JPS611390A - ベクターとしての単純ヘルペスウイルス - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は表現ベクターに関し、特に、本発明は異種遺伝
子の表現のためのベクターとしてのウィルスのゲノムに
関する。
子の表現のためのベクターとしてのウィルスのゲノムに
関する。
先′テＩ事の１車な親日
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶＨＳ Ｖ）のようなある
種のウィルスによる感受性細胞の感染は、例えば、典型
的に宿主蛋白質合成の停止をもたらず。この停止は２段
階で起こる。初期段階は恐らくウィルスの構造蛋白によ
ってひき起こされ、遺伝研究はこの活性がウィルス増殖
のために木質的でないことを示している。第２の不可逆
的抑制は、ウィルス遺伝子生産物の表現の結果としてウ
ィルス生殖サイクル中に起こる。アクチノマイシンＤに
よる化学的除核またはシトコラシンＢの助けによる物理
的除核に基づく有効データは、抑制が少なくとも部分的
に翻訳レベルに於けるものであることを暗示している。
種のウィルスによる感受性細胞の感染は、例えば、典型
的に宿主蛋白質合成の停止をもたらず。この停止は２段
階で起こる。初期段階は恐らくウィルスの構造蛋白によ
ってひき起こされ、遺伝研究はこの活性がウィルス増殖
のために木質的でないことを示している。第２の不可逆
的抑制は、ウィルス遺伝子生産物の表現の結果としてウ
ィルス生殖サイクル中に起こる。アクチノマイシンＤに
よる化学的除核またはシトコラシンＢの助けによる物理
的除核に基づく有効データは、抑制が少なくとも部分的
に翻訳レベルに於けるものであることを暗示している。
単純ヘルペスウィルス１型（ＨＳＶ−１）は、ある種の
宿主遺伝子、および特に例えば、ウィルス調節領域の制
御下に置かれかつトランスフェクシヨンによって細胞中
へ導入された卵白アルブミンのような異種遺伝子を誘発
することが従来知られているが、その表現は選択的であ
りかつ一時的である。以前には、野性型ウィルスの抑制
機構がウィルスのゲノム中に導入された異種遺伝子の持
続した表現を許さないだろうと信じられていた。
宿主遺伝子、および特に例えば、ウィルス調節領域の制
御下に置かれかつトランスフェクシヨンによって細胞中
へ導入された卵白アルブミンのような異種遺伝子を誘発
することが従来知られているが、その表現は選択的であ
りかつ一時的である。以前には、野性型ウィルスの抑制
機構がウィルスのゲノム中に導入された異種遺伝子の持
続した表現を許さないだろうと信じられていた。
鬼里皇叉約
、 本発明によると、ウィルスのゲノムのプロモーター
調節領域の制御下に異種遺伝子がウィルスのゲノム中に
挿入され、かくしてウィルスのゲノムが感染細胞中に於
ける異種遺伝子の表現のためのベクターとなる。
調節領域の制御下に異種遺伝子がウィルスのゲノム中に
挿入され、かくしてウィルスのゲノムが感染細胞中に於
ける異種遺伝子の表現のためのベクターとなる。
かくして、ウィルスのゲノムは、ウィルスのゲノムと一
緒に該遺伝子の連続的増殖のためおよび宿主染色体によ
って指令される蛋白質合成の停止にも拘らず適当な宿主
中に於ける異種遺伝子の持続的表現のために有用になる
ように遺伝手術される。
緒に該遺伝子の連続的増殖のためおよび宿主染色体によ
って指令される蛋白質合成の停止にも拘らず適当な宿主
中に於ける異種遺伝子の持続的表現のために有用になる
ように遺伝手術される。
本発明は、肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢｓＡｇ ）の表現の
ためのベクターとしてのＦｆＳＶ−１の使用によって例
示される。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、その表現を可能にしか
つ調節するために、ＨＳ Ｖ遺伝子プロモーター調節領
域の制御下に置かれる。この構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ ）を、次に、ウィルスのゲノムのチミジンキナーゼ
（Ｔ Ｋ）遺伝子中へ挿入する。さらに、ＴＫ遺伝子中
に於て欠失を作って該遺伝子を不活化させる。得られた
ＤＮＡ構造物を適当なＨＳＶ−１株の無傷のＤＮＡとコ
トランスフェクションさせ、ＴＫ子孫を選択する。かか
る子孫は、欠失とＨＢｓＡｇ挿入との両方を含む組換え
体を含むことが見いだされている。かかる組換え体の培
養は持続した時間にわたって）ＩＢＳＡＪ！を有効に生
産することが見いだされている。
ためのベクターとしてのＦｆＳＶ−１の使用によって例
示される。ＨＢｓＡｇ遺伝子は、その表現を可能にしか
つ調節するために、ＨＳ Ｖ遺伝子プロモーター調節領
域の制御下に置かれる。この構造物（ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔ ）を、次に、ウィルスのゲノムのチミジンキナーゼ
（Ｔ Ｋ）遺伝子中へ挿入する。さらに、ＴＫ遺伝子中
に於て欠失を作って該遺伝子を不活化させる。得られた
ＤＮＡ構造物を適当なＨＳＶ−１株の無傷のＤＮＡとコ
トランスフェクションさせ、ＴＫ子孫を選択する。かか
る子孫は、欠失とＨＢｓＡｇ挿入との両方を含む組換え
体を含むことが見いだされている。かかる組換え体の培
養は持続した時間にわたって）ＩＢＳＡＪ！を有効に生
産することが見いだされている。
本発明によれば、ＤＮＡ構造物、異種遺伝子の表現ため
に有用な該ＤＮＡ構造物含有ウィルスベクター、かかる
構造物およびベクターの調製方法、ベクターを用いる表
現方法ならびに特異的なプラスミドおよび組換えウィル
スが捷供される。
に有用な該ＤＮＡ構造物含有ウィルスベクター、かかる
構造物およびベクターの調製方法、ベクターを用いる表
現方法ならびに特異的なプラスミドおよび組換えウィル
スが捷供される。
本発明は、特異的に形質転換された遺伝子を前辺て選択
することなしに大規模細胞培養に射て異種遺伝子の同時
導入および同調表現を可能にする。
することなしに大規模細胞培養に射て異種遺伝子の同時
導入および同調表現を可能にする。
本発明は、通常表現されにくい遺伝子および危険である
かまたは培養できない生物の表現を可能にする。
かまたは培養できない生物の表現を可能にする。
本発明の他の目的ならびに利益は、添付図面ならびに特
許請求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことにより
、当業者には明らかになるであろう。
許請求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことにより
、当業者には明らかになるであろう。
単純ヘルペスウィルスＣＨＳ Ｖ）を本発明によってベ
クターへ転換するには、そのＤＮＡ中へ適当なウィルス
プロモーターに連鎖された異種遺伝子を組換えれば十分
である。異種遺伝子は、それ自身の転写終結−ポリ−ア
デニル化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ−ｐｏｌｙ−ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を
有さねばならないかあるいは新規のかかる信号が与えら
れなければならない。
クターへ転換するには、そのＤＮＡ中へ適当なウィルス
プロモーターに連鎖された異種遺伝子を組換えれば十分
である。異種遺伝子は、それ自身の転写終結−ポリ−ア
デニル化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ−ｐｏｌｙ−ａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）信号を
有さねばならないかあるいは新規のかかる信号が与えら
れなければならない。
異種遺伝子は完全暗号配列を含まねばならない。
異種遺伝子が転写終結信号を越えて終結する場合および
転写終結信号から下流にもう１つのプロモーターが存在
する場合には、ＨＳＶのＴＫ遺伝子の構造配列は、ＴＫ
遺伝子がそのプロモーターから表現され得ないように変
更されねばならない。
転写終結信号から下流にもう１つのプロモーターが存在
する場合には、ＨＳＶのＴＫ遺伝子の構造配列は、ＴＫ
遺伝子がそのプロモーターから表現され得ないように変
更されねばならない。
異種遺伝子をウィルス中へ組換えるためには、それによ
って遺伝子が所望の位置で組換わる相同フランキング（
ｆｌａｎｋｉｎｇ ）配列と所望の組換え体を選択する
ためのシステムとを有することが必要である。この場合
には、フランキング（ｆｌａｎｋｔｎｇ ）配列はウィ
ルスＴＫ遺伝子の領域の部分からなりかつ、不活性ＴＫ
遺伝子の選択が行われつ＼あるので、ＴＫ遺伝子によっ
て特異的にまたは主として燐酸化される任意のヌクレオ
チド同族体（例えば薬剤）を組換え体ＴＫウィルスの選
択に用いることができる。
って遺伝子が所望の位置で組換わる相同フランキング（
ｆｌａｎｋｉｎｇ ）配列と所望の組換え体を選択する
ためのシステムとを有することが必要である。この場合
には、フランキング（ｆｌａｎｋｔｎｇ ）配列はウィ
ルスＴＫ遺伝子の領域の部分からなりかつ、不活性ＴＫ
遺伝子の選択が行われつ＼あるので、ＴＫ遺伝子によっ
て特異的にまたは主として燐酸化される任意のヌクレオ
チド同族体（例えば薬剤）を組換え体ＴＫウィルスの選
択に用いることができる。
