KR20100134078A

KR20100134078A - 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법

Info

Publication number: KR20100134078A
Application number: KR20107024394A
Authority: KR
Inventors: 료이치 카와무라; 타카유키 이마무라; 히토미 오와키
Original assignee: 잇빤 자이단호진 가가쿠오요비겟세이료호겐쿠쇼
Priority date: 2008-04-16
Filing date: 2009-04-15
Publication date: 2010-12-22
Also published as: EP2269594A4; US9149557B2; AU2009236960A1; CA2721335A1; CN102105141A; JP5437236B2; WO2009128474A1; JPWO2009128474A1; EP2269594B1; EP2269594A1; CN102105141B; US20110038847A1

Abstract

트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법을 제공한다. 유효성분으로서 트롬빈, 유연화제로서 글리세롤, 침투화제로서 트윈 80을 함유하고, 경우에 따라서는 안정화제로서 히스티딘 및 트레할로오스를 함유하는 트롬빈 충전액에, 폴리글리콜산으로 이루어지는 생체 흡수성 시트를 침지시키고, 트롬빈을 상기 생체 흡수성 시트 상에 건조 고정화하는 공정으로 이루어지는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법, 및 상기 방법에 의해 수득되는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제.

Description

트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법{METHOD OF PRODUCING THROMBIN-IMMOBILIZED BIOABSORBABLE SHEET PREPARATION}

본 발명은 트롬빈을 고정화한 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는, 유효성분으로서 트롬빈, 첨가제로서 다가 알코올, 계면활성제, 아미노산 및 올리고당을 함유하는 용액에, 생체 흡수성의 시트상 지지체를 침지시키고, 건조시키는 것에 의한, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법, 및 당해 제조방법에 의해 수득되는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 관한 것이다.

트롬빈은 지혈 혈전의 형성이나 창상치유 등의 생명 유지 진전에 불가결한 작용을 가지는 혈액응고에 관여하는 효소이다. 트롬빈은 통상 혈중에서는 불활성 프로트롬빈으로 존재하지만, 예를 들면, 혈소판이나 조직 세포의 손상을 기인으로 하는 응고계의 활성화에 의해, 가용성 형태의 피브리노겐을 지혈 및 창상치유에 유용한 불용성의 피브린으로 변환시킨다. 본 원리를 이용한 지혈제는 폭넓은 임상 현장에서 응용되고 있다.

트롬빈은 오래 전부터 지혈제의 유효성분으로 사용되고 있지만, 종래의 액상형 지혈제에서는 분출성ㆍ용출성의 출혈 부위에 대한 압박 지혈ㆍ압박 폐쇄가 불가능하기 때문에, 출혈을 멈추게 할 수가 없다.

이러한 분출성ㆍ용출성의 출혈에 대한 지혈을 목적으로 하여, 트롬빈, 피브리노겐 및/또는 혈액 응고인자를 콜라겐 스펀지, 알긴산, 폴리글리콜산으로 이루어지는 부직포, 젤라틴 또는 하이드로겔로 이루어지는 다른 생체 흡수성 지지체에 고정화한 시트형 지혈제의 개발이 시도되고 있다(예를 들면, 특허문헌 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 참조).

그렇지만, 그 대부분이 두껍고, 또 건조 상태에서 장기 폐쇄 부위에 적용하는 경우에는 지지체 자신의 단단함이 영향을 주기 때문에 유연성이 부족하게 되어, 창상면에 밀착시키는 것이 어렵고, 그 때문에 충분한 접착 효과가 얻어지지 않는 등의 문제가 있어서 실용화되지 않고 있다.

말 유래의 콜라겐으로 이루어지는 지지체에 피브리노겐과 소 유래의 트롬빈이 고정된 시트형 피브린 접착 제제(제품명: TachoComb/CSL Behling사)가 유일하게 제품화되어 있지만(예를 들면, 특허문헌 8 참조), 시트의 두께(약 3mm)나 동물 유래 성분을 함유하는 등 조작성이나 위험 인자의 배제에 있어서 개선의 여지가 있다.

한편으로, 트롬빈의 안정화제에 관한 여러 가지의 보고가 있다. 예를 들면 액제에 대해서는, 유기 카르복시산염(예를 들면, 특허문헌 9 참조)이나 글리세롤(예를 들면, 특허문헌 10, 11 및 12 참조)을 함유시키는 것에 의해, 또 바이알 내나 알루미늄 파우치 포장된 건조 제제에 대해서는, 당, 염기성 아미노산 및 유기산 액제(예를 들면, 특허문헌 13 참조), 젤라틴, 글리신 및 당(예를 들면, 특허문헌 14 참조), 지방족 다염기 카르복시산 및 알부민(예를 들면, 특허문헌 15 참조) 또는 인간 혈청 알부민 및 아미노산(예를 들면, 특허문헌 16 참조)을 함유시키는 것에 의해, 트롬빈을 안정적으로 유지시키는 방법이 보고되고 있다. 그러나, 시트형 제제에 있어서는, 단순하게 트롬빈을 안정화시키는 것 만으로는 목적이 달성되지 않는다.

시트 제제를 사용할 때는, 이것을 창상 부위에 밀착시키기 위해서 뭉치거나, 절곡시키는 경우가 있으므로, 이러한 힘에 대해서 시트의 파손이나 트롬빈 성분의 탈락이 일어나지 않도록 시트의 유연성이나 트롬빈 유지력을 올릴 필요가 있다.

예를 들면, 상술한 당, 염기성 아미노산 및 유기산 액제를 함유시킨 트롬빈 제제에서는, 이것을 시트에 고정시킨 경우에는 유연성이 없어지기 때문에 시트형의 제제에는 적합하지 않다. 또, 트롬빈 용액에 부직포를 침지시켜 단순하게 동결건조한 경우에는 트롬빈이 부직포에 고정화되지 않는다. 이러한 과제를 해결하기 위해서 키틴 부직포를 지지체로 하고, 이것을 콘드로이친황산, 알긴산 또는 히알우론산 등의 산성 고분자 용액, 키토산 등의 염기성 고분자 용액 및 트롬빈 용액의 3종 용액에 교호로 침지시켜서 트롬빈을 고정화하고, 진공 혹은 송풍건조시켜서 시트상 지혈제나 시트상 창상 치료제로 사용하는 기술이 보고되고 있다(예를 들면, 특허문헌 17 참조). 그렇지만, 이러한 교호 흡착시키는 방법은 시트의 유연성은 확보할 수 있어도, 트롬빈의 활성저하는 방지할 수 없고, 또 제조과정에 있어서도 조작이 번잡한 등, 보다 효과적인 제제화 방법의 개발이 요구되고 있다.

