JP2664892B2 - ベクターとしての単純ヘルペスウイルス - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
発明の分野
本発明は発現ベクターに関し、特に、本発明は異種遺
伝子の発現のためのベクターとしてのウイルスのゲノム
に関する。 先行技術の簡単な説明 単純ヘルペスウイルス（HSV）のようなある種のウイ
ルスによる感受性細胞の感染は、例えば、典型的に宿主
蛋白質合成の停止をもたらす。この停止は２段階で起こ
る。初期段階は恐らくウイルスの構造蛋白によってひき
起こされ、遺伝研究はこの活性がウイルス増殖のために
本質的でないことを示している。第２の不可逆的抑制
は、ウイルス遺伝子生産物の発現の結果としてウイルス
生殖サイクル中に起こる。アクチノマイシンＤによる化
学的除核またはシトコラシンＢの助けによる物理的除核
に基づく有効データは、抑制が少なくとも部分的に翻訳
レベルに於けるものであることを暗示している。 単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）は、ある種の
宿主遺伝子、および特に例えば、ウイルス調節領域の制
御下に置かれかつトランスフェクションによって細胞中
へ導入された卵白アルブミンのような異種遺伝子を誘発
することが従来知られているが、その発現は選択的であ
りかつ一時的である。以前には、野生型ウイルスの抑制
機構がウイルスのゲノム中に導入された異種遺伝子の持
続した発現を許さないだろうと信じられていた。 発明の要約 本発明によると、ウイルスのゲノムのプロモーター調
節領域の制御下に異種遺伝子がウイルスのゲノム中に挿
入され、かくしてウイルスのゲノムが感染細胞中に於け
る異種遺伝子の発現のためのベクターとなる。 かくして、ウイルスのゲノムは、ウイルスのゲノムと
一緒に該遺伝子の連続的増殖のためおよび宿主染色体に
よって指令される蛋白質合成の停止にも拘らず適当な宿
主中に於ける異種遺伝子の持続的発現のために有用にな
るように遺伝的に加工される。 本発明は、肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）の発現のため
のベクターとしてのHSV−１の使用によって例示され
る。HBsAg遺伝子は、その発現を可能にしかつ調節する
ために、HSV遺伝子プロモーター調節領域の制御下に置
かれる。この構造物（construct）を、次に、ウイルス
のゲノムのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子中へ挿入す
る。さらにTK遺伝子中に於て欠失を作って該遺伝子を不
活化させる。得られたDNA構造物を適当なHSV−１株の無
傷のDNAとコトランスフェクションさせ、TK子孫を選択
する。かかる子孫は、欠失とHBsAg挿入との両方を含む
組換え体を含むことが見いだされている。かかる組換え
体の培養は持続した時間にわたってHBsAgを有効に生産
することが見いだされている。 本発明によれば、異種遺伝子発現のために有用なウイ
ルスベクターが提供される。 本発明は、特異的に形質転換された遺伝子を前以て選
択することなしに大規模細胞培養に於て異種遺伝子の同
時導入および同調発現を可能にする。本発明は、通常発
現されにくい遺伝子および危険であるかまたは培養でき
ない生物の発現を可能にする。 本発明の他の目的ならびに利益は、添付図面ならびに
特許請求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことによ
り、当業者には明らかになるであろう。 発明の詳細な説明 発明の一般的陳述 単純ヘルペスウイルス（HSV）を本発明によってベク
ターへ転換するには、そのDNA中へ適当なウイルスプロ
モーターに連鎖された異種遺伝子を組換えれば十分であ
る。異種遺伝子は、それ自身の転写終結−ポリ−アデニ
ル化（transcription termination−poly−adenylatio
n）信号を有さねばならないかあるいは新規のかかる信
号が与えられなければならない。 異種遺伝子は完全暗号配列を含まねばならない。異種
遺伝子が転写終結信号を越えて終結する場合および転写
終結信号から下流にもう１つのプロモーターが存在する
場合には、HSVのTK遺伝子の構造配列は、TK遺伝子がそ
のプロモーターから発現され得ないように変更されねば
ならない。 異種遺伝子をウイルス中へ組換えるためには、遺伝子
が所望の位置で組換わる相同フランキング（flanking）
配列と所望の組換え体を選択するためのシステムとを有
することが必要である。この場合には、フランキング
（flanking）配列はウイルスTK遺伝子の領域の部分から
なりかつ、不活性TK遺伝子の選択が行われつゝあるの
で、TK遺伝子によって特異的にまたは主として燐酸化さ
れる任意のヌクレオチド同族体（例えば薬剤）を組換え
体TKウイルスの選択に用いることができる。 HSVの場合には、TK遺伝子は、非常に低い頻度で起こ
る組換え体の選択を許すので、異種遺伝子の挿入のため
の高度に望ましい位置である。また、HSVゲノム内のTK
遺伝子の位置は、異種遺伝子の挿入前に（既知の方法
で）変えることができる。 しかし、異種遺伝子の挿入はTK遺伝子に於てなされる
必要はなく、挿入は任意の有効な非致死部位に於てなさ
れることができかつHSVゲノム中の別の選択マーカーの
使用によって選択され得る。 HSV遺伝子は、α、β、γと称せられる３主要群を形
成し、その発現は対等に調節されかつカスケード形式で
連続的に整理される。ほとんどのα遺伝子および一部分
のβ遺伝子では、プロモーターおよび調節領域が転写開
始部位から上流にあることが知られている。特に、α遺
伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ICP）No.0、４、27また
は22を指定する遺伝子〕のプロモーター調節領域、他の
遺伝子の５′転写非暗号および暗号配列へ融合すること
によって作られるキメリック（chimeric）遺伝子はそれ
ぞれα遺伝子またはβ遺伝子として調節される。 従って、本発明によれば、１端にウイルス遺伝子のプ
ロモーター調節領域がありかつ他端に適当な転写終結信
号があるその完全な構造配列を含む異種遺伝子がHSVゲ
ノム中へ永久的に組込まれるDNA構造物が調製される。 かかる構造物は、ウイルスのゲノム中に於て異種遺伝
子を永続化させる能力および組換えウイルスのゲノムを
担持するウイルスで感染された細胞中に於て異種遺伝子
を発現する能力を有する。 本発明の典型的な実施の態様 α−及びβ−調節HBsAgを担持するHSV−１ベクターの遺
伝子工学 本発明の典型的な実施の態様に於て、HBsAg指定遺伝
子の５′転写非暗号領域の構造配列および25塩基対を、
HBsAg遺伝子の５′転写非暗号および暗号領域のHSV−１
遺伝子のそれぞれのプロモーター調節領域への融合によ
ってHSV−１ゲノムのウイルスチミジンキナーゼ（TK）
遺伝子のICP4のαプロモーターまたはβプロモーターの
制御下に置く。このキメリック（chimeric）構造物を、
次に、フランキング（flanking）配列による相同組換え
によってTK遺伝子の５′転写非暗号領域中へ挿入する。
キメリック（chimeric）遺伝子を担持する組換え体で感
染された細胞は、少なくとも12時間、細胞外媒質中へHB
sAgを生産し、排出することが見いだされる。 発現の一時的なパターンとα−プロモーター調節領域
へ連鎖したHBsAgがα遺伝子として調節されるという観
察とは、ウイルス中へ挿入されたHBsAg遺伝子キメラが
ウイルス遺伝子として調節されることを示す。 HSV−１のTK遺伝子のヌクレオチド配列は公表されて
いる。ワグナー（Wagner）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.
