CN101480490B - 获得冯维勒布兰德氏因子浓缩物或因子ⅷ/冯维勒布兰德氏因子复合物的方法和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

制备冯维勒布兰德氏因子的浓缩物或因子VIII/冯维勒布兰德氏因子的复合物的方法以及它们的用途。该方法特征在于制备冯维勒布兰德氏因子或因子VIII/冯维勒布兰德氏因子的复合物的溶液，其含有浓度达12IUVWF:RCo/ml的VWF并且冯维勒布兰德氏因子/因子VIII比例为0.4或更大；然后通过孔径小于35纳米的过滤器，进行纳米过滤a)中制备的溶液。

Description

获得冯维勒布兰德氏因子浓缩物或因子Ⅷ/冯维勒布兰德氏因子复合物的方法和它们的用途
技术领域
本发明涉及冯维勒布兰德氏因子(Von Willebrand Factor)的治疗性浓缩物或者因子VIII/冯维勒布兰德氏因子的复合物，以及制备用于治疗遗传性假血友病(VWD)和血友病A的药物化合物的方法，它们已通过小于35nm的孔径进行纳米过滤，由此，有和没有被膜的病毒例如甲肝或红病毒属B19可以被有效地除去。 
背景技术
冯维勒布兰德氏因子(VWF)是具有多聚体结构的血浆蛋白，其中各种形式的分子量在各单体亚单元大约230000道尔顿(Da)和更大分子量多聚体形式中高达2千万Da以上之间变化，因此形成最大的已知可溶性蛋白。其血浆浓度大约5-10μg/ml[Siedlecki等，Blood，vol 88，n 8，1996：2939-2950]，更小尺寸的血浆形式是对应于二聚体的形式，大小大约500000Da。 
VWF在原发性止血中起重要的作用，负责血小板与受损伤血管表面的粘附，并因此形成血小板栓子，在血小板栓子上血纤维蛋白凝固的形成机制得以发展。这说明，更高分子量的多聚体以更高的效率支持血小板到内皮下层的粘附机制，VWF浓缩物的临床疗效与这些更高分子量多聚体的浓度有关[Metzner等，Haemophilia(1998)4，25-32]。 
除此，血浆内VWF起着因子VIII(FVIII)的运输剂和稳定剂的作用，天然状态的FVIII分子被发现连接到多聚体形式的VWF。因子VIII/冯维勒布兰德氏因子(FVIII/VWF)的复合物达到1150nm以上的长度[Furuya K等，Vox Sanguinis(2006)91，119-125]。除此，更小球状形式的VWF具有大 约149×77×3.8nm的大小，并且其结构取决于剪切力，可以变化成延长的或线形的形式[Siedlecki等，Blood(1996)88，2939-2950]。FVIII的血浆浓度大约0.05-0.1μg/ml(这比VWF的血浆浓度小大约50至100倍)。 
定量或定性VWF缺陷导致原发性止血——称为遗传性假血友病——的变化，其显示为流血问题。 
具有高功能性VWF含量的纯化VWF浓缩物和FVIII浓缩物在治疗遗传性假血友病方面具有治疗用途。 
将要考虑的另一方面是，由于VWF是FVIII的天然稳定剂，因此具有高VWF含量的FVIII浓缩物在用于治疗血友病A时可能具有许多优点，正如许多作者指出的，例如：灌输的FVIII在体内更长的平均寿命、针对FVIII抑制剂抗体的保护性作用[Gensana M.等，Haemophilia，(2001)v.7，369-374][Bjorkman S.等，Clin Pharmacokinet，(2001)v.40，815-832][Behrmann K.等，Thromb Haemost，(2002)v.88，221-229]，以及抑制FVIII活性的抗体的形成的可能频率更低[Goudemand J.等，Blood(2006)107：46-51]。 
表征这些浓缩物中VWF的含量和活性的分析技术已经建立。测定作为瑞斯托菌素辅因子的VWF活性(VWF:RCo)是广泛使用的测定VWF活性的方法[Heath等，Thromb Haemost1992；68：155-159]。VWF抗原(VWF:Ag)的测定[Cejka J.Clin Chem.1982；28：1356-1358]显示出在样品中活性以及无活性VWF的数量。 
