BRPI0900057B1

BRPI0900057B1 - Processo para a obtenção de um concentrado de fator de von willebrand ou de um complexo de fator viii/fator de von willebrand e uso dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0900057B1
Application number: BRPI0900057-7A
Authority: BR
Inventors: Pere Ristol Debart; Maria Mercedes Faro Tomas; Juan Ignacio Jorquera Nieto
Original assignee: Grifols, S.A.
Priority date: 2008-01-08
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2021-03-23
Also published as: JP4976366B2; HK1129075A1; US20110275570A1; NZ573400A; EP2078730A1; ES2298096A1; BRPI0900057A2; ES2298096B1; AU2008255137B2; CL2009000022A1; EP2078730B9; AU2008255137C1; RU2008151957A; CA2645701A1; RU2417096C2; PL2078730T3; JP2009161528A; CA2645701C; EP2078730B1; MX2008015892A

Abstract

processo para a obtenção de um concentrado de fator de von willebrand ou de um complexo de fator viii/fator de von willebrand e uso dos mesmos. a presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um concentrado de fator de von willebrand ou de um complexo de fator viii/fator de von willebrand e uso dos mesmos. o processo é caracterizado pela preparação de uma solução de fator de von willebrand ou de um complexo de fator viii/fator de von willebrand que contém vwf e uma concentração de até 12 iu de vwf:rco/ml e uma razão de fator de von willebrand /fator viii de 0,4 ou mais e então prosseguindo-se com a nanofiltração da solução preparada em a) através de um filtro que tem um tamanho de poro menor do que 35 nanometros.

Description

PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR DE VON WILLEBRAND OU DE UM COMPLEXO DE FATOR VIII/FATOR DE VON WILLEBRAND E USO DOS MESMOS

1 - Escopo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um concentrado terapêutico de Fator de Von Willebrand ou a um complexo de Fator VIII/Fator de Von Willebrand e a um processo para a preparação de um composto medicinal indicado para o tratamento de Doença de Von Willebrand (VWD) e Hemofilia A que foi nanofiltrado através de um tamanho de poro menor do que 35 nm, através do qual vírus com ou sem um envoltório tais como, por exemplo, da hepatite A ou o eritrovírus B19 podem ser eficazmente eliminados.

2 - Técnica anterior

[002] O Fator de Von Willebrand (VWF) é uma proteína de plasma que tem uma estrutura multímera em que o peso molecular das várias formas varia entre aproximadamente 230000 Daltons (Da) para cada subunidade de monômero e até mais do que 20 milhões de Da nas formas multímeras de maior peso molecular, formando desse modo a maior proteína solúvel conhecida. A sua concentração no plasma é de aproximadamente em torno de 5 - 10 μg/ml [Siedlecki e outros, Blood, vol. 88, n°. 8, 1996: 2939- 2950] e a forma de plasma de menor tamanho é aquela que corresponde ao dímero, com um tamanho aproximado de 500000 Da.

[003] O VWF tem um papel essencial a representar na hemostasia primária, sendo responsável pela adesão de plaquetas às superfícies vasculares danificadas e, portanto, pela formação do bloco de plaqueta sobre o qual se desenvolvem os mecanismos para a formação do coagulado de fibrina. É sugerido que os multímeros de peso molecular mais altos suportam os mecanismos de adesão de plaquetas ao subendotélio com maior eficiência e a eficiência clínica dos concentrados de VWF tem sido relacionada à concentração destes multímeros de mais alto peso molecular [Metzner e outros, Hemofilia (1998) 4, 25-32].

[004] Além disso, no plasma, o VWF representa o papel de um transportador e de um estabilizador de Fator VIII (FVIII), a molécula de FVIII no estado nativo sendo encontrada, é associada às formas de multímero de VWF. O complexo de Fator VIII/ Fator de Von Willebrand (FVIII/VWF) atinge um comprimento de até 1150 nm [Furuya K e outros, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125]. Além disso o VWF em sua menor forma globular terá um tamanho de aproximadamente 149  77  3,8 nm e a sua estrutura pode variar, dependendo da força de cisalhamento, em uma forma estendida ou linear [Siedlecki e outros, Blood (1996) 88, 2939-2950]. A concentração no plasma de FVIII é de aproximadamente em torno de 0,05 – 0,1 μg/ml (que é uma de 50 a 100 vezes menor do que aquela de VWF).

[005] Os defeitos quantitativos ou qualitativos em VWF produzem mudanças em hemostase primária, conhecida como Doença de Von Willebrand, que é manifestada como problema de hemorragia.

[006] Os concentrados de VWF purificados e os concentrados de FVIII com um alto teor funcional de VWF são de uso terapêutico no tratamento da Doença de Von Willebrand.

[007] Um outro aspecto que precisa ser considerado é que como o VWF é o estabilizador natural para FVIII, os concentrados de FVIII com um alto teor de VWF podem ter muitas vantagens quando usados no tratamento da Hemofilia A, como ressaltado por um número de autores, por exemplo: uma media mais longa na vida ao vivo para o FVIII infundido, um efeito protetor contra os anticorpos inibidores de FVIII [Gensana M. e outros, Haemophilia, (2001) v.7, 369-374] [Bjorkman S. e outros, Clin Pharmacokinet, (2001) v.40, 815-832] [Behrmann K. e outros, Thromb Haemost, (2002) v.88, 221-229] e uma menor freqüência possível do desenvolvimento de anticorpos que inibem a atividade do FVIII [Goudemand J. e outros, Blood (2006) 107: 46 – 51].