USA,Vol.78,1441−1445ページ（1981）およびマックナ
イト（McKnight）、Nucleic Acids Res.,Vol.8、5949
−5964ページ（1980）を参照されたい。TK遺伝子の領域
内の単一のBgl II部位は、TK遺伝子の５′転写されるが
翻訳されない領域内にある。この部位における欠失は該
部位から上流に位置する領域のプロモーター機能に影響
を与えない。 本発明によるHSV−１ゲノム中への異種遺伝子の挿入
およびHSV−1TK遺伝子の一部分の欠失のために有用な適
当な方法は、モカルスキー（Mocarski）ら、セル（Cel
l）、Vol.22,243−255ページ（1980）；ポスト（Post）
ら、Proc．Natl．Acad．Sci. USA,Vol.77、No.7、4201−
4205ページ（1980）；ポスト（Post）ら、セル（Cel
l）、Vol.24、555−565ページ（1981）；ポスト（Pos
t）ら、セル（Cell）、Vol.25、227−232ページ（198
1）、ならびにヨーロッパ特許公告第74,808号（1983年
３月23日）に記載されている。上記刊行物の記載は参照
文として本明細書に含まれるものとする。 特に、βTK調節HBsAgおよびαICP4調節HBsAgの両方を
TK遺伝子の５′転写非暗号領域を中断する該遺伝子のBg
l II部位中へ挿入する。このキメリック（chimeric）断
片を、次に、無傷のHSV DNAとコトランスフェクション
し、フランキング（flanking）配列による相同組換えに
よって生産されたHBsAg担持TK−組換え体を、TK＋ウイ
ルス子孫を不活化するBuDRの存在下に於てTK−細胞つい
て平板培養することによって選択する。 HBsAg遺伝子担持DNA断片は、該遺伝子に対するその末
端３′に於て、TKプロモーターの代わりになりかつTK＋
表現型を保持するプロモーターを含むように思われるの
で、該遺伝子の暗号配列内のSac I部位に於ける小欠失
によってキメリック（chimeric）構造物中のTK遺伝子を
不活化することが必要である。 この方法は、β−プロモーター調節HBsAgを含むHSVの
作製を可能にするが、以下これを詳述する。 さらに、α−調節HBsAgの発現をβ−調節HBsAg組換え
ウイルスの発現と区別するため、HSV−１のα４遺伝子
のプロモーター調節領域をHBsAg遺伝子含有DN断片に結
合した。このキメリック（chimeric）遺伝子をTK遺伝子
のBgl II部位中にクローニングし、コトランスフェクシ
ョン（cotransfection）によって無傷のウイルスDNAと
組換えウイルスを生産させた。この詳細および結果を以
下詳しく示す。 次に、第１図−第５図を参照しながら、肝炎Ｂ型表面
抗原（HBsAg）のための挿入暗号配列を含む２種の組換
え単純ヘルペスウイルスの作製および該ウイルスからの
この蛋白質の発現を詳細に説明する。 キメリックβ−TKプロモーター調節HBsAgを含むHSV−１
組換え体の作製および発現 HSV−１株Ｆ〔HSV−１（Ｆ）〕（ATCC受託番号VR73
3）のBamH I Q断片を担持するプラスミドpRB103（ATCC
受託番号39718）から、Bal31エキソヌクレアーゼ消化に
より、特異的なSac I部位に於て約200個の塩基対を除去
してTK遺伝子を不活化することによってプラスミドpRB3
222を作製した。この作製に於ては、HBsAgのための開始
コドンがXho I部位から25塩基対下流にかつTK遺伝子の
プロモーター領域に近接して置かれる。従って、β−調
節遺伝子は、β−TK遺伝子から誘導される転写開始部位
から約80塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（下
記）中のHBsAgのための開始コドンは、αICP4遺伝子か
ら誘導される転写開始コドンから約60塩基対であった。 プラスミドpCP10（ATCC受託番号39717）のDNAをXho I
およびBgl IIで開裂し、得られた消化物を５％ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動にかけた。Xho I−Bgl II
断片（約1.7kb、HBsAgのための暗号配列を含んでいる）
を、次に、ポリアクリルアミドゲルから精製し、DNA断
片の末端をT4 DNAポリメラーゼで充填し、Bgl IIリン
カーに結合させ、Bgl IIで開裂しかつpRP3222のBgl II
部位中にクローニングした。 TKプロモーター調節領域に対する正しい転写配向（Ba
mH I DNA制限パターンから決定される）でHBsAg遺遺伝
子を含むここに得られたプラスミドを本明細書中ではpR
B3223（ATCC受託番号No.39716）と称する。 組換えプラスミドpRB3223をPvu IIで直線化し、この
プラスミド0.1−0.5μｇを、次に、うさぎ皮膚細胞中へ
0.5μｇのHSV−１（Ｆ）DNAとコトランスフェクション
し、得られた組換えウイルスのプラーク精製をルイエチ
ャン（Ruyechan）ら、J.Virol.,Vol.29、677−697ペー
ジ（1979）の記載のようにして行った。得られたTK−組
換えウイルスを、次に、チミン欠損混合物199（mixture
199lacking teimine）を含むが３％の子牛血清と40μg/
ml BuDR（ブロモウラシルデオキシリボシド）を補充し
た培地の存在下で143TK−細胞系について選択した。 予想通り、得られたTK−子孫は、Sac I部位に於ける
欠失のみを組換えた組換え体（R3222と称す）と、該欠
失とHBsAg遺伝子挿入の両方を組換えたもう１つの組換
え体とを含んでいた。後者の組換え体をR3223（ATCC受
託番号VR2086）と称す。 組換えウイルスDNAをEcoR I制限エンドヌクレアーゼ
で消化することによって、組換えウイルスR3223をR3222
から区別した。これらのウイルスのそれぞれのDNA組織
をサザーンブロット（Southern bolt）分析によってさ
らに確認した。 下記第１表および第２図は、組換えウイルスR3223に
よるHBsAgの発現および分泌を示す。25cm2フラスコ中で
ベロー（Vero）細胞をR3223（2pfu/細胞）に１時間暴露
した後、１％子牛血清を補充した維持混合物199から培
地中で37℃に於て培養した。第１表中に示した時間に於
て、１つのフラスコ中の維持培地5mlを取り、細胞を、
毎回燐酸塩緩衝食塩水（PBS）（0.15M NaCl、8.2mM Na2
HPO4、1.5mM KH2PO4、2.5mM KCl）5mlずつで３回洗浄
し、1mlのPBS中に採り、３回凍結−融解し、エッペンド
ルフ（Eppendorf）ミクロ遠心機で遠心した。 細胞溶解質を含む上澄液を、次に、PBSで容量5mlにし
た。200μの培地と感染細胞とを含む部分を、次に、
商標アウスザイム（AUSZYME）IIで発売されているアボ
ット・ラボラトリーズ・エリザ診断用キット（The Abbo
tt Laboratories ELISA diagnostic kit）で、メーカー
が推奨する方法により、下記のようにしてHBsAgの存在
を検定した。 組換え体および親ウイルス〔HSV−１（Ｆ）〕感染細
胞からの細胞外培地および溶解質をHBsAgに対するモル
モット抗体を塗布したビーズと混合した。培養後、HBsA
gに対するペルオキシダーゼ−共役抗体と反応させた。H
BsAgの存在は、492nmに於て分光光度計で測定された。 第１表からわかるように、感染後５時間のような早期
に、HBsAgが感染細胞溶解質中に検出されたが、培地中
には検出されなかった。感染後８時間では、感染細胞溶
解質中および細胞外培地中の両方にHBsAgが検出され
た。感染後12時間では、細胞外培地から多量のHBsAgが
回収された。しかし、感染細胞中のHBsAg量は感染後の
より早期に検出された量とほぼ同じであった。 感染細胞中に蓄積されるHBsAg量は、感染後８時間ま
たはそれ以前に於て、HSV−１（Ｆ）感染細胞の溶解質
および培地で得られたバックグラウンド値より約15倍高
いピーク値に達し、それ以後はあまり増加しなかった。
細胞外培地中に検出されるHBsAgの量は時間と共に増加
し、HBsAgが排出されて感染細胞の外部に蓄積されるこ
とを示している。α−調節HBsAgとβ−調節HBsAgとの蓄
積のパターンは類似しており、α−調節TK遺伝子および
β−調節TK遺伝子を担持するウイルスによって発現され
るこれら遺伝子の蓄積の速度論も類似しているという観
察と一致している。 HBsAgは、野性型〔HSV−１（Ｆ）〕ウイルス感染細胞
中または細胞外培地中には検出されなかった。HBsAg遺
伝子を担持するワクチニアウイルスで感染された細胞中
でもHBsAgが排出されるという観察が示された。 第２図は、上記のようにして得られた排出HBsAgを特
徴づけるために行った研究の結果を示す。ベロー（Ver
o）細胞を,R3223により、2pfu/細胞で感染させた。感染
後12時間に於て、維持培地9mlを採り、ベックマンSW41
ローター（Beckman SW41 rotor）で、４℃に於て20時
間、36,000rpmで遠心した。得られたペレットを同培地
0.5ml中に懸濁した後、200μを、1.1−1.5g/mlの同密
度CsCl密度勾配の上に重層し、ベックマンSW41ローター
で、25℃に於て、36時間、36,000rpmで遠心した。遠心
分離管の底部から分画（0.5ml）を集め、PBSで1:10に希
釈した。各分画を、第１表に関して上で詳述したように
してHBsAgの存在を分析した。 第２図からわかるように、密度1.17g/cm3の所にHBsAg
が集まった。血清中で、HBsAgは18〜25mmの直径を有す
る球形粒子を形成することが知られている〔デーン（Da
ne）ら、ランセット（Lancet）、Vol.1、695ページ、19
70〕。第３図からわかるように、寸法がデーン（Dane）
粒子に似ている（すなわち18−25nm）粒子がピーク分画