评估VWF浓缩物功能性品质的一个相关参数是VWF:RCo活性与VWF:Ag抗原之间的关系。 
假定VWF和高分子量多聚体的多聚体结构的潜在重要性与其临床活性和效应相关，则这种多聚体结构的表征对于确定具有高VWF含量的VWF浓缩物和FVIII浓缩物的有效性是必要的。这种多聚体结构通过凝胶电泳法确定[Ruggeri等，Blood 1981；57：1140-1143]。 
纯化VWF或FVIII/VWF复合物的各种方法，其中VWF是功能性的并且用作治疗VWD的产品中具有足够的浓度已有描述，如专利EP0411810和EP 0639203或出版物Ristol P.等，Sangre(1996)41：125-130中所 显示复合物中。 
其它FVIII纯化方法提供无VWF或仅有痕量VWF的最终产品。这些浓缩物不适合用于治疗VWD。同样在一些情况下，这些FVIII浓缩物中存在的残留VWF不是功能性的，已经失去形成它的部分多聚体，特别是更大分子量的那些。这些浓缩物当被用于治疗血友病A时将不具有富含VWF的FVIII浓缩物的优点。 
现有的FVIII浓缩物被报道(表2和3)，记录为1997年产生的凝血因子浓缩物，并于2006年由世界血友病联盟(World HaemophiliaFederation)(WHF)更新(Kasper，C.K.；Brooker，M.Registry of clotting factorconcentrate，January 2006)，其详细说明了分馏和病毒失活的方法以及它们的VWF含量和功能效应等等。 
在纳米过滤的FVIII浓缩物中，必须区分以下两种：通过35nm(或更大孔径)纳米过滤的那些，以及这种纳米过滤对于没有被膜的病毒例如甲肝病毒(大约24nm)或B19病毒(18与24nm之间)无效的那些。另一方面，孔径35nm以下的纳米过滤FVIII浓缩物没有VWF含量，或者如果它们有，它也缺乏高分子量多聚体，结果是它们对于治疗VWD无效，并且当被用于治疗血友病A时不具有富含VWF的FVIII浓缩物的优势。 
除去致病物质的巨大能力对于确保生物产品的安全性是必要的，并因此具有此目的的生产方法包括各种方法。在这些方法中，应当考虑的是，基于与洗涤剂相关的有机溶剂作用的化学失活处理法，其已被证明对于具有脂被膜的病毒有巨大效果，虽然它们对于无脂被膜的病毒无效。其它物理处理法如热处理法不管脂被膜存在与否都有效，但其效果取决于处理的程度，而这又由被处理失活的蛋白质的抗性控制。其它有助于减少病毒载量的技术包括沉淀分离或层析分离。 
已被证明无论是否存在脂被膜都非常有效地消除病毒的一种方法是通过具有能够阻止病毒微粒的孔径的过滤器进行过滤(纳米过滤)。这种方法也显示有效除去其它感染性微粒如朊病毒。尽管如此，这种方法的有效性受到所用孔径的控制，其实质上受到要过滤的蛋白质大小的控制。 
存在不同孔径的纳米过滤器，通常在15和75纳米(nm)之间，并且一 般而言，孔径越小，阻止致病原越有效，孔径在35nm以下并优选在15和20nm之间的纳米过滤器是阻止大小在18和23nm之间的最小病毒例如红病毒属B19或甲肝病毒(大约24nm)的纳米过滤器。由于它们的特性，这些纳米过滤器将仅仅是物理上适用于更小尺寸的蛋白质，所述蛋白质因此能够被过滤而具有可接受的进行工业生产的回收率(通常，纳米过滤后的回收率应为60％或更大)。 
由于其分子结构，VWF或FVIII/VWF复合物基本上不表现出能够通过35nm以下的过滤器过滤，特别是较高分子量的VWF多聚体形式。迄今，通过35nm以下纳米过滤器纳米过滤包括较高分子量的多聚体形式在内的VWF或FVIII/VWF复合物是不可能的。 