일본 특허공보 S61-59737호 일본공개특허공보 H05-163157호 일본공표특허공보 2002-515300호 미국특허 제4453939호 일본공표특허공보 H09-510357호 일본공표특허공보 2000-510357호 일본공표특허공보 2001-513368호 유럽특허 제0059265호 일본공개특허 S56-39782호 일본공개특허 S62-106028호 일본특허공보 H07-64747호 일본공개특허공보 S63-192723호 일본공개특허공보 H02-53732호 일본공개특허공보 H07-165604호 일본공개특허공보 2002-193832호 일본공개특허공보 2006-117678호 일본공개특허공보 2006-306759호.

상술한 바와 같이, 트롬빈을 유효성분으로 함유하는 시트형의 제제는 이미 개발되어 있지만, 시트 제제의 유연성, 트롬빈의 안정성이나 유지력, 및 번잡한 제조과정 및 미지의 위험인자의 배제에 있어서는 여전히 개선의 여지가 남아 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기 문제를 해결하고, 편리성이 높은 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법 및 당해 제조방법에 의해 수득되는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위해서 예의 연구를 거듭한 결과, 트롬빈 용액에 글리세롤을 함유시키는 것에 의해, 동결건조 분체의 과잉 형성을 억제할 수 있는 것, 및 시트 제제로 하였을 때 유연성을 유지할 수 있는 것, 그 결과, 건조 후의 분체비산에 의한 트롬빈 성분의 탈락이나 부직포 상에서의 파손을 회피할 수 있는 것을 발견하였다. 또, 트윈 80을 첨가하는 것에 의해 트롬빈의 부직포로의 침투성이 증대하는 것, 및 트레할로오스와 소량의 히스티딘을 첨가하는 것에 의해, 이것을 건조 제제로 하였을 때에 트롬빈의 안정성이 각각을 단독으로 첨가하였을 때보다도 각별하게 상승하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 따라서 본 발명은 다음과 같다.

〔1〕하기 (1)에서 (3)의 공정으로 이루어지는, 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법.

(1) 유효성분을, 유연화제 및 침투화제를 함유하는 충전액에 혼합하는 공정,

(2) 상기 (1)의 충전액을 생체 흡수성 시트에 적하 또는 상기 (1)의 충전액에 생체 흡수성 시트를 침지시키는 공정, 및

(3) 상기 (2)의 생체 흡수성 시트를 건조하는 공정.

〔2〕 상기 〔1〕에서, 유효성분이 트롬빈 또는 피브리노겐인 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔3〕 상기 〔2〕에서, 트롬빈의 농도가 1000∼2000 단위/㎖인 제조방법.

〔4〕 상기 〔1〕내지 〔3〕 중 어느 하나에서, 유연화제가 다가 알코올 또는 글리코사미노글리칸, 침투화제가 계면활성제인 〔1〕내지 〔3〕의 어느 하나의 제조방법.

〔5〕 상기 〔4〕에서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 글리코사미노글리칸이 히알우론산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 및 헤파란황산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 및 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트(Sucrose monolaurate), 콜산나트륨(Sodium Cholate), 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드(n-Octylglucoside), n-도데실말토사이드(n-Dodecylmaltoside) 및 디기토닌(Digitonin)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔6〕 상기 〔1〕내지 〔5〕 중 어느 하나에서, 충전액이 추가로 아미노산 및 올리고당을 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔7〕 상기 〔6〕에서, 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글루탐산, 글리신 및 아스파라긴산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 및 올리고당이 만니톨, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨 및 에리스리톨로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔8〕 상기 〔1〕내지 〔3〕 중 어느 하나에서, 충전액이 첨가제로서 글리세롤, 트윈 80, 히스티딘 및 트레할로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔9〕 상기 〔1〕내지 〔8〕 중 어느 하나에서, 유연화제의 농도가 1∼2% 및 침투화제의 농도가 0.01∼1%인 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔10〕 상기 〔6〕내지 〔9〕 중 어느 하나에서, 아미노산의 농도가 2.4∼180mM, 올리고당의 농도가 5∼40㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조방법.

〔11〕 상기 〔1〕내지 〔10〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 제조방법.

〔12〕 유효성분으로서 트롬빈 및 첨가제로서 유연화제, 침투화제, 아미노산 및 올리고당을 함유하는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제.

〔13〕 상기 〔12〕에서, 트롬빈의 농도가 1000∼2000 단위/㎖인 제제.

〔14〕 상기 〔12〕 또는 〔13〕에서, 유연화제가 다가 알코올 또는 글리코사미노글리칸, 침투화제가 계면활성제인 것을 특징으로 하는 제제.

〔15〕 상기 〔14〕에서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 글리코사미노글리칸이 히알우론산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 및 헤파란황산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 및 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.

〔16〕 상기 〔12〕내지 〔15〕 중 어느 하나에서, 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글루탐산, 글리신 및 아스파라긴산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 및 올리고당이 만니톨, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨 및 에리스리톨로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.

〔17〕 상기 〔12〕 또는 〔13〕에서, 첨가제로서 글리세롤, 트윈 80, 히스티딘 및 트레할로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 제제.

〔18〕 상기 〔12〕내지 〔17〕 중 어느 하나에서, 유연화제의 농도가 1∼2%, 침투화의 농도제가 0.01∼1%, 아미노산의 농도가 2.4∼180mM 및 올리고당의 농도가 5∼40㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제제.

〔19〕 상기 〔12〕내지 〔18〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트가, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 제제.

〔20〕생체 흡수성 시트 제제의 유연화제로서의 다가 알코올의 용도.

〔21〕 상기 〔20〕에서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.

〔22〕 상기 〔20〕 또는 〔21〕에서, 다가 알코올의 농도가 1∼2%인 것을 특징으로 하는 용도.

〔23〕 상기 〔20〕내지 〔22〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 용도.

〔24〕 상기 〔20〕내지 〔23〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트 제제가 트롬빈 또는 피브리노겐을 생체 흡수성 시트에 고정화한 것임을 특징으로 하는 용도.

〔25〕생체 흡수성 시트 제제에 있어서의 유효성분의 침투화제로서의 계면활성제의 용도.

〔26〕 상기 〔25〕에서, 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.

〔27〕 상기 〔25〕 또는 〔26〕에서, 계면활성제의 농도가 0.01∼1%인 것을 특징으로 하는 용도.

〔28〕 상기 〔25〕내지 〔27〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 용도.

〔29〕 상기 〔25〕내지 〔28〕 중 어느 하나에서, 생체 흡수성 시트 제제가 트롬빈 또는 피브리노겐을 생체 흡수성 시트에 고정화한 것임을 특징으로 하는 용도.

본 발명에 따르면, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제 및 그 제조방법이 제공된다. 본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 예를 들면, 글리세롤, 트윈 80, 트레할로오스 및 소량의 히스티딘을 함유하는 트롬빈 용액에, 폴리글리콜산으로 이루어지는 생체 흡수성 시트를 침지시키고, 동결건조시키는 것에 의해 제조된다. 글리세롤을 함유시키는 것에 의해, 트롬빈 성분이 생체 흡수성 시트로부터 탈락하는 것을 저지하며, 또한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성을 부여할 수 있다. 또 트윈 80을 함유시키는 것에 의해, 트롬빈의 생체 흡수성 시트에로의 침투성을 올릴 수 있고, 트롬빈의 고정화가 용이해진다. 또 트레할로오스와 소량의 히스티딘을 함유시키는 것에 의해, 건조 제제로 하였을 때에 트롬빈의 활성을 충분하게 유지할 수 있다. 따라서, 본 발명은 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조를 쉽게 한다. 또, 본 발명의 제조방법에 의해 제제화된 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 트롬빈의 안정성과 생체 흡수성 시트 제제로서 필요한 유연성을 갖는다.