の電子顕微鏡検査で検出（２％燐タングステン酸で負に
染色）され、かくして排出HBsAgの特性を確認した。 次に、HBsAgのための暗号配列を担持する組換えHSV−
１ウィルスプラスミドの調製およびその蛋白質を発現す
るためのベクターとしての該プラスミドの有効な使用に
ついて詳述する。第１図〜第３図の作製に於て、HBsAg
断片をウィルスのβプロモーター領域の制御下に置い
た。 αICP4−HBsAg遺伝子を含むHSV−１組換え体の作製およ
び発現 以下、組換えHSV−１プラスミドと、それぞれがαプ
ロモーターの制御下にあるHBsAg暗号配列および遺伝子
を担持する組換えウィルスとの作製を説明する。 第４図は、キメリック（Chimeric）αICP4−HBsAg遺
伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製を示す。
この作製は、HSV−１のα４遺伝子のプロモーター調節
領域の、上記HBsAg遺伝子含有DNA断片への結合を含む。
特に、pRB103からのHSV−１（Ｆ）TK遺伝子を含むBamH
I Q断片をプラスミドpRB14のXho I部位中へ挿入する。
プラスミドpRBは、pRB322（ATCC受託番号No.31344）か
ら、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市のニュー・
イングランド・バイオラブズ（New England Biolobs）
から得たXho IリンカーによるEco RI−Pvu II断片の置
換によって作製されたものである。 得られた組換えプラスミドを本明細書中ではpRB3148
と称す。次に、HSV−１（Ｆ）BamH I Qの唯一のBgl II
部位中へpUC13からのHind III−Hae III断片（ポリリン
カーを含む）を、BamH I部位はTK遺伝子の構造配列に最
近接するが、Sal I部位は該遺伝子の転写開始部位に最
接近するようにクローニングすることによってプラスミ
ドpRB3159を作製した。プラスミドpUC13をポリリンカー
を含む適当な断片源として選んだが、他の適当なポリリ
ンカーが市販されている。 pRB3159から、Sac Iによる消化および再結合によるBa
mH I QのBal II−Sac I断片を含むSac Iの欠失によって
プラスミドpRB3166を作製した。 最終工程では、pRB3166中の２個の断片をクローニン
グしてプラスミドpRB3225を得た。最初に、αICP4遺伝
子のプロモーター−調節領域を含むpRB403（ATCC受託番
号39719）からのBamH I−Pvu II断片をポリリンカー配
列のSac I部位中へ、BamH I−Pvu II断片中のαICP4の
転写開始部位がXba I部位に近接するようにクローニン
グした。最初に、pRB3223からのHBsAg遺伝子を含むBal
II断片を、Xba I部位中へ、αICP4プロモーターとHBsAg
遺伝子の構造配列とがEco RIDNA制限エンドヌクレアー
ゼパターンから決定される同じ転写配向であるようにク
ローニングした。かくして、上記方法により、キメリッ
ク（Chimeric）遺伝子Ｐα４−HBsAgがTK遺伝子のBal I
I部位中へクローニングされた。 得られた組換えプラスミドpRB3225（ATCC受託番号397
15）を、第１図に関して上で説明したように143TK−細
胞中に於て無傷のHSV−１（Ｆ）DNAとコトランスフェク
ションし、TK遺伝子中にＰα４−HBsAg断片を含む得ら
れた組換えウイルスR3225（ATCC受託番号VR2087）を、1
43TK−細胞中でTK−子孫から選択しかつ以下に示すよう
にHBsAg発現について検査した。トランスフェクション
および選択工程は第５図に略示してある。 α−調節HBsAg（R3225）の発現をβ−調節HBsAg（R32
23）組換えウイルスの発現から区別するため、α遺伝子
は新規の蛋白質合成感染後の不在下で転写されるが、β
遺伝子はその発現のために機能的α遺伝子の存在を必要
とするという観察を下記の方法に従って利用した。 25cm2フラスコ中に於て、複製Hep−２細胞培養を、シ
クロヘキシミド（＋シクロ）５μg/ml含有維持培地中
で、１時間予備培養した後、それぞれ野性型〔HSV−１
（Ｆ）〕ウィルスまたはR3222ウィルスまたはR3223ウィ
ルスまたはR3225ウィルスにより、20/Pfu/細胞で感染さ
せた。感染後５時間で、シクロヘキシミド含有培地を取
り出し、細胞を十分に洗った後、アクチノマイシンＤ
（10μg/ml）含有培地中で培養した。90分の追加培養
後、細胞と培地を採り、アウスザイムII診断用キット
（アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）
でHBsAg対照実験（−シクロ）は、薬品を添加しない以
外は同じ洗浄方法を用いて行った。結果を下記第２表に
示す。 上記第２表に示すように、感染中および感染後５時間
に培地中に存在する抑制濃度のシクロヘキシミドの除去
後、HBsAgはR3225で感染された細胞では作られたが、R3
223で感染された細胞では作られなかった。 HSV−１α遺伝子の特徴は、それらが感染中および感
染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写され
たウィルス遺伝子のみであるということである。上記第
２表からわかるように、シクロヘキシミドの存在下で感
染されかつ維持される細胞中ではR3225中に含まれるHBs
Ag遺伝子だけが発現され、次に、αICP4遺伝子生成物の
合成に依存するβ遺伝子の転写を妨害するアクチノマイ
シンＤの存在下に於てシクロヘキシミドの抑制効果から
解放される。 結果の考察 以上のことは、HSVゲノムが異種遺伝子、特にHBsAgの
ための発現ベクターとして作用し得ることを示してい
る。 HSVは宿主の高分子代謝、特に宿主の蛋白質合成を停
止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつHSVプ
ロモーター調節領域によって調節される異種遺伝子（HB
sAgで例示される）の表現に悪影響を与えない。遺伝子
生産物の抗原性、CsCl密度勾配中に於けるその浮遊密度
および帯状化調製物中に存在する特徴的18〜25nm粒径
は、HSVが担持するHBsAg遺伝子の生成物が該遺伝子の真
の生産物であることを示す。HBsAgが感染細胞から排出
されるという観察は、抗原が細胞から分泌されるために
正しく処理されることを暗示している。 ここに示される結果は、αICP4連鎖HBsAgとβTK連鎖H
BsAg遺伝子とが共に少なくとも12時間抗原を発現するこ
とを示す。HBsAgの合成のパターンとICP4連鎖がα遺伝
子として調節されるという観察とは、HSV−１ベクター
中のキメリック（Chimeric）HBsAg遺伝子がウィルス遺
伝子として調節されることを示す。ICP4遺伝子中のts突
然変異体のゲノム中へαプロモーター調節領域下で遺伝
子を挿入することによって、かかる突然変異体が非許容
温度で感染されかつ維持される細胞中で連続的にα遺伝
子を発現すると示されているので、HBsAgの生産は特に
高められる。 異種遺伝子のためのベクターとしてのHSVゲノムの使
用は、ヒト細胞中に於ける生合成および（ａ）その増殖
が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝炎Ｂ型ウ
ィルス）の遺伝子、（ｂ）ヒトに対して特に危険な感染
因子の遺伝子および（ｃ）培養細胞中で極めて低レベル
で発現されるかまたは全く発現されない細胞遺伝子の生
産物のキャラクタリゼーションのために特に有用であ
る。HSV−１発現ベクターは、遺伝子調節、特に翻訳レ
ベルに於ける遺伝子調節の分析に有用である。 HSV−ベクターの特別な利点は、これらのウィルスが
非常に広い宿主範囲を有すること、すなわち一様な方法
で多くの異なる型の細胞の感染が可能だということであ
る。従って、HSV−１ベクター中へ挿入された異種遺伝
子は、培養で容易に連続的に増殖させることができかつ
ウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分としてパッケ
ージされる。このベクターは、次に、大規模細胞培養を
同調的に感染させるのに用いて、すべての感染細胞中で
異種遺伝子の持続発現を得ることができる。この方法
は、細胞とDNAとのトランスフェクションと異種遺伝子
を発現する少数の細胞の選択とに依存する他の方法より
も非常に有利である。この方法は、異種遺伝子の発現の
ためのDNA断片による形質転換に有用でないヒトワクチ
ン生産（例えばMRC−５またはW138）用に認可されたヒ
ト二倍体細胞株に適用可能である。 本明細書中で示した典型的な例に於て、HBsAg遺伝子
の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中へHBsAgを挿
入した。以前には、7Kbpのような多量のDNAが挿入され
た〔ナイプ（Knipe）ら、Pro.Natl.Acad.Sci.,Vol.75,3
896−3900ページ、1978〕が、野生型HSV DNAの余分の
遺伝子生産物担持能力には制限があるであろう。 内部反復配列内に含まれる約14KbpのDNAがそれから2K
bp挿入物で置換されている突然変異体HSV−11（Ｆ）135
8の作製は既に報告されている〔ポッフェンバーガー（P
offenberger）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.,Vol.80,269
0−2694ページ、1983〕。挿入物を置換しかつゲノムを
その既知の最高容量まで膨脹させることにより、1358突
然変異体は23Kbpのような多量の異種DNAを担持すること
ができた。従って、HSV−１（Ｆ）1358は、免疫予防の
ための種々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つか