从上面提到的世界血友病联盟(WHF)的凝血因子浓缩剂的登记看，一种纳米过滤的FVIII浓缩物(这种情况使用20nm)是日本红十字协会的Cross Eight M，其也被描述在出版物：K.Furuya等人，Vox Sanguinis(2006)91，119-125中。尽管事实是在该出版物中叙述道，通过20nm过滤FVIII浓缩物的VWF含量得以实现以及其多聚体结构没有改变，但从WHF登记可见，该浓缩物具有非功能性VWF。再看Furuya出版物，可见，VWF含量为痕量水平[第123页：......VWF含量类似于通常发现的(FVIII:C的VWF/U的0,007-0,015U)......]，而血浆中的比例是1活性单位VWF对每活性单位FVIII(比例1:1)。另一方面，这种残留VWF的多聚体结构的表征(第123页图4)显示不大于10个的多聚体带(band)，而已知具有高分子量多聚体的保存完好的多聚体结构必须含有不小于11个带(Metzner等，Haemophilia(1998)4；27页，第2段)。Furuya在其出版物中告诉我们的是使用单克隆抗体、通过亲和层析纯化的FVIII浓缩物具有痕量的VWF含量，只有较低分子量的多聚体得以保存，以及该VWF组分没有受到20nm下纳米过滤的不利影响。显然，该浓缩物(Cross Eight M)不适合治疗VWD，并且没有受益于正常人血浆中发现的VWF以比例(1:1)的存在。 
在上述世界血友病联盟凝血因子浓缩物的记录中提及的其它纳米过滤的FVIII浓缩物是LFB’s FACTANE。根据该记录，该浓缩物在15nm进行纳米过滤并含有VWF。该产品对应于根据专利WO2005040214获得的 产品，该专利描述了通过孔径在13和25nm之间的筛纳米过滤的FVIII组合物，其中病毒阻止的效率与小于15％的高分子量VWF含量(多于10个的多聚体)有关，这再次证实在Furuya出版物中观察到的情况，当存在低浓度的FVIII时也就是说，VWF/FVIII比例远离1(在Furuya的情况为0.015，在专利WO 2005040214 Factane的情况为0.15)，通过20nm可以纳米过滤更低分子量的VWF多聚体。反言之，更大分子量的多聚体被纳米过滤器留住。此外，在该专利中，为了回收与VWF结合的FVIII——其也被留住，通过加入浓度大于0.20M的CaCl2——0.20M为FVIII/VWF复合物解离的最低浓度，引起FVIII/VWF复合物被迫解离。尽管如此，所有实施例都利用了至少0.35M的CaCl2浓度，以确保FVIII/VWF复合物解离，并由此回收FVIII。在该专利中定义的组合物仅仅为了治疗FVIII缺乏而不是VWD的目的。同样，该产品不适合于治疗VWD，如“法国卫生产品安全局(French Agency for the Safety of Health Products)”批准的产品中所证明的[http://afssaps-prd.afssaps.fr/php/ecodex/frames.php？specid＝66716833&typedoc＝R&ref＝R0093176.htm]，4.1节，Therapeutic Indications，其中清楚地说明该产品不含足量的用于治疗VWD的VWF。除此，在关于该产品的出版物中[VoxSanguinis(2007)92，327-337]，作者说明该产品(Factane)并不用于治疗VWD(第335页)。 
总之，K.Furuya等人[Vox Sanguinis(2006)91，119-125]和专利WO2005040214以及出版物Vox Sanguinis(2007)92，327-337所述过程的目的是获得VWF低的FVIII浓缩物(<15％或VWF/FVIII比<0.15:1)——适于治疗血友病A，但没有富VWF的浓缩物提供给血友病治疗的优势，并且其绝不适合于治疗VWD。 
已被述及的是(Siedlecki等，Blood，vol 88，n 8，1996：2939-2950)，VWF在流动状态下改变了其三维结构，导致高剪切力(高剪切应力)，这使得血小板粘附机制在体内发生。这种结构变化的结果是分子从球形结构变为更线形的形式。在这方面，K.Furuya等在其出版物(Vox Sanguinis(2006)91，119-125)中已经表明，其FVIII浓缩物通过20nm过滤必须在高压(0.8巴)下进行，以得到可接受的FVIII收率，他们认为这可能是由于在较低压力 下流动效应不足以使存在的VWF改变其结构从而使得过滤困难这一事实。在所定的条件(0.8巴)下，他们也得到存在的低分子量VWF多聚体的良好收率，记住纳米过滤之前的起始值非常低。 