[008] Foram estabelecidas as técnicas analíticas para caracterização tanto do teor como da atividade do VWF nestes concentrados. A determinação da atividade do VWF como um co-fator de Ristocetina (VWF:RCo) é um método amplamente usado para determinar a atividade de VWF [Heath e outros, Thromb Haemost 1992; 68:155-159]. A medida do antígeno de VWF (VWF:Ag) [Cejka J. Clin Chem. 1982; 28:1356-1358] nos apresenta a quantidade tanto do VWF ativo como inativo em uma amostra.

[009] Um dos parâmetros relevantes para avaliar a qualidade funcional dos concentrados de VWF é a relação entre a atividade VWF:RCo e o antígeno VWF:Ag.

[0010] Dada a possível importância da estrutura multímera de VWF e os multímeros de alto peso molecular em relação à sua atividade clínica e eficiência, a caracterização desta estrutura de multímero é fundamental para determinar a utilidade dos concentrados de VWF e de FVIII com um alto teor de VWF. Esta estrutura de multímero é determinada por eletroforese em gel [Ruggeri e outros, Blood 1981; 57: 1140-1143].

[0011] Foram descritos vários métodos de purificação de VWF ou do complexo de FVIII/VWF em que o VWF é funcional e tem uma concentração suficiente para o seu uso como um produto terapêutico em VWD, como apresentado pelas patentes EP 0411810 e EP 0639203 ou pela publicação por Ristol P. e outros, Sangre (1996) 41:125-130,

[0012] Outros processos para a purificação de FVIII fornecem um produto final sem VWF ou apenas com uma quantidade mínima deste último. Estes concentrados não são adequados para o tratamento de VWD. Além disso em alguns casos o VWF residual presente nestes concentrados de FVIII não é funcional, tendo perdido parte dos multímeros que o formam, especialmente aqueles de maior peso molecular. Estes concentrados não terão as vantagens dos concentrados de FVIII que são ricos em VWF quando usados para o tratamento de Hemofilia A.

[0013] Os concentrados de FVIII existentes são relatados (Tabelas 2 e 3) no registro dos concentrados do fator de coagulação criados em 1997 e discutidos até esta data pela World Haemophilia Federation (WHF) em 2006 (Kasper, C.K.; Brooker, M. Registry of clotting factor concentrates, Janeiro de 2006), que especifica entre outras coisas os métodos de fracionamento e de inativação viral e o seu teor de VWF e a eficiência funcional.

[0014] Entre os concentrados de FVIII nanofiltrados nós devemos fazer uma distinção entre aqueles que são nanofiltrados através de 35 nm (ou um maior tamanho do poro) e aqueles em que esta nanofiltração não é eficaz contra vírus que não têm um envoltório, tal como, por exemplo, o vírus da hepatite A (de aproximadamente 24 nm) ou o vírus B19 (entre 18 e 24 nm). Por outro lado, os concentrados de FVIII nanofiltrados tendo tamanhos do poro menores do que 35 nm não têm teor de VWF ou se eles tiverem, faltam os multímeros de alto peso molecular, como um resultado do qual eles não são eficazes para o tratamento de VWD e não têm as vantagens dos concentrados de FVIII ricos em VWF quando usados para o tratamento da Hemofilia A.

[0015] Uma grande capacidade para a remoção de agentes patogênicos é essencial para garantir a segurança dos produtos biológicos e, portanto, são incorporados vários métodos aos processos de produção com este objetivo. Entre estes deveria ser feita menção aos tratamentos de inativação química baseados na ação de solventes orgânicos associados a um detergente, o que demonstrou grande eficiência contra os vírus com um envoltório de lipídeo, embora estes sejam ineficazes contra os vírus sem um envoltório de lipídeo. Outros tratamentos físicos tais como tratamentos térmicos são eficazes sem levar em conta se um envoltório de lipídeo está presente ou não, porém a sua eficiência depende da gravidade do tratamento, que por sua vez é determinado pela resistência da proteína que está sendo processada para inativação. Outras técnicas que ajudam a reduzir a carga viral compreendem separações por precipitação ou por cromatografia.

[0016] Um método que foi provado ser muito eficaz na eliminação de vírus, sem levar em conta se um envoltório de lipídeo está presente ou não, é a filtração através de filtros que tenham um tamanho de poro capaz de reter partículas virais (nanofiltração). Este processo também foi demonstrado ser eficaz na remoção de outras partículas infecciosas tais como príons. Apesar disso, a eficiência deste método é determinada pelo tamanho do poro usado, que é essencialmente determinado pelo tamanho da proteína que precisa ser filtrada.

[0017] Há nanofiltros de diferentes tamanhos de poro, normalmente entre 15 e 75 nanômetros (nm) e em geral quanto menor o tamanho de poro, maior a eficiência na retenção de patogênicos, nanofiltros de tamanho de poro abaixo de 35 nm e de preferência entre 15 e 20 nm, sendo aqueles que retêm os menores vírus de tamanho entre 18 e 23 nm, tal como o eritrovírus B19 ou o vírus da hepatite A (aproximadamente 24 nm). Por causa de suas características, estes nanofiltros serão apenas aplicáveis fisicamente às proteínas de menor tamanho que podem, portanto, ser filtradas com recuperação aceitável para a produção industrial (normalmente a recuperação depois da nanofiltração deveria ser 60 % ou mais).