또, 본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 트롬빈이 매우 신속하게 액 중으로 용출하므로, 트롬빈 고정화 시트가 액상의 피브리노겐이나 혈액과 접촉하는 즉시 트롬빈의 효소활성을 발현할 수 있다. 즉, 접착 폐쇄면이나 활동성 출혈부위에 있어서 신속하게 트롬빈이 용출하여 피브리노겐을 기질에 효소활성을 발휘하고, 조속히 피브린 전환을 가져와서 효과적인 조직 접착 폐쇄효과, 지혈효과를 가져오는 것이 기대된다.

도 1은 글리세롤 첨가ㆍ미첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 형상을 나타내는 도면이다.
도 2는 글리세롤 첨가·미첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성값을 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 혈청 알부민 첨가·미첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 4는 여러 종류의 올리고당 첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 5는 각 농도의 만니톨 또는 트레할로오스 첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 6은 각종 아미노산 첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
도 7은 각 농도의 히스티딘 및 트레할로오스 첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서의, 일정기간 보존 후의 트롬빈의 잔존 활성율을 나타내는 도면이다.
No.1: 히스티딘 미첨가, No.2: 히스티딘 2.4mM, No.3: 히스티딘 4.8mM, No.4: 히스티딘 9.6mM, No.5: 히스티딘 22.5mM, No.6: 히스티딘 45mM, No.7: 히스티딘 90mM, No.8: 히스티딘 180mM
도 8은 각종 계면활성제 첨가·미첨가 트롬빈 충전액에 침지시킨 생체 흡수성 시트가 일정시간에 흡수한 액 중량을 나타내는 도면이다.
No.1: 계면활성제 미첨가, No.2: 트윈 80(Tween 80), No.3: 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), No.4: 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), No.5: 수크로오스 모노라우레이트, No.6: 콜산나트륨, No.7: 트윈 20(Tween 20), No.8: 트리톤 X-100(Triton X-100), No.9: 노니데트 P-40(Nonidet P40), No.10: 황산-3-\(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), No.11: n-옥틸글루코사이드, No.12: n-도데실말토사이드, No.13: 디기토닌.
도 9는 각 농도의 트윈 80 첨가·미첨가 트롬빈 충전액에 침지시킨 생체 흡수성 시트가, 일정 시간에 흡수한 액중량을 나타내는 도면이다.
도 10은 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성 비교시험 방법을 나타내는 도면이다.
도 11은 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성 비교시험 결과를 나타내는 도면이다.

본 발명은 트롬빈을 고정화한 생체 흡수성 시트 제제의 유연화제로서 효과를 가지는 다가 알코올, 트롬빈의 생체 흡수성 시트로의 침투성을 높이는 계면활성제, 트롬빈 성분의 안정성을 유지시키는 특정한 아미노산 및 올리고당을 함유하는 충전액을 사용하는 것에 의한, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법, 및 당해 방법에 의해 수득된 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 의해 특징된다.

본 발명에 사용되는 트롬빈 성분은 일반적으로 시약으로 시판되고 있는 트롬빈(예를 들면, 인간 혈장 유래 트롬빈(Sigma-Aldrich사의 품번 T6884 등)), 저온 에탄올 분획이나 크로마토그래피 조작 등에 의해 동물의 혈액으로부터 조제되는 생체 유래의 트롬빈 또는 유전자 재조합 기술에 의해 수득되는 재조합 트롬빈의 어느 것을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 미지의 감염 인자나 위험 인자의 혼입을 배제하기 위해서, 재조합 트롬빈이 사용된다. 유전자 재조합 기술을 이용하는 경우에는, 지혈을 실시하는 대상 동물로부터 취득한 트롬빈 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.

트롬빈은 생체에서는 그 전구체인 프로트롬빈으로서 비타민 K 의존적으로 간세포에서 생합성되고, 세포막 인지질 상에서 FXa-FVa 복합체에 의해 한정 분해(절단은 프로트롬빈의 Arg320-ILe321 및 Arg271-Thr272 사이의 2곳)를 받아서 트롬빈이 된다. 트롬빈을 유전자 재조합 기술에 의해 취득하는 경우에는, 일단 프로트롬빈의 형태로 발현시키고, 이것을 정제 후에 에카린 처리하여 트롬빈으로 변환할 수 있다.

예를 들면, 인간 프로트롬빈 유전자는 인간 간장으로부터 추출된 전체 RNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 출발 재료로 하여, Sambrook 들이 기술하고 있는 일반적인 유전자 재조합 기술(Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989)에 따라서 조제할 수 있다. 오늘날에는 여러 종류의 키트가 시판되고 있으므로, 이것을 사용할 수 있다. 예를 들면, RNA의 추출에는 TRIzol시약(Invitrogen사), ISOGEN(NIPPON GENE사), Strata Prep Total RNA Purification Kit(TOYOBO사) 등의 시약, mRNA의 정제에는 mRNA Purification Kit(Amersham Bioscience사), Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit(TOYOBO사), mRNA Separator Kit(Clontech사) 등의 키트, cDNA에로의 변환에는, T-Primed First Strand Kit(Amersham Pharmacia사), SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning(Invitrogen사), cDNA Synthesis Kit(TakaraShuzo사), SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits(Clontech사), Directionary cDNA Library Construction systems(Novagen사), GeneAmp PCR Gold(Applied Biosystems사) 등이 사용된다.