１（ＳＶの場合には、ＴＫ遺伝子は〜非常に低い頻度で
起こる組換え体の選択を許すので、異種遺伝子の挿入の
ための高度に望ましい位置である。
起こる組換え体の選択を許すので、異種遺伝子の挿入の
ための高度に望ましい位置である。
また、ＨＳＶゲノム内のＴＫ遺伝子の位置は、異種遺伝
子の挿入前に（既知の方法で）変えることができる。
子の挿入前に（既知の方法で）変えることができる。
しかし、異種遺伝子の挿入はＴＫ遺伝子に於てなされる
必要はなく、挿入は任意の有効な非致死部位に於てなさ
れることができかつＨ３■ゲノム中の別の選択マーカー
の使用によって選択され得る。
必要はなく、挿入は任意の有効な非致死部位に於てなさ
れることができかつＨ３■ゲノム中の別の選択マーカー
の使用によって選択され得る。
ＨＳＶ遺伝子は、α、β、Ｔと称せられる３主要群を形
成し、その表現は対等に調節されかつカスケード形式で
連続的に整理される。はとんどのα遺伝子および一部分
のβ遺伝子では、プロモーターおよび調節領域が転写開
始部位から上流にあることが知られている。特に、α遺
伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ＩＣＰ）Ｎｏｓ−０，４
，２７または２２を指定する遺伝子〕のプロモーター調
節領域の、他の遺伝子の５′転写非暗号および暗号配列
への融合によって作られるキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ）遺伝子はそれぞれα遺伝子またはβ遺伝子とじて調
節される。
成し、その表現は対等に調節されかつカスケード形式で
連続的に整理される。はとんどのα遺伝子および一部分
のβ遺伝子では、プロモーターおよび調節領域が転写開
始部位から上流にあることが知られている。特に、α遺
伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ＩＣＰ）Ｎｏｓ−０，４
，２７または２２を指定する遺伝子〕のプロモーター調
節領域の、他の遺伝子の５′転写非暗号および暗号配列
への融合によって作られるキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉ
ｃ）遺伝子はそれぞれα遺伝子またはβ遺伝子とじて調
節される。
従って、本発明によれば、■端にウィルス遺伝子のプロ
モーター調節Ｍ域がありかつ他端に適当な転写終結信号
があるその完全な構造配列を含む異種遺伝子が）ＩＳＶ
ゲノム中へ永久的に組込まれるＤＮＡ構造物が調製され
る。
モーター調節Ｍ域がありかつ他端に適当な転写終結信号
があるその完全な構造配列を含む異種遺伝子が）ＩＳＶ
ゲノム中へ永久的に組込まれるＤＮＡ構造物が調製され
る。
かかる構造物は、ウィルスのゲノム中に於て異種遺伝子
を永続化させる能力および組換えウィルスのゲノムを担
持するウィルスで感染された細胞中に於て異種遺伝子を
表現する能力を有する。
を永続化させる能力および組換えウィルスのゲノムを担
持するウィルスで感染された細胞中に於て異種遺伝子を
表現する能力を有する。
本発Ｈの典型的な 施の腹壁
α−及びβ−調節ＨＢｓＡｇを担持するＪ（Ｓ Ｖ −
１ヘクターの゛伝手術 本発明の典型的な実施の態様に於て、１ＩＢｓＡε指定
遺伝子の５′転写非暗号領域の構造配列および２５塩基
対を、ＨＢｓＡｇ遺伝子の５′転写非暗号および暗号ｆ
ｌＩ域のＨＳＶ−１遺伝子のそれぞれのプロモーター調
節領域への融合によってＨＳＶ−１ゲノムのウィルスチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の１ｃＰ４のαプロモー
ターまたはβプロモーターの制御下に置く。このキメリ
ンク（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ）構造物を、次に、フランキ
ング（ｆｌａ１１□ｋｉｎｇ）’配列による相同組換え
によってＴＫＫ伝子の５′転写非暗号領域中へ挿入する
。キメリック（ｃｈ ｉ■ｅｒｉｃ）遺伝子を担持する
組換え体で感染された細胞は、少なくとも１２時間、細
胞外媒質中へＨＢｓＡＨを生産し、排出することが見い
だされる。
１ヘクターの゛伝手術 本発明の典型的な実施の態様に於て、１ＩＢｓＡε指定
遺伝子の５′転写非暗号領域の構造配列および２５塩基
対を、ＨＢｓＡｇ遺伝子の５′転写非暗号および暗号ｆ
ｌＩ域のＨＳＶ−１遺伝子のそれぞれのプロモーター調
節領域への融合によってＨＳＶ−１ゲノムのウィルスチ
ミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子の１ｃＰ４のαプロモー
ターまたはβプロモーターの制御下に置く。このキメリ
ンク（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ）構造物を、次に、フランキ
ング（ｆｌａ１１□ｋｉｎｇ）’配列による相同組換え
によってＴＫＫ伝子の５′転写非暗号領域中へ挿入する
。キメリック（ｃｈ ｉ■ｅｒｉｃ）遺伝子を担持する
組換え体で感染された細胞は、少なくとも１２時間、細
胞外媒質中へＨＢｓＡＨを生産し、排出することが見い
だされる。
表現の一時的なパターンとα−プロモーター調節Ｈ域へ
連鎖したＨＢｓＡｇがα遺伝子として調節されるという
観察とは、ウィルス中へ挿入されたＨＢｓＡｇ遺伝子キ
メラがウィルス遺伝子として調節されることを示す。
連鎖したＨＢｓＡｇがα遺伝子として調節されるという
観察とは、ウィルス中へ挿入されたＨＢｓＡｇ遺伝子キ
メラがウィルス遺伝子として調節されることを示す。
ＨＳＶ−１のＴＫＫ伝子のヌクレオチド配列は公表され
ている。ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ ）ら、Ｐｒｏｃ−Ｊ
ｌｌａむ１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、 Ｖｏｌ−７８，１４４１−１４４５ページ（
１９８１）およびマンフナイト（ＭｃＫｎｔｇｈｔ ）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５−、 Ｖ
ｏｌ−８，５９４９−５９６４ページ（１９８０）を参
照されたい。ＴＫＫ伝子のｔ！Ｗ域内の単一のＢｇｌ
…部位は、ＴＫＫ伝子の５′転写の但し翻訳されていな
いｖ４ｊｊ！内にある。この部位における欠失は該部位
から上流に位置する領域のプロモーター機能に影響を与
えない。
ている。ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ ）ら、Ｐｒｏｃ−Ｊ
ｌｌａむ１． Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ
、 Ｖｏｌ−７８，１４４１−１４４５ページ（
１９８１）およびマンフナイト（ＭｃＫｎｔｇｈｔ ）
、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５−、 Ｖ
ｏｌ−８，５９４９−５９６４ページ（１９８０）を参
照されたい。ＴＫＫ伝子のｔ！Ｗ域内の単一のＢｇｌ
…部位は、ＴＫＫ伝子の５′転写の但し翻訳されていな
いｖ４ｊｊ！内にある。この部位における欠失は該部位
から上流に位置する領域のプロモーター機能に影響を与
えない。
本発明によるＨＳＶ−１ゲノム中への異種遺伝子の挿入
およびＨＳＶ−ＩＴＫ遺伝子の一部分の欠失のために有
用な適当な方法は、モカルスキー（Ｍｏｃａｒｓｋｉ
）ら、丸Ａｙ （Ｃｅ１ｌ ） 、Ｖｏｌ２２ 。
およびＨＳＶ−ＩＴＫ遺伝子の一部分の欠失のために有
用な適当な方法は、モカルスキー（Ｍｏｃａｒｓｋｉ
）ら、丸Ａｙ （Ｃｅ１ｌ ） 、Ｖｏｌ２２ 。
２４３−２５５ページ（１９８０）、ポスト（Ｐｏｓｔ
）ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 Ｖｏｌ。
）ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、 Ｖｏｌ。
７７、階７．４２０１−４２０５ページ（１９８０）
；ポスト（Ｐｏ５ｔ ） ら、旦（（：ａｌｌ ）
、Ｖｏｌ２４．５５５−５６５ページ（１９−８１）；
ポスト（Ｐｏ５ｔ ）ら、（！／ｌ／ （Ｃｅ１ｌ ）
、Ｖｏｌ、 ２５．２２７−２３２ページ（１９８１
）、ならびにヨーロッパ特許公告第７４．８０８号（１
９８３年３月２３日）に記載されている。上記刊行物の
記載は参照文として本明細書に含まれるものとする。
；ポスト（Ｐｏ５ｔ ） ら、旦（（：ａｌｌ ）
、Ｖｏｌ２４．５５５−５６５ページ（１９−８１）；
ポスト（Ｐｏ５ｔ ）ら、（！／ｌ／ （Ｃｅ１ｌ ）
、Ｖｏｌ、 ２５．２２７−２３２ページ（１９８１
）、ならびにヨーロッパ特許公告第７４．８０８号（１
９８３年３月２３日）に記載されている。上記刊行物の
記載は参照文として本明細書に含まれるものとする。
特に、βＴＫ調節ｕＢｓＡｇおよびαＩＣＰ４調節−’
ＨＢｓＡｇの両方をＴＫＫ伝子の５′転写非暗号
領域を中断する該遺伝子のＢ、ｌ Ｉｔ部部位へ挿入す
る。
ＨＢｓＡｇの両方をＴＫＫ伝子の５′転写非暗号
領域を中断する該遺伝子のＢ、ｌ Ｉｔ部部位へ挿入す
る。
このキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ）断片を、次に、
無傷のＨＳＶ ＤＮＡとコトランスフェクションし、
フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ ）配列による相同組