所引用的文件没有公开通过小于35nm例如通过20nm的纳米过滤可能应用到具有功能性含量高分子量多聚体的VWF或VWF/FVIII复合物(比例≥0.4)，这使得它可用于治疗VWD，或者在用于治疗血友病A时保持富VWF的浓缩物的所述优点。此外，WO2005040214清楚地向本领域技术人员表明，该孔径阻止高分子量VWF通过。 
VWF作为治疗性产品的纳米过滤目前被限制在通过35nm进行纳米过滤的技术状态被专利EP1632501证明。该专利公开一种获得具有低FVIII含量的VWF浓缩物(FVIII:C/VWF:RCo比小于0.06)的方法，其包括通过35nm孔径的过滤器进行纳米过滤除去病毒的阶段，如在其说明书第23段和第37段实施例1所表明的。从该专利可知，VWF尺寸的分子的纳米过滤对于孔径小于35nm的纳米过滤器是不可行的。 
可见，目前，不存在通过20nm进行纳米过滤的用于治疗遗传性假血友病的治疗性浓缩物。除此，目前的技术状态表明，通过20nm对含有高分子量多聚体的VWF进行这种纳米过滤是不可能的，如果VWF的高分子量多聚体存在而且VWF和FVIII之间的比例大于0.15，这如同FVIII/VWF分子复合物的情况。 
制备通过20nm纳米过滤的FVIII/VWF浓缩物——其具有更类似于人血浆中通常遇到的两种组分FVIII和VWF大分子复合物之间的比例(1单位VWF对每1单位FVIII)，仍具有天然FVIII/VWF复合物的所有优点且适合于治疗VWD和血友病A，仍是未解决的问题。 
从人血浆获得VWF或FVIII/VWF复合物的方法通常开始于冷沉淀分馏和通过选择性沉淀或近来通过色谱技术纯化，实质上利用离子交换和/或亲和性。 
目前基于免疫亲和层析(使用单克隆抗体)的纯化FVIII的方法为FVIII提供非常高的比活性，但缺少功能性VWF[K.Furuya等，Vox Sanguinis(2006)91，119-125]。
可见，这些获得VWF或FVIII/VWF复合物的方法包括一个或多个病毒失活或去除的特定阶段。 
在本发明中，VWF活性基于VWF作为抗生素瑞托菌素的辅因子(VWF:RCo)在其诱导血小板聚结的能力中的作用(Pharmacopoiea Europea07/2006:20721)。该活性以国际单位表示(IU VWF:RCo)，其浓度以IU/毫升(IU VWF:RCo/ml)表示。 
FVIII的活性与FVIII的凝固活性(FVIII:C)相关，其基于在FIXa、钙离子和磷脂存在下FVIII作为活化FX的辅因子的作用(PharmacopoeiaEuropea 07/2006:20704)。这用于生色底物量化，并以国际单位表示(IUFVIII)，其浓度以IU FVIII/毫升(IU FVIII/ml)表示。 
发明内容
本发明描述冯维勒布兰德氏因子的治疗性浓缩物或因子VIII/冯维勒布兰德氏因子的复合物，其已通过孔径小于等于35nm的筛纳米过滤，其中所得的产品具有大约或等于0.4的VWF:RCo/FVIII:C比以及保持的VWF的多聚体结构，其包括高分子量多聚体(多于11个带)，并用于制备治疗遗传性假血友病和血友病A的药物化合物，以及描述了获得它的方法。 
附图说明
图1显示有和没有纳米过滤阶段的不同批次最终产品中VWF的多聚体结构。A，C，E，G，I：非纳米过滤产品；B，D，F，H，J：纳米过滤产品。 
具体实施方式
基于所进行的对纳米过滤VWF或FVIII/VWF复合物的研究——其中VWF具有包含高分子量多聚体的保持的多聚体结构，令人惊奇地，本发明人显示，在含有VWF或FVIII/VWF复合物和钙离子的溶液的情况下，通过标称孔径小于35nm、优选20nm的纳米过滤器在最大压力小于0.5巴、优选在0.2和0.4巴之间时进行过滤是可能的。 
