ受託番号３１３４
４）から、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市のニ
ュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biol
obs)から得た Xho Iリンカーによる Eco RI-Pvu II断片
の置換によって作製されたものである。
１組換え体の作製及び発現 以下、組換えＨＳＶ−１プラスミドと、それぞれがαプ
ロモーターの制御下にあるHBsAg コード配列及び遺伝子
を担持する組換えウィルスとの作製を説明する。図４は
キメリックαＩＣＰ４−HBsAg 遺伝子を含む組換え単純
ヘルペスウィルスの作製を示す。この作製は、ＨＳＶ−
１のα４遺伝子のプロモーター調節領域の、上記HBsAg
遺伝子含有ＤＮＡ断片への結合を含む。特に、pRB 103
からのＨＳＶ−１（Ｆ）ＴＫ遺伝子を含む Bam HI Q 断
片をプラスミド pRB 1 4のXho Ｉ部位中へ挿入する。プ
ラスミド pRBは、pRB 322 （ＡＴＣＣ受託番号３１３４
４）から、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市のニ
ュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biol
obs)から得た Xho Iリンカーによる Eco RI-Pvu II断片
の置換によって作製されたものである。
【００３５】得られた組換えプラスミドを本明細書中で
は pRB 3148 と称す。次に、ＨＳＶ−１（Ｆ） Bam HI
Q の唯一の Bgl II 部位中ヘ pUC 1 3からのHind III−
HeaIII 断片（ポリリンカーを含む）を、Bam HI部位は
ＴＫ遺伝子の構造配列に最接近するが、Sal Ｉ部位は該
遺伝子の転写開始部位に最接近するようにクローニング
することによってプラスミド pRB 3159 を作製した。プ
ラスミド pUC１３をポリリンカーを含む適当な断片源と
して選んだが、他の適当なポリリンカーが市販されてい
る。
は pRB 3148 と称す。次に、ＨＳＶ−１（Ｆ） Bam HI
Q の唯一の Bgl II 部位中ヘ pUC 1 3からのHind III−
HeaIII 断片（ポリリンカーを含む）を、Bam HI部位は
ＴＫ遺伝子の構造配列に最接近するが、Sal Ｉ部位は該
遺伝子の転写開始部位に最接近するようにクローニング
することによってプラスミド pRB 3159 を作製した。プ
ラスミド pUC１３をポリリンカーを含む適当な断片源と
して選んだが、他の適当なポリリンカーが市販されてい
る。
【００３６】pRB 3159 から、Sac Ｉによる消化及び再
結合によるBam HI Qの Bal II −Sac Ｉ断片を含む Sac
Ｉの欠失によってプラスミド pRB 3166 を作製した。
結合によるBam HI Qの Bal II −Sac Ｉ断片を含む Sac
Ｉの欠失によってプラスミド pRB 3166 を作製した。
【００３７】最終工程では、 pRB 3166 中の２個の断片
をクローニングしてプラスミド pRB3225 を得た。最初
に、αＩＣＰ４遺伝子のプロモーター−調節領域を含む
pRB403（ＡＴＣＣ受託番号３９７１９）からの Bam HI
− Pvu II 断片をポリリンカー配列の SacＩ部位中
へ、Bam HI-Pvu II 断片中のαＩＣＰ４の転写開始部位
が XbaＩ部位に接近するようにクローニングした。最後
に、 pRB 3223 からHBsAg 遺伝子を含む Bal II 断片
を、Xba I 部位中へ、αＩＣＰ４プロモーターとHBsAg
遺伝子の構造配列とが Eco RI ＤＮＡ制限エンドヌクレ
アーゼパターンから決定される同じ転写配向であるよう
にクローニングした。かくして、上記方法により、キメ
リック（Chimeric) 遺伝子Ｐα４−HBsAg がＴＫ遺伝子
の Bal II 部位中へクローニングされた。
をクローニングしてプラスミド pRB3225 を得た。最初
に、αＩＣＰ４遺伝子のプロモーター−調節領域を含む
pRB403（ＡＴＣＣ受託番号３９７１９）からの Bam HI
− Pvu II 断片をポリリンカー配列の SacＩ部位中
へ、Bam HI-Pvu II 断片中のαＩＣＰ４の転写開始部位
が XbaＩ部位に接近するようにクローニングした。最後
に、 pRB 3223 からHBsAg 遺伝子を含む Bal II 断片
を、Xba I 部位中へ、αＩＣＰ４プロモーターとHBsAg
遺伝子の構造配列とが Eco RI ＤＮＡ制限エンドヌクレ
アーゼパターンから決定される同じ転写配向であるよう
にクローニングした。かくして、上記方法により、キメ
リック（Chimeric) 遺伝子Ｐα４−HBsAg がＴＫ遺伝子
の Bal II 部位中へクローニングされた。
【００３８】得られた組換えプラスミドpRB 3225(ATCC
受託番号39715)を、図１に関して上で説明したように１
４３TK−細胞中において無傷のHSV-1(F)DNA とコトラン
スフェクションし、TK遺伝子中にＰα４−HBsA断片を含
む得られた組換えウィルスＲ3225 （ＡＴＣＣ受託番号V
R2087) を、１４３TK−細胞中でTK−子孫から選択しか
つ以下に示すようにHBsAg 発現について検査した。トラ
ンスフェクション及び選択工程は図５に略示してある。
受託番号39715)を、図１に関して上で説明したように１
４３TK−細胞中において無傷のHSV-1(F)DNA とコトラン
スフェクションし、TK遺伝子中にＰα４−HBsA断片を含
む得られた組換えウィルスＲ3225 （ＡＴＣＣ受託番号V
R2087) を、１４３TK−細胞中でTK−子孫から選択しか
つ以下に示すようにHBsAg 発現について検査した。トラ
ンスフェクション及び選択工程は図５に略示してある。
【００３９】α−調節HBsAg （Ｒ 3225)の発現をβ−調
節HBsAg （Ｒ 3223)組換えウィルスの発現から区別する
ため、α遺伝子は新規の蛋白質合成後感染の不在下で転
写されるが、β遺伝子はその発現のために機能的α遺伝
子の存在を必要とするという観察を下記の方法に従って
利用した。２５cm3 フラスコ中において、複製Hep −２
細胞培養を、シクロヘキシミド（＋シクロ）５μｇ／ml
含有維持培地中で、１時間予備培養した後、それぞれ野
性型〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕ウィルス、Ｒ 3222 ウィル
ス、Ｒ 3223 ウィルス、又はＲ 3225 ウィルスにより、
２０／Pfu ／細胞で感染させた。感染後５時間で、シク
ロヘキシミド含有培地を取り出し、細胞を十分に洗った
後、アクチノマイシンＤ（１０μｇ／ml）含有培地中で
培養した。９０分の追加培養後、細胞と培地を採り、ア
ウスザイムII診断用キット（アボット・ラボラトリーズ
でHBsAg 対照実験（−シクロ）は、薬品を添加しない以
外は同じ洗浄方法を用いて行った。結果を下記に示す。
節HBsAg （Ｒ 3223)組換えウィルスの発現から区別する
ため、α遺伝子は新規の蛋白質合成後感染の不在下で転
写されるが、β遺伝子はその発現のために機能的α遺伝
子の存在を必要とするという観察を下記の方法に従って
利用した。２５cm3 フラスコ中において、複製Hep −２
細胞培養を、シクロヘキシミド（＋シクロ）５μｇ／ml
含有維持培地中で、１時間予備培養した後、それぞれ野
性型〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕ウィルス、Ｒ 3222 ウィル
ス、Ｒ 3223 ウィルス、又はＲ 3225 ウィルスにより、
２０／Pfu ／細胞で感染させた。感染後５時間で、シク