[0018] Por causa de sua estrutura molecular o VWF ou o complexo de FVIII/VWF não parece à princípio ser capaz de filtração por nanofiltros menores do que 35 nm, especialmente as formas multímeras de VWF de peso molecular mais alto. Não tem sido possível a nanofiltração de VWF ou do complexo de FVIII/VWF que inclui formas de multímero de peso molecular mais alto por nanofiltros de menos do que 35 nm.

[0019] Pelo Registro de Concentrados de Fator de Coagulação da World Haemophilia Federation (WHF) mencionados acima, um concentrado de FVIII nanofiltrado (neste caso usando 20 nm) é o Cross Eight M da Cruz Vermelha Japonesa, que também está descrita na publicação por K. Furuya e outros, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125. Apesar do fato que é afirmado na publicação de que foi conseguida a filtração do conteúdo de VWF do concentrado de FVIII por 20 nm e que a sua estrutura de multímero não foi alterada, podemos observar pelo registro de WHF que este concentrado tem um VWF não funcional. Voltando à publicação de Furuya observamos que o teor de VWF está no nível de traços [página 123: ... os teores de VWF eram similares àqueles normalmente encontrados (0,007-0,015 U de VWF/U de FVIII:C)...], ao passo que a razão no plasma é a unidade de atividade 1 de VWF para cada unidade de atividade de FVIII (proporção 1:1). Por outro lado, a caracterização da estrutura de multímero deste VWF residual (figura 4, página 123) apresenta não mais do que 10 faixas de multímero, ao passo que é sabido que uma estrutura de multímero bem conservada que tem os multímeros de alto peso molecular não deve conter menos que 11 faixas (Metzner e outros, Haemophilia (1998) 4; página 27, 2º Parágrafo). O que Furuyanos declara em sua publicação e que o concentrado de FVIII purificado por cromatografia de afinidade que usa anticorpos monoclonais tem um nível de traços de teor de VWF, que somente os multímeros de menor peso molecular são preservados e que esta composição de VWF não é afetada adversamente pela nanofiltração a 20 nm. Obviamente este concentrado (Cross Eight M) é inadequado para o tratamento de VWD e não se beneficia da presença de VWF nas proporções (1:1) encontradas em plasma humano normal.

[0020] O outro concentrado de FVIII nanofiltrado mencionado no registro dos concentrados do fator de coagulação da World Haemophilia Federation citada acima é FACTANE de LFB. De acordo com o registro este concentrado é nanofiltrado a 15 nm e contém VWF. Este produto corresponde àquele obtido de acordo com a patente WO 2005040214 que descreve uma composição de FVIII nanofiltrada através de uma peneira de tamanho de poro entre 13 e 25 nm em que a eficiência da retenção de vírus está associada como o conteúdo de VWF de alto peso molecular (mais que 10 multímeros) menos do que 15 %, que confirma de novo o que foi observado na publicação de Furuya, que os multímeros de VWF de menor peso molecular podem ser nanofiltrados através de 20 nm quando baixas concentrações presentes com respeito a FVIII, isto é, digamos com razões de VWF/FVIII que são diferentes de 1 (0,015 no caso de Furuya e 0,15 no caso de Factane, patente WO 2005/040214). Ao contrário, os multímeros de maior peso molecular estão retidos pelo nanofiltro. Além disso, nesta patente, para recuperar o FVIII associado com o VWF, que também seria retido, é provocada uma dissociação forçada do complexo de FVIII/VWF pela adição de CaCl2 em uma concentração maior que 0,20 M, que é a concentração mínima na qual se dissocia o complexo de FVIII/VWF. Apesar disso, todos os exemplos fazem uso de uma concentração de CaCl2 de pelo menos 0,35 M para garantir a dissociação do complexo FVIII/VWF e desse modo a recuperação de FVIII. A composição definida nesta patente é unicamente com a finalidade de tratar déficit de FVIII e não de VWD. Além disso este produto não é adequado para o tratamento de VWD, como é provado na autorização do produto pela "French Agency for the Safety of Health Products" [http://afssaps-prd.afssaps.fr/php/ecodex/frames.php?specid=6 67168 33&typedoc=R& ref=R0093176.htm], na seção 4.1 Indicações Terapêuticas, nas quais é claramente especificada que o produto não contém VWF em quantidade suficiente para o tratamento de VWD. Além disso, na publicação sobre aquele produto [Vox Sanguinis (2007) 92, 327-337] os autores confirmam que o produto (Factane) não é intencionado para o tratamento de VWD (página 335).

[0021] Para resumir, o objetivo dos procedimentos descritos por K. Furuya e outros, [Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125] e a patente WO 2005/040214 e a publicação Vox Sanguinis (2007) 92, 327-337 é obter um concentrado de FVIII que é pobre em pobre em VWF (< 15 % ou uma razão de VWF/FVIII de <0,15:1) aplicável ao tratamento de Hemofilia A, porém que não se beneficia das vantagens de que um concentrado rico em VWF seria responsável pelo tratamento de Hemofilia e que em nenhuma circunstância, seria adequado para o tratamento de VWD.