換えによって生産されたＨＢｓＡｇ担持ＴＫ−［換え体
を、ＴＫ＋ウィルス子孫を不活化するＢｕＤＲの存在下
に於てｔｋ−細胞ついて平板培養することによって選択
する。
無傷のＨＳＶ ＤＮＡとコトランスフェクションし、
フランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ ）配列による相同組
換えによって生産されたＨＢｓＡｇ担持ＴＫ−［換え体
を、ＴＫ＋ウィルス子孫を不活化するＢｕＤＲの存在下
に於てｔｋ−細胞ついて平板培養することによって選択
する。
ＨＢｓＡｇ遺伝子担持ＤＮＡ断片は、該遺伝子に対する
その末端３′に於て、ＴＫプロモーターの代わりになり
かつＴＫ十裏表現型保持するプロモーターを含むように
思われるので、該遺伝子の暗号配列内のＳａｃ １部位
に於ける小欠失によってキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ
）構造物中のＴＫＫ伝子を不活化することが必要であ
る。
その末端３′に於て、ＴＫプロモーターの代わりになり
かつＴＫ十裏表現型保持するプロモーターを含むように
思われるので、該遺伝子の暗号配列内のＳａｃ １部位
に於ける小欠失によってキメリック（ｃｈｉｍｅｒｉｃ
）構造物中のＴＫＫ伝子を不活化することが必要であ
る。
この方法は、β−プロモーター調節ＨＢｓＡｇを含む）
（ＳＶの作製を可能にするが、以下これを詳述する。
（ＳＶの作製を可能にするが、以下これを詳述する。
さらに−α−調節ＨＢｓＡｇの表現をβ−調節ｌｌＢｓ
Ａｇ組換えウィルスの表現と区別するため、ＨＳＶ−１
のα４遺伝子のプロモーター調節領域のｕＢａＡｇ遺伝
子含有ＤＮ断片への結合を含む作製を行った。
Ａｇ組換えウィルスの表現と区別するため、ＨＳＶ−１
のα４遺伝子のプロモーター調節領域のｕＢａＡｇ遺伝
子含有ＤＮ断片への結合を含む作製を行った。
このキメリンク（ｃｈｔｍｅｒｉｃ ）遺伝子をＴＫ遺
伝子のＢｇｌ １１部位中にクローニングし、コトラン
スフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ）に
よって無傷のウィルスＤＮＡと組換えて組換えウィルス
を生産させた。この詳細および結果を以下詳しく示す。
伝子のＢｇｌ １１部位中にクローニングし、コトラン
スフェクション（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ）に
よって無傷のウィルスＤＮＡと組換えて組換えウィルス
を生産させた。この詳細および結果を以下詳しく示す。
次に、第１図−第５図を参照しながら、肝炎置型表面抗
原（ＨＢｓＡｇ ）のための挿入暗号配列を含む２種の
組換え単純ヘルペスウィルスの作製および該ウィルスか
らのこの蛋白質の表現を詳細に説明する。
原（ＨＢｓＡｇ ）のための挿入暗号配列を含む２種の
組換え単純ヘルペスウィルスの作製および該ウィルスか
らのこの蛋白質の表現を詳細に説明する。
キメリックβ−ＴＫプロモーター調節ＨＢｓＡｇを含む
ＨＳ Ｖ−１組換え体の作製お呵び膚−塊一一−ＨＳＶ
−１株Ｆ （ＨＳＶ−１（Ｆ））（ＡＴＣＣ受託番号Ｎ
ｏ、ＶＲ７３３）のＲａｗ＋１０断片を担−持するプラ
スミドｐＲＢＩ ０３ （ＡＴＣＣ受託番号隘３９７１
Ｂ＞から、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼ消化により、
特異的なＳａｃ １部位に於て約２００個の塩基対を除
去してＴＫ遺伝子を不活化することによってプラスミド
ｐＲＢ３２２２を作製した。
ＨＳ Ｖ−１組換え体の作製お呵び膚−塊一一−ＨＳＶ
−１株Ｆ （ＨＳＶ−１（Ｆ））（ＡＴＣＣ受託番号Ｎ
ｏ、ＶＲ７３３）のＲａｗ＋１０断片を担−持するプラ
スミドｐＲＢＩ ０３ （ＡＴＣＣ受託番号隘３９７１
Ｂ＞から、Ｂａ１３１エキソヌクレアーゼ消化により、
特異的なＳａｃ １部位に於て約２００個の塩基対を除
去してＴＫ遺伝子を不活化することによってプラスミド
ｐＲＢ３２２２を作製した。
この作製に於ては１、ｌｌＢｓＡｇのための開始コドン
がＸｈｏ １部位から２５塩基対下流にかつＴＫ遺伝子
のプロモーター領域に近接して置かれる。従って、β−
調節遺伝子は、βＴＫ遺伝子から誘導される転写開始部
位から約８０塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（
下記）中の）ｔＢｓＡｇのための開始コドンは、αＩＣ
Ｐ４遺伝子から誘導される転写開始コドンから約６０塩
基対であった。
がＸｈｏ １部位から２５塩基対下流にかつＴＫ遺伝子
のプロモーター領域に近接して置かれる。従って、β−
調節遺伝子は、βＴＫ遺伝子から誘導される転写開始部
位から約８０塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（
下記）中の）ｔＢｓＡｇのための開始コドンは、αＩＣ
Ｐ４遺伝子から誘導される転写開始コドンから約６０塩
基対であった。
プラスミドｐｃＰ１０ （ＡＴＣＣ受託番号嵐３９７１
７）のＤＮＡをＸｂｏ ＩおよびＢｇｌ Ｉｔで開裂し
、得られた消化物を５％ポリアクリルアミドゲル中で電
気泳動にかけた。Ｘｈｏ Ｉ −Ｂｇｌ Ｉｔ断片（約
１．７ ｋｂ、 ＨＢｓＡｇのための暗号配列を含んで
いる）を、次に、ポリアクリルアミドゲルから精製し、
ＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填
し、Ｂｇｌ Ｉｔリンカ−に結合させ、Ｂｇｌ Ｉｔで
開裂しかつｐＪｉＢ３２２２のＢｇｌ Ｉ［部位中にク
ローニングした。
７）のＤＮＡをＸｂｏ ＩおよびＢｇｌ Ｉｔで開裂し
、得られた消化物を５％ポリアクリルアミドゲル中で電
気泳動にかけた。Ｘｈｏ Ｉ −Ｂｇｌ Ｉｔ断片（約
１．７ ｋｂ、 ＨＢｓＡｇのための暗号配列を含んで
いる）を、次に、ポリアクリルアミドゲルから精製し、
ＤＮＡ断片の末端をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで充填
し、Ｂｇｌ Ｉｔリンカ−に結合させ、Ｂｇｌ Ｉｔで
開裂しかつｐＪｉＢ３２２２のＢｇｌ Ｉ［部位中にク
ローニングした。
ＴＫプロモーター調節領域に対する正しい転写配向くＢ
ａｌｌ１旧ＤＮＡ制限パターンから決定される）でＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含むここに得られたプラスミドを本明細
書中ではｐＲＢ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号１１ｋＬ３
９７１６）と称する。
ａｌｌ１旧ＤＮＡ制限パターンから決定される）でＨＢ
ｓＡｇ遺伝子を含むここに得られたプラスミドを本明細
書中ではｐＲＢ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号１１ｋＬ３
９７１６）と称する。
組換えプラスミドｐＲＢ３２２３をｐｖｕ ＴＩで直線
化し、このプラスミド（Ｌ ｌ −０，５μｇを、次に
、うさぎ皮膚細胞中へ０．５μｇのＨＳＶ−１（Ｆ）Ｄ
ＮＡとコトランスフェクションし、得られた組換えウィ
ルスのプラーク精製をルイエチセン（、Ｒｕｙｅｃｈａ
ｎ ）ら、Ｊ、 Ｖｊｒｏｊ、、 ￥ｏ１． ２９．６
７７−６９７ページぐ１９７９）の記載のようにして行
った。得られたＴＫ−組換えウィルスを、次に、チミン
欠損混合物１９９ （ｍ１ｘｔｕｒｅ １９９ ｌａｃ
ｋｉｎｇｔｂｆｉｎｅ ）を含むが３％の子牛血清と４
０μｇ／ｍ １２ ＢｕｌｌＲ（ブロモウラシルデオキ
シリボシド）を補充した培地の存在下で１４３ｔｋ−細
胞系について選択した。
化し、このプラスミド（Ｌ ｌ −０，５μｇを、次に
、うさぎ皮膚細胞中へ０．５μｇのＨＳＶ−１（Ｆ）Ｄ
ＮＡとコトランスフェクションし、得られた組換えウィ
ルスのプラーク精製をルイエチセン（、Ｒｕｙｅｃｈａ
ｎ ）ら、Ｊ、 Ｖｊｒｏｊ、、 ￥ｏ１． ２９．６
７７−６９７ページぐ１９７９）の記載のようにして行
った。得られたＴＫ−組換えウィルスを、次に、チミン
欠損混合物１９９ （ｍ１ｘｔｕｒｅ １９９ ｌａｃ
ｋｉｎｇｔｂｆｉｎｅ ）を含むが３％の子牛血清と４
０μｇ／ｍ １２ ＢｕｌｌＲ（ブロモウラシルデオキ
シリボシド）を補充した培地の存在下で１４３ｔｋ−細
胞系について選択した。
予想通り、得られたＴＫ−子孫は〜Ｓａｃ １部位に
於ける欠失のみを組換えた組換え体［３２２２と称す）
と、該欠失とＨＢｓＡｇ遺伝子挿入の両方を組換えたも
う１つの組換え体とを含んでいた。後者の組換え体をＲ
３２２３（ＡＴＣＣ受託番号旭ＶＲ２０８６＞と称す。
於ける欠失のみを組換えた組換え体［３２２２と称す）
と、該欠失とＨＢｓＡｇ遺伝子挿入の両方を組換えたも
う１つの組換え体とを含んでいた。後者の組換え体をＲ
３２２３（ＡＴＣＣ受託番号旭ＶＲ２０８６＞と称す。
組換えウィルスＤＮＡをＥｃｏ Ｒ１ｔ！１＠Ｉ−ンド
ヌクレアーゼで消化することによって、組換えウィルス
Ｒ３２２３をＲ３２２２から区別した。これらのウィル
スのそれぞれのＤＮＡ組織をサザーンブロフト（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ ｂＪｏｔ ）分析によってさらに確認した
。
ヌクレアーゼで消化することによって、組換えウィルス
Ｒ３２２３をＲ３２２２から区別した。これらのウィル