ロヘキシミド含有培地を取り出し、細胞を十分に洗った
後、アクチノマイシンＤ（１０μｇ／ml）含有培地中で
培養した。９０分の追加培養後、細胞と培地を採り、ア
ウスザイムII診断用キット（アボット・ラボラトリーズ
でHBsAg 対照実験（−シクロ）は、薬品を添加しない以
外は同じ洗浄方法を用いて行った。結果を下記に示す。
【００４０】
【表２】 表 ２ 組換えウィルスによって発現されるHBsAg の調節 ──────────────────────────────────── 感染の条件 被検物 HSV-1(F) R3222 R3223 R3225 ──────────────────────────────────── −シクロヘキシミド 培地 ＜0.06 * ＜0.06 5.22 2.34 −シクロヘキシミド 細 胞 ＜0.06 ＜0.06 3.09 1.04 溶解質 ＋シクロヘキシミド 培地 ＜0.06 ＜0.06 ＜0.06 0.77 ＋シクロヘキシミド 細 胞 ＜0.06 ＜0.06 ＜0.06 0.80 溶解質 ──────────────────────────────────── ＊ 光学密度単位
【００４１】上記表２に示すように、感染中及び感染後
５時間に培地中に存在する抑制濃度のシクロヘキシミド
の除去後、HBsAg はＲ 3225 で感染された細胞では作ら
れたが、Ｒ 3223 で感染された細胞では作られなかっ
た。ＨＳＶ−１α遺伝子の特徴は、それらが感染中及び
感染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写さ
れたウィルス遺伝子のみであるということである。上記
表２から分るように、シクロヘキシミドの存在下で感
染、かつ維持した細胞中ではＲ 3225 中に含まれるHBsA
g 遺伝子だけが発現し、次に、αＩＣＰ４遺伝子生成物
の合成に存在するβ遺伝子の転写を妨害するアクチノマ
イシンＤの存在下においてシクロヘキシミドの抑制効果
から解放される。
５時間に培地中に存在する抑制濃度のシクロヘキシミド
の除去後、HBsAg はＲ 3225 で感染された細胞では作ら
れたが、Ｒ 3223 で感染された細胞では作られなかっ
た。ＨＳＶ−１α遺伝子の特徴は、それらが感染中及び
感染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写さ
れたウィルス遺伝子のみであるということである。上記
表２から分るように、シクロヘキシミドの存在下で感
染、かつ維持した細胞中ではＲ 3225 中に含まれるHBsA
g 遺伝子だけが発現し、次に、αＩＣＰ４遺伝子生成物
の合成に存在するβ遺伝子の転写を妨害するアクチノマ
イシンＤの存在下においてシクロヘキシミドの抑制効果
から解放される。
【００４２】結果の考案 以上のことは、ＨＳＶゲノムが異種遺伝子、特にHBsAg
のための発現ベクターとして作用し得ることを示してい
る。ＨＳＶは宿主の高分子代謝、特に宿主の蛋白質合成
を停止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつＨ
ＳＶプロモーター調節領域によって調節される異種遺伝
子（HBsAg で例示される）の発現に悪影響を与えない。
遺伝子生産物の抗原性、CsCl密度勾配中におけるその浮
遊密度及び帯状化調製物中に存在する特徴的１８〜２５
nm粒径は、ＨＳＶが担持するHBsAg 遺伝子の生成物が、
該遺伝子の真の生成物であることを示す。HBsAg が感染
細胞から排出されるという観察は、抗原が細胞から放出
されるために正しく処理されることを暗示している。
のための発現ベクターとして作用し得ることを示してい
る。ＨＳＶは宿主の高分子代謝、特に宿主の蛋白質合成
を停止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつＨ
ＳＶプロモーター調節領域によって調節される異種遺伝
子（HBsAg で例示される）の発現に悪影響を与えない。
遺伝子生産物の抗原性、CsCl密度勾配中におけるその浮
遊密度及び帯状化調製物中に存在する特徴的１８〜２５
nm粒径は、ＨＳＶが担持するHBsAg 遺伝子の生成物が、
該遺伝子の真の生成物であることを示す。HBsAg が感染
細胞から排出されるという観察は、抗原が細胞から放出
されるために正しく処理されることを暗示している。
【００４３】ここに示される結果は、αＩＣＰ４結合HB
sAg とβＴＫ結合HBsAg 遺伝子とが共に少なくとも１２
時間抗原を発現することを示す。HBsAg の合成パターン
とＩＣＰ４結合がα遺伝子として調節されるという観察
とは、ＨＳＶ−１ベクター中のキメリックHBsAg 遺伝子
がウィルス遺伝子として調節されることを示す。ＩＣＰ
４遺伝子中のts突然変異体のゲノム中へαプロモーター
調節領域下で遺伝子を挿入することによって、かかる突
然変異体が非許容温度で感染されかつ維持される細胞中
で連続的にα遺伝子を発現すると示されているので、HB
sAg の生産は特に高められる。
sAg とβＴＫ結合HBsAg 遺伝子とが共に少なくとも１２
時間抗原を発現することを示す。HBsAg の合成パターン
とＩＣＰ４結合がα遺伝子として調節されるという観察
とは、ＨＳＶ−１ベクター中のキメリックHBsAg 遺伝子
がウィルス遺伝子として調節されることを示す。ＩＣＰ
４遺伝子中のts突然変異体のゲノム中へαプロモーター
調節領域下で遺伝子を挿入することによって、かかる突
然変異体が非許容温度で感染されかつ維持される細胞中
で連続的にα遺伝子を発現すると示されているので、HB
sAg の生産は特に高められる。
【００４４】異種遺伝子のためのベクターとしてのＨＳ
Ｖゲノムの使用は、ヒト細胞中における生合成及び(1)
その増殖が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝
炎Ｂ型ウィルス）の遺伝子、(2) ヒトに対して特に危険
な感染因子の遺伝子、及び(3) 培養細胞中で極めて低レ
ベルで発現されるか又は全く発現されない細胞遺伝子の
生産物のキャラクタリゼーションのために特に有用であ
る。ＨＳＶ−１発現ベクターは、遺伝子調節、特に翻訳
レベルにおける遺伝子調節の分析に有用である。
Ｖゲノムの使用は、ヒト細胞中における生合成及び(1)
その増殖が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝
炎Ｂ型ウィルス）の遺伝子、(2) ヒトに対して特に危険
な感染因子の遺伝子、及び(3) 培養細胞中で極めて低レ
ベルで発現されるか又は全く発現されない細胞遺伝子の
生産物のキャラクタリゼーションのために特に有用であ
る。ＨＳＶ−１発現ベクターは、遺伝子調節、特に翻訳
レベルにおける遺伝子調節の分析に有用である。
【００４５】ＨＳＶ−ベクターの特別な利点は、これら
のウィルスが非常に広い宿主範囲を有すること、即ち、
一様な方法で多くの異なる型の細胞の感染が可能だとい
うことである。従って、ＨＳＶ−１ベクター中へ挿入さ
れた異種遺伝子は、培養で容易に連続的に増殖させるこ
とができかつウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分
としてパッケージされる。このベクターは、次に、大規
模細胞培養を同調的に感染させるのに用いて、すべての
感染細胞中で異種遺伝子を持続的に発現することができ
る。この方法は、細胞とＤＮＡとのトランスフェクショ
ンと異種遺伝子を発現する少数の細胞の選択とに依存す
る他の方法よりも非常に有利である。この方法は、異種
遺伝子の発現のためのＤＮＡ断片による形質転換に有用
でないヒトワクチン生産（例えばＭＲＣ−５又はＷ１３
８）用に認可されたヒト二倍体細胞株に適用可能であ
る。
のウィルスが非常に広い宿主範囲を有すること、即ち、