[0022] Foi afirmado (Siedlecki e outros, Blood, vol 88, n 8, 1996: 2939-2950) que VWF muda a sua estrutura tridimensional sob condições de escoamento que dão origem a altas forças de cisalhamento (alto esforço de cisalhamento), que permite que os mecanismos de adesão de plaqueta ocorram in vivo. Esta mudança na estrutura tem o resultado de que a molécula muda sendo de uma estrutura globular para uma forma mais linear. Sob este aspecto, K. Furuya e outros, em sua publicação (Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125) já indicaram que a filtração de seu concentrado de FVIII através de 20 nm deve ser realizada a alta pressão (0,8 bar) para se obter um rendimento aceitável de FVIII e isto que eles sugerem é provavelmente devido ao fato que a uma pressão inferior o efeito do fluxo não é suficiente para o VWF presente mudar a sua estrutura, tornando assim difícil a filtração. Sob as condições especificadas (0,8 bar) eles também conseguiram boa recuperação dos multímeros de VWF presentes de baixo peso molecular, levando-se em consideração que os valores iniciais antes da nanofiltração são muito baixos.

[0023] Os documentos citados não descrevem a possível aplicação de nanofiltração através de menos que 35 nm, tal como, por exemplo através de 20 nm, a VWF ou o complexo de VWF/FVIII (razão  0,4) com um teor funcional de multímeros de alto peso molecular que permitirão que o mesmo seja usado para o tratamento de VWD ou que mantém as vantagens descritas de concentrados ricos em VWF quando usados para o tratamento de Hemofilia A. Além disso, a WO 2005/040214 indica claramente aos os peritos na técnica que este tamanho de poro impede a passagem de VWF de alto peso molecular.

[0024] O estado da técnica em que a nanofiltração de VWF como um produto terapêutico está no presente momento restrito à nanofiltração através de 35 nm é demonstrado pela patente EP 1632501. Esta patente descreve um processo para a obtenção de um concentrado de VWF com um baixo teor de FVIII (razão FVIII:C/VWF:RCo menor que 0,06) que inclui um estágio de remoção de vírus por nanofiltração através de filtros com 35 nm de tamanho de poro, como indicado no parágrafo 23 do relatório descritivo e no Exemplo 1, parágrafo 37. Por esta patente podemos aprender que a nanofiltração de uma molécula do tamanho de VWF não é possível para nanofiltros que tenham um tamanho de poro menor que 35 nm.

[0025] Como foi observado, neste presente momento não há concentrado terapêutico indicado para o tratamento de Doença de Von Willebrand que foi sendo nanofiltrado através de 20 nm. Além disso o presente estado da técnica indica que esta nanofiltração de VWF contendo multímeros de alto peso molecular através de 20 nm não é possível, como no caso do complexo molecular FVIII/VWF, se os multímeros de alto peso molecular de VWF estiverem presentes e a proporção entre VWF e FVIII for maior do que 0,15.

[0026] A preparação de um concentrado de FVIII/VWF nanofiltrado através de 20 nm com proporções entre os dois componentes do FVIII e do complexo macromolecular de VWF que são mais similares àqueles encontrados normalmente em plasma humano (1 unidade de VWF para cada 1 unidade de FVIII), que ainda tem todas as vantagens do complexo nativo de FVIII/VWF e é adequado para o tratamento de VWD e Hemofilia A, ainda é um problema não resolvido.

[0027] Os processos para a obtenção de VWF ou de complexo de FVIII/VWF proveniente de plasma humano normalmente partem com a fração de crioprecipitado e se purificam por precipitação seletiva ou mais recentemente por técnicas cromatográficas, que usam essencialmente troca iônica e/ou afinidade.

[0028] Os processos para a purificação de FVIII que são atualmente baseados em cromatografia por imunoafinidade (que usa anticorpos monoclonais) conferem à FVIII uma atividade específica muito alta porém falta a VWF funcional [K. Furuya e outros, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125].

[0029] Como foi observado, estes processos para a obtenção de VWF ou do complexo de FVIII/VWF envolvem um ou mais estágios específicos de inativação ou de remoção de vírus.

[0030] Nesta invenção, a atividade do VWF é baseada no papel de VWF como um co-fator para o antibiótico Ristocetina (VWF:RCo) em sua capacidade para induzir agregação de plaqueta (Pharmacopoiea Europea 07/2006:20721). Esta atividade é expressa em Unidades Internacionais (IU VWF:RCo) e a sua concentração em IU/mililitro (IU de VWF:RCo/ml).

[0031] A atividade de FVIII refere-se à atividade de coagulação de FVIII (FVIII:C) que está baseada no papel de FVIII como um co-fator na ativação de FX na presença de FIXa, íons de cálcio e fosfolipídeos (Pharmacopoeia Europea 07/2006:20704). Isto é quantificado para um substrato cromogênico e expresso em Unidades Internacionais (IU de FVIII) e na sua concentração em IU de FVIII/mililitro (IU de FVIII/ml).

3 - Descrição da Invenção

[0032] Esta invenção descreve um concentrado terapêutico de Fator de Von Willebrand ou um complexo de Fator VIII/ Fator de Von Willebrand que foi nanofiltrado através de uma peneira de tamanho de poro menor que o equivalente a 35 nm em que o produto obtido tem uma razão VWF:RCo/FVIII:C que é maior ou igual a 0,4 e uma estrutura conservada de multímero para o VWF que inclui os multímeros de alto peso molecular (mais do que 11 faixas) e que é útil para a preparação de um composto medicinal indicado para o tratamento de Doença de Von Willebrand e Hemofilia A e um processo para a obtenção do mesmos.

[0033] Na base de investigações realizadas na nanofiltração de VWF ou no complexo de FVIII/VWF em que o VWF tem uma estrutura de multímero preservada contendo os multímeros de alto peso molecular, os inventores demonstraram surpreendentemente que no caso de uma solução que contém VWF ou o complexo de FVIII/VWF e íons de cálcio é possível realizar a filtração através de um nanofiltro de tamanho de poro nominal menor que 35 nm e de preferência 20 nm a uma pressão máxima menor que 50 kPa (0,5 bar) e de preferência entre 20 kPa a 40 kPa (0,2 e 0,4 bar).