이렇게 해서 수득된 인간 트롬빈 유전자는 적당한 발현 벡터에 삽입되고, 그 발현 벡터에 의해 숙주, 예를 들면 동물세포의 형질전환이 수행된다. 발현 벡터에는 특별한 제약은 없지만, 외래 유전자에 적당한 프로모터 등의 발현 조절영역, 종지 코돈, 폴리 A 부가 시그널 서열, kozack 서열, 분비신호 등이 부가된다. 당해 발현 벡터에 포함되는 프로모터는 숙주로 사용하는 동물세포와의 조합에 의해, SV40초기, SV40후기, 사이트메가로바이러스 프로모터, 닭 β 액틴 등, 최종적으로 외래 유전자가 발현하는 것이라면 어느 것일 수 있다. 바람직하게는, 닭 β-액틴 프로모터계 발현 플라스미드 pCAGG(일본 공개특허공보 H03-168087)가 사용된다. 선택이나 유전자 증폭의 마커 유전자로서, neo유전자나 디하이드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자, 퓨로마이신 내성효소 유전자, 글루타민 합성효소(GS) 유전자 등 일반적으로 알려져 있는 선택이나 유전자 증폭용 마커 유전자를 이용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 숙주로서는 각종 포유류 유래의 배양세포를 널리 이용할 수 있고, 적합하게는 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO 세포), 인간 유래 293세포 또는 새 유래세포 등이 예시된다. 동물세포에로의 유전자 도입방법에도 특별한 제약은 없다. 예를 들면 인산 칼슘법, DEAE 덱스트란법, 리포펙틴계의 리포솜을 사용하는 방법, 프로토플라스트 폴리에틸렌글리콜 융합법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있고, 사용하는 숙주세포에 따라서 적당한 방법을 선택할 수 있다(Molecular Cloning(3rd Ed.), Vol3, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)). 배양에 사용하는 배지로서 그 형상으로부터 한천배지, 액체배지, 그 종류로부터 YMM-01, DMEM, RPMI, αMEM 등이 사용되지만, 세포나 배양목적, 혹은 배양단계에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 각각의 배지의 프로토콜에 따라서 혈청, 아미노산, 비타민, 당, 항생물질, pH조정용 완충액 등을 첨가한 것이 사용된다. 배지의 pH는 6∼8, 배양온도는 30℃∼39℃의 범위가 설정된다. 배지의 양, 첨가물 및 배양시간은 배양 스케일에 맞추어서 적당하게 조절된다.

인간 프로트롬빈 생산세포는 항트론빈 항체를 사용한 특이반응을 이용한 검출방법, 예를 들면 Dot-Blot, Western Blot, 샌드위치 ELISA 등의 방법에 의해, 클론화된 약제 내성세포의 배양액 중의 인간 프로트롬빈을 검출하는 것에 의해 취득할 수 있다. 이렇게 해서 수득된 인간 프로트롬빈 생산세포는, 무혈청 배지에 순응화시킨 후, 공업생산 레벨의 대량배양이 수행된다. 대량배양의 방법으로서는, Fed-Batch 배양, 배치배양 등을 일반적으로 사용할 수 있지만, 임의의 방법일 수도 있다.

이러한 프로트롬빈 생산세포로부터 인간 프로트롬빈을 정제할 때는, 일반적으로 단백질 화학에 있어서 사용되는 정제방법, 예를 들면 염석법, 한외여과법, 등전점침전법, 전기영동법, 이온교환 크로마토그래피법, 겔여과 크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 소수 크로마토그래피법, 하이드록시애퍼타이트 크로마토그래피법 등의 방법을 사용할 수 있다. 실제로는, 세포 유래의 다종류의 불순물이 혼재하기 때문에, 상기 방법의 조합에 의해 수행되는 경우도 있다.

인간 프로트롬빈의 인간 트롬빈으로의 변환에는, 재조합 에카린을 사용하는 것이 바람직하다. 재조합 에카린은 특허공보(WO2003/004641)에 기재된 방법에 따라서 조제할 수 있다. 간단하게는, Nishida 들의 방법에 따라서, 사독(뱀독) 에카린 cDNA를 조제하고(S. Nishida et. Al., Biochemistry, 34,1771-1778, 1995), 이것을 본 발명에서 사용한 닭 β-액틴 프로모터계 발현 플라스미드 pCAGG에 결합한다. 수득된 발현 벡터를 동물세포, 예를 들면 CHO 세포에 도입하고, 재조합 에카린 생산세포를 얻는다. 재조합 에카린은 양이온교환 크로마토그래피, 겔여과를 실시하는 것에 의해 정제할 수 있다. 이렇게 해서 정제된 재조합 에카린을 인간 프로트롬빈에 작용시키고, 인간 트롬빈으로의 변환이 수행된다. 반응조건은 통상의 효소반응과 같은 조건이 사용된다. 예를 들면 인간 프로트롬빈 1000㎍/㎖로 최종농도 2-8 Unit/㎖의 에카린을 첨가하고, 36-38℃에서 1-4시간 반응시키는 것에 의해 인간 프로트롬빈의 인간 트롬빈으로의 변환은 완료한다.

에카린 처리액으로부터 인간 트롬빈을 정제할 때는, 상기의 단백정제 방법에 제공하는 것에 의해 수행된다. 바람직하게는, 벤즈아미딘 크로마토그래피와 양이온교환 크로마토그래피의 조합에 의한 정제방법을 사용할 수 있다. 벤즈아미딘 크로마토그래피에서는 인간 트롬빈을 pH 7-9, 0.3-0.7M NaCl 함유 완충액으로 평형화한 칼럼에 흡착시키고, 동일 완충액으로 세정후, 0.1M의 벤즈아미딘 염산염 함유 동일 완충액에 의해 용출한다.

다음에, 상기의 인간 트롬빈 용출액은 양이온교환 크로마토그래피에 제공된다. 양이온교환체로서 설포프로필기형, 카르복시메틸기형의 교환기를 가지는 지지체가 개발되어 있지만, 적당하게 선택해서 사용할 수 있다. 본 발명에서는, SP토요펄550C(토소사)가 사용된다. 인간 트롬빈은 pH6-7, 0.2M NaCl 함유 10mM 시트르산 완충액으로 평형화한 칼럼에 흡착시키고, 동일 완충액으로 세정후, 0.6M NaCl 함유 동일 완충액으로 용출된다. 이렇게 해서 고순도의 인간 트롬빈을 취득할 수 있다.

수득된 인간 트롬빈의 활성단위는 응고활성, 합성기질(S-2238) 절단활성으로 표시된다. 응고활성값은 피브리노겐이 응고하는 시간을 표준품의 검량선과 비교해서 구해지는 상대값을 나타낸 것이다. 이러한 표준품으로서, 일본약전 표준품 및 WHO 국제 표준품(NIBSC사)의 트롬빈을 사용할 수 있다. 또한 S-2338 절단활성은 트롬빈과 그 특이적인 기질과의 반응을 이용한 것으로, 합성기질 S-2238을 트롬빈이 절단함으로써 유리해 오는 p-니트로아닐린 양을 OD405/650의 흡광도 변화로 측정하는 것에 의해 수행된다.

이렇게 해서 수득된 재조합 인간 트롬빈(이하, 단순하게 「트롬빈」이라 부르는 경우도 있다)은 생체 흡수성 시트에 고정된다. 당해 생체 흡수성 시트의 형체로서는 생체 흡수성의 합성섬유를 시트상으로 가공한 직물, 직포 또는 부직포 등, 어느 정도의 유연성, 신축성을 가지는 것이라면 어떠한 것을 사용할 수 있다. 생체 흡수성의 합성 섬유는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되지만, 폴리글리콜산을 기재로서 편·직성(織成)된 편·직지(織地)를 니들펀칭하고, 부직포화하는 것에 의해 제조되는 폴리글리콜산계 부직포를 사용하는 것이 바람직하다.

트롬빈을 생체 흡수성 시트에 고정할 때의 용액(이하, 「트롬빈 충전액」이라 부르는 경우도 있다)에는, 지혈제의 유효성분인 트롬빈의 이외에, 트롬빈 자신의 활성을 유지하기 위한 안정화제, 생체 흡수성 시트에 고정화된 트롬빈 성분의 탈락이나 비산을 저지하기 위한 유연화제, 및 트롬빈의 생체 흡수성 시트에로의 침투성을 높이기 위한 침투화제가 첨가된다. 트롬빈 충전액 중에 포함되는 트롬빈의 양은, 일반적으로 지혈작용을 발휘하는 농도범위, 예를 들면 최종농도 100∼5000 단위/㎖로 사용된다. 바람직하게는, 1000∼2000 단위/㎖이다.

트롬빈의 활성소실 또는 저하는 트롬빈을 보존하는 동안에 이것이 응집해서 발생하는 것에 기인한다. 따라서 트롬빈의 안정화제로서는 트롬빈의 응집체 형성을 억제할 수 있는 물질이 사용된다. 이러한 물질로서 단백, 예를 들면 알부민, 특정한 아미노산 및 올리고당을 들 수 있다.

아미노산으로서는 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글루탐산, 글리신 및 아스파라긴산을 들 수 있다. 글루탐산 및 히스티딘은 안정제로서 특히 높은 효과가 예상되지만, 다량으로 사용하면 글루탐산은 신경독성이 걱정되기 때문에, 안전성의 관점에서 히스티딘을 사용하는 것이 바람직하다. 아미노산의 최종농도로서는 2.4∼180mM이 사용 가능하다.

올리고당으로서는 보존기간 동안에 있어서 트롬빈의 활성유지에 효과를 가지는 것이 사용된다. 이러한 올리고당으로서, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨, 에리스리톨 및 만니톨을 들 수 있다. 트레할로오스는 외과수술 시에 장기 표면에 보충함으로써 조직의 변성을 억제하여 건조성 유착을 방해한다는 보고(http://www.vm.a.u-tokyo.ac.jp/vmc/achievement/treharose.html, 혹은 http:// www.next21.info/press/images/20050624Treha.pdf)가 있어, 안정화제로서의 효과뿐만 아니라 폐쇄 처치면과 다른 장기의 유착을 경감시키는 효과도 기대된다. 그 때문에, 트레할로오스를 사용하는 것이 바람직하다. 올리고당의 최종농도로서는 5∼40㎎/㎖가 사용 가능하다.

아미노산과 올리고당을 함께 사용하는 것에 의해, 각각 단독으로 사용하였을 때와 비교해서, 트롬빈의 안정성에 있어서 상승효과를 얻을 수 있다. 따라서 본 발명의 트롬빈 충전액은 아미노산과 올리고당의 양쪽을 함유하는 것으로, 이것들의 혼합비는 상기의 사용범위로 적당하게 조정된다. 바람직하게는 아미노산 22.5∼180mM, 올리고당 30∼40㎎/㎖의 농도가 사용된다. 가장 바람직한 형태는 히스티딘 180mM, 트레할로오스 40㎎/㎖이다.

유연화제 및 침투화제로서는 트롬빈의 활성에 영향을 미치지 않고, 생체 흡수성 시트 제제의 유연성을 유지할 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다.

이러한 유연화제로서 다가 알코올이나 히알우론산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 및 헤파란황산 등의 글리코사미노글리칸을 들 수 있다. 바람직하게는 다가 알코올이다. 다가 알코올로서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트를 들 수 있지만, 여러 종류의 치료약이나 백신의 안정화제로서 실적이 있는 글리세롤을 사용하는 것이 바람직하다. 유연화제의 최종농도는 1∼2%의 범위로 사용할 수 있다.

침투화제로서는 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌 등의 계면활성제가 사용된다. 바람직하게는 트윈 80이다. 침투화제의 농도는 0.01∼1%의 범위로 사용할 수 있지만, 바람직하게는 0.01∼0.1%이다. 본 발명의 유연화제나 침투화제는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제로 한정되지 않고, 다른 지혈성분 단백, 예를 들면 피브리노겐을 고정화한 생체 흡수성 시트 제제를 제조할 때에도 유효하게 사용할 수 있다.

트롬빈 충전액의 조제에 사용되는 완충액으로서는 인산완충액, Tris 완충액, 시트르산 완충액 등이 사용되고, 그 pH 범위는 6.0∼8.0이다. 필요에 따라서 적당량의 다른 첨가제, 예를 들면 염화칼슘, 염화나트륨 등의 염이나 수크로오스나 만니톨 등의 부형제를 첨가할 수 있다.

본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는, 예를 들면 적당한 용기에 장전한 폴리글리콜산으로 이루어지는 생체 흡수성 시트에 트롬빈 충전액을 적하하거나, 또는 트롬빈 충전액을 붓은 용기에 당해 생체 흡수성 시트를 침지시키고, -80℃에서 동결 후, 건조시키는 것에 의해 취득할 수 있다. 혹은, 트롬빈 충전액이 충전된 생체 흡수성 시트를 자연건조시킬 수도 있다. 트롬빈 충전액에 침투화제를 포함시킴으로써, 트롬빈의 당해 생체 흡수성 시트에로의 침투성을 높일 수 있다. 또 건조에 의해 수분이 제거되는 과정에서 트롬빈은 안정화제 및 유연화제에 포함된 상태에서 생체 흡수성 시트의 섬유 상에 안정되게 고정된다. 수득된 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 폴리에틸렌-알루미늄 2층 필름봉지에 건조제와 함께 넣어서 밀봉 포장하는 것에 의해, 실온(22∼25℃)에서 보존된다.

이렇게 해서 수득된 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 평가는 생체 흡수성 시트 상에 고정화된 트롬빈의 유지율, 성형 후의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성 및 트롬빈의 안정성 등을 조사하는 것에 의해 수행된다.

트롬빈의 생체 흡수성 시트상의 유지율은 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 생리식염수나 적당한 완충액에 침지시켜서 진탕하는 것에 의해 용출된 트롬빈의 활성과 충전시의 활성을 비교하는 것에 의해 산출된다. 트롬빈 활성의 측정에는 전술한 응고활성이나 합성기질 절단활성을 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 80% 이상의 유지율을 가지는 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 취득할 수 있다.

본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성은 다음과 같이 해서 평가된다. 즉, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트를 적당한 크기에 절단하고, 일변을 대좌(받침대)에 고정한 후, 대좌로부터 수평방향으로 돌출한 부분에, 약 55㎎/㎖로 조제한 피브리노겐액을 적하한다. 피브리노겐액은 생체 흡수성 시트 상에 고정된 트롬빈의 작용에 의해 즉시 피브린으로 전환되고, 시트는 그 중력에 의해 수직방향으로 아래로 늘어진다. 돌출부분의 선단이 수평 수준선으로부터 어느 정도 아래로 늘어졌는지를 계측하는 것에 의해, 유연성이 평가된다.