の遺伝子のベクターとして働く能力がある。 単純ヘルペスウイルス２型（HSV−２）のDNAは、構造
がHSV−１と本質的で同じであり、塩基対のヌクレオチ
ドマッチング（matching）のみが異なる。従って、HSV
−１ゲノムを用いて本明細書中で示したDNA構造物と同
じDNA構造物が本発明によって実行可能である。 単純ヘルペスウイルス１は公けに容易に入手可能であ
る。例えば、米国、メリーランド州20852、ロックビ
ル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Cullection）にATCC受託番号VR733の名称で寄託されて
いる。同様に、プラスミドpRB322は公けに容易に入手で
き、これもATCCに、ATCC受託番号31344の名称で寄託さ
れている。ATCCは、特にヨーロッパ特許条約への履行規
則（Implementing Regulation）の要求に従って、これ
らの培養株を保持するように要求されている。また本明
細書中でATCC受託番号で示した残りの培養株も寄託され
ている。 本明細書中で示した残りのものも公けに入手可能であ
る。例えば、制限酵素、T4 DNAリガーゼ、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレ
アーゼBal31、制限酵素リンカーは米国マサチュセッツ
州ケンブリッジ市のニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（New England Biolabs）から購入し、メーカーの指
示通りに使用した。所望の組換えプラスミドのための大
腸菌（E.coli）コロニーのスクリーニングのためのDNA
プローブは、米国マサチュセッツ州ケンブリッジ市のニ
ュー・イングランド・ヌクレア（New England Nuclea
r）から得た〔γ−P32〕−ATPによるニックトランスレ
ーションによってラベルした。 HSV−１のＦ株〔HSV−１（Ｆ）〕および本明細書中で
誘導されたすべての組換え体は、アメカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（American Type Culture Coll
ection）から得たベロー（Vero）またはHEp−２細胞系
で増殖および力価測定を行った。ウイルスDNAとのトラ
ンスフェクションに用いたうさぎ皮膚細胞ならびにTK−
組換え体の選択に用いたヒトtk−細胞系も公けに入手可
能である。 以上の詳細な説明は本発明の理解を容易にするために
のみ記載したものであり、本発明の範囲内での変更は当
業者には明らかであるので、これらの説明は何ら不必要
な限定を意味するものではない。
伝子の発現のためのベクターとしてのウイルスのゲノム
に関する。 先行技術の簡単な説明 単純ヘルペスウイルス（HSV）のようなある種のウイ
ルスによる感受性細胞の感染は、例えば、典型的に宿主
蛋白質合成の停止をもたらす。この停止は２段階で起こ
る。初期段階は恐らくウイルスの構造蛋白によってひき
起こされ、遺伝研究はこの活性がウイルス増殖のために
本質的でないことを示している。第２の不可逆的抑制
は、ウイルス遺伝子生産物の発現の結果としてウイルス
生殖サイクル中に起こる。アクチノマイシンＤによる化
学的除核またはシトコラシンＢの助けによる物理的除核
に基づく有効データは、抑制が少なくとも部分的に翻訳
レベルに於けるものであることを暗示している。 単純ヘルペスウイルス１型（HSV−１）は、ある種の
宿主遺伝子、および特に例えば、ウイルス調節領域の制
御下に置かれかつトランスフェクションによって細胞中
へ導入された卵白アルブミンのような異種遺伝子を誘発
することが従来知られているが、その発現は選択的であ
りかつ一時的である。以前には、野生型ウイルスの抑制
機構がウイルスのゲノム中に導入された異種遺伝子の持
続した発現を許さないだろうと信じられていた。 発明の要約 本発明によると、ウイルスのゲノムのプロモーター調
節領域の制御下に異種遺伝子がウイルスのゲノム中に挿
入され、かくしてウイルスのゲノムが感染細胞中に於け
る異種遺伝子の発現のためのベクターとなる。 かくして、ウイルスのゲノムは、ウイルスのゲノムと
一緒に該遺伝子の連続的増殖のためおよび宿主染色体に
よって指令される蛋白質合成の停止にも拘らず適当な宿
主中に於ける異種遺伝子の持続的発現のために有用にな
るように遺伝的に加工される。 本発明は、肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）の発現のため
のベクターとしてのHSV−１の使用によって例示され
る。HBsAg遺伝子は、その発現を可能にしかつ調節する
ために、HSV遺伝子プロモーター調節領域の制御下に置
かれる。この構造物（construct）を、次に、ウイルス
のゲノムのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子中へ挿入す
る。さらにTK遺伝子中に於て欠失を作って該遺伝子を不
活化させる。得られたDNA構造物を適当なHSV−１株の無
傷のDNAとコトランスフェクションさせ、TK子孫を選択
する。かかる子孫は、欠失とHBsAg挿入との両方を含む
組換え体を含むことが見いだされている。かかる組換え
体の培養は持続した時間にわたってHBsAgを有効に生産
することが見いだされている。 本発明によれば、異種遺伝子発現のために有用なウイ
ルスベクターが提供される。 本発明は、特異的に形質転換された遺伝子を前以て選
択することなしに大規模細胞培養に於て異種遺伝子の同
時導入および同調発現を可能にする。本発明は、通常発
現されにくい遺伝子および危険であるかまたは培養でき
ない生物の発現を可能にする。 本発明の他の目的ならびに利益は、添付図面ならびに
特許請求の範囲と共に以下の詳細な説明を読むことによ
り、当業者には明らかになるであろう。 発明の詳細な説明 発明の一般的陳述 単純ヘルペスウイルス（HSV）を本発明によってベク
ターへ転換するには、そのDNA中へ適当なウイルスプロ
モーターに連鎖された異種遺伝子を組換えれば十分であ
る。異種遺伝子は、それ自身の転写終結−ポリ−アデニ
ル化（transcription termination−poly−adenylatio
n）信号を有さねばならないかあるいは新規のかかる信
号が与えられなければならない。 異種遺伝子は完全暗号配列を含まねばならない。異種
遺伝子が転写終結信号を越えて終結する場合および転写
終結信号から下流にもう１つのプロモーターが存在する
場合には、HSVのTK遺伝子の構造配列は、TK遺伝子がそ
のプロモーターから発現され得ないように変更されねば
ならない。 異種遺伝子をウイルス中へ組換えるためには、遺伝子
が所望の位置で組換わる相同フランキング（flanking）
配列と所望の組換え体を選択するためのシステムとを有
することが必要である。この場合には、フランキング
（flanking）配列はウイルスTK遺伝子の領域の部分から
なりかつ、不活性TK遺伝子の選択が行われつゝあるの
で、TK遺伝子によって特異的にまたは主として燐酸化さ
れる任意のヌクレオチド同族体（例えば薬剤）を組換え
体TKウイルスの選択に用いることができる。 HSVの場合には、TK遺伝子は、非常に低い頻度で起こ
る組換え体の選択を許すので、異種遺伝子の挿入のため
の高度に望ましい位置である。また、HSVゲノム内のTK
遺伝子の位置は、異種遺伝子の挿入前に（既知の方法
で）変えることができる。 しかし、異種遺伝子の挿入はTK遺伝子に於てなされる
必要はなく、挿入は任意の有効な非致死部位に於てなさ
れることができかつHSVゲノム中の別の選択マーカーの
使用によって選択され得る。 HSV遺伝子は、α、β、γと称せられる３主要群を形
成し、その発現は対等に調節されかつカスケード形式で
連続的に整理される。ほとんどのα遺伝子および一部分
のβ遺伝子では、プロモーターおよび調節領域が転写開
始部位から上流にあることが知られている。特に、α遺
伝子〔例えば感染細胞蛋白質（ICP）No.0、４、27また
は22を指定する遺伝子〕のプロモーター調節領域、他の
遺伝子の５′転写非暗号および暗号配列へ融合すること
によって作られるキメリック（chimeric）遺伝子はそれ
ぞれα遺伝子またはβ遺伝子として調節される。 従って、本発明によれば、１端にウイルス遺伝子のプ
ロモーター調節領域がありかつ他端に適当な転写終結信
号があるその完全な構造配列を含む異種遺伝子がHSVゲ
ノム中へ永久的に組込まれるDNA構造物が調製される。 かかる構造物は、ウイルスのゲノム中に於て異種遺伝
子を永続化させる能力および組換えウイルスのゲノムを
担持するウイルスで感染された細胞中に於て異種遺伝子
を発現する能力を有する。 本発明の典型的な実施の態様 α−及びβ−調節HBsAgを担持するHSV−１ベクターの遺
伝子工学 本発明の典型的な実施の態様に於て、HBsAg指定遺伝
子の５′転写非暗号領域の構造配列および25塩基対を、
HBsAg遺伝子の５′転写非暗号および暗号領域のHSV−１
遺伝子のそれぞれのプロモーター調節領域への融合によ
ってHSV−１ゲノムのウイルスチミジンキナーゼ（TK）
遺伝子のICP4のαプロモーターまたはβプロモーターの
制御下に置く。このキメリック（chimeric）構造物を、
次に、フランキング（flanking）配列による相同組換え
によってTK遺伝子の５′転写非暗号領域中へ挿入する。
キメリック（chimeric）遺伝子を担持する組換え体で感
染された細胞は、少なくとも12時間、細胞外媒質中へHB
sAgを生産し、排出することが見いだされる。 発現の一時的なパターンとα−プロモーター調節領域
へ連鎖したHBsAgがα遺伝子として調節されるという観
察とは、ウイルス中へ挿入されたHBsAg遺伝子キメラが
ウイルス遺伝子として調節されることを示す。 HSV−１のTK遺伝子のヌクレオチド配列は公表されて
いる。ワグナー（Wagner）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.