一様な方法で多くの異なる型の細胞の感染が可能だとい
うことである。従って、ＨＳＶ−１ベクター中へ挿入さ
れた異種遺伝子は、培養で容易に連続的に増殖させるこ
とができかつウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分
としてパッケージされる。このベクターは、次に、大規
模細胞培養を同調的に感染させるのに用いて、すべての
感染細胞中で異種遺伝子を持続的に発現することができ
る。この方法は、細胞とＤＮＡとのトランスフェクショ
ンと異種遺伝子を発現する少数の細胞の選択とに依存す
る他の方法よりも非常に有利である。この方法は、異種
遺伝子の発現のためのＤＮＡ断片による形質転換に有用
でないヒトワクチン生産（例えばＭＲＣ−５又はＷ１３
８）用に認可されたヒト二倍体細胞株に適用可能であ
る。
【００４６】本明細書中で示した典型的な例において、
HBsAg 遺伝子の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中
へHBsAg を挿入した。以前には、７Kbp のような多量の
ＤＮＡが挿入された〔ナイプ（Knipe)ら、Pro. Natl. A
cad. Sci.,Vol. 75, 3896 −3900頁、１９７８）が、野
生型ＨＳＶ DNAの余分な遺伝子生産物担持能力には制限
があるであろう。
HBsAg 遺伝子の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中
へHBsAg を挿入した。以前には、７Kbp のような多量の
ＤＮＡが挿入された〔ナイプ（Knipe)ら、Pro. Natl. A
cad. Sci.,Vol. 75, 3896 −3900頁、１９７８）が、野
生型ＨＳＶ DNAの余分な遺伝子生産物担持能力には制限
があるであろう。
【００４７】内部反復配列内に含まれる約１４Kbp のＤ
ＮＡがそれから２Kbp 挿入物で置換されている突然変異
体ＨＳＶ−１１（Ｆ）１３５８の作製は既に報告されて
いる〔ポッフェンバーガー（Poffenberger) ら、Proc.
Natl. Acad. Sci.,Vol. 80,2690−2694頁、1983〕。挿
入物を置換しかつゲノムをその既知の最高容量まで拡大
させることにより、１３５８突然変異体は２３Kbp のよ
うな多量の異種ＤＮＡを担持することができた。従っ
て、ＨＳＶ−１（Ｆ）１３５８は、免疫予防のための種
々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つかの遺伝子
のベクターとして働く能力がある。
ＮＡがそれから２Kbp 挿入物で置換されている突然変異
体ＨＳＶ−１１（Ｆ）１３５８の作製は既に報告されて
いる〔ポッフェンバーガー（Poffenberger) ら、Proc.
Natl. Acad. Sci.,Vol. 80,2690−2694頁、1983〕。挿
入物を置換しかつゲノムをその既知の最高容量まで拡大
させることにより、１３５８突然変異体は２３Kbp のよ
うな多量の異種ＤＮＡを担持することができた。従っ
て、ＨＳＶ−１（Ｆ）１３５８は、免疫予防のための種
々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つかの遺伝子
のベクターとして働く能力がある。
【００４８】単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）
のＤＮＡは、構造がＨＳＶ−１と本質的に同じであり、
塩基対のヌクレオチドマッチング（matching) のみが異
なる。従って、ＨＳＶ−１ゲノムを用いて本明細書中で
示したＤＮＡ構造物と同じＤＮＡ構造物が本発明によっ
て実行可能である。ＨＳＶ−１は公けに容易に入手可能
である。例えば、米国、メリーランド州20852 、ロック
ビル、パークローンドライブ12301 、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur
e Collection）にＡＴＣＣ受託番号ＶＲ 733の名称で寄
託されている。同様に、プラスミドpBR 322 は公けに容
易に入手でき、これもＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ受託番号31
344 の名称で寄託されている。ＡＴＣＣは、特にヨーロ
ッパ特許条約への履行規則(Implementing Regulation）
の要求に従って、これらの培養株を保持するように要求
されている。また本明細書中でＡＴＣＣ受託番号で示し
た残りの培養株も寄託されている。
のＤＮＡは、構造がＨＳＶ−１と本質的に同じであり、
塩基対のヌクレオチドマッチング（matching) のみが異
なる。従って、ＨＳＶ−１ゲノムを用いて本明細書中で
示したＤＮＡ構造物と同じＤＮＡ構造物が本発明によっ
て実行可能である。ＨＳＶ−１は公けに容易に入手可能
である。例えば、米国、メリーランド州20852 、ロック
ビル、パークローンドライブ12301 、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション（American Type Cultur
e Collection）にＡＴＣＣ受託番号ＶＲ 733の名称で寄
託されている。同様に、プラスミドpBR 322 は公けに容
易に入手でき、これもＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ受託番号31
344 の名称で寄託されている。ＡＴＣＣは、特にヨーロ
ッパ特許条約への履行規則(Implementing Regulation）
の要求に従って、これらの培養株を保持するように要求
されている。また本明細書中でＡＴＣＣ受託番号で示し
た残りの培養株も寄託されている。
【００４９】本明細書中で示した残りのものも公けに入
手可能である。例えば、制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、エキソヌクレアーゼBal 31、制限酵素リンカーは
米国マサチュセッツ州ケンブリッジ市のニュー・イング
ランド・バイオラブズ(New England Biolabs）から購入
し、メーカーの指示通りに使用した。所望の組換えプラ
スミドのための大腸菌(E. coli）コロニーのスクリーニ
ングのためのＤＮＡプローブは、米国マサチュセッツ州
ケンブリッジ市のニュー・イングランド・ヌクレア(New
England Nuclear）から得た〔γ−P32 〕−ＡＴＰによ
るニックトランスレーションによってラベルした。
手可能である。例えば、制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラ
ーゼ、エキソヌクレアーゼBal 31、制限酵素リンカーは
米国マサチュセッツ州ケンブリッジ市のニュー・イング
ランド・バイオラブズ(New England Biolabs）から購入
し、メーカーの指示通りに使用した。所望の組換えプラ
スミドのための大腸菌(E. coli）コロニーのスクリーニ
ングのためのＤＮＡプローブは、米国マサチュセッツ州
ケンブリッジ市のニュー・イングランド・ヌクレア(New
England Nuclear）から得た〔γ−P32 〕−ＡＴＰによ
るニックトランスレーションによってラベルした。
【００５０】ＨＳＶ−１の株〔ＨＳＶ−１（Ｆ）〕及び
本明細書中で誘導された全ての組換え体は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）から得たベロ(Vero)又はHEp −２
細胞系で増殖及び力価測定を行った。ウィルスＤＮＡと
のトランスフェクションに用いたうさぎ皮膚細胞並びに
ＴＫ−組換え体の選択に用いたヒトＴＫ−細胞系も公け