[0034] A solução que é para ser nanofiltrada tem uma concentração máxima de 0,6 Unidade de Absorvância (AU280), equivalente a não mais do que 12 IU de VWF:RCo/ml. A composição de proteína da solução, além de seu próprio teor de VWF e FVIII, também pode compreender outras proteínas, tal como, por exemplo, fibrinogênio ou fibronectina, a atividade específica do VWF (IU de VWF:RCo/mg de proteína) sendo maior do que ou igual a 1 e tipicamente de 10 ou mais. A atividade específica do FVIII (IU de FVIII/mg de proteína) no caso de nanofiltração do complexo de FVIII/VWF também é maior do que ou igual a 1 e tipicamente de 10 ou mais.

[0035] A solução que precisa ser nanofiltrada pode conter cálcio (cloreto) entre 0,05 e 0,20 M e pelo menos um aminoácido básico como um estabilizador de proteína, de preferência histidina, entre 20 e 30 mM. O pH da solução que precisa ser filtrada deve ser maior do que 5,5 para evitar a desnaturação.

[0036] A razão de carga, expressa como a atividade biológica da proteína que precisa ser filtrada, pode atingir 50 IU de VWF:RCo/cm2 de área da superfície de filtração, equivalente a 0,5 mg de VWF/cm2.

[0037] Sob as condições especificadas é possível filtrar até 120 litros de solução por m2 de área da superfície de filtração, obtendo-se uma recuperação de atividade de FVIII de mais do que 70 % e uma recuperação de atividade de VWF de mais do que 60 %, com uma estrutura de multímero de VWF preservada (mais do que 11 multímeros) e uma razão de VWF:RCo/FVIII que é pelo menos de 80 % daquela do material usado.

[0038] A solução que precisa ser filtrada é caracterizada pelo fato de que ela tem uma razão de atividade de VWF:RCo/FVIII que é maior do que ou igual a 0,4 e tipicamente entre 1 e 3 e é, portanto, igualmente aplicável a soluções de VWF sem FVIII e soluções do complexo de FVIII/VWF, dado que VWF, sendo a molécula de multímero de maior tamanho, é a única que limita o processo.

[0039] Sob as condições especificadas o fluxo de filtração padrão é um máximo de 30 litros/hora/m2 e tipicamente entre 10 e 20 litros/hora /m2, o tempo de filtração sendo de 12 horas ou menos. Isto torna possível a aplicação industrial e é óbvio que estes parâmetros podem ser mudados ou otimizados pela variação da área da superfície de nanofiltração, isto sendo o fator que limita o processo, por causa de seu alto custo.

[0040] Em uma modalidade preferida a préfiltração é realizada usando um nanofiltro do tamanho de poro entre 35 e 100 nm antes da nanofiltração através de um tamanho de poro menor do que 35 nm. A razão entre as áreas do pré-filtro e do nanofiltro (< 35 nm) fica entre 1:2 e 1:4.

[0041] Também é possível realizar uma dupla nanofiltração através de 20 nm (20 nm + 20 nm), que aumenta a vantagem de segurança adicionada para o produto da nanofiltração.

[0042] Através desta invenção é obtido um VWF nanofiltrado ou um complexo de FVIII/VWF que torna possível preparar uma medicação de alta pureza adequada para o tratamento de VWD e de Hemofilia A, que tem uma atividade de VWF maior do que 100 IU de VWF:RCo/ml e uma razão entre as atividades de VWF e de FVIII de 0,4 ou mais e em que a estrutura de multímero do VWF inclui os multímeros de alto peso molecular (mais do que 11 faixas).

4 - Exemplos

[0043] Dos nanofiltros comercialmente disponíveis, foram usados nanofiltros Planova da Asahi Kasei Corporation, Japão, fabricados partindo de celulose regenerada e que têm um tamanho de poro de aproximadamente 35 ± 2 nm no caso de Planova 35N e 19 ± 1 nm no caso de Planova 20N, para fornecer os exemplos da invenção. Filtros deste tipo permitem filtração do modo "dead end" e do modo tangencial. Nos exemplos que se seguem foi realizada nanofiltração usando Planova no modo "dead end", porém, para as finalidades desta invenção o uso do modo tangencial também é adequado, como é o uso de nanofiltros de outras marcas e composição comerciais, que serão conhecidas dos versados na técnica. Tanto a montagem, quanto o processo de operação e a testagem para garantir que os nanofiltros aos quais se refere esta invenção estão intactos são especificados integralmente nas instruções do fabricante.

Exemplo 1: Aquisição do material de partida.

[0044] A solução de complexo de FVIII/VWF antes da nanofiltração, que se origina do plasma humano, pode ser obtida, por exemplo, partindo do crioprecipitado solubilizado por precipitação com polietileno glicol e purificação subseqüente com cromatografia por afinidade, como apresentado na patente EP 0411810. A solução nanofiltrada pode ser subseqüentemente purificada para obter um produto de grande pureza, por exemplo, por precipitação com glicina, como apresentado na patente EP 0639203. Alternativamente, o FVIII ou o VWF ou ambos, podem ser obtidos por biossíntese usando-se a tecnologia de DNA recombinante em células transgênicas ou em animais [Wood W.I. e outros, Nature (1984) 312: 330-337]; [Toole, JJ. e outros, Nature (1984) 312: 342-347].