USA,Vol.78,1441−1445ページ（1981）およびマックナ
イト（McKnight）、Nucleic Acids Res.,Vol.8、5949
−5964ページ（1980）を参照されたい。TK遺伝子の領域
内の単一のBgl II部位は、TK遺伝子の５′転写されるが
翻訳されない領域内にある。この部位における欠失は該
部位から上流に位置する領域のプロモーター機能に影響
を与えない。 本発明によるHSV−１ゲノム中への異種遺伝子の挿入
およびHSV−1TK遺伝子の一部分の欠失のために有用な適
当な方法は、モカルスキー（Mocarski）ら、セル（Cel
l）、Vol.22,243−255ページ（1980）；ポスト（Post）
ら、Proc．Natl．Acad．Sci. USA,Vol.77、No.7、4201−
4205ページ（1980）；ポスト（Post）ら、セル（Cel
l）、Vol.24、555−565ページ（1981）；ポスト（Pos
t）ら、セル（Cell）、Vol.25、227−232ページ（198
1）、ならびにヨーロッパ特許公告第74,808号（1983年
３月23日）に記載されている。上記刊行物の記載は参照
文として本明細書に含まれるものとする。 特に、βTK調節HBsAgおよびαICP4調節HBsAgの両方を
TK遺伝子の５′転写非暗号領域を中断する該遺伝子のBg
l II部位中へ挿入する。このキメリック（chimeric）断
片を、次に、無傷のHSV DNAとコトランスフェクション
し、フランキング（flanking）配列による相同組換えに
よって生産されたHBsAg担持TK−組換え体を、TK＋ウイ
ルス子孫を不活化するBuDRの存在下に於てTK−細胞つい
て平板培養することによって選択する。 HBsAg遺伝子担持DNA断片は、該遺伝子に対するその末
端３′に於て、TKプロモーターの代わりになりかつTK＋
表現型を保持するプロモーターを含むように思われるの
で、該遺伝子の暗号配列内のSac I部位に於ける小欠失
によってキメリック（chimeric）構造物中のTK遺伝子を
不活化することが必要である。 この方法は、β−プロモーター調節HBsAgを含むHSVの
作製を可能にするが、以下これを詳述する。 さらに、α−調節HBsAgの発現をβ−調節HBsAg組換え
ウイルスの発現と区別するため、HSV−１のα４遺伝子
のプロモーター調節領域をHBsAg遺伝子含有DN断片に結
合した。このキメリック（chimeric）遺伝子をTK遺伝子
のBgl II部位中にクローニングし、コトランスフェクシ
ョン（cotransfection）によって無傷のウイルスDNAと
組換えウイルスを生産させた。この詳細および結果を以
下詳しく示す。 次に、第１図−第５図を参照しながら、肝炎Ｂ型表面
抗原（HBsAg）のための挿入暗号配列を含む２種の組換
え単純ヘルペスウイルスの作製および該ウイルスからの
この蛋白質の発現を詳細に説明する。 キメリックβ−TKプロモーター調節HBsAgを含むHSV−１
組換え体の作製および発現 HSV−１株Ｆ〔HSV−１（Ｆ）〕（ATCC受託番号VR73
3）のBamH I Q断片を担持するプラスミドpRB103（ATCC
受託番号39718）から、Bal31エキソヌクレアーゼ消化に
より、特異的なSac I部位に於て約200個の塩基対を除去
してTK遺伝子を不活化することによってプラスミドpRB3
222を作製した。この作製に於ては、HBsAgのための開始
コドンがXho I部位から25塩基対下流にかつTK遺伝子の
プロモーター領域に近接して置かれる。従って、β−調
節遺伝子は、β−TK遺伝子から誘導される転写開始部位
から約80塩基対下流にあったが、α−調節遺伝子（下
記）中のHBsAgのための開始コドンは、αICP4遺伝子か
ら誘導される転写開始コドンから約60塩基対であった。 プラスミドpCP10（ATCC受託番号39717）のDNAをXho I
およびBgl IIで開裂し、得られた消化物を５％ポリアク
リルアミドゲル中で電気泳動にかけた。Xho I−Bgl II
断片（約1.7kb、HBsAgのための暗号配列を含んでいる）
を、次に、ポリアクリルアミドゲルから精製し、DNA断
片の末端をT4 DNAポリメラーゼで充填し、Bgl IIリン
カーに結合させ、Bgl IIで開裂しかつpRP3222のBgl II
部位中にクローニングした。 TKプロモーター調節領域に対する正しい転写配向（Ba
mH I DNA制限パターンから決定される）でHBsAg遺遺伝
子を含むここに得られたプラスミドを本明細書中ではpR
B3223（ATCC受託番号No.39716）と称する。 組換えプラスミドpRB3223をPvu IIで直線化し、この
プラスミド0.1−0.5μｇを、次に、うさぎ皮膚細胞中へ
0.5μｇのHSV−１（Ｆ）DNAとコトランスフェクション
し、得られた組換えウイルスのプラーク精製をルイエチ
ャン（Ruyechan）ら、J.Virol.,Vol.29、677−697ペー
ジ（1979）の記載のようにして行った。得られたTK−組
換えウイルスを、次に、チミン欠損混合物199（mixture
199lacking teimine）を含むが３％の子牛血清と40μg/
ml BuDR（ブロモウラシルデオキシリボシド）を補充し
た培地の存在下で143TK−細胞系について選択した。 予想通り、得られたTK−子孫は、Sac I部位に於ける
欠失のみを組換えた組換え体（R3222と称す）と、該欠
失とHBsAg遺伝子挿入の両方を組換えたもう１つの組換
え体とを含んでいた。後者の組換え体をR3223（ATCC受
託番号VR2086）と称す。 組換えウイルスDNAをEcoR I制限エンドヌクレアーゼ
で消化することによって、組換えウイルスR3223をR3222
から区別した。これらのウイルスのそれぞれのDNA組織
をサザーンブロット（Southern bolt）分析によってさ
らに確認した。 下記第１表および第２図は、組換えウイルスR3223に
よるHBsAgの発現および分泌を示す。25cm2フラスコ中で
ベロー（Vero）細胞をR3223（2pfu/細胞）に１時間暴露
した後、１％子牛血清を補充した維持混合物199から培
地中で37℃に於て培養した。第１表中に示した時間に於
て、１つのフラスコ中の維持培地5mlを取り、細胞を、
毎回燐酸塩緩衝食塩水（PBS）（0.15M NaCl、8.2mM Na2
HPO4、1.5mM KH2PO4、2.5mM KCl）5mlずつで３回洗浄
し、1mlのPBS中に採り、３回凍結−融解し、エッペンド
ルフ（Eppendorf）ミクロ遠心機で遠心した。 細胞溶解質を含む上澄液を、次に、PBSで容量5mlにし
た。200μの培地と感染細胞とを含む部分を、次に、
商標アウスザイム（AUSZYME）IIで発売されているアボ
ット・ラボラトリーズ・エリザ診断用キット（The Abbo
tt Laboratories ELISA diagnostic kit）で、メーカー
が推奨する方法により、下記のようにしてHBsAgの存在
を検定した。 組換え体および親ウイルス〔HSV−１（Ｆ）〕感染細
胞からの細胞外培地および溶解質をHBsAgに対するモル
モット抗体を塗布したビーズと混合した。培養後、HBsA
gに対するペルオキシダーゼ−共役抗体と反応させた。H
BsAgの存在は、492nmに於て分光光度計で測定された。 第１表からわかるように、感染後５時間のような早期
に、HBsAgが感染細胞溶解質中に検出されたが、培地中
には検出されなかった。感染後８時間では、感染細胞溶
解質中および細胞外培地中の両方にHBsAgが検出され
た。感染後12時間では、細胞外培地から多量のHBsAgが
回収された。しかし、感染細胞中のHBsAg量は感染後の
より早期に検出された量とほぼ同じであった。 感染細胞中に蓄積されるHBsAg量は、感染後８時間ま
たはそれ以前に於て、HSV−１（Ｆ）感染細胞の溶解質
および培地で得られたバックグラウンド値より約15倍高
いピーク値に達し、それ以後はあまり増加しなかった。
細胞外培地中に検出されるHBsAgの量は時間と共に増加
し、HBsAgが排出されて感染細胞の外部に蓄積されるこ
とを示している。α−調節HBsAgとβ−調節HBsAgとの蓄
積のパターンは類似しており、α−調節TK遺伝子および
β−調節TK遺伝子を担持するウイルスによって発現され
るこれら遺伝子の蓄積の速度論も類似しているという観
察と一致している。 HBsAgは、野性型〔HSV−１（Ｆ）〕ウイルス感染細胞
中または細胞外培地中には検出されなかった。HBsAg遺
伝子を担持するワクチニアウイルスで感染された細胞中
でもHBsAgが排出されるという観察が示された。 第２図は、上記のようにして得られた排出HBsAgを特
徴づけるために行った研究の結果を示す。ベロー（Ver
o）細胞を,R3223により、2pfu/細胞で感染させた。感染
後12時間に於て、維持培地9mlを採り、ベックマンSW41