スのそれぞれのＤＮＡ組織をサザーンブロフト（５ｏｕ
ｔｈｅｒｎ ｂＪｏｔ ）分析によってさらに確認した
。
下記第１表および第２図は、組換えウィルスＲ３２２３
！こよるｔｌＢｓＡｇの表面および排出を示す。
！こよるｔｌＢｓＡｇの表面および排出を示す。
２５ａｉ＋フラスコ中でベロー（Ｖｅｒｏ ）細胞をＲ
３２２３（２ρｆｕ／細胞）に１時間暴露した後、１％
子牛血清を補充した維持混合物１９９から培地中で３７
℃に於て培養した。第１表中に示した時間に於て、１つ
のフラスコ中の維持借地５ｍｌを取り、細胞を、毎回燐
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（０，１５ＭＮａＣ７！、８
．２ ｍ Ｍ ＮａＪＰＯａ、１．５ ｍ Ｍ ＫＨ２
ＰＯ，，２，５ｍＭ ＸＣｅ）５ｍｊ！ずつで３回洗浄
し、１ｍ７！のＰＢＳ中に採り、３回凍結−融解し、エ
ソペントルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ）ミクロ遠心機で
遠心した。
３２２３（２ρｆｕ／細胞）に１時間暴露した後、１％
子牛血清を補充した維持混合物１９９から培地中で３７
℃に於て培養した。第１表中に示した時間に於て、１つ
のフラスコ中の維持借地５ｍｌを取り、細胞を、毎回燐
酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）（０，１５ＭＮａＣ７！、８
．２ ｍ Ｍ ＮａＪＰＯａ、１．５ ｍ Ｍ ＫＨ２
ＰＯ，，２，５ｍＭ ＸＣｅ）５ｍｊ！ずつで３回洗浄
し、１ｍ７！のＰＢＳ中に採り、３回凍結−融解し、エ
ソペントルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ）ミクロ遠心機で
遠心した。
細胞溶解質を含む上澄液を、次に、ＰＢＳで容量５ｍｊ
ｌ！にした。２００μｌの培地と感染細胞とを含む部分
を、次に、商標アウスザイム（ＡＵＳＺＹＭＥ）■で発
売されているアボット・ラボラトリーズ−エリザ診断用
キット（Ｔｈｅ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓＥＬＩＳＡ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ ）で
、メーカーが推奨する方法により、下記のようにしてＨ
ＢｓＡＨの存在を検定した。
ｌ！にした。２００μｌの培地と感染細胞とを含む部分
を、次に、商標アウスザイム（ＡＵＳＺＹＭＥ）■で発
売されているアボット・ラボラトリーズ−エリザ診断用
キット（Ｔｈｅ Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓＥＬＩＳＡ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｋｉｔ ）で
、メーカーが推奨する方法により、下記のようにしてＨ
ＢｓＡＨの存在を検定した。
紺換え体および親ウィルス（ＨＳＶ−１ＣＦ））感染細
胞からの細胞外培地および溶解質をＨＲｓＡｇに対する
モルモット抗体を塗布したビーズと混合した。培養後、
ｌ（ＢｓＡｇに対するペルオキシダーゼ−共役抗体と反
応させた。ＨＢｓＡｇの存在は、４９２ｎｍに於て分光
光度計で測定された。
胞からの細胞外培地および溶解質をＨＲｓＡｇに対する
モルモット抗体を塗布したビーズと混合した。培養後、
ｌ（ＢｓＡｇに対するペルオキシダーゼ−共役抗体と反
応させた。ＨＢｓＡｇの存在は、４９２ｎｍに於て分光
光度計で測定された。
第１表かられかるように、感染後５時間のような早期に
、ＨＢｓＡｇが感染細胞溶解質中に検出されたが、培地
中には検出されなかった。感染後８時間では、感染細胞
溶解質中および細胞外培地中の両方にＨＢｓＡｇが検出
された。感染後１２時間では、細胞外培地から多量のＨ
ＢｓＡｇが回収された。しかし、感染細胞中のＨＢｓＡ
Ｈ量は感染後のより早期に検出された量とほぼ同じであ
った。
、ＨＢｓＡｇが感染細胞溶解質中に検出されたが、培地
中には検出されなかった。感染後８時間では、感染細胞
溶解質中および細胞外培地中の両方にＨＢｓＡｇが検出
された。感染後１２時間では、細胞外培地から多量のＨ
ＢｓＡｇが回収された。しかし、感染細胞中のＨＢｓＡ
Ｈ量は感染後のより早期に検出された量とほぼ同じであ
った。
感染細胞中に蓄積されるｔｌＢｓＡｇ量は、感染後８時
間またはそれ以前に於て、ＨＳＶ−１（Ｆ）感染細胞の
溶解質および培地で得られるバンクグラウンド値より約
１５倍高いピーク値に達し、それ以後はあまり増加しな
かった。細胞外培地中に検出されるＨＢｓＡｇＯ量は時
間と共に増加し、ＨＢｓＡｇが排出されて感染細胞の外
部に蓄積されることを示しているゎα−調節ＨＢｓＡｇ
とβ−調節ＨＢｓＡｇとの蓄積のパターンは類似してお
り、α−調節ＴＫ遺伝子およびβ−調節ＴＫ遺伝子を担
持するウィルスによって表現されるこれら遺伝子の蓄積
の速度論も頻ｉしているという観察と一致している。
間またはそれ以前に於て、ＨＳＶ−１（Ｆ）感染細胞の
溶解質および培地で得られるバンクグラウンド値より約
１５倍高いピーク値に達し、それ以後はあまり増加しな
かった。細胞外培地中に検出されるＨＢｓＡｇＯ量は時
間と共に増加し、ＨＢｓＡｇが排出されて感染細胞の外
部に蓄積されることを示しているゎα−調節ＨＢｓＡｇ
とβ−調節ＨＢｓＡｇとの蓄積のパターンは類似してお
り、α−調節ＴＫ遺伝子およびβ−調節ＴＫ遺伝子を担
持するウィルスによって表現されるこれら遺伝子の蓄積
の速度論も頻ｉしているという観察と一致している。
ＨＢｓＡｇは、野性型［ＨＳＶ−１（Ｆ））ウィルス感
染細胞中または細胞外培地中には検出されなかった。ｔ
ｌＢｓＡｇ遺伝子を担持するワクチニアウィルスで感染
された細胞中でもＨＢｓＡｇが排出されるという観察が
示された。
染細胞中または細胞外培地中には検出されなかった。ｔ
ｌＢｓＡｇ遺伝子を担持するワクチニアウィルスで感染
された細胞中でもＨＢｓＡｇが排出されるという観察が
示された。
第２図は、上記のようにして得られた排出ＨＢｓＡｇを
特徴づけるために行った研究の結果を示す６文ロー（Ｖ
ｅｒｏ）細胞を、Ｒ３２２３により、２ｐｆｕ／細胞で
感染させた６感染後１２時間に於て、維持培地９ ｍ
ｌを採り、ベックマン５Ｗ４１０−ター（Ｂｅｃｋ＋＋
ａｎ ５Ｗ４１ ｒｏｔｏｒ）で、４℃に於て２０時間
、３６．０００μｌｍで遠心した。得られたベレットを
同培地０．５ ｍ Ｉｔ中に懸濁した後、２００μｋを
、１１−１−５ｇ／ｍｌｌの同密度ＣｓＣｌ密度勾配の
上に重層し、ベックマン５Ｗ４１０−ターで、２５１１
こ於て、３６時間、３６． ００ Ｏｒｐｍで遠心した
。遠心分離管の底部から分１％（０，５ｍＪ）を集め、
ＰＢＳで１−１０に希釈した。各分画を、第１表に関し
て上で詳述したようにして１ｌＢｓＡＨの存在を分析し
た。
特徴づけるために行った研究の結果を示す６文ロー（Ｖ
ｅｒｏ）細胞を、Ｒ３２２３により、２ｐｆｕ／細胞で
感染させた６感染後１２時間に於て、維持培地９ ｍ
ｌを採り、ベックマン５Ｗ４１０−ター（Ｂｅｃｋ＋＋
ａｎ ５Ｗ４１ ｒｏｔｏｒ）で、４℃に於て２０時間
、３６．０００μｌｍで遠心した。得られたベレットを
同培地０．５ ｍ Ｉｔ中に懸濁した後、２００μｋを
、１１−１−５ｇ／ｍｌｌの同密度ＣｓＣｌ密度勾配の
上に重層し、ベックマン５Ｗ４１０−ターで、２５１１
こ於て、３６時間、３６． ００ Ｏｒｐｍで遠心した
。遠心分離管の底部から分１％（０，５ｍＪ）を集め、
ＰＢＳで１−１０に希釈した。各分画を、第１表に関し
て上で詳述したようにして１ｌＢｓＡＨの存在を分析し
た。
第２図かられかるように、密度１．１７ｇ／−の所にＨ
ＢｓＡｇが集まった。血清中で、ＨＢｓＡｇは１８〜２
５ｎ＋＊の直径を有する球形粒子を形成することが知ら
れている（ゾーン（Ｄａｎｅ）ら、ランセント（Ｌａｎ
ｃｅｔ）、Ｖｏｌ、１．６９５ページ、１９７０）。
ＢｓＡｇが集まった。血清中で、ＨＢｓＡｇは１８〜２
５ｎ＋＊の直径を有する球形粒子を形成することが知ら
れている（ゾーン（Ｄａｎｅ）ら、ランセント（Ｌａｎ
ｃｅｔ）、Ｖｏｌ、１．６９５ページ、１９７０）。
第３図かられかるように〜寸法がゾーン（Ｄａｎ’ｅ）
粒子に似ている（すなわち１８−２５ｎＩ！り粒子がピ
ーク分画の電子顕微鏡検査で検出（２％燐タングステン
酸で負に染色）され、かくして排出ＨＢｓＡｇの特性を
確認した。
粒子に似ている（すなわち１８−２５ｎＩ！り粒子がピ
ーク分画の電子顕微鏡検査で検出（２％燐タングステン
酸で負に染色）され、かくして排出ＨＢｓＡｇの特性を
確認した。
次に、ＨＢｓＡｇのだめの暗号配列を担持する組換えＨ
ＳＶ−１ウイルスプラスミドの調製およびその蛋白質を
表現するためのベクターとしての該プラスミドの有効な
使用について詳述する。第１図〜第３図の作製に於て、
ｕＢｓＡｇ断片をウィルスのβプロモーター領域の制御
下に置いた。
ＳＶ−１ウイルスプラスミドの調製およびその蛋白質を
表現するためのベクターとしての該プラスミドの有効な
使用について詳述する。第１図〜第３図の作製に於て、
ｕＢｓＡｇ断片をウィルスのβプロモーター領域の制御
下に置いた。
αＩ ＣＰ ４−ＨＢｓＡｇ遺伝子を含むＨＳ Ｖ −
１組換え体の作製および人災−−−−−−−以下、組換
えＨＳＶ−１プラスミド−と、それぞれがαプロモータ
ーの制御下にあるＨＢｓＡｇ暗号配列および遺伝子を担
持する組換えウィルスとの作製を説明する。
１組換え体の作製および人災−−−−−−−以下、組換