に入手可能である。以上の詳細な説明は本発明の理解を
容易にするためにのみ記載したものであり、本発明の範
囲内での変更は当業者には明らかであるので、これらの
説明は何ら不必要な限定を意味するものではない。
本明細書中で誘導された全ての組換え体は、アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type
Culture Collection）から得たベロ(Vero)又はHEp −２
細胞系で増殖及び力価測定を行った。ウィルスＤＮＡと
のトランスフェクションに用いたうさぎ皮膚細胞並びに
ＴＫ−組換え体の選択に用いたヒトＴＫ−細胞系も公け
に入手可能である。以上の詳細な説明は本発明の理解を
容易にするためにのみ記載したものであり、本発明の範
囲内での変更は当業者には明らかであるので、これらの
説明は何ら不必要な限定を意味するものではない。
【図１】図１は、β−ＴＫプロモーター調節肝炎Ｂ型表
面抗原遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製
の概略を示すフローシートである。
面抗原遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製
の概略を示すフローシートである。
【図２】図２は、図１のウィルスで感染された細胞中に
おける精製発現HBsAg の塩化セシウム勾配中の浮遊密度
を示すグラフである。
おける精製発現HBsAg の塩化セシウム勾配中の浮遊密度
を示すグラフである。
【図３】図３は、図１のウィルスで感染された細胞から
得られた精製発現HBsAg である生物の形態を示す電子顕
微鏡写真である。
得られた精製発現HBsAg である生物の形態を示す電子顕
微鏡写真である。
【図４】図４は、キメリックαＩＣＰ４−HBsAg 遺伝子
を含む組換えプラスミドの作製の概略を示すフローシー
トである。
を含む組換えプラスミドの作製の概略を示すフローシー
トである。
【図５】図５は、図４のプラスミドと無傷のウィルスＤ
ＮＡとのコトランスフェクション及びαＩＣＰ４−HBsA
g 遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選択を示
すフローシートである。
ＮＡとのコトランスフェクション及びαＩＣＰ４−HBsA
g 遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選択を示
すフローシートである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，49（３）（1984) Ｐ．857−864 ＣＥＬＬ，33（1983）Ｐ．145−151 ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，２ （３）（1982）Ｐ．233−240 ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ．，78（３）（1981）Ｐ. 1441−1445 ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ．，79（1982）Ｐ．4917− 4921 ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ Ｉ．ＵＳＡ．，77（７）（1980）Ｐ. 4201−4205
Claims (12)
- 【請求項１】 所望の蛋白質を取得する方法であって、
以下の工程： （１）単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）のウィルスゲノ
ム中の非必須的領域に永久的に組込まれた前記所望の蛋
白質をコードする発現可能な非単純ヘルペスウィルスヌ
クレオチド配列を含むプラスミドベクターを調製し、 （２）前記プラスミドベクターを、無傷の単純ヘルペス
ウィルスＤＮＡとコトランスフェクションして、ウィル
ス子孫を生産し、 （３）前記非単純ヘルペスウィルス配列を含有する子孫
をスクリーニング及び単離して、組換えウィルスを取得
し、そして （４）適当な宿主を前記組換えウィルスで感染させ、次
いで前記感染細胞を培養し、もって前記蛋白質を産生さ
せる、 ことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記蛋白質を回収し、精製する工程を更
に含有する請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記非必須的領域及び前記配列を、前記
ゲノムにおける選択マーカーを使用して選択し、前記ス
クリーニング工程（３）を、前記マーカーの存在又は不
存在について選択することによって行う請求項１記載の
方法。 - 【請求項４】 前記マーカーが、前記ゲノムのチミジン
キナーゼ遺伝子である請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 前記単純ヘルペスウィルスが、ＨＳＶ−
１である請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記単純ヘルペスウィルスが、ＨＳＶ−
２である請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 前記配列が、各端部において、適当な転
写終結信号と、単純ヘルペスウィルスのアルファ遺伝子
プロモーターを含有するプロモーター調節領域と、によ
ってフランキングされている請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記プロモーター調節領域が、感染細胞
蛋白質のアルファ遺伝子プロモーターを含む請求項６記
載の方法。 - 【請求項９】 前記プロモーター調節領域が、感染細胞
蛋白質Ｎｏ．４遺伝子のアルファ遺伝子プロモーターを
含む請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】 前記配列が、各端部において、適当な
転写終結信号と、単純ヘルペスウィルスのベータ遺伝子
プロモーターを含有するプロモーター調節領域と、によ
ってフランキングされている請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 前記ベータ遺伝子プロモーターが、前
記チミジンキナーゼ遺伝子のプロモーターである請求項
１０記載の方法。 - 【請求項１２】 前記配列が、肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢ
ｓＡｇ）に対する構造コード配列を含む請求項１記載の
方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61693084A | 1984-06-04 | 1984-06-04 | |
| US616930 | 1984-06-04 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118664A Division JP2664892B2 (ja) | 1984-06-04 | 1985-05-31 | ベクターとしての単純ヘルペスウイルス |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181780A JPH06181780A (ja) | 1994-07-05 |
| JP2641688B2 true JP2641688B2 (ja) | 1997-08-20 |
Family
ID=24471577
