JP2002193832A

JP2002193832A - トロンビン乾燥製剤

Info

Publication number: JP2002193832A
Application number: JP2000394265A
Authority: JP
Inventors: Takahito Matsuo; 宇人松尾; Yoshihiro Mizumachi; 義博水町
Original assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nihon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-12-26
Filing date: 2000-12-26
Publication date: 2002-07-10

Abstract

(57)【要約】低濃度の安定化剤の添加により、安定化され、形状が良
好で、溶解後の溶状に優れたトロンビン乾燥製剤を提供
すること。【解決手段】トロンビン２５０単位／ｍｌ当たり、炭素
数２〜６の脂肪族多基塩性カルボン酸またはその塩を
０．０５〜８ｍｇおよびアルブミンを０．０１〜５ｍｇ
含有させてなるトロンビン乾燥製剤が前記課題を解決し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、安定化されたトロ
ンビンの乾燥製剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】循環血液は、常に流動性を保ちながら生
理機能を営んでいるが、いったん血管組織に破綻がおき
ると流動性を失ってゲル化する。こうした止血には、主
に血小板が機能する一次止血と有形成分を除いた血漿成
分が関与する二次止血がある。二次止血の場合、その作
用には数多くの血漿由来蛋白因子、酵素、リン脂質、カ
ルシウムイオンなどが関与し、特定の条件が加わると、
一定の順序で次々に活性化反応が進むという、いわゆる
凝固カスケードがおこり、凝血が完了する。この凝固カ
スケードの最終段階で関与するのがトロンビンとフィブ
リノーゲンである。すなわち活性化されたプロトロンビ
ンがトロンビンとなり、このトロンビンがフィブリノー
ゲンに作用してフィブリンを生成することにより血液凝
固が完成する。

【０００３】この血液凝固作用のため、トロンビンは臨
床的には外科領域において、通常の結紮によっては止血
困難な小血管、毛細血管及び実質臓器からの出血（例え
ば外傷に伴う出血、手術中の出血、骨性出血、膀胱出
血、抜歯後の出血、鼻出血及び上部消化管からの出血）
の止血に用いられている。一方、トロンビンのような触
媒作用を有する蛋白質を分離精製する際、そのもの自体
が不安定となり、活性を失いやすい。そのため蛋白製剤
の製剤設計を行なうにあたっては、何らかの物質を添加
することによって安定性を保つ工夫が必要となる。トロ
ンビンの場合、特に乾燥製剤における安定化剤として
は、たとえばコラーゲン(特開昭60-112721号公報)、ア
プロチニン、ゼラチン（特開昭56-68607号公報）、アル
ブミン（特開昭56-39782号公報）、プロテアーゼ抑制剤
とＥＤＴＡ（特開昭57-18985号公報）、糖類、塩基性ア
ミノ酸、および有機酸（特許第2715104号）等が知られ
ている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前述したように、トロ
ンビンの安定化のために種々の安定化剤を添加すること
が知られているが、いずれの添加剤もかなりの高濃度に
添加されているので、低濃度の液状トロンビン製剤の場
合や粉末状製剤で直接局所に噴霧または散布する場合
は、含まれている安定化剤の量が多くなり、生体に与え
る影響を無視できない。またトロンビン以外の成分の量
が多くなると、凍結乾燥製剤の表面が粗くなったり、収
縮したりしてバイアル瓶中での形状が悪くなり、商品価
値が著しく低下する。特開昭５６−３９７８２では有機
カルボン酸によるトロンビンの安定化効果について言及
しているが、トロンビン溶液に対し１％以上、好ましく
は５％以上の有機カルボン酸を単独或いは２種以上混合
して、高濃度で含有せしめることが記載されている。そ
して、１％以下の場合は安定化剤の効果が少なく、実用
的でないと述べている。

【０００５】特公昭５８−２６９５６ではプロテアーゼ
抑制剤、キレート化剤及びアルブミンの３種類をトロン
ビンに混合することによる安定化効果について言及して
いるが、添加剤として用いるアルブミンの濃度は、０.
５〜１０％、有利には１〜５％を有しなければならない
としているとしている。さらに、特許第2715104では糖
類、塩基性アミノ酸及び有機酸塩の併用により、トロン
ビンの安定化をはかることが記載されているが、いずれ
の添加剤も１.５〜９％と高濃度で存在させる必要があ
るとしている。このように安定化剤として様々な方法が
提案されているものの、低濃度で有効な方法については
未だ報告されていない。したがって、より少ない量の物
質の添加により安定化されたトロンビン乾燥製剤の開発
が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するため種々研究を重ねた結果、凍結乾燥前のト
ロンビン溶液に特定の多塩基性カルボン酸またはその塩
とアルブミンを同時に添加することにより、凍結乾燥後
のトロンビン活性の安定性、溶解性及び凍結乾燥製剤の
形状に対して極めて良好な効果がもたらされること、お
よびその効果がそれぞれの極めて低い濃度の添加で発揮
されることを見出し、更に検討を重ねて本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、（１）トロンビン２５０単位
に対し、炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸
またはその塩を０．０５〜８ｍｇおよびアルブミンを
０．０１〜５ｍｇ含有させてなるトロンビン乾燥製剤、
（２）炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸
が、ヒドロキシル基を有してもよい二または三塩基性カ
ルボン酸である（１）記載のトロンビン乾燥製剤、
（３）炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸
が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、マロン酸
またはシュウ酸である（１）記載のトロンビン乾燥製
剤、（４）炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン
酸の塩が、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩である
（１）記載のトロンビン乾燥製剤、（５）アルブミンが
ヒト由来アルブミンである（１）記載のトロンビン乾燥
製剤、および（６）乾燥製剤が凍結乾燥製剤である
（１）記載のトロンビン乾燥製剤、である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明に使用するトロンビンは、
トロンビンとしての生物活性又は生理活性を有するもの
であればよく、たとえば血漿蛋白を分画して得られるも
の、あるいは遺伝子工学的な手法により得られるものを
使用することができる。血漿由来の場合、ヒトに限らず
ウシ、ウマ等の動物由来のものも用いることができる。
しかしヒト由来のものが好適に使用される。本発明に使
用する炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸と
しては、たとえば炭素数２〜６の飽和、二塩基性カルボ
ン酸や三塩基性カルボン酸が挙げられ、それらはさらに
１または２以上の水酸基を有していてもよい。これらの
具体例としては、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸等のオキ
シジまたはトリカルボン酸、コハク酸、マロン酸、シュ
ウ酸等のジカルボン酸などが挙げられる。それらの塩と
してはナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩やア
ンモニウム塩が好適に使用される。これらの中でもクエ
ン酸及びその塩を用いることが特に好ましい。

【０００８】本発明に用いるアルブミンはアルブミンと
しての物理化学的な特性を有する蛋白質であれば良く、
例えば血漿蛋白を分画して得られるもの、あるいは遺伝
子工学的な手法により得られるものを使用することがで
きる。血漿由来の場合、ヒト、ウシ、ウマ等の動物由来
のものを用いることができるが、好ましくはヒト由来の
ものを用いる。本発明のトロンビン製剤はトロンビン含
有水溶液を凍結乾燥することによって製造することがで
きる。該トロンビン含有水溶液におけるトロンビンの濃
度は０．１〜２００００単位／ｍｌの範囲で用いること
ができるが、低濃度の添加剤としての特徴を最大限に生
かすためには、比較的低濃度のトロンビンを用いること
がより効果的である。したがって添加剤がより有効なト
ロンビン濃度は１０００単位／ｍｌ未満であり、好まし
くは５００単位／ｍｌ未満である。本発明はトロンビン
活性の安定化効果に限らず、凍結乾燥製剤の形状及び溶
解後の溶状の劣化防止に優れた効果を示すことから、乾
燥製剤の製剤化技術に大きな進展をもたらすものであ
る。

【０００９】炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボ
ン酸またはその塩の使用量は、トロンビン２５０単位当
たり、通常０．０５〜８ｍｇ、好ましくは０．５〜６ｍ
ｇである。使用量がこの範囲より多いと、凍結乾燥した
際の乾燥製剤の表面が粗くなったり、乾燥製剤全体が収
縮して瓶の内壁から剥がれた状態になったりして外観が
悪くなり、商品価値が著しく低下することがある。この
範囲より少ない場合は、乾燥トロンビン製剤の安定効果
が不充分となる。アルブミンの使用量は、トロンビン２
５０単位当たり、通常０．０１〜５ｍｇ、好ましくは
０．０５〜４ｍｇである。アルブミンはこの使用量にお
い炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸または
その塩との併用により、乾燥状態におけるトロンビンを
長期に亘り安定に保ち、凍結乾燥製剤の形状を良好に
し、且つ、溶解した場合、液の白濁や折出物を防止する
などの良好な液状の保持に効果を発揮する。

【００１０】本発明の乾燥製剤の調製方法としては、ト
ロンビン溶液を自体公知の手段に基づいた方法、具体的
には凍結乾燥によって製造することができるが、必要に
応じてウイルス不活化のための加熱処理、ウイルス除去
のための膜処理、透析、除菌ろ過等を施しておいても良
い。本発明は通常の製剤化技術により局所投与用、外用
剤、散剤、顆粒剤に調製して用いられる。また、トロン
ビン単剤に限らず、生体組織接着剤のようにトロンビン
を含有している製剤または構成薬剤の一つとなっている
場合にも用いることができる。

【００１１】

【実施例】以下に実施例、比較例および試験例をあげて
本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れるものではない。実施例１ヒト血漿由来のトロンビンの調製ヒト血漿１９Ｌに１／１０容の１ＭＢａＣｌ_２を４℃
にて撹拌しながら添加し、１時間放置した。折出した白
色沈殿物を遠心分離によって集め、０.０１ＭＢａＣｌ
_２を含む０.９％ＮａＣｌ液で洗浄後、再び遠心した。
洗浄した沈殿物に、１.５Ｌの４０％飽和硫酸アンモニ
ウムを加え、撹拌しながら４℃で一晩放置した。沈殿物
を遠心で除いた後、上澄み１６４０ｍｌに対し固形硫酸
アンモニウム２７６ｇを加え（７０％飽和）約１時間放
置した。これを遠心し、その沈殿物を１００ｍｌの０.
０５Ｍリン酸緩衝液に溶かし、１０Ｌの同一リン酸緩衝
液(pH6.0)に透析した。これを遠心し、上清１２８ｍｌ
を得た。カラムサイズ４.７ｃｍｘ２０ｃｍのＤＥＡＥ
イオン交換体に流速８０〜９０ｍｌ／ｈｒで上清液を負
荷した後、０.０５Ｍリン酸緩衝液(pH6.0)を含むＮａＣ
ｌ濃度勾配を (0.2→0.6M、２Ｌづつ) 行って溶出する
と、ほぼ均一のプロトロンビン (約1200mg) が得られ
た。（続生化学実験講座８、血液下、P492〜497、化学
同人社参照）

【００１２】得られたプロトロンビン溶液２００ｍｌに
２０ｍｌのトロンボプラスチン溶液及び２０ｍｌの０.
１８Ｍ塩化カルシウムを添加し３７℃で１時間放置し
た。これを冷やしながら遠心分離した後、得られた上清
２００ｍｌに２７ｍｌの５３.３％の冷エタノール（−5
℃）を添加し、−４℃で再度遠心分離した。再度得られ
た上清に１.０Ｍの酢酸を加えてｐＨ６.０〜５.５に調
整し、上清と等量の６５％の冷エタノール(-10℃)溶液
を添加した。温度を−６℃に維持したまま十分反応させ
た後、遠心分離した沈殿物をトロンビン画分とした。
（Method in enzymology vol.XIX, Proteolytic enzym
e, p172〜176, Academicpress参照）試験サンプルの調製得られたトロンビン画分は透析により脱塩処理を施した
後、本試験に供した。トロンビン溶液に対しヒトアルブ
ミンを０.２％となるように、またクエン酸ナトリウム
を０.３％となるように添加した。またこの時トロンビ
ンの力価は２５０単位／ｍｌとなるように調整した。こ
の溶液を凍結した後、減圧下で乾燥する（凍結乾燥）す
ることにより本試験のサンプルを得た。

【００１３】上記サンプルについて凍結乾燥後の仕上が
り形状を観察し、表面が平滑で、器壁からの剥がれのな
い良好なものを○、やや不良を△、表面が粗かったり、
収縮のみられる不良なものをｘとして判定した。また、
上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後に溶
解したときの性状を観察した。更に、上記サンプルを５
５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビンの活性を
測定した。

【００１４】比較例１実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、クエ
ン酸ナトリウムを１．０％となるように添加した。また
この時トロンビンの力価は２５０単位／ｍｌとなるよう
に調整した。次にこの溶液を凍結した後、減圧下で乾燥
する（凍結乾燥）することで本試験のサンプルを得た。
上記サンプルについて凍結乾燥後の仕上がり形状を観察
し、良好を○、やや不良を△、不良をｘとして判定し
た。また、上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７
週間後に溶解したときの性状を観察した。更に、上記サ
ンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビ
ンの力価を測定した。

【００１５】比較例２実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、マン
ニトールを５.０％となるように添加した。またこの時
トロンビンの力価は２５０単位／ｍｌとなるように調整
した。次にこの溶液を凍結した後、減圧下で乾燥する
（凍結乾燥）することで本試験のサンプルを得た。上記
サンプルについて凍結乾燥後の仕上がり形状を観察し、
良好を○、やや不良を△、不良をｘとして判定した。ま
た、上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後
に溶解したときの性状を観察した。更に、上記サンプル
を５５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビンの力
価を測定した。

【００１６】比較例３実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、アル
ブミンを０.５％となるように添加した。またこの時ト
ロンビンの力価は２５０単位／ｍｌとなるように調整し
た。次にこの溶液を凍結した後、減圧下で乾燥する（凍
結乾燥）することで本試験のサンプルを得た。上記サン
プルについて凍結乾燥後の仕上がり形状を観察し、良好
を○、やや不良を△、不良をｘとして判定した。また、
上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後に溶
解したときの性状を観察した。更に、上記サンプルを５
５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビンの力価を
測定した。

【００１７】比較例４実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、アル
ブミンを０.２％となるように添加した。またこの時ト
ロンビンの力価は２５０単位／ｍｌとなるように調整し
た。次にこの溶液を凍結した後、減圧下で乾燥する（凍
結乾燥）することで本試験のサンプルを得た。上記サン
プルについて凍結乾燥後の仕上がり形状を観察し、良好
を○、やや不良を△、不良をｘとして判定した。また、
上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後に溶
解したときの性状を観察した。更に、上記サンプルを５
５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビンの力価を
測定した。

【００１８】比較例５実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、アル
ブミンを０.２％及びマンニトールを１.０％となるよう
に添加した。またこの時トロンビンの力価は２５０単位
／ｍｌとなるように調整した。次にこの溶液を凍結した
後、減圧下で乾燥する（凍結乾燥）することで本試験の
サンプルを得た。上記サンプルについて凍結乾燥後の仕
上がり形状を観察し、良好を○、やや不良を△、不良を
ｘとして判定した。また、上記サンプルを５５℃で保存
し、０、３、７週間後に溶解したときの性状を観察し
た。更に、上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７
週間後にトロンビンの力価を測定した。

【００１９】比較例６実施例１と同様にして得たトロンビン溶液に対し、添加
剤を加えず、力価を２５０単位／ｍｌとなるように調整
した。次にこの溶液を凍結した後、減圧下で乾燥する
（凍結乾燥）することで本試験のサンプルを得た。上記
サンプルについて凍結乾燥後の仕上がり形状を観察し、
良好を○、やや不良を△、不良をｘとして判定した。ま
た、上記サンプルを５５℃で保存し、０、３、７週間後
に溶解したときの性状を観察した。更に、上記サンプル
を５５℃で保存し、０、３、７週間後にトロンビンの力
価を測定した。

【００２０】試験例１トロンビン力価の測定試験この測定法は、一定量のフィブリノーゲンに対し添加さ
れるトロンビンの濃度が増加するに従って凝固時間が短
縮する原理を利用したもので、ある範囲においてトロン
ビン濃度（対数）と凝固時間（対数）とは直線関係にあ
り、濃度既知のトロンビン標準品溶液について凝固時間
を測定することにより標準曲線（検量線）が得られる。
サンプルについても同様に操作して凝固時間を求め、検
量線からサンプル中のトロンビン量を定量した。すなわ
ち、実施例１及び比較例１、２、３、４、５、６で得ら
れたサンプルのトロンビン力価は以下のようにして測定
した。各サンプル０.１ｍｌに０.９ｍｌの０.１％フィ
ブリノーゲン溶液加え凝固するまでの時間を測定した。
同時に標準トロンビンを用い標準曲線を作成し、サンプ
ルのトロンビン力価を標準曲線より算出した。試験結果

【００２１】

【表１】 Cit-Na : クエン酸ナトリウム Alb : アルブミン Man : マンニトール〔表１〕から明らかなように凍結乾燥後の仕上がりは比
較例１のクエン酸ナトリウムのみまたは比較例４のアル
ブミンのみでは形状に不具合が生じているが、実施例１
では両者少ない量での併用により改善された。また高濃
度の添加剤を用いた場合、比較例２のマンニトールでは
良好であるが、クエン酸ナトリウムの場合は比較例１の
ように高濃度であっても必ずしも良好な形状は得られな
かった。

【００２２】

【表２】〔表２〕から明らかなように、５５℃で７週間保存した
後の性状は、比較例３、４のアルブミンのみ場合及び比
較例５のアルブミンとマンニトールを組み合わせた場合
は白濁を生じることがわかった。一方、実施例１の性状
は良好であった。

【００２３】

【表３】表中の数値は凍結乾燥前のトロンビン力価を１００％と
して算出した。〔表３〕から明らかなように、比較例６
の無添加及び比較例２のマンニトールでは保存期間３週
間でトロンビン力価が顕著に低下した。また比較例３、
４のアルブミンのみ及び比較例５のアルブミンと糖の組
み合わせは保存期間７週間で半分程度にトロンビン力価
が低下した。しかしながら実施例１では保存期間７週間
でも９０％程度のトロンビン力価が保持された。これら
の結果から、凍結乾燥後の仕上がり形状、５５℃保存後
の溶解後性状及びトロンビン力価の全てを満足させるの
は実施例１の特定量のアルブミンとクエン酸ナトリウム
の組み合わせだけであった。すなわち高濃度のクエン酸
ナトリウムや高濃度のマンニトールを使用しなくとも十
分な効果を示すことがわかった。このように極めて少な
い量でのアルブミンと脂肪族多塩基性カルボン酸または
その塩の組み合わせにより、添加剤の生体に及ぼす影響
を極力抑制することができる。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、トロンビン溶液に極め
て少ない量のアルブミン及び炭素数２〜６の飽和脂肪族
多基塩性カルボン酸またはその塩を同時に添加すること
で、それから得られる乾燥製剤のトロンビン活性の安定
性、凍結乾燥後の形状および再溶解後の溶状に対し極め
て良好な効果を示す。また本発明はトロンビン単独の製
剤に限らず、生体組織接着剤のようにトロンビンを含有
するすべての製剤においてその効果が発揮される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 4C076 AA29 BB12 CC14 DD43 EE41 FF33 FF63 GG06 4C084 AA01 AA03 CA36 DC03 MA05 MA44 NA02 NA03 ZA531

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トロンビン２５０単位に対し、炭素数２〜
６の飽和脂肪族多塩基性カルボン酸またはその塩を０．
０５〜８ｍｇおよびアルブミンを０．０１〜５ｍｇ含有
させてなるトロンビン乾燥製剤。
【請求項２】炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボ
ン酸が、ヒドロキシル基を有していてもよい二または三
塩基性カルボン酸である請求項１記載のトロンビン乾燥
製剤。
【請求項３】炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボ
ン酸が、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸、マロ
ン酸またはシュウ酸である請求項１記載のトロンビン乾
燥製剤。
【請求項４】炭素数２〜６の飽和脂肪族多塩基性カルボ
ン酸の塩が、アルカリ金属塩またはアンモニウム塩であ
る請求項１記載のトロンビン乾燥製剤。
【請求項５】アルブミンがヒト由来アルブミンである請
求項１記載のトロンビン乾燥製剤。
【請求項６】乾燥製剤が凍結乾燥製剤である請求項１記
載のトロンビン乾燥製剤。