えＨＳＶ−１プラスミド−と、それぞれがαプロモータ
ーの制御下にあるＨＢｓＡｇ暗号配列および遺伝子を担
持する組換えウィルスとの作製を説明する。
第４図は〜キメリック（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ） αＴ Ｃ
Ｐ ４−ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウ
ィルスの作製を示す。この作製は、ＨＳ Ｖ −１のα
４遺伝子のプロモーター調節傾城の、上記ＨＢｓＡｇ遺
伝子含有ＤＮＡ断片への結合を含む。特に、ｐｌ？Ｂ１
０３からのＨＳＶ−１（Ｆ）ＴＫ遺伝子を含むＢａｗ＋
ＨＩ Ｑ 断片をプラスミドｐＲ３１４のＸｈｏ
１部位中へ挿入する。プラスミドｐＲＢは、ｐＲＢ３２
２（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、３１３４４）から、米国マ
サチューセノツ州ケンブリッジ市のニュー・イングラン
ド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ｏｂｓ）から得たＸｈｏ Ｉ リンカ−によるＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｖｕ Ｉｔ断片の置換によって作製されたもの
である。
Ｐ ４−ＨＢｓＡｇ遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウ
ィルスの作製を示す。この作製は、ＨＳ Ｖ −１のα
４遺伝子のプロモーター調節傾城の、上記ＨＢｓＡｇ遺
伝子含有ＤＮＡ断片への結合を含む。特に、ｐｌ？Ｂ１
０３からのＨＳＶ−１（Ｆ）ＴＫ遺伝子を含むＢａｗ＋
ＨＩ Ｑ 断片をプラスミドｐＲ３１４のＸｈｏ
１部位中へ挿入する。プラスミドｐＲＢは、ｐＲＢ３２
２（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、３１３４４）から、米国マ
サチューセノツ州ケンブリッジ市のニュー・イングラン
ド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ
ｏｂｓ）から得たＸｈｏ Ｉ リンカ−によるＥｃｏ
ＲＩ−Ｐｖｕ Ｉｔ断片の置換によって作製されたもの
である。
得られた組換えプラスミドを本明細書中ではｐＲＢ３１
４８と称す。次に、）ＩｓＶ−１（Ｆ）Ｂａｍ ＩＩ
Ｑ の唯一のＢｇｌ １１部位中へｐＵＣ１３からの
旧ｎｄ Ｉ［ｌ −’ｄｅａ ｍ９片（ポリリンカー
を含む）を、Ｒａｍ旧部位はＴＫ遺伝子の構造配列に最
近接するが、Ｓａｌ １部位は該遺伝子の転写開始部
位に最近接するようにクローニングすることによってプ
ラスミドｐＲＢ３１５９を作製した。プラスミドｐＵｃ
１３をポリリンカーを含む適当な断片源として選んだが
、他の適当なポリリンカーが市販されている。
４８と称す。次に、）ＩｓＶ−１（Ｆ）Ｂａｍ ＩＩ
Ｑ の唯一のＢｇｌ １１部位中へｐＵＣ１３からの
旧ｎｄ Ｉ［ｌ −’ｄｅａ ｍ９片（ポリリンカー
を含む）を、Ｒａｍ旧部位はＴＫ遺伝子の構造配列に最
近接するが、Ｓａｌ １部位は該遺伝子の転写開始部
位に最近接するようにクローニングすることによってプ
ラスミドｐＲＢ３１５９を作製した。プラスミドｐＵｃ
１３をポリリンカーを含む適当な断片源として選んだが
、他の適当なポリリンカーが市販されている。
ｐＲＢ ３ ］、 ５９から、Ｓａｃ Ｉによる消化お
よび再結合によるＢａｎ ［Ｑ のＢａｌ ＩＴ −
３ａｃ Ｉ断片を含ムＳａｃ Ｉの欠失によってプ
ラスミドｐＲＢ３１６６を作製した。
よび再結合によるＢａｎ ［Ｑ のＢａｌ ＩＴ −
３ａｃ Ｉ断片を含ムＳａｃ Ｉの欠失によってプ
ラスミドｐＲＢ３１６６を作製した。
最終工程では、ｐＲＢ３１６６中の２個の断片をクロー
ニングしてプラスミドｐＲＢ３２２５を得た。
ニングしてプラスミドｐＲＢ３２２５を得た。
最初に、αＴＣＰ４遺伝子のプロモーター−一調節領域
を含むｐＲＢ ４０３ （ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ。
を含むｐＲＢ ４０３ （ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ。
３９７１９）からのＢａ哨旧−ＰνｕＩＩ断片をポリリ
ンカー配列のＳａｃ １部位中へ、Ｂａｍ Ｈｌ−Ｐｖ
ｕ ＩＩ断片中のαＩＣＰ４の転写開始部位がＸｂａ
１部位に近接するようにクローニングした。最後るこ
、ｐＲＲ３２２３からの１１８ ｓ Ａ β遺伝子を含
むＢａｌ Ｔ＋断片を、Ｘｂａ １部位中へ、α１ｃ
Ｐ４プロモーターとＨＢｓＡｇ遺伝子の構造配列とがＥ
ｃｏ Ｒ，Ｉ Ｄ Ｎ Ａ制限エンドヌクレアーゼパタ
ーンから決定される同じ転写配向であるようにクローニ
ングした。かくして、上記方法により、キメリック（Ｃ
ｈｉｎ＋ｅｒｊｃ）遺伝子Ｐ α、 ＨＢｓＡｇ ｆ
Ｊ＜Ｔ Ｋ遺伝子のＲａｌ Ｔ１部位中ヘクローニング
された。
ンカー配列のＳａｃ １部位中へ、Ｂａｍ Ｈｌ−Ｐｖ
ｕ ＩＩ断片中のαＩＣＰ４の転写開始部位がＸｂａ
１部位に近接するようにクローニングした。最後るこ
、ｐＲＲ３２２３からの１１８ ｓ Ａ β遺伝子を含
むＢａｌ Ｔ＋断片を、Ｘｂａ １部位中へ、α１ｃ
Ｐ４プロモーターとＨＢｓＡｇ遺伝子の構造配列とがＥ
ｃｏ Ｒ，Ｉ Ｄ Ｎ Ａ制限エンドヌクレアーゼパタ
ーンから決定される同じ転写配向であるようにクローニ
ングした。かくして、上記方法により、キメリック（Ｃ
ｈｉｎ＋ｅｒｊｃ）遺伝子Ｐ α、 ＨＢｓＡｇ ｆ
Ｊ＜Ｔ Ｋ遺伝子のＲａｌ Ｔ１部位中ヘクローニング
された。
得られた組換えプラスミドＩ）ＩＩＢ ３２２５ ｃＡ
ｔｃｃ受託番号Ｎｏ、３９７１５）を、第１図に関して
上で説明したように１４３ｔｋ−細胞中に於て無傷のＨ
ＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡとコトランスフェクションし、Ｔ
Ｋ遺伝子中にＰｃｍ ｕＢｓＡｇ断片を含む得られた
組換えウィルスＲ３２２５（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、Ｖ
Ｒ２０８７）を、１４３ｔｋ−細胞中でＴＫ−子孫から
選択しかつ以下に示すように１１８ｓＡｇ表現について
検査した。トランスフェクションおよび選択工程は第５
図に略示しである。
ｔｃｃ受託番号Ｎｏ、３９７１５）を、第１図に関して
上で説明したように１４３ｔｋ−細胞中に於て無傷のＨ
ＳＶ−１（Ｆ）ＤＮＡとコトランスフェクションし、Ｔ
Ｋ遺伝子中にＰｃｍ ｕＢｓＡｇ断片を含む得られた
組換えウィルスＲ３２２５（ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、Ｖ
Ｒ２０８７）を、１４３ｔｋ−細胞中でＴＫ−子孫から
選択しかつ以下に示すように１１８ｓＡｇ表現について
検査した。トランスフェクションおよび選択工程は第５
図に略示しである。
α−調節ＨＢｓＡｇ （Ｒ３２２５）の表現をβ−調
節ＨＢｓＡｇ （Ｒ３２２３）組換えウィルスの表現
から区別するため、α遺伝子は新規の蛋白質合成感染後
の不在下で転写されるが、β遺伝子はその表現のために
機能的α遺伝子の存在を必要とするという観察を下記の
方法に従って利用した。
節ＨＢｓＡｇ （Ｒ３２２３）組換えウィルスの表現
から区別するため、α遺伝子は新規の蛋白質合成感染後
の不在下で転写されるが、β遺伝子はその表現のために
機能的α遺伝子の存在を必要とするという観察を下記の
方法に従って利用した。
２５Ｃｉフラスコ中に於て、複製Ｈｅｐ−”細胞培ｉを
、シクロへキシミド（＋シクロ）５μｇ ／ ｍ １含
有維持培地中で、１時間予備培養した後、それぞれ野性
型（ＨＳＶ−１（Ｆ））ウィルスまたはＲ３２２２ウイ
ルスまたはＲ３２２３ウイルスまたはＲ３２２５ウイル
スにより、２０ ／Ｐｆｕ ／細胞で感染させた。感染
後５時間で、シクロヘキシミド含有培地を取り出し、細
胞を十分に洗った後、アクチノマイシンＤ （１０ＩＩ
ｇ／ｍｆ）含有培地中で培養した。９０分の追加培養後
、細胞と培地を採り、アウスサイム■診断用キット（ア
ボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）てｌ（ＢｓＡｇ対照実験（−シクロ）は
、薬品を添加しない以外は同じ洗浄方法を用いて行った
。結果を下記第２表に示す。
、シクロへキシミド（＋シクロ）５μｇ ／ ｍ １含
有維持培地中で、１時間予備培養した後、それぞれ野性
型（ＨＳＶ−１（Ｆ））ウィルスまたはＲ３２２２ウイ
ルスまたはＲ３２２３ウイルスまたはＲ３２２５ウイル
スにより、２０ ／Ｐｆｕ ／細胞で感染させた。感染
後５時間で、シクロヘキシミド含有培地を取り出し、細
胞を十分に洗った後、アクチノマイシンＤ （１０ＩＩ
ｇ／ｍｆ）含有培地中で培養した。９０分の追加培養後
、細胞と培地を採り、アウスサイム■診断用キット（ア
ボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）てｌ（ＢｓＡｇ対照実験（−シクロ）は
、薬品を添加しない以外は同じ洗浄方法を用いて行った
。結果を下記第２表に示す。
上記第２表Ｇこ示すように、感染中および感染後５時間
に培地中に存在する抑制濃度のシクロへキシミドの除去
後、ｌｌＢｓＡｇはＲ３２２５で感染された細胞では作