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118664A Expired - Lifetime JP2664892B2 (ja) | 1984-06-04 | 1985-05-31 | ベクターとしての単純ヘルペスウイルス |
| JP5174769A Expired - Lifetime JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118664A Expired - Lifetime JP2664892B2 (ja) | 1984-06-04 | 1985-05-31 | ベクターとしての単純ヘルペスウイルス |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5599691A (ja) |
| EP (1) | EP0176170B1 (ja) |
| JP (2) | JP2664892B2 (ja) |
| AT (1) | ATE79649T1 (ja) |
| CA (1) | CA1282721C (ja) |
| DE (1) | DE3586520T2 (ja) |
Families Citing this family (59)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1282721C (en) * | 1984-06-04 | 1991-04-09 | Bernard Roizman | Herpes simplex virus as a vector |
| US4859587A (en) * | 1984-06-04 | 1989-08-22 | Institut Merieux | Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods |
| US5763269A (en) * | 1985-09-06 | 1998-06-09 | Syntro Corporation | Recombinant infectious bovine rhinotrocheitis virus |
| SE8505027D0 (sv) * | 1985-10-24 | 1985-10-24 | Kabigen Ab | A lytic virulent phage, a hostcell containing same and a process for protein production |
| WO1987004463A1 (en) * | 1986-01-27 | 1987-07-30 | Syntro Corporation | Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same |
| NZ220645A (en) * | 1986-06-20 | 1989-10-27 | Merck & Co Inc | Modified varicella-zoster virus and its cultivation |
| FR2601689B1 (fr) * | 1986-07-17 | 1992-10-16 | Syntro Corp | Herpes virus attenues, herpes virus qui renferment de l'adn etranger codant pour une sequence d'amino-acides, et vaccins les contenant |
| US5866136A (en) * | 1986-08-01 | 1999-02-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Organisation | Recombinant vaccine |
| EP0275300B1 (en) * | 1986-08-01 | 1996-01-03 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Recombinant vaccine |
| FR2602790B1 (fr) * | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
| EP0277773A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Hybrid cytomegalovirus (CMV) and vaccine |
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| EP0326127A3 (en) * | 1988-01-26 | 1990-03-28 | Novagene, Inc. | Infectious bovine rhinotracheitis virus insertion mutants, vaccins containing same, and methods for the production and use of same |
| GB8918616D0 (en) * | 1989-08-15 | 1989-09-27 | Univ Glasgow | Herpes simplex virus type 1 mutant |
| US5849571A (en) * | 1990-10-10 | 1998-12-15 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Latency active herpes virus promoters and their use |
| US5849572A (en) * | 1990-10-10 | 1998-12-15 | Regents Of The University Of Michigan | HSV-1 vector containing a lat promoter |
| EP0675962B1 (en) * | 1992-12-23 | 2003-02-05 | Arch Development Corporation | Synthetic herpes simplex virus promoters |
| EP0701563A4 (en) * | 1993-03-08 | 1997-07-02 | Univ Pittsburgh | GENE TRANSFER FOR THE TREATMENT OF CONNECTIVE TISSUES IN A HOST MAMMAL |
| WO1996038546A1 (en) * | 1995-06-01 | 1996-12-05 | Merck & Co., Inc. | Herpes simplex type 1 protease mutants and vectors |
| US6344445B1 (en) | 1995-10-19 | 2002-02-05 | Cantab Pharmaceutical Research Limited | Herpes virus vectors and their uses |
| US6544523B1 (en) | 1996-11-13 | 2003-04-08 | Chiron Corporation | Mutant forms of Fas ligand and uses thereof |
| ATE476508T1 (de) | 1997-11-06 | 2010-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Neisseriale antigene |
| US6914131B1 (en) | 1998-10-09 | 2005-07-05 | Chiron S.R.L. | Neisserial antigens |