Exemplo 2: Nanofiltração do complexo de FVIII/VWF.

[0045] A filtração em série através de um filtro Planova 35 N de 0,12 m2 e de um filtro Planova 20N de 0,3 m2 foi realizada usando-se 14,7 litros de uma solução de complexo de FVIII/VWF parcialmente purificado que tem uma atividade específica de 10,4 IU de FVIII/AU280nm e uma concentração de VWF:RCo de 5,69 IU/ml, equivalentes a 0,235 AU280nm, na presença de 25 mM de histidina e 0,14 M de cálcio a um pH de 6,77 e a uma temperatura de 20 ± 5º C. A filtração foi realizada a um fluxo constante de aproximadamente 14 L/h/m2, mantendo-se uma diferença de pressão de entre 20 kPa a 30 kPa (0,20 e 0,30 bar) no Planova 20N por meio de filtração de toda a solução, que foi completada em um período de tempo de 3,3 horas. A produtividade por área e por unidade de tempo foi de 3,6 de IU de FVIII/cm2/hora, 8,2 de IU de VWF RCo/cm2/hora (razão de VWF:RCo/FVIII:C = 2,3) e 9,8 IU de VWF:Ag/cm2/hora. A recuperação da atividade foi de 94 % de FVIII e de 95 % de VWF RCo.

Exemplo 3: Características do Complexo de FVIII/VWF nanofiltrado através de Planova 20N.

[0046] 7 diferentes lotes de material de partida foram processados da maneira ilustrada no Exemplo 2. O complexo de FVIII/VWF que tem uma atividade específica próxima a ou maior do que 10 IU de FVIII/AU280nm e uma concentração de proteína de 0,3 ± 0,2 AU280nm foi usado como o material de partida na presença de 25 mM de histidina e 0,14 M de cálcio a um pH de 6,8 ± 0,2 e a uma temperatura de 20 ± 5º C. Foram realizadas clarificação através de 0,1 μm e nanofiltração em série subseqüente através de Planova 35N e de Planova 20N. A filtração foi mantida a um fluxo constante de entre 10 e 20 litros/h/m2. A pressão de operação no filtro Planova 20N foi mantida entre 20 kPa e 40 kPa (0,2 e 0,4 bar) através da filtração em todos os casos.

[0047] Os resultados obtidos (Tabela 1) demonstram que a nanofiltração do complexo de FVIII/VWF através de um tamanho de poro de 20 nm sob as condições especificadas não tem efeito algum sobre a atividade e a pureza (atividade específica) do nanofiltrado obtido.

[0048] A análise comparativa das razões de VWF:RCo/FVIII e VWF:RCo/VWF:Ag (Tabela 1) obtidas no material antes e depois da nanofiltração torna possível estabelecer que sob as condições especificadas é possível filtrar o VWF presente no concentrado de FVIII/VWF através de um peneira de tamanho de poro de 20 nm sem afetar a funcionalidade de VWF como um co-fator de Ristocetina.
Tabela 1

[0049] Os valores correspondem à média de 7 lotes ± SD

Exemplo 4: Estrutura de multímeros do VWF obtido por eletroforese em gel, estabelecendo a conservação dos mesmos, inclusive multímeros de maior peso molecular com mais do que 11 faixas.

[0050] A figura 1 apresenta a estrutura de multímero do VWF em diferentes lotes de produtos finais, com e sem o estágio de nanofiltração. Pelo menos 16 faixas em pistas correspondentes ao material nanofiltrado podem ser contados na fotografia original.

Exemplo 5: Efeito da diferença de pressão sobre a nanofiltração do complexo de FVIII/VWF.

[0051] Uma solução de FVIII/VWF parcialmente purificada cuja atividade específica do FVIII era de aproximadamente 10 IU/AU280nm e com concentrações na faixa de 0,1-0,3 AU280nm foi filtrada através de Planova 35N sob as condições descritas nos Exemplos 2 e 3. A nanofiltração foi ajustada para alta pressão 80 kPa (0,8 bar) e baixa pressão 30 kPa (0,3 bar) e foram obtidos os resultados apresentados na Tabela 2.

(1) não disponível dado que o processo foi interrompido por causa do entupimento e bloqueio do nanofiltro.

[0052] De modo similar esta solução de Complexo de FVIII/VWF pré-filtrada através de Planova 35N foi filtrada através de Planova 20N sob as condições descritas no Exemplo 2. A nanofiltração foi ajustada para alta pressão 80 kPa (0,8 bar) e baixa pressão 30 kPa (0,3 bar) e foram obtidos os seguintes resultados:

[0053] Na filtração através de Planova 35N a alta pressão houve uma queda drástica no fluxo, apenas 10,6 % e 14,6 % do fluxo inicial sendo observado depois da nanofiltração de uma hora e, em um caso, somente 7,9 % do fluxo inicial a 3 horas. Na filtração através de Planova 35N a uma diferença de pressão de 30 kPa (0,3 bar) o fluxo permaneceu a 88,6 % mesmo depois de 3 horas de nanofiltração.

[0054] Na filtração através de Planova 20N, usando-se uma solução de Complexo de FVIII/VWF pré-filtrado através de Planova 35N como o material de partida e com uma diferença de pressão de 80 kPa (0,8 bar), foi obtida uma vazão de 40 % depois de uma hora de nanofiltração e a filtração foi interrompida antes de 3 horas por causa do entupimento do filtro. Na filtração através de Planova 20N com uma diferença de pressão de 30 kPa (0,3 bar) o fluxo permaneceu a 75,7 % mesmo depois de 3 horas de nanofiltração.

[0055] É evidente pelos exemplos acima que se mantermos condições de baixa pressão durante a filtração para tamanhos de poro de 35 nm ou abaixo evita-se a produção de uma súbita queda no escoamento. Como uma conseqüência, foi observado que não há bloqueio de parte dos poros da membrana do filtro devido à deposição de moléculas de alto peso molecular presentes na solução de FVIII/VWF, tais como formas de multímero de VWF que alcançam tamanhos de até 20000000 Da, sob estas condições de pressão.

Exemplo 6: Efeito da concentração do material usado na nanofiltração do complexo de FVIII/VWF.

[0056] Usando-se diferentes soluções de complexo de FVIII/VWF parcialmente purificado que tenha uma atividade específica de FVIII de aproximadamente 10 IU de FVIII/AU280nm, com uma atividade de VWF em relação à atividade de FVIII (VWF:RCo:FVIII) de aproximadamente 2 e incluindo concentrações na faixa de 0,1-0,65 AU280nm, foi realizada filtração através de Planova 20N a uma diferença de pressão de aproximadamente 50 kPa (0,5 bar) e sob as mesmas condições do processo e da composição do produto como descrito nos Exemplos 1 e 2 (exceto para a sua concentração).

[0057] Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 4:
Tabela 4

(1) n.d: não determinada (por causa de bloqueio anterior e entupimento do nanofiltro).
(2) Os valores calculados à base da quantidade de proteína filtrada durante 6 horas, com em todos os casos uma atividade específica de 10 IU de FVIII/AU280nm, uma razão de VWF:RCo/FVIII de 2 e a recuperação da proteína observada em cada caso.

[0058] A redução no fluxo observada durante a nanofiltração é diretamente proporcional à concentração do material do carregamento. Assim o fluxo observado depois de uma hora de nanofiltração é de 80,7 %, 63,6 %, 60,7 %, 52,9 % e 16,2 % em relação ao fluxo inicial para concentrações de 0,106 AU, 0,17 AU, 0,314 AU, 0,343 AU e 0,648 AU respectivamente. Em relação ao fluxo observado depois de 3 horas de nanofiltração, a queda até valores abaixo de uns 30,5 % do fluxo inicial pode ser atribuída ao fato de que a nanofiltração foi realizada sob condições de pressão que representam o limite superior para o processo.

[0059] Os valores ótimos de produtividade (7,8 IU de VWF:RCo/cm2/h equivalentes a 46,8 IU de VWF:RCo/cm2) e a recuperação da proteína (ver tabela) foram obtidos para uma concentração de carga próxima a 0,3 AU. Quando a concentração do material de carregamento for um máximo (0,648 AU) é observado entupimento do filtro desde o início da filtração e os valores de produtividade e de recuperação caem drasticamente até valores abaixo de 2 IU de VWF:RCo/cm2/h e recuperação total de proteína de 46,8 %, um resultado que tira de qualquer possibilidade a nanofiltração a esta concentração.

[0060] Pode ser estabelecido por estes resultados que a faixa de concentração viável para a nanofiltração da solução de FVIII/VWF que tem uma atividade específica de aproximadamente 10 IU de FVIII/AU280nm é ≤ 0,6 AU, aproximadamente equivalente a ≤ 6 IU/ml de FVIII e ≤ 12 IU/ml de VWF:RCo.

Exemplo 7: Efeito da concentração de cálcio sobre a nanofiltração do complexo de FVIII/VWF.

[0061] Usando-se diferentes soluções de complexo de FVIII/VWF formulados com albumina que tenham uma atividade específica de mais do que 10 IU de FVIII/AU280 e uma atividade FVIII em torno de 3 IU/ml, aproximadamente equivalentes a 4 IU/ml of VWF:RCo, foi realizada filtração através de um filtro que tem um tamanho de poro de 20 nm na presença de 0,1 M de arginina, 25 mM de histidina e 0,05 mM de cálcio a um pH de 7,3 ± 0,1. A filtração foi realizada mantendo-se uma diferença de pressão através de Planova 20N de aproximadamente 50 kPa (0,5 bar). A Tabela 5 apresenta os parâmetros mais relevantes obtidos nos testes realizados usando-se dois lotes de produto separados.

(1) Valores calculados à base das IU de FVIII filtrado por unidade de tempo e as unidades da superfície considerando uma razão (VWF:RCo/FVIII) de 1,24.

[0062] Estes resultados indicam que a ausência virtual de cálcio (0,05 mM) e a sua reposição por arginina (0,1M) produzem uma queda significativa na produtividade, até valores de 1,6 IU de FVIII/cm2/hora e 2,0 IU de VWF:RCo/cm2/hora em ambos os casos, que são notavelmente menores do que aqueles observados no Exemplo 2 (3,6 IU de FVIII/cm2/hora e 8,2 IU de VWF:RCo/cm2/hora), com uma atividade de FVIII similar no material de partida.

[0063] Similarmente a recuperação da atividade de FVIII observada nos dois testes caiu até valores de 43,3 % e 46,6 % respectivamente. Não obstante, mesmo sob estas condições é possível a nanofiltração do complexo macromolecular de FVIII e VWF com proporções entre as atividades de VWF e FVIII similares àquelas encontradas na natureza (1:1).

Exemplo 8: Produção de um lote de nanofiltrado de FVIII/VWF em uma escala industrial.