られたが、Ｒ３２２３で感染された細胞では作られなか
った。
に培地中に存在する抑制濃度のシクロへキシミドの除去
後、ｌｌＢｓＡｇはＲ３２２５で感染された細胞では作
られたが、Ｒ３２２３で感染された細胞では作られなか
った。
ＨＳＶ−１α遺伝子の特徴は、それらが感染中および感
染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写され
たウィルス遺伝子のみであるということである。上記第
２表かられかるように、シクロヘキシミドの存在下で感
染されかつ維持される細胞中ではＲ３２２５中に含まれ
るｌｌＢｓ１１ｇ遺伝子だけが表現され、次に、αＩＣ
Ｐ４遺伝子生成物の合成に依存するβ遺伝子の転写を妨
害するアクチノマイシンＤの存在下に於てシクロヘキシ
ミドの抑制効果から解放される。
染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写され
たウィルス遺伝子のみであるということである。上記第
２表かられかるように、シクロヘキシミドの存在下で感
染されかつ維持される細胞中ではＲ３２２５中に含まれ
るｌｌＢｓ１１ｇ遺伝子だけが表現され、次に、αＩＣ
Ｐ４遺伝子生成物の合成に依存するβ遺伝子の転写を妨
害するアクチノマイシンＤの存在下に於てシクロヘキシ
ミドの抑制効果から解放される。
趙呆Ω考皇
以上のことは、ＨＳＶゲノムが異種遺伝子、特にｔｌＢ
ｓＡｇのための表現ベクターとして作用し得ることを示
している。
ｓＡｇのための表現ベクターとして作用し得ることを示
している。
ＨＳＶは宿主の高分子代謝、特に宿主の蛍白質合成を停
止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつＨＳＶ
プロモーター調節領域によって゛調節される異種遺伝子
（ＨＢｓＡｇで例示される）の表現に悪影響を与えない
。遺伝子生産物の抗原性、ＣｓＣｊ！密度勾配中に於け
るその浮遊密度および帯状化調製物中に存在する特徴的
１８〜２５ｎｓ 粒径は、ＨＳＶが担持するＨＢｓＡ
ｇ遺伝子の生成物が該遺伝子の真の生産物であることを
示す、 ＨＢｓＡｇが感染細胞から排出されるという観
察はへ抗原が細胞から輸出されるために正しく処理され
ることを暗示している。
止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつＨＳＶ
プロモーター調節領域によって゛調節される異種遺伝子
（ＨＢｓＡｇで例示される）の表現に悪影響を与えない
。遺伝子生産物の抗原性、ＣｓＣｊ！密度勾配中に於け
るその浮遊密度および帯状化調製物中に存在する特徴的
１８〜２５ｎｓ 粒径は、ＨＳＶが担持するＨＢｓＡ
ｇ遺伝子の生成物が該遺伝子の真の生産物であることを
示す、 ＨＢｓＡｇが感染細胞から排出されるという観
察はへ抗原が細胞から輸出されるために正しく処理され
ることを暗示している。
ここに示される結果は、αＩＣＰ４連鎖ｌｌＢｓＡｇと
βＴＫ連［ＨＢｓＡｇ遺伝子とが共に少なくとも１２時
間抗原を表現することを示す、 ｔｌＢｓＡＨの合成の
パターンとＩＣＰ４連鎖がα遺伝子として調節されると
いう観察とは、ＨＳＶ−１ベクター中のキメリック（Ｃ
ｂｉｓｅｒｉｃ）ＩＩＢｓＡｇ遺伝子がウィルス遺伝子
として調節されることを示す、ＩＣＰ４遺伝子中のハ突
然変異体のゲノム中へαプロモーター調節領域下で遺伝
子を挿入することによって、かかる突然変異体が非許容
温度で感染されかつ維持される細胞中で連続的にα遺伝
子を表現すると示されているので、ＨＢｓＡｇの生産は
特に高められる。
βＴＫ連［ＨＢｓＡｇ遺伝子とが共に少なくとも１２時
間抗原を表現することを示す、 ｔｌＢｓＡＨの合成の
パターンとＩＣＰ４連鎖がα遺伝子として調節されると
いう観察とは、ＨＳＶ−１ベクター中のキメリック（Ｃ
ｂｉｓｅｒｉｃ）ＩＩＢｓＡｇ遺伝子がウィルス遺伝子
として調節されることを示す、ＩＣＰ４遺伝子中のハ突
然変異体のゲノム中へαプロモーター調節領域下で遺伝
子を挿入することによって、かかる突然変異体が非許容
温度で感染されかつ維持される細胞中で連続的にα遺伝
子を表現すると示されているので、ＨＢｓＡｇの生産は
特に高められる。
異種遺伝子のためのベクターとしてのＨＳＶゲノムの使
用は、ヒト細胞中に於ける生合成およびｆａ）その増殖
が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝炎Ｂ型ウ
ィルス）の遺伝子、（ｈｌヒトに対して特に危険な感染
因子の遺伝子および（Ｃ１培養細胞中で極めて低レベル
で表現されるかまたは全く表現されない細胞遺伝子の生
産物のキャラクタリゼーションのために特に有用である
。ＨＳ Ｖ −１表現ベクトルは、遺伝子調節、特に翻
訳レベルに於ける遺伝子調節の分析に有用である。
用は、ヒト細胞中に於ける生合成およびｆａ）その増殖
が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝炎Ｂ型ウ
ィルス）の遺伝子、（ｈｌヒトに対して特に危険な感染
因子の遺伝子および（Ｃ１培養細胞中で極めて低レベル
で表現されるかまたは全く表現されない細胞遺伝子の生
産物のキャラクタリゼーションのために特に有用である
。ＨＳ Ｖ −１表現ベクトルは、遺伝子調節、特に翻
訳レベルに於ける遺伝子調節の分析に有用である。
ＨＳＶ−ベクターの特別な利点は、これらのウィルスが
非常に広い宿主範囲を有すること、すなわち−・様な方
法で多くの異なる型の細胞の感染が可能だということで
ある。従って、ＨＳ Ｖ −１ヘクター中へ挿入された
異種遺伝子は、培養で容易に連続的に増殖させることが
できかつウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分とし
てパッケージされる。このベクターは、次に、大規模細
胞培養を同調的に感染させるのに用いて、すべての感染
細胞中で異種遺伝子の持続表現を得ることができる。こ
の方法は、細胞とＤＮＡとのトランスフェクションと異
種遺伝子を表現する少数の細胞の選択とに依存する他の
方法よりも非常に有利である。
非常に広い宿主範囲を有すること、すなわち−・様な方
法で多くの異なる型の細胞の感染が可能だということで
ある。従って、ＨＳ Ｖ −１ヘクター中へ挿入された
異種遺伝子は、培養で容易に連続的に増殖させることが
できかつウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分とし
てパッケージされる。このベクターは、次に、大規模細
胞培養を同調的に感染させるのに用いて、すべての感染
細胞中で異種遺伝子の持続表現を得ることができる。こ
の方法は、細胞とＤＮＡとのトランスフェクションと異
種遺伝子を表現する少数の細胞の選択とに依存する他の
方法よりも非常に有利である。
この方法は、異種遺伝子の表現のためのＤＮＡ断片によ
る形質転換に有用でないヒトワクチン生産（例えばＭＲ
（、−５またはＷ１３８）用に認可されたヒト二倍体細
胞株に適用可能である。
る形質転換に有用でないヒトワクチン生産（例えばＭＲ
（、−５またはＷ１３８）用に認可されたヒト二倍体細
胞株に適用可能である。
本明細書中で示した典型的な例に於て、ＨＢｓＡｇ遺伝
子の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中へＨＢｓＡ
ｇを挿入した。以前には、７にｂｐのような多量のＤＮ
Ａが挿入された〔ナイプ（Ｋｎｉｐｅ）ら、Ｐｒｏ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｖａｔ、 ７５．
３８９６ ３９００ベージ、１９７８）が、野生型ＨＳ
Ｖ ＤＮＡの余分の遺伝子生産物担持能力には制限が
あるであろう。
子の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中へＨＢｓＡ
ｇを挿入した。以前には、７にｂｐのような多量のＤＮ
Ａが挿入された〔ナイプ（Ｋｎｉｐｅ）ら、Ｐｒｏ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ、、 Ｖａｔ、 ７５．
３８９６ ３９００ベージ、１９７８）が、野生型ＨＳ
Ｖ ＤＮＡの余分の遺伝子生産物担持能力には制限が
あるであろう。
内部反復配列内に含まれる約１４Ｋｂ、のＤＮＡがそれ
から２ Ｋｂｐ挿入物で置換されている突然変異体ＨＳ
Ｖ−１１ＣＦ）１３５８の作製は既に報告されている〔
ボッフェンバーガー（Ｐｏｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ６、Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ、ｊ、、 Ｖ
ｏｌ、 ８０．２６９０−２６９４ページ、１９８３］
。挿入物を置換しかつゲノＪ１をその既知の最高容量ま
で膨張させることにより、１３５８突然変異体は２３Ｋ
ｂｐのような多量の異種ＤＮＡを担持することができた
。従って、ＨＳＶ−１（Ｆ）１３５８は、免疫予防のた
めの種々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つかの
遺伝子のベクターとしてＩ肋り能力がある。
から２ Ｋｂｐ挿入物で置換されている突然変異体ＨＳ
Ｖ−１１ＣＦ）１３５８の作製は既に報告されている〔
ボッフェンバーガー（Ｐｏｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ６、Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃ、ｊ、、 Ｖ