| EP2210945B1 (en) | 1998-01-14 | 2013-06-26 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neisseria meningitidis antigens |
| NZ508366A (en) | 1998-05-01 | 2004-03-26 | Chiron Corp | Neisseria meningitidis antigens and compositions |
| US6783972B1 (en) | 1998-09-22 | 2004-08-31 | University Of Florida Research Foundation | Methods for large-scale production of recombinant AAV vectors |
| US6774119B1 (en) | 1999-04-26 | 2004-08-10 | Cedars-Sinai Medical Center | Herpes simplex virus type 1 (hsv-1)-derived vector for selectively inhibiting malignant cells and methods for its use to treat cancers and to express desired traits in malignant and non-malignant mammalian cells |
| US7368261B1 (en) | 1999-04-30 | 2008-05-06 | Novartis Vaccines And Diagnostics Srl | Conserved Neisserial antigens |
| GB9911683D0 (en) | 1999-05-19 | 1999-07-21 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| US6764675B1 (en) * | 1999-06-08 | 2004-07-20 | The Uab Research Foundation | Herpes simplex virus expressing foreign genes and method for treating cancers therewith |
| GB9916529D0 (en) | 1999-07-14 | 1999-09-15 | Chiron Spa | Antigenic peptides |
| MXPA02004283A (es) | 1999-10-29 | 2002-10-17 | Chiron Spa | Peptidos antigenicos neisseriales. |
| DK1248647T3 (da) | 2000-01-17 | 2010-09-27 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Ydre membranvesikel (OMV) vaccine omfattende N. meningitidis serogruppe B ydre membranproteiner |
| KR100847385B1 (ko) * | 2000-02-02 | 2008-07-18 | 안제스에무지 가부시키가이샤 | 유전자 전달을 위한 바이러스 엔벨로프 벡터 |
| CN1800385B (zh) | 2000-02-28 | 2010-06-02 | 启龙有限公司 | 奈瑟球菌蛋白质的异源表达 |
| EP1950297A2 (en) | 2000-05-31 | 2008-07-30 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Compositions and methods for treating neoplastic disease using chemotherapy and radiation sensitizers |
| MXPA03003690A (es) | 2000-10-27 | 2004-05-05 | Chiron Spa | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
| US7060442B2 (en) * | 2000-10-30 | 2006-06-13 | Regents Of The University Of Michigan | Modulators on Nod2 signaling |
| CA2430341A1 (en) | 2000-11-28 | 2002-06-06 | The University Of Chicago | Genetically engineered herpes virus for the treatment of cardiovascular disease |
| GB0107661D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Staphylococcus aureus |
| GB0107658D0 (en) | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Chiron Spa | Streptococcus pneumoniae |
| NZ562929A (en) | 2001-12-12 | 2009-07-31 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunisation against chlamydia trachomatis |
| AU2003282691A1 (en) * | 2002-10-07 | 2004-05-04 | University Of Chicago | Targeting of herpes simplex virus to specific receptors |
| US20070243170A1 (en) * | 2002-10-07 | 2007-10-18 | The University Of Chicago | Targeting of Herpes Simplex Virus to Specific Receptors |
| US8927251B2 (en) | 2002-10-07 | 2015-01-06 | The University Of Chicago | Targeting of herpes simplex virus to specific receptors |
| US7550148B2 (en) * | 2002-10-07 | 2009-06-23 | The University Of Chicago | Targeting of Herpes simplex virus to specific receptors |
| US20070059329A1 (en) | 2002-11-15 | 2007-03-15 | Nathalie Norais | Unexpected surface proteins in meningococcus |
| GB0308198D0 (en) | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Chiron Srl | ADP-ribosylating bacterial toxin |
| US8268324B2 (en) | 2004-03-29 | 2012-09-18 | Galpharma Co., Ltd. | Modified galectin 9 proteins and use thereof |
