JP2010254606A - トロンビン溶液の調製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、5mmol/L以上50mmol/L以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が0.17mol/L以上0.46mol/L以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法を提供する。
【選択図】なし
Description
(1)アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンをアニオン交換体に吸着させた後、5mmol/L以上50mmol/L以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が0.17mol/L以上0.46mol/L以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
(2)溶離液とアニオン交換体との接触時間が2分以上10分以下である、(1)に記載のトロンビン溶液の調製方法。
(3)アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、(1)又は(2)に記載のトロンビン溶液の調製方法。
(4)溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、アニオン交換体を等張液で洗浄する、(1)乃至(3)の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
日本薬局方によるトロンビンの定量法に準じてトロンビン活性値を測定した。フィブリノーゲン溶液(ボルヒール(登録商標)、(財)化学及血清療法研究所)を生理食塩液(大塚生食注、大塚製薬)で希釈し、フィブリノーゲン濃度3mg/mLのフィブリノーゲン溶液を調製した。日本薬局方標準品のトロンビン標準品((財)日本公定書協会)を生理食塩液に溶かし、4種の標準溶液を調製した。標準溶液の濃度は、下記方法による凝固時間が14〜60秒の範囲内となるように濃度を振り調製した。測定サンプルも凝固時間が14〜60秒の範囲内となるように生理食塩液で希釈した。測定は血液凝固自動測定装置(KC4デルタ、trinity biotech社)を使用した。
NaCl 1.753g、EDTA・2Na 0.744g、BSA 0.200g、1mol/L Tris−HCl(pH8.0) 4mlを注射用水(大塚蒸留水、大塚製薬)196mLに溶解して、アッセイバッファーを調製した。発色性合成基質はS−2238(テストチーム(登録商標)発色基質S−2238、積水メディカル)を注射用水で溶解し、濃度2μmol/mLの合成基質溶液を調製した。標準溶液として日本薬局方標準品のトロンビン標準品を生理食塩液に溶解し200U/mLにしたものを更にアッセイバッファーで希釈し、4種の標準溶液を調製した。
注射用水で置換したDEAE基を有するアニオン交換体(セルロファインKANTO DEAE−500、関東化学)0.5mLを容器容量2.5mLのポリエチレン製のカラム(ラボラトリー・ポリエチレンカラムS1012、モビテック社)に充填した。溶離液は、注射用水に塩化カルシウム二水和物を5乃至50mmol/Lとなるように溶解し、更に塩化ナトリウムでイオン強度が0.17乃至0.46mol/Lとなるように調製した。また、健常人ボランティアより血液を採取し、血液100mLに対して抗凝固剤としてCPD液を14mL添加し、ヒト新鮮血液とした。CPD液はクエン酸三ナトリウム二水和物30.0g、ブドウ糖23.2g、クエン酸一水和物3.58g、リン酸二水素ナトリウム二水和物2.51gを注射用水1Lに溶解して調製した。
溶離液の塩化カルシウム二水和物の濃度を5mmol/L未満又は50mmol/Lより高くなるように調製したか、又は溶離液のイオン強度を0.17mol/L未満又は0.46mol/Lより高くなるように調製した以外は、実施例1〜26と同様に実験した。比較例1乃至15の結果を表2、図1、及び図2に示す。実施例1乃至26、及び比較例1乃至15の結果より、溶離液のカルシウムイオンが5mmol/Lより少ない場合、又はイオン強度が0.17mol/Lより低い場合は、トロンビン溶液のトロンビン活性値が低下することが示された。また、カルシウムイオンが50mmol/Lより多い、又はイオン強度が0.46mol/Lより高い場合は、得られるトロンビン溶液がゲル化することが示された。
アニオン交換体と溶離液との接触時間を2分に変更した以外は、実施例13と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例13と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液のゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で504U/mL、合成基質法で353U/mLであった。実施例13と比較し、溶離液との接触時間を2分に短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表3に示す。
アニオン交換体と溶離液との接触時間を5分に変更した以外は、実施例13と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例13と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で473U/mL、合成基質法で340U/mLであった。実施例13と比較し、溶離液との接触時間を5分へ短縮しても同程度のトロンビン活性値を持つトロンビン溶液を調製できた。結果を表3に示す。
アニオン交換体と溶離液との接触時間を30分に変更した以外は、比較例12と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、比較例12と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で188U/mL、合成基質法で128U/mLであった。比較例12と比較し、溶離液との接触時間を30分へ延長してもプロトロンビンからトロンビンへの活性化、溶出が不十分であり、トロンビン活性値は低かった。結果を表3に示す。
アニオン交換体カラムに添加する溶離液の液量を1.0mLへ変更した以外は、実施例13と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例13と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で285U/mL、合成基質法で196U/mLであった。実施例13と比較し、溶離液の液量を2倍へ増やすとトロンビン活性値は1/2となり、溶離液の液量を増してもトロンビンをほぼ同等に回収できた。
アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を16mLに変更した以外は、実施例13と同様の方法でトロンビン溶液を調製し、実施例13と同様にトロンビン溶液のゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で1030U/mL、合成基質法で729U/mLであった。実施例13と比較し、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を2倍に増やすとトロンビン活性値も2倍となり、アニオン交換体カラムにかけるヒト新鮮血液を増やした分、トロンビン活性値は上がった。
実施例13で調製したトロンビン溶液を室温で24時間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で512U/mL、合成基質法で356U/mLであった。実施例13と比較し、トロンビン溶液を室温で24時間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表4に示す。
実施例13で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、冷蔵4℃で2週間保存し、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で505U/mL、合成基質法で338U/mLであった。実施例13と比較し、トロンビン溶液を冷蔵4℃で2週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表4に示す。
実施例13で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−20℃で3週間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で519U/mL、合成基質法で356U/mLであった。実施例13と比較し、トロンビン溶液を冷凍−20℃で3週間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表4に示す。
実施例13で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、微量に混在する赤血球を除去後、−20℃で6ヶ月間冷凍保存した。冷凍トロンビン溶液を室温で解凍後、ゲル化の有無を確認し、トロンビン活性値の測定を行った。その結果、トロンビン溶液にゲル化はみられなかった。また、トロンビン活性値は凝固時間法で534U/mL、合成基質法で350U/mLであった。実施例13と比較し、トロンビン溶液を冷凍−20℃で6ヶ月間保存してもゲル化は発生せず、トロンビン活性値は安定であった。結果を表4に示す。
実施例13で調製したトロンビン溶液を遠心分離し、トロンビン溶液に微量に混在する赤血球を除去し、トロンビン活性値を凝固時間法で測定した。その結果、凝固法によるトロンビン活性値は517U/mLであり、遠心分離操作によるトロンビン活性値の変化はみられなかった。
Claims (4)
- アニオン交換体を用いるトロンビン溶液の調製方法であって、血液をアニオン交換体と接触させて、血液に含まれるプロトロンビンを吸着させた後、5mmol/L以上50mmol/L以下のカルシウムイオンを含み、且つイオン強度が0.17mol/L以上0.46mol/L以下である溶離液をアニオン交換体と接触させて、ゲル化しないトロンビン溶液を得る、トロンビン溶液の調製方法。
- 前記溶離液とアニオン交換体の接触時間が2分以上10分以下である、請求項1に記載のトロンビン溶液の調製方法。
- 前記アニオン交換体がジエチルアミノエチル基を有するアニオン交換体である、請求項1又は2に記載のトロンビン溶液の調製方法。
- 前記溶離液をアニオン交換体と接触させる前に、該アニオン交換体を等張液で洗浄する、請求項1乃至3の何れかに記載のトロンビン溶液の調製方法。
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