ｏｌ、 ８０．２６９０−２６９４ページ、１９８３］
。挿入物を置換しかつゲノＪ１をその既知の最高容量ま
で膨張させることにより、１３５８突然変異体は２３Ｋ
ｂｐのような多量の異種ＤＮＡを担持することができた
。従って、ＨＳＶ−１（Ｆ）１３５８は、免疫予防のた
めの種々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つかの
遺伝子のベクターとしてＩ肋り能力がある。
単純ヘルペスウィルス２型（ＨＳＶ−２）のＤＮＡは、
構造がＨＳＶ−１と本質的に同してあり、塩基対のヌク
レオチドマソチンク （ｍａｔｃｈｉｎｇ）のみが異な
る。従って、ＨＳ Ｖ−ｔゲノムを用いて本明細書中で
示したＤＮＡ構造物と同じＤＮＡ構造物が本発明乙こよ
って実行可能である。
構造がＨＳＶ−１と本質的に同してあり、塩基対のヌク
レオチドマソチンク （ｍａｔｃｈｉｎｇ）のみが異な
る。従って、ＨＳ Ｖ−ｔゲノムを用いて本明細書中で
示したＤＮＡ構造物と同じＤＮＡ構造物が本発明乙こよ
って実行可能である。
単にヘルペスウィルス１は公げに容易に入手可能である
。例えば、米国、メリーラント州２０８５２、ロックビ
ル、パークローンドライブ＋２３０１、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１．ｅｃｔｉｏｎ）
にＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、 Ｖ Ｒ７３３の名称で寄託
されている。
。例えば、米国、メリーラント州２０８５２、ロックビ
ル、パークローンドライブ＋２３０１、アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１．ｅｃｔｉｏｎ）
にＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、 Ｖ Ｒ７３３の名称で寄託
されている。
同様に、プラスミｔ”ｐＲＢ ３２２は公けに容易に入
手でき、これもＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、
３１３４４の名称で寄託されている。ＡＴＣＣは、特に
ヨーロッパ特許条約への履行規則（Ｉｍｐｌｅｓｅｎｔ
−４ｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の要求に従って、こ
れらの培養株を保持するように要求されている。また本
明細書中でＡ ”「ＣＣ受託番号で示した残りの培養株
も寄託されている。
手でき、これもＡＴＣＣに、ＡＴＣＣ受託番号Ｎｏ、
３１３４４の名称で寄託されている。ＡＴＣＣは、特に
ヨーロッパ特許条約への履行規則（Ｉｍｐｌｅｓｅｎｔ
−４ｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）の要求に従って、こ
れらの培養株を保持するように要求されている。また本
明細書中でＡ ”「ＣＣ受託番号で示した残りの培養株
も寄託されている。
本明細書中で示した残りのものも公げに入手可能である
。例えば、制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮ八へリメラーゼ、エ
キソヌクレアーゼＢａ１３１．制限酵素リンカ−は米国
マサチュセ・ノツ州ケンブリッジ市のニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）から購入し、メーカーの指示通りに使用した
。所望の組換えプラスミドのだメの大腸菌（Ｅ 、 ｃ
ｏＬＤコロニーのスクリーニングのためのＤＮＡプロー
ブは、米国マサチュセノツ州ケンブリッジ市のニュー・
イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ）から得た〔γ−Ｐ”）−ＡＴＰによるニ
ックトランスレーションによってラベルした。
。例えば、制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ、Ｔ４ ＤＮ八へリメラーゼ、エ
キソヌクレアーゼＢａ１３１．制限酵素リンカ−は米国
マサチュセ・ノツ州ケンブリッジ市のニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）から購入し、メーカーの指示通りに使用した
。所望の組換えプラスミドのだメの大腸菌（Ｅ 、 ｃ
ｏＬＤコロニーのスクリーニングのためのＤＮＡプロー
ブは、米国マサチュセノツ州ケンブリッジ市のニュー・
イングランド・ヌクレア（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎ
ｕｃｌｅａｒ）から得た〔γ−Ｐ”）−ＡＴＰによるニ
ックトランスレーションによってラベルした。
ＨＳＶ−１のＦ株（ＨＳＶ−１（Ｆ））および本明細書
中で誘導されたすべての組換え体は、アメカン・タイプ
−カルチャー・コレクシタン（ｌＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から
得たヘロー（νｅｒａ）またはＩＩＥｐ−２細胞系で増
殖および力価測定を行った。ウィルスＤＮＡとのトラン
スフェクションに用いたうさぎ゛皮膚細胞ならびにＴＫ
−組換え体の選択に用いたヒトｔｋ−細胞系も公けに入
手可能である。
中で誘導されたすべての組換え体は、アメカン・タイプ
−カルチャー・コレクシタン（ｌＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から
得たヘロー（νｅｒａ）またはＩＩＥｐ−２細胞系で増
殖および力価測定を行った。ウィルスＤＮＡとのトラン
スフェクションに用いたうさぎ゛皮膚細胞ならびにＴＫ
−組換え体の選択に用いたヒトｔｋ−細胞系も公けに入
手可能である。
以上の詳細な説明は本発明の理解を容易にするためにの
み記載したものであり、本発明の範囲内での変更は当業
者には明らかであるので、これらの説明は何ら不必要な
限定を意味するものではない。
み記載したものであり、本発明の範囲内での変更は当業
者には明らかであるので、これらの説明は何ら不必要な
限定を意味するものではない。
第１図は、β−ＴＫプロモーター調節肝調節肝炎固型表
面抗原遺伝子組換え単純ヘルペスウイＪレスの作製の概
略を示すフローシートであり、第２図は、第１図のウィ
ルスで感染された細胞中に於ける精製表現ＨＢｓＡｇの
塩化セシウム勾配中の浮遊密度を示すグラフであり、 第３図は、第１図のウィルスで感染された細胞から得ら
れた精製表現ＨＢｓＡｇである生物の形態を示す電子顕
微鏡写真であり、 第４図は、キメリンク（Ｃｈｆｅｒｉｃ）αＩＣＰ４−
１ＢｓＡｇ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製の概略
を示すフローシートであり、 第５図は、第４図のプラスミドと無傷のウィルスＤＮＡ
とのコトランスフェクションおよびαＩ ＣＰ ４−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選
択を示すフローシートである。 ｔ０引崎ンスプーグｈン ＦＩＧ、１ １１’ｌｋ◆号 ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ Ｘｈｏ Ｉ Ｘｈｏ ］［ ＦＩＧ、 ４ ｐＲＢ３２２５＋Ｈ８Ｖ＝−１ プトラｙスブシケ
面抗原遺伝子組換え単純ヘルペスウイＪレスの作製の概
略を示すフローシートであり、第２図は、第１図のウィ
ルスで感染された細胞中に於ける精製表現ＨＢｓＡｇの
塩化セシウム勾配中の浮遊密度を示すグラフであり、 第３図は、第１図のウィルスで感染された細胞から得ら
れた精製表現ＨＢｓＡｇである生物の形態を示す電子顕
微鏡写真であり、 第４図は、キメリンク（Ｃｈｆｅｒｉｃ）αＩＣＰ４−
１ＢｓＡｇ遺伝子を含む組換えプラスミドの作製の概略
を示すフローシートであり、 第５図は、第４図のプラスミドと無傷のウィルスＤＮＡ
とのコトランスフェクションおよびαＩ ＣＰ ４−Ｈ
ＢｓＡｇ遺伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選
択を示すフローシートである。 ｔ０引崎ンスプーグｈン ＦＩＧ、１ １１’ｌｋ◆号 ＦＩＧ、 ２ ＦＩＧ、 ３ Ｘｈｏ Ｉ Ｘｈｏ ］［ ＦＩＧ、 ４ ｐＲＢ３２２５＋Ｈ８Ｖ＝−１ プトラｙスブシケ
Claims (27)
- （１）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスのゲ
ノム中の非致死部位へ永久的に組込まれかつ該ゲノム中
に於ける選択マーカーの使用によって選択される、該ゲ
ノムに対して異種の遺伝子を有する単純ヘルペスウイル
ス（ＨＳＶ）のウイルスのゲノムを含んでなり、かつ該
異種遺伝子が、そのそれぞれの端部に該ウイルスの遺伝
子のプロモーター調節領域と適当な転写終結信号とを有
する完全な構造暗号配列を含む組換えＤＮＡ構造物。 - （２）上記ＨＳＶがＨＳＶ−１である特許請求の範囲第
（１）項記載の構造物。 - （３）上記マーカーが上記ゲノムのチミジンキナーゼ遺
伝子である特許請求の範囲第（２）項記載の構造物。 - （４）上記プロモーター調節領域がアルファプロモータ
ーを含む特許請求の範囲第（３）項記載の構造物。 - （５）上記プロモーター調節領域が感染細胞蛋白質のア