| WO2006002394A2 (en) | 2004-06-24 | 2006-01-05 | New York University | Avirulent oncolytic herpes simplex virus strains engineered to counter the innate host response |
| US20080089910A1 (en) * | 2004-06-29 | 2008-04-17 | Visalli Et Al | Attenuated Herpes Simplex Virus Type-2, Vectors Thereof and Immunogenic Compositions Thereof |
| SG10201912554TA (en) | 2005-03-23 | 2020-02-27 | Genmab As | Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma |
| EP2054431B1 (en) | 2006-06-09 | 2011-08-31 | Novartis AG | Conformers of bacterial adhesins |
| EP2612868B1 (en) | 2007-11-01 | 2018-08-15 | Astellas Pharma Inc. | Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids |
| ES2667622T3 (es) | 2008-05-29 | 2018-05-11 | Alma Mater Studiorum - Università di Bologna | Virus del herpes simple (VHS) con tropismo modificado, utilizaciones y procedimiento de preparación del mismo |
| SG11201805835WA (en) | 2016-01-08 | 2018-08-30 | Replimune Ltd | Modified oncolytic virus |
| US10350542B2 (en) | 2016-04-29 | 2019-07-16 | General Electric Company | Wet flue gas desulfurization system with zero waste water liquid discharge |
| EP3652309A4 (en) * | 2017-07-13 | 2021-04-28 | University of Miami | PAIN MANAGEMENT METHOD |
| WO2023012385A1 (es) | 2021-08-06 | 2023-02-09 | Nabrawind Technologies, S.L. | Transicion de laminados de material compuesto para pala modular |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4769331A (en) * | 1981-09-16 | 1988-09-06 | University Patents, Inc. | Recombinant methods and materials |
| EP0074808A3 (en) | 1981-09-16 | 1984-07-04 | University Patents, Inc. | Recombinant method and materials |
| US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
| AU570940B2 (en) * | 1982-11-30 | 1988-03-31 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Process for producing poxvirus recombinants for expression offoreign genes |
| US5288641A (en) * | 1984-06-04 | 1994-02-22 | Arch Development Corporation | Herpes Simplex virus as a vector |
| CA1282721C (en) * | 1984-06-04 | 1991-04-09 | Bernard Roizman | Herpes simplex virus as a vector |
-
1985
- 1985-05-28 CA CA000482524A patent/CA1282721C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-30 AT AT85303791T patent/ATE79649T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-05-30 EP EP85303791A patent/EP0176170B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-30 DE DE8585303791T patent/DE3586520T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-31 JP JP60118664A patent/JP2664892B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-06-22 JP JP5174769A patent/JP2641688B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-11 US US08/419,831 patent/US5599691A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-01-31 US US08/791,852 patent/US5846707A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-12-04 US US09/205,162 patent/US6071692A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ＣＥＬＬ，３３（１９８３）Ｐ．１４５−１５１ |
| Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，４９（３）（１９８４）Ｐ．８５７−８６４ |
| ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，２（３）（１９８２）Ｐ．２３３−２４０ |
| ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ．，７７（７）（１９８０）Ｐ．４２０１−４２０５ |
| ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ．，７８（３）（１９８１）Ｐ．１４４１−１４４５ |
| ＰＲＯ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ．，７９（１９８２）Ｐ．４９１７−４９２１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3586520D1 (de) | 1992-09-24 |
| DE3586520T2 (de) | 1993-01-07 |
| US5846707A (en) | 1998-12-08 |