将要纳米过滤的溶液具有0.6吸光单位(AU280)的最大浓度，等于不大 于12 IU VWF:RCo/ml。溶液的蛋白质组合物除了其自身的VWF和FVIII组分外也可包括其它蛋白质，例如血纤蛋白原或纤连蛋白，VWF的比活性(IU VWF:RCo/mg蛋白质)大于或等于1，通常为10或更大。在纳米过滤FVIII/VWF复合物的情况下，FVIII的比活性(IU FVIII/mg蛋白质)也大于或等于1，通常为10或更大。 
将要纳米过滤的溶液可以含有0.05和0.20M之间的钙(氯化物)和至少一种碱性氨基酸作为蛋白质稳定剂，优选20和30mM之间的组氨酸。将要过滤的溶液的pH必须大于5.5，以防止变性。 
加载比率——表达为将要过滤的蛋白质的生物活性，可以达到50IUVWF:RCo/cm2过滤表面积，相当于0.5mg VWF/cm2。 
在规定的条件下，每m2过滤表面积过滤高达120升的溶液是可能的，获得大于70％的FVIII活性的回收和大于60％的VWF活性的回收，具有保持的VWF多聚体结构(多于11个多聚体)，并且VWF:RCo/FVIII比为所用原料的至少80％。 
待过滤的溶液的特征是，其VWF:RCo/FVIII活性比大于或等于0.4通常在1和3之间，并因此同样适合于不含FVIII的VWF溶液和FVIII/VWF复合物溶液，前提是作为较大体积多聚体分子的VWF是限制该方法的因素。 
在指定的条件下，标准的过滤流量是最大值30升/小时/m2，通常在10和20升/小时/m2之间，过滤时间为12小时或更短。这使得工业应用成为可能，并且明显的是通过改变纳米过滤表面积，这些参数可以被改变或优化，由于其高成本，这是限制该方法的因素。 
在优选的实施方式中，在通过小于35nm的孔径进行纳米过滤之前，使用孔径在35和100nm之间的纳米过滤器进行预过滤。预过滤器和纳米过滤器(<35nm)之间的比为1:2至1:4。 
通过20nm进行双纳米过滤(20nm+20nm)也是可能的，这增加了纳米过滤产品安全性提高的益处。 
通过本发明，纳米过滤的VWF或FVIII/VWF复合物被获得，使得制备这样的高纯药物成为可能：其适合用于治疗VWD和血友病A，具有的 VWF活性大于100 IU VWF:RCo/ml，并且VWF与FVIII活性之间的比为0.4或更大，以及其中VWF的多聚体结构包括高分子量多聚体(多于11个带)。 
实施例 
在商业可得的纳米过滤器中，来自日本Asahi Kasei Corporation的 纳米过滤器被用于提供本发明的实施例，其由再生纤维素制造，在Planova 35N的情况其孔径大约35±2nm，在Planova 20N的情况其孔径是19±1nm。这种过滤器允许死端模式和切向模式(tangential mode)过滤。在下面的实施例中，使用Planova以死端模式进行纳米过滤，但是出于本发明的目的，使用本领域技术人员熟知的其它商标的纳米过滤器和组合物，使用切向模式也是合适的。为确保本发明涉及的纳米过滤器完好，组装、操作和测试方法在制造商的说明书中有详细说明。 
实施例1：原料的获得 
来源于人血浆、纳米过滤前的FVIII/VWF复合物溶液可以例如通过用聚乙二醇沉淀并随后用亲和层析法纯化，从溶解的冷沉淀获得，如专利EP0411810所示。该纳米过滤溶液然后可以被纯化，以获得高纯产品，例如通过用甘氨酸沉淀如专利EP 0639203所示。可选地，FVIII或VWF或两者可以通过使用重组DNA技术在转基因细胞或动物中生物合成而得到[Wood W.I.等，Nature(1984)312：330-337]；[Toole，JJ.等，Nature(1984)312：342-347]。 
实施例2：纳米过滤FVIII/VWF复合物 
通过0.12m2的Planova 35N过滤器和0.3m2的Planova 20N过滤器，使用14.7升的部分纯化FVIII/VWF复合物溶液，在存在25mM组氨酸和0.14M钙、pH为6.77以及温度为20±5℃下进行序列过滤，该溶液比活性为10.4 IU FVIII/AU280nm以及VWF:RCo浓度为5.69IU/ml，相当于0.235AU280nm。过滤以大约14L/h/m2的恒定流速进行，在过滤全部溶液过程中， 保持Planova 20N中的压差在0.20和0.30巴之间，在3.3小时的时间内完成。每面积单位和时间单位的产率是3.6 IU FVIII/cm2/小时，8.2 IU VWFRCo/cm2/小时(VWF:RCo/FVIII:C比＝2.3)和9.8 IU VWF:Ag/cm2/小时。活性回收率为94％FVIII和95％ VWF RCo。 
实施例3：通过Planova 20N纳米过滤的FVIII/VWF复合物的表征 
7个不同批次的原料如实施例2所述方式被加工。比活性接近或大于10 IU FVIII/AU280nm并且蛋白浓度为0.3±0.2 AU280nm的FVIII/VWF复合物在存在25mM组氨酸和0.14M钙、pH为6.8±0.2以及温度为20±5℃下被用作原料。通过0.1μm进行澄清，然后通过Planova 35N和Planova 20N进行系列纳米过滤。过滤保持在10和20升/h/m2之间的恒定流速。Planova20N过滤器中的操作压力在所有情况下、在整个过滤过程中保持在0.2和0.4巴之间。 
得到的结果(表1)显示，在所述条件下通过20nm孔径纳米过滤FVIII/VWF复合物对获得的纳米过滤物的活性和纯度(比活性)根本没有影响。 
在纳米过滤前后材料中获得的VWF:RCo/FVIII与VWF:RCo/VWF:Ag比的比较分析(表1)使得能够确定：在所述条件下，通过20nm孔径的筛过滤FVIII/VWF浓缩物中存在的VWF而不影响作为瑞托菌素辅因子的VWF的功能是可能的。 
表1
Figure G2008101840044D00101
数值对应于7批次的平均±SD
实施例4：通过凝胶电泳获得的VWF的多聚体结构，确立了多聚体结构的保持，该多聚体结构包括具有多于11个的带的更大分子量的多聚体。 
图1显示，在原始照片中在泳道中可以数出至少16个对应于纳米过滤材料的带。A，C，E，G，I：非纳米过滤产品；B，D，F，H，J：纳米过滤产品。 
实施例5：压差对纳米过滤FVIII/VWF复合物的影响 
FVIII比活性大约10 IU/AU280nm而且浓度在0.1-0.3 AU280nm范围的FVIII/VWF的部分纯化溶液在实施例2和3所述条件下通过Planova 35N过滤。纳米过滤被设置为高压(0.8巴)和低压(0.3巴)，得到表2所示的结果。 
表2
Figure G2008101840044D00111
(1)由于纳米过滤器的堵塞和阻塞，过程中断，没有获得数据 
同样，通过Planova 35N预过滤的FVIII/VWF复合物的这种溶液在实施例2所述的条件下通过Planova 20N过滤。纳米过滤被设置为高压(0.8巴)和低压(0.3巴)，得到以下结果：
表3
Figure G2008101840044D00121
(1)由于纳米过滤器的堵塞和阻塞，过程中断，没有获得数据 
在高压下通过Planova 35N过滤时，流量存在急剧下降，观察到一小时纳米过滤后只有初始流量的10.6％和14.6％，在一种情况下，3小时时只有初始流量的7.9％。在压差0.3巴通过Planova 35N过滤时，流量甚至在3小时纳米过滤后仍保持在88.6％。 
在通过Planova 20N过滤，用通过Planova 35N预过滤的FVIII/VWF复合物溶液作为原料并且压差为0.8巴，在一小时纳米过滤后得到40％的流量比率，由于过滤器堵塞，过滤在3小时前停止。以0.3巴压差，通过Planova 20N过滤时，甚至在3小时纳米过滤后，流量仍保持在75.7％。 
从上述实施例明显可见，过滤过程中对于35nm或以下孔径保持低压条件避免了流量突降的产生。因此，在这些压力条件下，由于FVIII/VWF溶液中存在的高分子量分子如大小达20000000 Da的VWF多聚体形式的沉积，没有观察到过滤器膜部分孔的阻塞。 