ルファプロモーターを含む特許請求の範囲第（４）項記
載の構造物。 - （６）上記プロモーター調節領域が感染細胞蛋白質Ｎｏ
．４のアルファプロモーターを含む特許請求の範囲第（
５）項記載の構造物。 - （７）上記プロモーター調節領域がベータプロモーター
を含む特許請求の範囲第（３）項記載の構造物。 - （８）上記ベータプロモーターが該チミジンキナーゼ遺
伝子のベータプロモーターである特許請求の範囲第（７
）項記載の構造物。 - （９）上記異種遺伝子が肝炎Ｂ型表面抗原の構造暗号配
列を含む特許請求の範囲第（１）項記載の構造物。 - （１０）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスの
ゲノム中の非致死部位へ永久的に組込まれかつ該ゲノム
中に於ける選択マーカーの使用によって選択される、該
ゲノムに対して異種の遺伝子を有する単純ヘルペスウイ
ルス（ＨＳＶ）のウイルスのゲノムを含み、かつ該異種
遺伝子が、そのそれぞれの端部に該ウイルスの遺伝子の
プロモーター調節領域と適当な転写終結信号とを有する
完全な構造暗号配列を含む組換えＤＮＡ構造物を含有し
ているプラスミドベクター。 - （１１）プラスミドｐＲＢ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ．３９７１６）を含む特許請求の範囲第（１０）項
記載のベクター。 - （１２）プラスミドｐＲＢ３２２５（ＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ．３９７１５）を含む特許請求の範囲第（１０）項
記載のベクター。 - （１３）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイルスの
ゲノム中の非致死部位へ永久的に組込まれかつ該ゲノム
中に於ける選択マーカーの使用によって選択される、該
ゲノムに対して異種の遺伝子を有する単純ヘルペスウイ
ルス（ＨＳＶ）のウイルスのゲノムを含み、かつ該異種
遺伝子が、そのそれぞれの端部に該ウイルスの遺伝子の
プロモーター調節領域と適当な転写終結信号とを有する
完全な構造暗号配列を含む組換えＤＮＡ構造物を含有し
ているプラスミドベクターの、適当な宿主中に於ける無
傷のＨＳＶ ＤＮＡとのコトランスフェクションおよび
得られた子孫からの該マーカー欠損子孫の選択の生産物
を含んでなる組換えウイルス。 - （１４）組換えウイルスＲ３２２３（ＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ．ＶＲ２０８６）を含む特許請求の範囲第（１３）
項記載の組換えウイルス。 - （１５）組換えウイルスＲ３２２５（ＡＴＣＣ受託番号
Ｎｏ．ＶＲ２０８７）を含む特許請求の範囲第（１３）
項記載の組換えウイルス。 - （１６）（ａ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイ
ルスのゲノム中の非致死部位へ永久的に組込まれかつ該
ゲノム中に於ける選択マーカーの使用によって選択され
る、該ゲノムに対して異種の遺伝子を有する単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）のウイルスのゲノムを含み、かつ
該異種遺伝子が、そのそれぞれの端部に該ウイルスの遺
伝子のプロモーター調節領域と適当な転写終結信号とを
有する完全な構造暗号配列を含む組換えＤＮＡ構造物を
含有しているプラスミドベクターを、適当な宿主中に於
いて無傷のＨＳＶ ＤＮＡとコトランスフェクションす
る工程と、 （ｂ）得られた子孫から該ＨＳＶゲノムのゲノム中の該
選択マーカーを欠損する組換えウイルスを選択する工程
と を特徴とする組換えウイルスを得る方法。 - （１７）（ａ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイ
ルスのゲノム中の非致死部位へ永久的に組込まれかつ該
ゲノム中に於ける選択マーカーの使用によって選択され
る、該ゲノムに対して異種の遺伝子を有する単純ヘルペ
スウイルス（ＨＳＶ）のウイルスのゲノムを含み、かつ
該異種遺伝子が、そのそれぞれの端部に該ウイルスの遺
伝子のプロモーター調節領域と適当な転写終結信号とを
有する完全な構造暗号配列を含みかつ該異種遺伝子が蛋
白質の表現のために暗号づけする組換えＤＮＡ構造物を
含むプラスミドベクターを調製する工程と、 （ｂ）該プラスミドベクターを無傷のＨＳＶ ＤＮＡと
コトランスフェクションしてウイルス子孫を生産する工
程と、 （ｃ）該マーカーを欠損する子孫を選択しかつ単離して
組換えウイルスを得る工程と、 （ｄ）適当な宿主を該組換えウイルスで感染させかつ該
感染細胞を培養して蛋白質を生産させる工程と、 を特徴とする所望の蛋白質を得る方法。 - （１８）上記蛋白質を収穫する工程および精製する工程
をも含む特許請求の範囲第（１７）項記載の方法。 - （１９）（ａ）単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のウイ
ルスのゲノムを用意する工程と、 （ｂ）該ゲノム中の該ゲノムの非致死部位へ該ゲノムに
対して異種の遺伝子を永久的に組込みかつ該ゲノム中の
選択マーカーの使用によって選択される工程であって、
該ゲノム中へ組込まれたときの該異種遺伝子が、そのそ
れぞれの端部に、該ウイルスの遺伝子のプロモーター調
節領域と適当な転写終結信号とを有する完全な構造暗号
配列を含んでいる工程と を特徴とする組換えＤＮＡ構造物の調製方法。 - （２０）上記ＨＳＶがＨＳＶ−１である特許請求の範囲
第（１９）項記載の方法。 - （２１）上記マーカーが上記ゲノムのチミジンキナーゼ
遺伝子である特許請求の範囲第（２０）項記載の方法。 - （２２）上記プロモーター調節領域がアルファプロモー
ターを含む特許請求の範囲第（２１）項記載の方法。 - （２３）上記プロモーター調節領域が感染細胞蛋白質の
アルファプロモーターを含む特許請求の範囲第（２２）
項記載の方法。 - （２４）上記プロモーター調節領域が感染細胞蛋白質Ｎ
ｏ．４のアルファプロモーターを含む特許請求の範囲第
（２３）項記載の方法。 - （２５）上記プロモーター調節領域がベータプロモータ
ーを含む特許請求の範囲第（２１）項記載の方法。 - （２６）上記ベータプロモーターが該チミジンキナーゼ
遺伝子のベータプロモーターである特許請求の範囲第（
２５）項記載の方法。 - （２７）上記異種遺伝子が肝炎Ｂ型表面抗原のための構
造暗号配列を含む特許請求の範囲第（１９）項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61693084A | 1984-06-04 | 1984-06-04 | |
| US616930 | 1984-06-04 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5174769A Division JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611390A true JPS611390A (ja) | 1986-01-07 |
| JP2664892B2 JP2664892B2 (ja) | 1997-10-22 |
Family
ID=24471577
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60118664A Expired - Lifetime JP2664892B2 (ja) | 1984-06-04 | 1985-05-31 | ベクターとしての単純ヘルペスウイルス |
| JP5174769A Expired - Lifetime JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5174769A Expired - Lifetime JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5599691A (ja) |
| EP (1) | EP0176170B1 (ja) |
| JP (2) | JP2664892B2 (ja) |
| AT (1) | ATE79649T1 (ja) |
| CA (1) | CA1282721C (ja) |
| DE (1) | DE3586520T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10350542B2 (en) | 2016-04-29 | 2019-07-16 | General Electric Company | Wet flue gas desulfurization system with zero waste water liquid discharge |
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| US5866136A (en) * | 1986-08-01 | 1999-02-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Organisation | Recombinant vaccine |
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