| EP0176170B1 (en) | 1992-08-19 |
| US6071692A (en) | 2000-06-06 |
| JPH06181780A (ja) | 1994-07-05 |
| JP2664892B2 (ja) | 1997-10-22 |
| US5599691A (en) | 1997-02-04 |
| JPS611390A (ja) | 1986-01-07 |
| ATE79649T1 (de) | 1992-09-15 |
| CA1282721C (en) | 1991-04-09 |
| EP0176170A1 (en) | 1986-04-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2641688B2 (ja) | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 | |
| US5288641A (en) | Herpes Simplex virus as a vector | |
| Weiher et al. | Multiple point mutations affecting the simian virus 40 enhancer | |
| Shih et al. | Expression of hepatitis B virus S gene by herpes simplex virus type 1 vectors carrying alpha-and beta-regulated gene chimeras. | |
| Rooney et al. | The spliced BZLF1 gene of Epstein-Barr virus (EBV) transactivates an early EBV promoter and induces the virus productive cycle | |
| Roizman et al. | Genetic engineering of novel genomes of large DNA viruses | |
| US5879934A (en) | Herpes simplex virus strains for gene transfer | |
| DeLuca et al. | Temperature-sensitive mutants in herpes simplex virus type 1 ICP4 permissive for early gene expression | |
| Geballe et al. | Regulation of cytomegalovirus late gene expression: gamma genes are controlled by posttranscriptional events | |
| McCarthy et al. | Herpes simplex virus type 1 ICP27 deletion mutants exhibit altered patterns of transcription and are DNA deficient | |
| Harrison et al. | Sequence requirements of the Epstein-Barr virus latent origin of DNA replication | |
| Lagunoff et al. | The regulation of synthesis and properties of the protein product of open reading frame P of the herpes simplex virus 1 genome | |
| Peeters et al. | Glycoprotein H of pseudorabies virus is essential for entry and cell-to-cell spread of the virus | |
| Nagaike et al. | Cloning of the varicella-zoster virus genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli | |
| Nasseri et al. | The cleavage recognition signal is contained within sequences surrounding an aa junction in herpes simplex virus DNA | |
| Berkner et al. | Abundant expression of polyomavirus middle T antigen and dihydrofolate reductase in an adenovirus recombinant | |
| Kibler et al. | Regulation of herpes simplex virus true late gene expression: sequences downstream from the US11 TATA box inhibit expression from an unreplicated template | |
| Brough et al. | Construction, characterization, and utilization of cell lines which inducibly express the adenovirus DNA-binding protein | |
| Arsenakis et al. | Construction and properties of a cell line constitutively expressing the herpes simplex virus glycoprotein B dependent on functional alpha 4 protein synthesis | |
| Watanabe et al. | Roles of Epstein-Barr virus BGLF3. 5 gene and two upstream open reading frames in lytic viral replication in HEK293 cells | |
| Jenson et al. | Palindromic structure and polypeptide expression of 36 kilobase pairs of heterogeneous Epstein-Barr virus (P3HR-1) DNA | |
| Baines et al. | The cDNA of UL15, a highly conserved herpes simplex virus 1 gene, effectively replaces the two exons of the wild-type virus | |
| Smith et al. | Transdominant inhibition of herpes simplex virus growth in transgenic mice | |
| EP0675962B1 (en) | Synthetic herpes simplex virus promoters | |
| Smith et al. | Mutants defective in herpes simplex virus type 2 ICP4: isolation and preliminary characterization |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |