ES2298096A1 - Procedimiento para la obtencion de un concetrado de factor von willebrand o del complejo de factor viii/factor von willebrand y utilizacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la obtención de un concentrado de Factor von Willebrand o del complejo de Factor VIII/Factor von Willebrand y utilización de los mismos. El procedimiento se caracteriza por la preparación de una solución de Factor von Willebrand o de complejo de Factor VIII/Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4; y proceder a continuación a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de tamaño de poro menor de 35 nanómetros.
Description
Procedimiento para la obtención de un
concentrado de Factor von Willebrand o del complejo de Factor
VIII/Factor von Willebrand y utilización de los mismos.
La presente invención se refiere a un
concentrado terapéutico del Factor von Willebrand o del complejo
Factor VIII/Factor von Willebrand y al proceso para la preparación
de un medicamento indicado para el tratamiento de la enfermedad de
von Willebrand (EVW) y la Hemofilia A que se ha nanofiltrado por un
tamaño de poro inferior a 35 nm, lo cual permite la eliminación
eficaz tanto de virus con envoltura como sin envoltura, como, por
ejemplo, la hepatitis A o el eritrovirus B19.
El Factor von Willebrand (FVW) es una proteína
plasmática de estructura multimérica en la que el peso molecular de
las diferentes formas varía entre aproximadamente los 230000 Daltons
(Da) de cada subunidad monomérica hasta más de 20 millones de Da de
las formas multiméricas de mayor peso molecular, constituyendo así
la mayor proteína soluble conocida. Su concentración en plasma se
sitúa aproximadamente en torno a 5-10 \mug/ml
[Siedlecki y otros, Blood, vol 88, n 8, 1996:
2939-2950] y la forma plasmática de menor tamaño es
la correspondiente al dímero, con un tamaño aproximado de 500000
Da.
El FVW desarrolla un papel primordial en la
hemostasia primaria, siendo responsable de la adhesión plaquetar
sobre las superficies vasculares dañadas y por tanto de la
formación del tapón plaquetar, sobre el que se desarrollarán los
mecanismos de formación del coágulo de fibrina. Se sugiere que los
multímeros de mayor peso molecular soportan con mayor eficacia los
mecanismos de adhesión plaquetar al subendotelio y se ha
relacionado la eficacia clínica de los concentrados de FVW con el
contenido de estos multímeros de mayor peso molecular [Metzner y
otros, Haemophilia (1998) 4, 25-32].
Además, en el plasma, el FVW ejerce el papel de
transportador y estabilizador del Factor VIII (FVIII),
encontrándose en estado nativo la molécula de FVIII unida a las
formas multiméricas del FVW. El complejo Factor VIII/Factor von
Willebrand (FVIII/FVW) alcanza una longitud que puede llegar a los
1150 nm [Furuya K y otros, Vox Sanguinis (2006) 91,
119-125]. Por otra parte, el FVW en su forma
globular más pequeña tendría un tamaño de aproximadamente 149 x 77
x 3,8 nm pudiendo variar su estructura, dependiendo de la fuerza
de cizalla, a una forma extendida o lineal [Siedlecki y otros,
Blood (1996) 88, 2939-2950]. La concentración
plasmática del FVIII se sitúa aproximadamente en torno a
0,05-0,1 \mug/ml (por lo que es unas 50 a 100
veces inferior a la del FVW).
Defectos cuantitativos o cualitativos del FVW
producen alteraciones en la hemostasia primaria, conocidas como
enfermedad de von Willebrand, que se manifiesta en problemas
hemorrágicos.
Los concentrados purificados de FVW y los
concentrados de FVIII con elevado contenido en FVW funcional,
presentan utilidad terapéutica en el tratamiento de la enfermedad
de von Willebrand.
Otro aspecto a considerar es que al ser el FVW
el estabilizante natural del FVIII, los concentrados de FVIII con
alto contenido en FVW, cuando se emplean para el tratamiento de la
Hemofilia A, pueden presentar numerosas ventajas, como han apuntado
algunos autores, por ejemplo: una mayor vida media "in
vivo" del FVIII infundido, un efecto protector frente a los
anticuerpos inhibidores del FVIII [Gensana M. y otros, Haemophilia,
(2001) v.7, 369-374] [Bjorkman S. y otros, Clin
Pharmacokinet, (2001) v.40, 815-832] [Behrmann K. y
otros, Thromb Haemost, (2002) v.88, 221-229] y una
posible menor frecuencia de desarrollo de anticuerpos inhibidores
de la actividad del FVIII [Goudemand J. y otros, Blood (2006) 107:
46-51].
Se han establecido técnicas analíticas para
caracterizar tanto el contenido como la actividad del FVW en estos
concentrados. La determinación de la actividad del FVW como
cofactor de Ristocetina (FVW:RCo) es uno de los métodos ampliamente
usados para la determinación de la actividad del FVW [Heath y
otros, Thromb Haemost 1992; 68:155-159]. La medida
del antígeno de FVW (FVW:Ag) [Cejka J. Clin Chem. 1982;
28:1356-1358] nos muestra la cantidad de FVW, tanto
activo como inactivo, en una muestra.
Uno de los parámetros relevantes para la
estimación de la calidad funcional de los concentrados de FVW es la
relación entre actividad FVW:RCo y antígeno FVW:Ag.
Dada la posible importancia de la estructura
multimérica del FVW y de los multímeros de alto peso molecular en
relación a su actividad y eficacia clínica, la caracterización de
esta estructura multimérica es fundamental para determinar la
utilidad de los concentrados de FVW y de los concentrados de FVIII
con elevado contenido en FVW. Esta estructura multimérica se
determina por electroforesis en gel [Ruggeri y otros, Blood 1981;
57:1140-
1143].
1143].
\newpage
Se han descrito diversos métodos de
purificación del FVW o del complejo FVIII/FVW en el que el FVW es
funcional y a una concentración suficiente para su uso como
producto terapéutico en la EVW, como muestran las patentes EP
0411810 y EP 0639203 o la publicación de Ristol P. y otros, Sangre
(1996) 41:125-130.
Otros procesos de purificación de FVIII
consiguen un producto final sin FVW o con un contenido de éste a
nivel de trazas. Estos concentrados no son aptos para el
tratamiento de la EVW. Además, en algunos casos el FVW residual
contenido en estos concentrados de FVIII no es funcional, habiendo
perdido parte de los multímeros que lo forman, especialmente los de
mayor peso molecular. Por tanto, estos concentrados no poseerían
las ventajas que tienen los concentrados de FVIII ricos en FVW
cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia A.
En el registro de concentrados de factores de
coagulación, creado en 1997 y actualizado por la Federación Mundial
de Hemofilia (FMH) en 2006 (Kasper,C.K.; Brooker,M. Registry of
clotting factor concentrates, January 2006), se relacionan (tablas
2 y 3) los concentrados de FVIII existentes, especificando, entre
otros, el método de fraccionamiento, la inactivación viral, su
contenido en FVW y la funcionalidad del mismo.
De entre los concentrados de FVIII nanofiltrados
debemos diferenciar los que son nanofiltrados por 35 nm (o tamaño
de poro superior), en los que esta nanofiltración no presenta
eficacia frente a virus no envueltos, como por ejemplo el virus de
la hepatitis A (de aproximadamente 24 nm) o el virus B19 (de entre
18 y 24 nm). Por otra parte los concentrados de FVIII nanofiltrados
por tamaños de poro inferior a 35 nm no presentan contenido en FVW,
o si lo presentan, éste carece de los multímeros de alto peso
molecular, con lo cual no son eficaces para el tratamiento de la
EVW y no poseen las ventajas que tienen los concentrados de FVIII
ricos en FVW cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia
A.
Una gran capacidad de eliminación de agentes
patógenos es imprescindible para asegurar la seguridad de los
productos biológicos, por ello en los procesos de producción se
incorporan diversos métodos con esta finalidad. Entre ellos cabe
citar los tratamientos químicos de inactivación, basados en la
acción de solventes orgánicos asociados a un detergente, que han
demostrado gran eficacia frente a virus con envoltura lipídica pero
que no presentan eficacia contra virus sin envoltura lipídica.
Otros tratamientos físicos, como los tratamientos térmicos, son
efectivos independientemente de la presencia o no de envuelta
lipídica pero su eficacia depende de la severidad del tratamiento,
la cual está condicionada a su vez por la resistencia a la
inactivación de la proteína a tratar. Otras técnicas que
contribuyen a la reducción de la carga viral consisten en
separaciones por precipitación o cromatografía.
Un método que se ha mostrado muy efectivo en la
eliminación de virus, independientemente de la presencia o no de
envuelta lipídica, es la filtración por filtros de un tamaño de
poro capaz de retener partículas víricas (nanofiltración). Este
método se ha mostrado también eficaz en la eliminación de otras
partículas infecciosas como los priones. A pesar de ello, la
eficacia de este método está condicionada por el tamaño de poro
aplicado, que se define, esencialmente, en función del tamaño de la
proteína a filtrar.
Existen nanofiltros de diferentes tamaños de
poro, normalmente entre 15 y 75 nanómetros (nm) y en general, a
menor tamaño de poro mayor eficacia en la retención de patógenos,
siendo los nanofiltros de poro inferior a 35 nm y preferentemente
entre 15 y 20 nm los que consiguen retener los virus más pequeños,
cuyo tamaño se sitúa entre los 18 y 23 nm, como el eritrovirus B19
o el virus de la hepatitis A (de aproximadamente 24 nm). Por sus
características, la aplicación de estos nanofiltros sólo debería
ser físicamente aplicable a aquellas proteínas de menor tamaño y
que por tanto pueden ser filtradas con una recuperación aceptable
para su producción industrial (normalmente la recuperación
postnanofiltración debería ser mayor o igual al 60%).
Por su estructura molecular el FVW o el
complejo FVIII/FVW no parece, a priori, filtrable por
nanofiltros menores a 35 nm, especialmente las formas multiméricas
de mayor peso molecular del FVW. Hasta la fecha, no se ha
conseguido la nanofiltración del FVW o del complejo FVIII/FVW que
incluya las formas multiméricas de mayor peso molecular, por
nanofiltros de menos de 35 nm.
Del registro de concentrados de factores de
coagulación de la Federación Mundial de Hemofilia (FMH) antes
citado, un concentrado de FVIII nanofiltrado (por 20 nm en este
caso) es el Cross Eight M de la Japanese Red Cross, también
descrito en la publicación de K. Furuya y otros, Vox Sanguinis
(2006) 91, 119-125. A pesar de que en la
publicación se afirma que se consigue filtrar el FVW contenido en el
concentrado de FVIII por 20 nm y que no se altera la estructura
multimérica del mismo, vemos que según el registro de la FMH, este
concentrado presenta un FVW no funcional. Volviendo a la
publicación de Furuya observamos que el contenido en FVW es a nivel
de trazas [pág. 123: ... the contents of vWF were similar to those
usually found (0,007-0,015 U of vWF/U of FVIII:C)
...], cuando el cociente en plasma es de 1 unidad de actividad de
FVW por cada unidad de actividad de FVIII (proporción 1:1). Por
otra parte, de la caracterización realizada de la estructura
multimérica de este FVW residual (Fig. 4, pág. 123) no se observan
más de 10 bandas de multímeros, siendo conocido que una estructura
multimérica bien conservada que presente los multímeros de alto
peso molecular debe contener no menos de 11 bandas (Metzner y
otros, Haemophilia (1998) 4; página 27, 2º párrafo). Por ello, lo
que nos indica Furuya en su publicación es que el concentrado de
FVIII purificado por cromatografía de afinidad con anticuerpos
monoclonales presenta un contenido de FVW a nivel de trazas, del
que solo se conservan los multímeros de menor peso molecular, y que
esta composición de FVW no se ve alterada por la nanofiltración
por 20 nm. Evidentemente este concentrado (Cross Eight M) no es
adecuado para el tratamiento de la EVW ni se beneficia de la
presencia de FVW en las proporciones (1:1) encontradas en el plasma
humano normal.
El otro concentrado de FVIII nanofiltrado,
mencionado en el registro de concentrados de factores de
coagulación de la Federación Mundial de Hemofilia antes citado, es
el FACTANE de LFB. Según el registro este concentrado es
nanofiltrado por 15 nm y contiene FVW. Este producto corresponde al
obtenido según la patente WO2005040214, que nos describe una
composición de FVIII nanofiltrado por un tamaño de poro entre 13 y
25 nm en la que se correlaciona la eficacia en la retención de
virus con un contenido de FVW de alto peso molecular (superior a 10
multímeros) inferior al 15%, reafirmando lo observado en la
publicación de Furuya, en el sentido de que los multímeros de menor
peso molecular del FVW son nanofiltrables por 20 nm cuando se
encuentran a concentraciones bajas con respecto al FVIII, es decir,
con cocientes FVW/FVIII muy alejados de 1 (0,015 en el caso de
Furuya y 0,15 en el caso de Factane, patente WO2005040214). En
cambio los de mayor peso molecular son retenidos por el nanofiltro.
Además, en esta patente, con objeto de recuperar el FVIII que,
asociado al FVW, quedaría igualmente retenido, se procede a la
disociación forzada del complejo FVIII/FVW mediante la adición de
CaCl_{2} a una concentración superior a 0,20 M, que es la
concentración mínima a la que se disocia el complejo FVIII/FVW. A
pesar de ello, todos los ejemplos se realizan a una concentración
de CaCl_{2} de al menos 0,35 M, con objeto de asegurar la
disociación del complejo FVIII/FVW y con ello la recuperación de
FVIII. La composición definida en esta patente está dirigida
exclusivamente al tratamiento del déficit de FVIII y no al de la
EVW. Además, este producto no es apto para el tratamiento de la
EVW, como puede comprobarse en la autorización de producto de la
"Agence frangaise de securité sanitaire des produits de santé"
[http://afssaps-prd.afssaps.fr/php/ecodex/frames.php?specid=
66716833&typedoc=R&ref=R0093176.htm], en el punto 4.1
Indicaciones terapéuticas, donde se especifica claramente que el
producto no contiene FVW en cantidad suficiente para el tratamiento
de la EVW. También, en la publicación sobre el mismo producto [Vox
Sanguinis (2007) 92, 327-337]
los autores confirman que el producto (Factane) no está previsto para el tratamiento de la EVW (pág. 335).
los autores confirman que el producto (Factane) no está previsto para el tratamiento de la EVW (pág. 335).
En resumen, el objetivo de los procedimientos
descritos por K. Furuya y otros, [Vox Sanguinis (2006) 91,
119-125] y por la patente WO2005040214 y publicación
de Vox Sanguinis (2007) 92, 327-337 es obtener un
concentrado de FVIII pobre en FVW (<15% o <0,15:1 de relación
FVW/FVIII) aplicable al tratamiento de la Hemofilia A, pero que no
gozaría de las ventajas que un concentrado rico en FVW aporta al
tratamiento de la Hemofilia y que en ningún caso sería adecuado
para el tratamiento de la EVW.
Se ha descrito (Siedlecki y otros, Blood, vol
88, n 8, 1996: 2939-2950) que el FVW cambia su
estructura tridimensional bajo condiciones de flujo que provocan
altas fuerzas de cizalla (high shear stress), lo cual permite
"in vivo" los mecanismos de adhesión plaquetar. Este
cambio de estructura hace que la molécula pase de ser una
estructura globular a una forma más lineal. En este sentido, K.
Furuya y otros, en su publicación (Vox Sanguinis (2006) 91,
119-125) ya indica que la filtración de su
concentrado de FVIII por 20 nm debe realizarse a alta presión (0,8
bar) para conseguir un rendimiento de FVIII aceptable, lo cual
sugieren que podría ser probablemente debido a que a menor presión
el efecto de flujo no es suficiente para que el FVW presente
cambie su estructura, dificultando con ello la filtración. A las
condiciones definidas (0,8 bar) consiguen además una buena
recuperación de los multímeros de bajo peso molecular del FVW
presente, teniendo en cuenta que los valores de partida, previos a
la nanofiltración, son de por sí muy bajos.
Los documentos citados no revelan la posible
aplicación de la nanofiltración por menos de 35 nm, como por
ejemplo por 20 nm, al FVW o al complejo FVW/FVIII (relación \geq
0,4) con un contenido funcional de multímeros de alto peso
molecular que permitan su uso para el tratamiento de la EVW o
mantengan las ventajas descritas de los concentrados ricos en FVW
cuando se emplean para el tratamiento de la Hemofilia A. Es más,
la WO2005040214 indica claramente al experto que este tamaño de
poro impide el paso del FVW de alto peso molecular.
El estado de la técnica en cuanto a
nanofiltración del FVW como producto terapéutico está limitado en
la actualidad a la nanofiltración por 35 nm, como muestra la
patente EP1632501. Esta patente muestra el procedimiento de
obtención de un concentrado de FVW con un bajo contenido en FVIII
(relación FVIII:C/FVW:RCo inferior a 0,06) que comprende una etapa
de eliminación viral por nanofiltración mediante filtros de 35 nm
de tamaño de poro, como se indica en el párrafo 23 de la
descripción y en el ejemplo 1, párrafo 37. De esta patente podemos
entender que la nanofiltración de una molécula del tamaño FVW no es
factible por nanofiltros de tamaño de poro inferior a 35 nm.
Como hemos visto, no existe en la actualidad
ningún concentrado terapéutico indicado para el tratamiento de la
Enfermedad de von Willebrand nanofiltrado por 20 nm. Además el
estado actual de la técnica indica que esta nanofiltración por 20
nm del FVW conteniendo los multímeros de alto peso molecular no es
posible, al igual que ocurre con el complejo molecular FVIII/FVW, si
los multímeros de alto peso molecular del FVW están presentes y si
la proporción entre FVW y FVIII es superior a 0,15.
Por tanto, sigue siendo un problema sin
resolver la preparación de un concentrado de FVIII/FVW nanofiltrado
por 20 nm con proporciones entre ambos componentes del complejo
macromolecular de FVIII y FVW más similares a las encontradas
normalmente en el plasma humano (1 Unidad de FVW por cada 1 Unidad
de FVIII), que retenga todas las ventajas del complejo FVIII/FVW
nativo y sea apto para el tratamiento de la EVW y de la Hemofilia
A.
Los procesos de obtención del FVW o del
complejo FVIII/FVW a partir del plasma humano parten habitualmente
de la fracción de crioprecipitado y se purifican por
precipitaciones selectivas o más recientemente por técnicas
cromatográficas, esencialmente por intercambio iónico y/o
afinidad.
Los procesos de purificación del FVIII que en
la actualidad se basan en la cromatografía por inmunoafinidad (con
anticuerpos monoclonales) consiguen un FVIII con una muy elevada
actividad específica pero carecen de FVW funcional [K. Furuya y
otros, Vox Sanguinis (2006) 91, 119-125].
Estos procesos de obtención del FVW o del
complejo FVIII/FVW contemplan, como hemos visto, una o varias
etapas específicas de inactivación o eliminación de virus.
En la presente invención, la actividad del FVW
está basada en el papel del FVW como Cofactor del antibiótico
Ristocetina (FVW:RCo) en la capacidad para inducir agregación
plaquetaria (Farmacopea Europea 07/2006:20721). Esta actividad se
expresa en Unidades Internacionales (UI FVW:RCo) y su concentración
en UI/mililitro (UI FVW:
RCo/ml).
RCo/ml).