[0064] Partindo de uma solução de complexo de FVIII/VWF parcialmente purificada que se origina de mais do que 3000 litros de plasma e que tem uma atividade específica de 15,6 IU de FVIII/AU280, a filtração foi realizada em série através de um filtro de tamanho de poro nominal de 35 nm (Planova 35N) de 4 m2 e dois filtros que têm um tamanho de poro nominal de 20 nm (Planova 20N) de 4 m2 na presença de 25 mM de histidina e de 0,14 M de cálcio a um pH de 6,80, A filtração foi realizada a um fluxo constante de aproximadamente 107 L/h mantendo-se uma pressão diferença através de Planova 20N de entre 20 kPa e 35 kPa (0,20 e 0,35 bar), com uma carga de aplicação (solução do produto + pós-lavagem) de 120,2 kg/m2 de Planova 20N. A atividade total aplicada por unidade de área era de 8,9 IU de FVIII/cm2 e 19,1 IU de VWF:RCo/cm2. A recuperação da atividade da nanofiltração era de 70,4 % de FVIII e 77,3 % de VWF:RCo. Incluindo a pós-lavagem e depois de concentrar o produto nanofiltrado obtido a recuperação da atividade observada foi de 97,5 % de FVIII e 86,8 % de VWF:RCo.

[0065] A precipitação subseqüente de cloreto de sódio e de glicina (de acordo com a EP 0639203) forneceu um concentrado de FVIII/VWF nanofiltrado de alta pureza.

[0066] O concentrado de FVIII/VWF nanofiltrado de alta pureza obtido foi estabilizado e a sua concentração resistência foi ajustada antes de o produto ser introduzido em frascos.

[0067] O teor relativo de VWF em relação ao teor de FVIII, expresso como a razão de VWF:RCo/FVIII, para o processo de purificação é apresentado na Tabela 6 a seguir:

Tabela 6

[0068] Variação da atividade (IU de VWF:RCo/IU de FVIII)no processo de purificação

[0069] Estes resultados indicam que o uso de nanofiltração no processo de purificação do complexo de FVIII/VWF não afeta essencialmente o estágio de purificação subseqüente que conduz a um produto de alta pureza. Isto indica, portanto, que as condições estabelecidas para a nanofiltração do concentrado de FVIII/VWF através de uma peneira de tamanho de poro de 20 nm não afeta adversamente a proporção das formas multímeras de mais alto peso molecular de VWF, dado que seria de esperar que uma tal variação tivesse um efeito adverso sobre a purificação subseqüente por precipitação.

[0070] O concentrado de FVIII/VWF nanofiltrado tem uma concentração relativa de VWF que é suficiente para uso como um produto terapêutico em VWD e um teor de FVIII que também permite que ele seja usado para o tratamento de Hemofilia A, com a vantagem adicional da presença de quantidades de VWF (o estabilizador natural de FVIII) similares àquelas encontradas na natureza, cujas propriedades vantajosas no tratamento de Hemofilia A foram mencionadas anteriormente.

[0071] Embora a invenção tenha sido descrita na base de modalidades preferidas da mesma e dos exemplos ilustrados, será entendido que na base do material divulgado, os peritos na técnica podem introduzir múltiplas variantes nas modalidades da invenção, que irão permanecer amplamente ali incluídas, tendo relação ao conteúdo das reivindicações a seguir e seus equivalentes.

Claims

Processo para obtenção de um concentrado de um complexo de Fator VIII/Fator de Von Willebrand (VWF) de origem humana ou recombinante, o processo caracterizado pelo fato de que compreende:
- a) preparar uma solução de um complexo de Fator VIII/Fator de Von Willebrand que contém Fator de Von Willebrand em uma concentração de até 12 IU de VWF:RCo/mL e tem uma razão de atividade de VWF:RCo/Fator VIII de 0,4 a 3,
- b) uma etapa de nanofiltração que consiste em filtrar a solução preparada em a) através de um nanofiltro que tem um tamanho de poro inferior a 35 nanometros, a uma pressão máxima inferior ou igual a 50 kPa (0,5 bar), na presença de íon de cálcio a uma concentração entre 0,05 e 0,14 M e a um pH superior a 5,5;
e, assim, obter um concentrado de complexo de Fator VIII/VWF, em que a razão de atividade de VWF:RCo/Fator VIII não é afetada.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Fator de Von Willebrand recuperado após a nanofiltração mantém uma estrutura de multímero que inclui multímeros da ordem de 11 ou mais.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rendimento de Fator de Von Willebrand recuperado após a nanofiltração é de 60 % ou mais.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o rendimento de Fator de Von Willebrand recuperado após a nanofiltração é de 70 % ou mais.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é usada uma razão de carga de até 50 IU de Fator de Von Willebrand por cm2 de área de superfície de filtração.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a concentração máxima da solução que está sendo filtrada é de 0,6 AU (OD280).
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração é realizada à uma pressão entre 20 kPa e 40 kPa (0,2 e 0,4 bar).
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fluxo de nanofiltração padrão está entre 10 e 20 litros/hora/m2.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração é realizada utilizando um nanofiltro tendo tamanho de poros de 20 nanometros ou menos.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a nanofiltração é realizada utilizando um nanofiltro tendo tamanho de poros de 19 ± 1 nanometros.
Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o concentrado recuperado do complexo Fator VIII/VWF tem uma razão de atividade VWF:RCo/Fator VIII de pelo menos 80% da solução preparada em a).