实施例6：所使用的材料浓度对FVIII/VWF复合物纳米过滤的影响 
使用部分纯化的FVIII/VWF复合物的不同溶液，该FVIII/VWF复合物具有大约10IU FVIII/AU280nm的比FVIII活性、相对于FVIII活性的大约2的VWF活性(VWF:RCo:FVIII)并且包括范围0.1-0.65 AU280nm的浓度，在压差为大约0.5巴下，使用与实施例1和2所述相同的过程和产品组成条件(除了浓度)，通过Planova 20N进行过滤。
所得结果示于表4： 
表4
Figure G2008101840044D00131
(1)n.d：未测量(由于纳米过滤器先前的堵塞和阻塞) 
(2)基于6小时期间过滤的蛋白质的量计算出的值，在所用情况使用比活性10 IU FVIII/AU280nm，VWF:RCo/FVIII比为2，以及在每一情况观察到的蛋白质回收率。 
纳米过滤过程中观察到的流量减小与加载的材料浓度成正比。因此，对于浓度0.106AU、0.17AU、0.314AU、0.343AU和0.648AU的初始流量，一小时纳米过滤后观察到的流量分别是80.7％、63.6％、60.7％、52.9％和16.2％。至于3小时纳米过滤后观察到的流量，降到初始流量的大约30.5％值以下可以归因于这样的事实：纳米过滤是在代表该过程上限的压力条件下进行的。 
对于接近0.3AU的加载浓度，得到最佳产率值(7.8IUVWF:RCo/cm2/h，相对于46.8 IU VWF:RCo/cm2)和蛋白质回收率(见表)。当加载材料浓度为最大值(0.648 AU)时，从过滤开始就观察到过滤器堵塞，产率和回收率值急剧下降到2 IU VWF:RCo/cm2/h以下和46.8％总蛋白回收率的值，使得在该浓度下停止纳米过滤。 
从这些结果可以确定，对于纳米过滤比活性大约10 IU FVIII/AU280nm 的FVIII/VWF溶液，可行的浓度范围是≤0.6AU，大约相当于≤6 IU/mlFVIII和≤12 IU/ml VWF:RCo。 
实施例7：钙浓度对FVIII/VWF复合物纳米过滤的影响 
使用以白蛋白配制的FVIII/VWF复合物的不同溶液，其比活性大于10 IU FVIII/AU280和FVIII活性大约3IU/ml、大约相当于4IU/ml的VWF:RCo，通过孔径20nm的过滤器，在0.1M精氨酸、25mM组氨酸和0.05mM钙存在下，pH为7.3±0.1时，进行过滤。保持跨Planova 20N的压差大约0.5巴，进行过滤。表5显示在使用两批独立的产品进行的试验中获得的最相关的参数。 
表5
Figure G2008101840044D00141
(1)考虑(VWF:RCo/FVIII)比为1.24，基于每时间单位和表面单位过滤的FVIII的IU计算的值。 
这些结果表明，钙的实质缺乏(0.05mM)以及用精氨酸(0.1M)代替产生产率的显著下降，在两种情况下下降到1.6 IU FVIII/cm2/小时和2.0 IUVWF:RCo/cm2/小时的值，这明显小于实施例2中观察到的值(3.6IUFVIII/cm2/小时和8.2 IU VWF:RCo/cm2/小时)，FVIII活性与原料中的相似。 
同样，在两个试验中观察到的FVIII活性的回收率分别降到43.3％和46.6％的值。尽管如此，即使在这些条件下，纳米过滤FVIII和VWF的大分子复合物——其VWF和FVIII活性之间的比例类似于其天然的比例(1:1)——是可行的。
实施例8：工业规模上纳米过滤的大量FVIII/VWF的生产 
从部分纯化的FVIII/VWF复合物溶液开始——其来源于多于3000升的血浆并具有15.6 IU FVIII/AU280的比活性，通过4m2标称孔径35nm(Planova 35N)的过滤器和4m2标称孔径20nm(Planova 20N)的两个过滤器，在25mM组氨酸和0.14M钙存在下，pH6.80时，进行系列过滤。以大约107L/h的恒定流量，保持跨Planova 20N的压差在0.20和0.35巴之间，Planova 20N的施加载量(产品溶液+后洗涤)为120.2kg/m2，进行过滤。每单位面积应用的总活性为8.9 IU FVIII/cm2和19.1 IUVWF:RCo/cm2。纳米过滤的活性回收率是70.4％的FVIII和77.3％的VWF:RCo。包括洗涤后并且在浓缩后获得的纳米过滤产物，观察到的活性回收率是97.5％的FVIII和86.8％的VWF:RCo。 