ローター（Beckman SW41 rotor）で、４℃に於て20時
間、36,000rpmで遠心した。得られたペレットを同培地
0.5ml中に懸濁した後、200μを、1.1−1.5g/mlの同密
度CsCl密度勾配の上に重層し、ベックマンSW41ローター
で、25℃に於て、36時間、36,000rpmで遠心した。遠心
分離管の底部から分画（0.5ml）を集め、PBSで1:10に希
釈した。各分画を、第１表に関して上で詳述したように
してHBsAgの存在を分析した。 第２図からわかるように、密度1.17g/cm3の所にHBsAg
が集まった。血清中で、HBsAgは18〜25mmの直径を有す
る球形粒子を形成することが知られている〔デーン（Da
ne）ら、ランセット（Lancet）、Vol.1、695ページ、19
70〕。第３図からわかるように、寸法がデーン（Dane）
粒子に似ている（すなわち18−25nm）粒子がピーク分画
の電子顕微鏡検査で検出（２％燐タングステン酸で負に
染色）され、かくして排出HBsAgの特性を確認した。 次に、HBsAgのための暗号配列を担持する組換えHSV−
１ウィルスプラスミドの調製およびその蛋白質を発現す
るためのベクターとしての該プラスミドの有効な使用に
ついて詳述する。第１図〜第３図の作製に於て、HBsAg
断片をウィルスのβプロモーター領域の制御下に置い
た。 αICP4−HBsAg遺伝子を含むHSV−１組換え体の作製およ
び発現 以下、組換えHSV−１プラスミドと、それぞれがαプ
ロモーターの制御下にあるHBsAg暗号配列および遺伝子
を担持する組換えウィルスとの作製を説明する。 第４図は、キメリック（Chimeric）αICP4−HBsAg遺
伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製を示す。
この作製は、HSV−１のα４遺伝子のプロモーター調節
領域の、上記HBsAg遺伝子含有DNA断片への結合を含む。
特に、pRB103からのHSV−１（Ｆ）TK遺伝子を含むBamH
I Q断片をプラスミドpRB14のXho I部位中へ挿入する。
プラスミドpRBは、pRB322（ATCC受託番号No.31344）か
ら、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ市のニュー・
イングランド・バイオラブズ（New England Biolobs）
から得たXho IリンカーによるEco RI−Pvu II断片の置
換によって作製されたものである。 得られた組換えプラスミドを本明細書中ではpRB3148
と称す。次に、HSV−１（Ｆ）BamH I Qの唯一のBgl II
部位中へpUC13からのHind III−Hae III断片（ポリリン
カーを含む）を、BamH I部位はTK遺伝子の構造配列に最
近接するが、Sal I部位は該遺伝子の転写開始部位に最
接近するようにクローニングすることによってプラスミ
ドpRB3159を作製した。プラスミドpUC13をポリリンカー
を含む適当な断片源として選んだが、他の適当なポリリ
ンカーが市販されている。 pRB3159から、Sac Iによる消化および再結合によるBa
mH I QのBal II−Sac I断片を含むSac Iの欠失によって
プラスミドpRB3166を作製した。 最終工程では、pRB3166中の２個の断片をクローニン
グしてプラスミドpRB3225を得た。最初に、αICP4遺伝
子のプロモーター−調節領域を含むpRB403（ATCC受託番
号39719）からのBamH I−Pvu II断片をポリリンカー配
列のSac I部位中へ、BamH I−Pvu II断片中のαICP4の
転写開始部位がXba I部位に近接するようにクローニン
グした。最初に、pRB3223からのHBsAg遺伝子を含むBal
II断片を、Xba I部位中へ、αICP4プロモーターとHBsAg
遺伝子の構造配列とがEco RIDNA制限エンドヌクレアー
ゼパターンから決定される同じ転写配向であるようにク
ローニングした。かくして、上記方法により、キメリッ
ク（Chimeric）遺伝子Ｐα４−HBsAgがTK遺伝子のBal I
I部位中へクローニングされた。 得られた組換えプラスミドpRB3225（ATCC受託番号397
15）を、第１図に関して上で説明したように143TK−細
胞中に於て無傷のHSV−１（Ｆ）DNAとコトランスフェク
ションし、TK遺伝子中にＰα４−HBsAg断片を含む得ら
れた組換えウイルスR3225（ATCC受託番号VR2087）を、1
43TK−細胞中でTK−子孫から選択しかつ以下に示すよう
にHBsAg発現について検査した。トランスフェクション
および選択工程は第５図に略示してある。 α−調節HBsAg（R3225）の発現をβ−調節HBsAg（R32
23）組換えウイルスの発現から区別するため、α遺伝子
は新規の蛋白質合成感染後の不在下で転写されるが、β
遺伝子はその発現のために機能的α遺伝子の存在を必要
とするという観察を下記の方法に従って利用した。 25cm2フラスコ中に於て、複製Hep−２細胞培養を、シ
クロヘキシミド（＋シクロ）５μg/ml含有維持培地中
で、１時間予備培養した後、それぞれ野性型〔HSV−１
（Ｆ）〕ウィルスまたはR3222ウィルスまたはR3223ウィ
ルスまたはR3225ウィルスにより、20/Pfu/細胞で感染さ
せた。感染後５時間で、シクロヘキシミド含有培地を取
り出し、細胞を十分に洗った後、アクチノマイシンＤ
（10μg/ml）含有培地中で培養した。90分の追加培養
後、細胞と培地を採り、アウスザイムII診断用キット
（アボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories）
でHBsAg対照実験（−シクロ）は、薬品を添加しない以
外は同じ洗浄方法を用いて行った。結果を下記第２表に
示す。 上記第２表に示すように、感染中および感染後５時間
に培地中に存在する抑制濃度のシクロヘキシミドの除去
後、HBsAgはR3225で感染された細胞では作られたが、R3
223で感染された細胞では作られなかった。 HSV−１α遺伝子の特徴は、それらが感染中および感
染後蛋白質合成の抑制剤に暴露された細胞中で転写され
たウィルス遺伝子のみであるということである。上記第
２表からわかるように、シクロヘキシミドの存在下で感
染されかつ維持される細胞中ではR3225中に含まれるHBs
Ag遺伝子だけが発現され、次に、αICP4遺伝子生成物の
合成に依存するβ遺伝子の転写を妨害するアクチノマイ
シンＤの存在下に於てシクロヘキシミドの抑制効果から
解放される。 結果の考察 以上のことは、HSVゲノムが異種遺伝子、特にHBsAgの
ための発現ベクターとして作用し得ることを示してい
る。 HSVは宿主の高分子代謝、特に宿主の蛋白質合成を停
止させるが、ウィルスのゲノム中へ挿入されかつHSVプ
ロモーター調節領域によって調節される異種遺伝子（HB
sAgで例示される）の表現に悪影響を与えない。遺伝子
生産物の抗原性、CsCl密度勾配中に於けるその浮遊密度
および帯状化調製物中に存在する特徴的18〜25nm粒径
は、HSVが担持するHBsAg遺伝子の生成物が該遺伝子の真
の生産物であることを示す。HBsAgが感染細胞から排出
されるという観察は、抗原が細胞から分泌されるために
正しく処理されることを暗示している。 ここに示される結果は、αICP4連鎖HBsAgとβTK連鎖H
BsAg遺伝子とが共に少なくとも12時間抗原を発現するこ
とを示す。HBsAgの合成のパターンとICP4連鎖がα遺伝
子として調節されるという観察とは、HSV−１ベクター
中のキメリック（Chimeric）HBsAg遺伝子がウィルス遺
伝子として調節されることを示す。ICP4遺伝子中のts突
然変異体のゲノム中へαプロモーター調節領域下で遺伝
子を挿入することによって、かかる突然変異体が非許容
温度で感染されかつ維持される細胞中で連続的にα遺伝
子を発現すると示されているので、HBsAgの生産は特に
高められる。 異種遺伝子のためのベクターとしてのHSVゲノムの使
用は、ヒト細胞中に於ける生合成および（ａ）その増殖
が細胞培養では制限されるウィルス（例えば肝炎Ｂ型ウ
ィルス）の遺伝子、（ｂ）ヒトに対して特に危険な感染
因子の遺伝子および（ｃ）培養細胞中で極めて低レベル
で発現されるかまたは全く発現されない細胞遺伝子の生
産物のキャラクタリゼーションのために特に有用であ
る。HSV−１発現ベクターは、遺伝子調節、特に翻訳レ
ベルに於ける遺伝子調節の分析に有用である。 HSV−ベクターの特別な利点は、これらのウィルスが
非常に広い宿主範囲を有すること、すなわち一様な方法
で多くの異なる型の細胞の感染が可能だということであ
る。従って、HSV−１ベクター中へ挿入された異種遺伝
子は、培養で容易に連続的に増殖させることができかつ
ウィルス粒子中のウィルスのゲノムの部分としてパッケ
ージされる。このベクターは、次に、大規模細胞培養を
同調的に感染させるのに用いて、すべての感染細胞中で
異種遺伝子の持続発現を得ることができる。この方法
は、細胞とDNAとのトランスフェクションと異種遺伝子
を発現する少数の細胞の選択とに依存する他の方法より
も非常に有利である。この方法は、異種遺伝子の発現の
ためのDNA断片による形質転換に有用でないヒトワクチ
ン生産（例えばMRC−５またはW138）用に認可されたヒ
ト二倍体細胞株に適用可能である。 本明細書中で示した典型的な例に於て、HBsAg遺伝子
の挿入の部位で変更された野生型ゲノム中へHBsAgを挿
入した。以前には、7Kbpのような多量のDNAが挿入され
た〔ナイプ（Knipe）ら、Pro.Natl.Acad.Sci.,Vol.75,3
896−3900ページ、1978〕が、野生型HSV DNAの余分の
遺伝子生産物担持能力には制限があるであろう。 内部反復配列内に含まれる約14KbpのDNAがそれから2K
bp挿入物で置換されている突然変異体HSV−11（Ｆ）135
8の作製は既に報告されている〔ポッフェンバーガー（P
offenberger）ら、Proc．Natl．Acad．Sci.,Vol.80,269
0−2694ページ、1983〕。挿入物を置換しかつゲノムを
その既知の最高容量まで膨脹させることにより、1358突
然変異体は23Kbpのような多量の異種DNAを担持すること
ができた。従って、HSV−１（Ｆ）1358は、免疫予防の
ための種々のヒト感染因子からの抗原を指定する幾つか
の遺伝子のベクターとして働く能力がある。 単純ヘルペスウイルス２型（HSV−２）のDNAは、構造
がHSV−１と本質的で同じであり、塩基対のヌクレオチ
ドマッチング（matching）のみが異なる。従って、HSV
−１ゲノムを用いて本明細書中で示したDNA構造物と同
じDNA構造物が本発明によって実行可能である。 単純ヘルペスウイルス１は公けに容易に入手可能であ
る。例えば、米国、メリーランド州20852、ロックビ
ル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Cullection）にATCC受託番号VR733の名称で寄託されて
いる。同様に、プラスミドpRB322は公けに容易に入手で
き、これもATCCに、ATCC受託番号31344の名称で寄託さ
れている。ATCCは、特にヨーロッパ特許条約への履行規
則（Implementing Regulation）の要求に従って、これ
らの培養株を保持するように要求されている。また本明
細書中でATCC受託番号で示した残りの培養株も寄託され
ている。 本明細書中で示した残りのものも公けに入手可能であ
る。例えば、制限酵素、T4 DNAリガーゼ、ポリヌクレ
オチドキナーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、エキソヌクレ
アーゼBal31、制限酵素リンカーは米国マサチュセッツ
州ケンブリッジ市のニュー・イングランド・バイオラブ
ズ（New England Biolabs）から購入し、メーカーの指
示通りに使用した。所望の組換えプラスミドのための大
腸菌（E.coli）コロニーのスクリーニングのためのDNA
プローブは、米国マサチュセッツ州ケンブリッジ市のニ
ュー・イングランド・ヌクレア（New England Nuclea
r）から得た〔γ−P32〕−ATPによるニックトランスレ
ーションによってラベルした。 HSV−１のＦ株〔HSV−１（Ｆ）〕および本明細書中で
誘導されたすべての組換え体は、アメカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（American Type Culture Coll
ection）から得たベロー（Vero）またはHEp−２細胞系
で増殖および力価測定を行った。ウイルスDNAとのトラ
ンスフェクションに用いたうさぎ皮膚細胞ならびにTK−
組換え体の選択に用いたヒトtk−細胞系も公けに入手可
能である。 以上の詳細な説明は本発明の理解を容易にするために
のみ記載したものであり、本発明の範囲内での変更は当
業者には明らかであるので、これらの説明は何ら不必要
な限定を意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
第１図は、β−TKプロモーター調節肝炎Ｂ型表面抗原遺
伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製の概略を
示すフローシートであり、 第２図は、第１図のウィルスで感染された細胞中に於け
る精製発現HBsAgの塩化セシウム勾配中の浮遊密度を示
すグラフであり、 第３図は、第１図のウィルスで感染された細胞から得ら
れた精製発現HBsAgである生物の形態を示す電子顕微鏡
写真であり、 第４図は、キメリック（Chimeric）αICP4−HBsAg遺伝
子を含む組換えプラスミドの作製の概略を示すフローシ
ートであり、 第５図は、第４図のプラスミドと無傷のウィルスDNAと
のコトランスフェクションおよびαICP4−HBsAg遺伝子
を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選択を示すフロー
シートである。
伝子を含む組換え単純ヘルペスウィルスの作製の概略を
示すフローシートであり、 第２図は、第１図のウィルスで感染された細胞中に於け
る精製発現HBsAgの塩化セシウム勾配中の浮遊密度を示
すグラフであり、 第３図は、第１図のウィルスで感染された細胞から得ら
れた精製発現HBsAgである生物の形態を示す電子顕微鏡
写真であり、 第４図は、キメリック（Chimeric）αICP4−HBsAg遺伝
子を含む組換えプラスミドの作製の概略を示すフローシ
ートであり、 第５図は、第４図のプラスミドと無傷のウィルスDNAと
のコトランスフェクションおよびαICP4−HBsAg遺伝子
を含む組換え単純ヘルペスウィルスの選択を示すフロー
シートである。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:92）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(56)参考文献 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，49（３）
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Ｃｅｌｌ，33（1983） Ｐ．145−151
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ｉ．ＵＳＡ．，78（３） （1981）
Ｐ．1441−1445
Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，79 （1982） Ｐ．4917
−4921
Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ．，77（７） （1980）
Ｐ．4201−4205
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．単純ヘルペスウィルス（HSV）の組換えウィルスゲ
ノムであって、前記ゲノムの非必須的領域に永久的に組
込まれ、所望の蛋白質をコードし、かつ単純ヘルペスウ
ィルスのプロモーター調節領域の制御下に発現可能な非
単純ヘルペスウィルスヌクレオチド配列を含むことを特
徴とする組換えウィルスゲノム。 ２．前記非必須的領域及び前記配列が、前記ゲノム中の
選択マーカーによって選択される特許請求の範囲第１項
に記載の組換えウィルスゲノム。 ３．前記マーカーが、前記ゲノムのチミジンキナーゼ
（TK）遺伝子である特許請求の範囲第２項記載の組換え
ウィルスゲノム。 ４．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−１である特許
請求の範囲第１項記載の組換えウィルスゲノム。 ５．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−２である特許
請求の範囲第１項記載の組換えウィルスゲノム。 ６．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信号
と、単純ヘルペスウィルスのアルファ遺伝子プロモータ
ーを含有するプロモーター調節領域と、によってフラン
キングされている特許請求の範囲第１項記載の組換えウ
ィルスゲノム。 ７．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質遺伝
子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請求の範囲