트롬빈의 안정성은 장기보존 후의 트롬빈의 잔존 효소활성이나 트롬빈 분자의 응집이나 분해의 정도를 보는 것에 의해 평가된다. 잔존 효소활성은 상기의 트롬빈의 유지율과 같은 요령으로 효소활성을 측정하는 것에 의해 수행된다. 또 트롬빈 분자의 응집이나 분해의 정도를 조사할 때는, 시트로부터 용출한 트롬빈 분자의 일부를 SDS-PAGE나 크기 배제 고속 액체크로마토그래피에 의해 수행된다.

본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 창상 부위나 지혈부위에 붙이는 것에 의해 조직의 접착제로서 사용될 수 있는 것으로, 출혈의 정도에 따라서 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 단독으로 적용하는 방법과, 피브린 접착제제의 1성분인 피브리노겐과 동시에 적용하는 방법을 취할 수 있다.

소화기 외과 분야에 있어서, 간장이나 비장의 부분분리나 부분파열 등의 손상 시에 발생하는 용출성 출혈에 대해서는, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 환부면에 단독으로 적용하고, 3∼5분간 압박함으로써 지혈할 수 있다. 한편, 피브린 접착제제의 1성분인 피브리노겐과 동시에 적용하면, 폐쇄 효과나 지혈효과가 증강된다. 예를 들면 호흡기 외과영역에 있어서는, 폐의 팽창·수축압이 발생하는 폐흉막 박리면, 폐엽실질 분리면, 혹은 기관지 단단부(斷端部)로부터의 기누(氣漏)부분도 효과적으로 폐쇄할 수 있다. 또, 자궁이나 태반주변의 용출성 출혈에 있어서는, 혈관이 많이 둘러쳐 있어, 절개나 절제에 동반하는 출혈의 리스크가 높기 때문에, 출혈점이 불명료하게 되어 지혈처리가 매우 곤란하지만, 본 발명에서는 일회의 처치로 일정면적을 동시에 폐쇄하는 것을 가능하게 한다.

가장 효과가 발휘되는 것은, 높은 혈압이 걸리는 동맥의 손상 부위나 인공혈관의 봉합처치로부터의 분출성 출혈에 적용하는 경우로서, 충분한 양의 피브리노겐을 적용 부분에 유지시키면서, 신속 또한 강고한 피브린을 형성하는 것으로 지혈을 가능하게 한다.

이상과 같이, 공기압이나 혈압에도 견딜수 있는 접착·폐쇄 효과는 본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제가 유연성이 풍부하고, 조직의 요철에 추종함으로써 밀착성이 높아지는 것, 신속하게 트롬빈이 용출해 피브리노겐을 피브린에 전환됨으로써 수득된다.

이하, 실시예에 따라서, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기의 실시예에 전혀 한정되지 않는다.

실시예

< 실시예 1: 글리세롤 첨가에 의한 동결건조 분체의 과잉형성의 억제>

최종농도 1% 또는 1.5% 또는 2% 글리세롤, 1875 단위/㎖ 트롬빈, 10㎎/㎖ 인간 혈청 알부민, 40mM 염화칼슘, 5㎎/㎖ 만니톨 및 0.1% 트윈 80을 포함하는 트롬빈 충전액(pH6.0)을, 생체 흡수성 시트(폴리글리콜산계 생체 흡수성 합성 부직포, 제품명: 네오베일/GUNZE사)을 깐 용기에 두께 1mm가 되도록 붓고, -80℃에서 2시간 동결 후, 진공 건조시키고, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 조제하였다. 이것을, 글리세롤을 포함하지 않는 상기 트롬빈 충전액으로 마찬가지로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제와 비교하였다.

도 1에 나타내는 바와 같이 글리세롤의 첨가에 의해, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 있어서 동결건조 분체의 과잉형성이 억제되었다.

< 실시예 2: 글리세롤 첨가에 의한 트롬빈의 안정성에 대한 영향>

실시예 1에서 얻은 1% 글리세롤 첨가 및 미첨가 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를, 각각 용기 그대로, 폴리에틸렌-알루미늄 2층 필름봉지에 건조제와 함께 넣어 밀봉 포장하고, 실온(22∼25℃)에서 보존하였다. 보존 1, 2, 3, 8주째에 검체를 개봉하고, 용기로부터 트롬빈 고정화 시트 제제를 박리해서 2cm×2cm(4㎠)로 절단하고, 생리식염수 1.0㎖에 침지 후, 충분하게 혼화해서 트롬빈을 용출하고, 그 트롬빈 용출액에 대해서 일본약전 「트롬빈 정량법」에 따라서 응고활성을 조사하였다. 이하, 「트롬빈 정량법」에 대해서 간단하게 설명한다.

우선, 피브리노겐 용액과 트롬빈 용액을 혼합해서 수득되는 피브린을 함유하는 용액의 흡광도(450nm)가 0.3에 도달할 때까지의 시간을 응고시간으로 하였다. 트롬빈 자가 표준물질을 사용해서 제작한 표준용액(4종의 단위)과 일정 농도의 피브리노겐 용액을 혼합시키고, 응고시간을 측정하였다. 트롬빈의 활성단위를 횡축, 응고시간을 종축에 설정하고, 활성단위와 응고시간의 관계를 나타내는 표준직선을 작성하였다. 상기 트롬빈 용출액에 대해서, 마찬가지로 응고시간을 측정하고, 이 표준직선을 사용해서 트롬빈 활성단위를 산출하고, 시트면적당의 잔존 트롬빈 활성단위(U/㎠)을 산출하였다. 도 2 와 같이, 글리세롤 첨가·미첨가 검체에 있어서, 보존기간을 횡축, 보존 전에 대한 보존 후의 트롬빈 용출액의 응고활성값(U/㎠)을 종축에 설정하고, 잔존 트롬빈 활성값을 나타냈다.

글리세롤 첨가 검체와 미첨가 검체를 비교한 결과, 글리세롤의 첨가에 의해 트롬빈 활성을 저하시키는 경우는 없었다.

< 실시예 3: 인간 혈청 알부민 첨가에 의한 트롬빈의 안정성에 대한 영향>

실시예 1에서 얻은 1% 글리세롤 첨가 트롬빈 충전액 및 그 트롬빈 충전액으로부터 알부민을 제외한 2종류의 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2의 기재에 따라서 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 제작·밀봉 포장해서 37℃에서 보존하였다.

보존 1, 2주째에 검체를 개봉하고, 트롬빈 용출액을 취득하고, 보존전의 용출액에 대해서 유지되고 있는 잔존 트롬빈 활성을 측정하여, 그래프화해서 도 3에 나타냈다.

그 결과, 인간 혈청 알부민 첨가 검체는 보존 2주간후에 보존전의 80%의 활성을 유지하고 있었지만, 미첨가의 검체는 20%까지 활성이 저하되었다.