氯化钠和甘氨酸的后续沉淀(按EP 0639203)产生高纯度的纳米过滤的FVIII/VWF浓缩物。 
得到的高纯度纳米过滤FVIII/VWF浓缩物是稳定的，并且其浓度在产品计量入瓶中之前被调节。 
经过纯化过程，相对于FVIII含量的相对VWF含量，表示为VWF:RCo/FVIII比，示于下面的表6： 
表6
纯化中活性(IU VWF:RCo/IU FVIII)的变化 
  
  纳米过滤产品(n＝1) 非纳米过滤产品(n＝6)
原料 1.7 1.57±0.19
中间体浓缩物 1.9 1.71±0.11
高纯度产品 1.5 1.14±0.25
配制的高纯度产品 1.5 1.24±0.19
这些结果表明，在纯化FVIII/VWF复合物的过程中使用纳米过滤基本 没有影响导致高纯产品的后续纯化阶段。因此表明，为通过20nm孔径的筛纳米过滤FVIII/VWF浓缩物所确定的条件没有不利地影响VWF的更大分子量多聚体形式的比例，虽然已知这样的变化被预料对后续的沉淀法纯化具有不利影响。 
纳米过滤的FVIII/VWF浓缩物具有足以用作VWD治疗性产品的相对VWF浓度和也使其能够用于治疗血友病A的FVIII含量，并具有存在与自然界发现的相类似的VWF量(FVIII的天然稳定剂)的附加益处，其治疗血友病A的有益性质前已述及。 
虽然对本发明基于其优选实施方式和阐明性实施例进行了描述，但将会理解，基于所公开的内容，本领域技术人员可以将多个变体引入本发明的实施方式，考虑到下面权利要求的内容和其等同物，这些将大部分被包括在其中。

Claims (9)

1.获得人或重组源的冯维勒布兰德氏因子的浓缩物或因子VIII/冯维勒布兰德氏因子复合物的方法，特征在于：
a)制备冯维勒布兰德氏因子或因子VIII/冯维勒布兰德氏复合物的溶液，其含有浓度达12IU VWF:RCo/ml的VWF并且冯维勒布兰德氏因子/因子VIII之间的比例为0.4或更大，
b)通过孔径为20纳米的过滤器，在小于或等于0.5巴的最大压力下，在浓度为0.05-0.2M的钙离子存在下，纳米过滤a)中制备的所述溶液。
2.根据权利要求1的纳米过滤方法，特征在于纳米过滤后回收的所述冯维勒布兰德氏因子保持多聚体结构，其包括11或更大级的多聚体。
3.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于纳米过滤后冯维勒布兰德氏因子的回收率为60％或更大。
4.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于纳米过滤后因子VIII的回收率为70％或更大。
5.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于使用每cm2过滤表面积达50IU冯维勒布兰德氏因子的加载比率。
6.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于过滤的所述溶液的最大浓度是0.6AU280。
7.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于所述纳米过滤在压力为0.2和0.4巴之间进行。
8.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于标准纳米过滤流量在10和20升/小时/m2之间。
9.根据权利要求1或2的纳米过滤方法，特征在于所述纳米过滤使用孔径为19±1纳米的过滤器进行。
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