第６項記載の組換えウィルスゲノム。 ８．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質No.4
遺伝子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請求の
範囲第７項記載の組換えウィルスゲノム。 ９．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信号
と、単純ヘルペスウィルスのベータ遺伝子プロモーター
を含有するプロモーター調節領域と、によってフランキ
ングされている特許請求の範囲第１項記載の組換えウィ
ルスゲノム。 １０．前記ベータ遺伝子プロモーターが、前記チミジン
キナーゼ遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第
９項記載の組換えウィルスゲノム。 １１．前記配列が、肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）の構造
コード配列を含む特許請求の範囲第１項記載の組換えウ
ィルスゲノム。 １２．単純ヘルペスウィルス（HSV）のウィルスゲノム
中の非必須的領域に永久的に組込まれ、所望の蛋白質を
コードし、かつ単純ヘルペスウィルスのプロモーター調
節領域の制御下に発現可能な非単純ヘルペスウィルスヌ
クレオチド配列を含むことを特徴とするプラスミドベク
ター。 １３．前記非必須的領域及び前記配列が、前記ゲノム中
の選択マーカーによって選択される特許請求の範囲第12
項に記載のプラスミドベクター。 １４．前記マーカーが、前記ゲノムのチミジンキナーゼ
（TK）遺伝子である特許請求の範囲第13項記載のプラス
ミドベクター。 １５．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−１である特
許請求の範囲第12項記載のプラスミドベクター。 １６．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−２である特
許請求の範囲第12項記載のプラスミドベクター。 １７．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信
号と、単純ヘルペスウィルスのアルファ遺伝子プロモー
ターを含有するプロモーター調節領域と、によってフラ
ンキングされている特許請求の範囲第12項記載のプラス
ミドベクター。 １８．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質遺
伝子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請求の範
囲第17項記載のプラスミドベクター。 １９．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質N
o.4遺伝子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請
求の範囲第18項記載のプラスミドベクター。 ２０．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信
号と、単純ヘルペスウィルスのベータ遺伝子プロモータ
ーを含有するプロモーター調節領域と、によってフラン
キングされている特許請求の範囲第12項記載のプラスミ
ドベクター。 ２１．前記ベータ遺伝子プロモーターが、前記チミジン
キナーゼ遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第
20項記載のプラスミドベクター。 ２２．プラスミドpRB3223（ATCC受託番号39716）を含む
特許請求の範囲第12項記載のプラスミドベクター。 ２３．プラスミドpRB3225（ATCC受託番号39715）を含む
特許請求の範囲第12項記載のプラスミドベクター。 ２４．前記配列が、肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）の構造
コード配列を含む特許請求の範囲第12項記載のプラスミ
ドベクター。 ２５．単純ヘルペスウィルス（HSV）のウィルスゲノム
中の非必須的領域に永久的に組込まれ、所望の蛋白質を
コードし、かつ単純ヘルペスウィルスのプロモーター調
節領域の制御下に発現可能な非単純ヘルペスウィルスヌ
クレオチド配列を含むプラスミドベクターを、適当な宿
主において、無傷の単純ヘルペスウィルスDNAとコトラ
ンスフェクションし、次いで前記非単純ヘルペスウィル
スヌクレオチド配列を含む子孫をスクリーニングするこ
とよって得られた組換えウィルスであって、単純ヘルペ
スウィルス（HSV）のウィルスゲノム中の非必須的領域
に永久的に組込まれ、所望の蛋白質をコードし、かつ単
純ヘルペスウィルスのプロモーター調節領域の制御下に
発現可能な非単純ヘルペスウィルスヌクレオチド配列を
含むことを特徴とする組換えウィルス。 ２６．前記非必須的領域及び前記配列が、前記ゲノム中
の選択マーカーによって選択され、かつ前記子孫が、前
記マーカーの有無に対する選択によってスクリーニング
される特許請求の範囲第25項に記載の組換えウィルス。 ２７．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−１である特
許請求の範囲第25項記載の組換えウィルス。 ２８．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−２である特
許請求の範囲第25項記載の組換えウィルス。 ２９．組換えウィルスR3223（ATCC受託番号VR2086）を
含む特許請求の範囲第25項記載の組換えウィルス。 ３０．組換えウィルスR3225（ATCC受託番号VR2087）を
含む特許請求の範囲第25項記載の組換えウィルス。 ３１．単純ヘルペスウィルス（HSV）の組換えウィルス
ゲノムを製造する方法であって、以下の工程： （１） 単純ヘルペスウィルスのウィルスゲノムを準備
する工程、そして （２） 所望の蛋白質をコードしかつ単純ヘルペスウィ
ルスのプロモーター調節領域の制御下に発現可能な非単
純ヘルペスウィルスヌクレオチド配列を、前記ゲノムの
非必須的領域に、永久的に組込む工程、 を含むことを特徴とする方法。 ３２．前記非必須的領域及び前記配列が、前記ゲノム中
の選択マーカーによって選択される特許請求の範囲第31
項に記載の方法。 ３３．前記マーカーが、前記ゲノムのチミジンキナーゼ
（TK）遺伝子である特許請求の範囲第32項記載の方法。 ３４．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−１である特
許請求の範囲第31項記載の方法。 ３５．前記単純ヘルペスウィルスが、HSV−２である特
許請求の範囲第31項記載の方法。 ３６．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信
号と、単純ヘルペスウィルスのアルファ遺伝子プロモー
ターを含有するプロモーター調節領域と、によってフラ
ンキングされている特許請求の範囲第31項記載の方法。 ３７．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質遺
伝子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請求の範
囲第36項記載の方法。 ３８．前記プロモーター調節領域が、感染細胞蛋白質N
o.4遺伝子のアルファ遺伝子プロモーターを含む特許請
求の範囲第37項記載の方法。 ３９．前記配列が、各端部において、適当な転写終結信
号と、単純ヘルペスウィルスのベータ遺伝子プロモータ
ーを含有するプロモーター調節領域と、によってフラン
キングされている特許請求の範囲第31項記載の方法。 ４０．前記ベータプロモーターが、前記チミジンキナー
ゼ遺伝子のプロモーターである特許請求の範囲第39項記
載の方法。 ４１．前記配列が、肝炎Ｂ型表面抗原（HBsAg）の構造
コード配列を含む特許請求の範囲第31項記載の方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP5174769A Expired - Lifetime JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5174769A Expired - Lifetime JP2641688B2 (ja) | 1984-06-04 | 1993-06-22 | ヘルペスウィルスベクターを使用する蛋白質の製造方法 |
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|---|---|
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