< 실시예 4: 올리고당 첨가에 의한 트롬빈의 안정성에 대한 영향>

표 1의 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2의 기재에 따라서, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 검체를 조제·밀봉 포장하고, 65℃에서 보존하였다. 표 1의 올리고당으로서 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨, 에리스리톨, 락토오스 및 대조로서 종래조성으로 보고된 만니톨을 사용하였다. 보존 8일후에 검체를 개봉하고, 트롬빈 용출액을 취득하고, 보존전의 용출액에 대해서 유지되어 있는 잔존 트롬빈 활성을 측정하고, 그래프화해서 도 4에 나타냈다.

그 결과, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨이 만니톨과 동등한 트롬빈의 안정화 효과를 나타내는 것이 확인되었다.

< 실시예 5: 트롬빈의 안정성에 제공하는 올리고당 농도의 영향>

5, 8, 10, 15 혹은 30㎎/㎖중 어느 하나의 농도로 올리고당을 함유하는 표 2의 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2의 기재에 따라서 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 조제·밀봉 포장하고, 65℃에서 보존하였다. 보존 3일후에 개봉해서 트롬빈 용출액을 회수하고, 잔존 트롬빈 활성을 측정하였다. 표 2의 올리고당으로서는 만니톨 및 트레할로오스를 사용하였다. 도 5의 그래프에 나타내는 바와 같이, 8㎎/㎖ 이상의 고농도 첨가조건에서는, 만니톨에 비해서 트레할로오스 쪽이 활성유지 효과가 뛰어나다는 것을 확인하였다.

< 실시예 6: 아미노산첨가에 의한 트롬빈의 안정성에 대한 영향>

표 3의 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2의 기재에 따라서, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제를 조제·밀봉 포장하고, 65℃에서 보존하였다. 표 3의 아미노산으로서 단순 아미노산인 글리신, 산성 아미노산인 글루탐산, 아스파라긴산, 염기성 아미노산인 아르기닌, 히스티딘, 리신을 사용하였다. 대조로서, 아미노산 미첨가 트롬빈 충전액 및 아미노산의 대신에 인간 혈청 알부민을 함유하는 트롬빈 충전액을 사용하였다.

보존 8일후에 개봉해서 트롬빈 용출액을 회수해서 트롬빈 활성측정을 실시하고, 보존전의 용출액의 활성값에 대한 잔존활성을 측정하였다.

도 6의 그래프에 나타내는 바와 같이, 아미노산 미첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제에 비해서, 아미노산 첨가그룹에 있어서는, 어느 것이나 트롬빈 활성유지 효과가 확인되었다. 글루탐산, 히스티딘 또는 리신을 첨가한 그룹은, 인간 혈청 알부민 첨가 트롬빈 충전액으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제보다도 높은 안정화 효과를 나타냈다.

< 실시예 7: 히스티딘 및 트레할로오스 의 최적 배합비의 검토>

표 3의 아미노산 첨가그룹 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액에 있어서, 아미노산으로서 히스티딘, 올리고당으로서 트레할로오스를 표 4에 기재된 농도로 함유하는 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1 및 실시예 2의 기재에 따라서, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 검체를 조제하고, 밀봉 포장해서 65℃로 보존하였다. 트롬빈 충전액 중, 히스티딘 첨가 충전액에 대해서는, 시트르산 완충액을 첨가하지 않았다. 보존 8일후에 개봉해서 트롬빈 용출액을 회수해서 트롬빈 활성측정을 실시하고, 보존후의 잔존활성을 측정하였다.

그 결과, 도 7에 나타내는 바와 같이, 트레할로오스를 5∼40㎎/㎖, 혹은 히스티딘을 2.4∼90mM으로 각각 단독에 첨가하였을 경우에는 잔존활성은 0.8∼2.4%에 머물렀지만, 트레할로오스와 히스티딘을 동시에 첨가하였을 경우에는, 배합농도에 따라 각각 단독 첨가하였을 때와 비교해서 트롬빈 잔존활성이 향상하였다.

예를 들면, 트레할로오스가 5㎎/㎖인 경우, 히스티딘을 90∼180mM으로 배합 함으로써 잔존활성은 5.6%∼23.1%로 향상되고, 트레할로오스가 15㎎/㎖인 경우, 히스티딘을 22.5∼180mM으로 배합함으로써 6.6%∼36.4%로 향상되었다. 마찬가지로 트레할로오스가 30㎎/㎖, 40㎎/㎖인 경우, 히스티딘을 2.4∼180mM으로 배합함으로써 잔존활성은 21.4%∼62.0%로 향상하였다.

히스티딘의 첨가효과는 트레할로오스가 고농도인 경우에 현저하고, 트레할로오스가 30∼40㎎/㎖인 경우, 히스티딘을 2.4mM으로 소량의 농도로 첨가해도 상승 효과가 인정되고, 특히 히스티딘 22.5∼180mM의 배합비로 첨가하였을 경우에 상승 효과가 높아, 트롬빈 잔존활성은 35% 이상으로 향상하였다.

< 실시예 8: 계면활성제 첨가에 의한 트롬빈 충전액의 시트로의 침투 효과>

표 5의 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액에, 실시예 1의 생체 흡수성 시트를 15초간 침지시키고, 침지하기 전후에서 증가한 시트의 무게를 측정하였다. 표 5의 계면활성제에는 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드, 디기토닌을 사용하였다.

도 8에 나타내는 바와 같이 각종 계면활성제의 첨가에 의해, 생체 흡수성 시트 에 대한 트롬빈 충전액의 침투성이 향상하였다.

< 실시예 9: 트윈 80 의 최적농도의 검토>

표 5의 조성으로 이루어지고, 계면활성제로서 여러 농도의 트윈 80을 함유하는 트롬빈 충전액에, 실시예 1에 기재된 생체 흡수성 시트를 15초간 침지시키고, 침지하기 전후에서 증가한 시트의 무게를 측정하였다. 트윈 80의 농도는 최종농도 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1 및 1%를 사용하였다. 대조로서 표 5에 기재된 계면활성제 미첨가 트롬빈 충전액을 사용하였다.

도 9에 나타내는 바와 같이, 0.01∼1% 트윈 80의 첨가에 의해, 본 시트에 있어서의 트롬빈 충전액의 침투성이 현저하게 향상하는 것이 확인되었다.

< 실시예 10: 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제 의 유연성 평가시험>

표 6의 조성으로 이루어지는 트롬빈 충전액을 사용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 조제한 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성을 평가하였다. 도 10에 나타내는 바와 같이, 본 발명의 시트(2cm×3cm)의 일부(2cm×1cm)를 대좌에 고정하고, 대좌로부터 수평방향으로 돌출시킨 나머지의 시트 부분(2cm×2cm)에, 피브리노겐 용액 55㎎/㎖을 적하하고, 돌출부분의 선단이 수평 수준선으로부터 아래로 늘어진 거리 및 각도를 측정함으로써 유연성을 평가하였다. 대조로서, 피브린 접착제의 성분이 고정화된 콜라겐 시트(제품명: TachoComb/CSL Behling사)을 사용하였다. 대조의 콜라겐 시트 제제는 피브리노겐이 미리 건조 고정화되어 있기 때문에, 적하하는 액체는 생리식염수를 사용하고, 접착면을 위로 한 상태에서 시험하였다. 측정은 용액을 적하하고나서 5분간 그대로 둔 후에 실시하고, 3회 실시한 후에, 각각의 평균값을 표준편차와 함께 그래프화하여, 도 11에 나타냈다.

그 결과, 비교 대조인 콜라겐 시트 제제의 늘어진 거리는, 생리식염수 0.1㎖을 적하한 시점에서 5mm에 미치지 않았지만, 본 발명의 시트에서는 피브리노겐액을 적하하기 이전부터 스스로의 무게에 의해 늘어질 정도로 유연하여, 피브리노겐액 0.1㎖을 적하하면 약 20mm의 거리를 나타냈다. 또, 피브리노겐액 0.3㎖을 적하하면, 크게 늘어져 측정할 수 없었다.

(산업상 이용 가능성)

본 발명에 따르면, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제 및 그 제조방법이 제공된다. 본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는, 예를 들면 글리세롤, 트윈 80, 트레할로오스 및 소량의 히스티딘을 함유하는 트롬빈 용액에, 폴리글리콜산으로 이루어지는 생체 흡수성 시트를 침지시키고, 동결건조시키는 것에 의해 제조된다. 글리세롤을 함유시키는 것에 의해, 트롬빈 성분이 생체 흡수성 시트로부터 탈락하는 것을 저지하고, 또 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 유연성을 부여할 수 있다. 또 트윈 80을 함유시키는 것에 의해, 트롬빈의 생체 흡수성 시트에로의 침투성을 올릴 수 있어, 트롬빈의 고정화가 용이해진다. 또 트레할로오스와 소량의 히스티딘을 함유시키는 것에 의해, 건조제제로 하였을 때에 트롬빈의 활성을 충분하게 유지할 수 있다. 따라서 본 발명은, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제의 제조를 쉽게 한다. 또 본 발명의 제조방법에 의해 제제화된 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 트롬빈의 안정성과 생체 흡수성 시트 제제로서 필요한 유연성을 가진다.

또, 본 발명의 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제는 트롬빈이 매우 신속하게 액 중에 용출하므로, 트롬빈 고정화 시트가 액상의 피브리노겐이나 혈액과 접촉하는 즉시 트롬빈의 효소활성을 발현할 수 있다. 즉, 접착 폐쇄면이나 활동성 출혈부위에 있어서 신속하게 트롬빈이 용출해서 피브리노겐을 기질에 효소활성을 발휘하고, 조속히 피브린 전환을 가져와서 효과적인 조직 접착 폐쇄 효과, 지혈효과를 가져오는 것이 기대된다.

Claims

(1) 유효성분을, 유연화제 및 침투화제를 함유하는 충전액에 혼합하는 공정,
(2) 상기 (1)의 충전액을 생체 흡수성 시트에 적하하거나, 상기 (1)의 충전액에 생체 흡수성 시트를 침지시키는 공정 및
(3) 상기 (2)의 생체 흡수성 시트를 건조하는 공정
으로 이루어지는, 생체 흡수성 시트 제제의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 유효성분이 트롬빈 또는 피브리노겐인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 2 항에 있어서, 트롬빈의 농도가 1000∼2000 단위/㎖인 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 유연화제가 다가 알코올 또는 글리코사미노글리칸이고, 침투화제가 계면활성제인 제조방법.
제 4 항에 있어서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 글리코사미노글리칸이 히알우론산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 및 헤파란황산으로 이루어지는 그룹에서 선택되며, 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 충전액이 아미노산 및 올리고당을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항에 있어서, 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글루탐산, 글리신 및 아스파라긴산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 올리고당이, 만니톨, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨 및 에리스리톨로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 충전액이 첨가제로서 글리세롤, 트윈 80, 히스티딘 및 트레할로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 유연화제의 농도가 1∼2%이고, 침투화제의 농도가 0.01∼1%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산의 농도가 2.4∼180mM이고, 올리고당의 농도가 5∼40㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
유효성분으로서 트롬빈, 및 첨가제로서 유연화제, 침투화제, 아미노산 및 올리고당을 함유하는, 트롬빈 고정화 생체 흡수성 시트 제제.
제 12 항에 있어서, 트롬빈의 농도가 1000∼2000 단위/㎖인 제제.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 유연화제가 다가 알코올 또는 글리코사미노글리칸이고, 침투화제가 계면활성제인 것을 특징으로 하는 제제.
제 14 항에 있어서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 글리코사미노글리칸이 히알우론산, 콘드로이친황산, 케라탄황산 및 헤파란황산으로 이루어지는 그룹에서 선택되며, 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij 35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40(Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산이 아르기닌, 히스티딘, 리신, 글루탐산, 글리신 및 아스파라긴산으로 이루어지는 그룹에서 선택되고, 올리고당이 만니톨, 수크로오스, 트레할로오스, 소르비톨 및 에리스리톨으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제제.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 첨가제로서 글리세롤, 트윈 80, 히스티딘 및 트레할로오스를 함유하는 것을 특징으로 하는 제제.
제 12 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 유연화제의 농도가 1∼2%이고, 침투화제의 농도가 0.01∼1%이며, 아미노산의 농도가 2.4∼180mM이고, 올리고당의 농도가 5∼40㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제제.
제 12 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 제제.
생체 흡수성 시트 제제의 유연화제로서의 다가 알코올의 용도.
제 20 항에 있어서, 다가 알코올이 글리세롤, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 소르비트로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 20 항 또는 제 21 항에 있어서, 다가 알코올의 농도가 1∼2%인 것을 특징으로 하는 용도.
제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 용도.
제 20 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트 제제가 트롬빈 또는 피브리노겐을 생체 흡수성 시트에 고정화한 것임을 특징으로 하는 용도.
생체 흡수성 시트 제제에서 유효성분의 침투화제로서의 계면활성제의 용도.
제 25 항에 있어서, 계면활성제가 트윈 80(Tween 80), 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르(Brij35), 플루로닉 F-68(Pluronic F-68), 수크로오스 모노라우레이트, 콜산나트륨, 트윈 20(Tween 20), 트리톤 X-100(Triton X-100), 노니데트 P-40 (Nonidet P40), 황산-3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판(CHAPS), n-옥틸글루코사이드, n-도데실말토사이드 및 디기토닌으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 계면활성제의 농도가 0.01∼1%인 것을 특징으로 하는 용도.
제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트가 폴리글리콜산, 폴리락트산, 카르복시메틸셀룰로오스, 키틴, 키토산, 알긴산, 콜라겐, 젤라틴 및 하이드로겔로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기재에 의해 합성된 것임을 특징으로 하는 용도.
제 25 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 흡수성 시트 제제가 트롬빈 또는 피브리노겐을 생체 흡수성 시트에 고정화한 것임을 특징으로 하는 용도.