La actividad de FVIII se refiere a actividad de
FVIII coagulante (FVIII:C), que se basa en el papel del FVIII como
cofactor en la activación del FX en presencia de FIXa, iones calcio
y fosfolipidos (Farmacopea Europea 07/2006:20704). Se cuantifica
por sustrato cromogénico y se expresa en Unidades Internacionales
(UI FVIII) y su concentración en UI FVIII/mililitro (UI
FVIII/ml).
La presente invención describe un concentrado
terapéutico del Factor von Willebrand o del complejo Factor
VIII/Factor von Willebrand que se ha nanofiltrado por un tamaño de
poro inferior al equivalente a 35 nm, en la que el producto
obtenido presenta una relación FVW:RCo/FVIII:C mayor o igual a 0,4
y una estructura multimérica del FVW conservada que incluye los
multímeros de alto peso molecular (más de 11 bandas) y que es útil
para la preparación de un medicamento indicado para el tratamiento
de la Enfermedad de von Willebrand y de la Hemofilia A y al proceso
para su obtención.
A partir de las investigaciones realizadas en
la nanofiltración del FVW o del complejo FVIII/FVW, en la que el
FVW presenta una estructura multimérica conservada, conteniendo los
multímeros de alto peso molecular, sorprendentemente, los
inventores han demostrado que para una solución conteniendo FVW o
el complejo FVIII/FVW e iones calcio, es posible la filtración por
un nanofiltro de tamaño de poro nominal inferior a 35 nm y
preferentemente de 20 nm, a una presión máxima inferior a 0,5 bar y
preferentemente entre 0,2 y 0,4 bar.
La solución a nanofiltrar está a una
concentración máxima de 0,6 Unidades de Absorbancia (UA_{280}),
equivalente, como máximo, a 12 UI FVW:RCo/ml. La composición
proteica de la solución, en adición al propio contenido de FVW y
FVIII, puede estar formada además por otras proteínas, como por
ejemplo el fibrinógeno o la fibronectina, siendo la actividad
específica del FVW (UI FVW:RCo/mg proteína) mayor o igual a 1 y
típicamente mayor o igual a 10. La actividad específica del FVIII
(UI FVIII/mg proteína) en el caso de nanofiltración del complejo
FVIII/FVW es también mayor o igual a 1, y típicamente mayor o igual
a 10.
La solución a nanofiltrar puede contener calcio
(cloruro) entre 0,05 y 0,20 M y al menos un aminoácido básico como
estabilizante de la proteína, preferentemente histidina entre 20 y
30 mM. El pH de la solución a filtrar debe ser superior a 5,5, para
prevenir la desnaturalización.
La relación de carga, expresada en actividad
biológica de la proteína a filtrar puede alcanzar las 50 UI de
FVW:
RCo/cm^{2} de superficie filtrante, equivalente a 0,5 mg de FVW /cm^{2} .
RCo/cm^{2} de superficie filtrante, equivalente a 0,5 mg de FVW /cm^{2} .
A las condiciones definidas, es posible la
filtración hasta 120 litros de solución por m^{2} de superficie
filtrante, obteniendo una recuperación de actividad de FVIII
superior al 70% y una recuperación de actividad de FVW superior al
60% con una estructura multimérica del FVW conservada (más de 11
multímeros) y un ratio FVW:RCo/FVIII que es como mínimo el 80% del
material aplicado.
La solución a filtrar se caracteriza por
presentar una relación de actividades FVW:RCo/FVIII mayor o igual a
0,4 y típicamente entre 1 y 3, siendo por tanto igualmente
aplicable a soluciones de FVW sin FVIII como a soluciones del
complejo FVIII/FVW, ya que el FVW al ser la molécula multimérica de
mayor tamaño es la limitante del proceso.
A las condiciones definidas, el caudal
normalizado de filtración es como máximo de 30 litros/hora/m^{2},
y típicamente entre 10 y 20 litros/hora/m^{2}, siendo el tiempo
de filtración menor o igual a 12 horas. Esto posibilita su
aplicación industrial, siendo evidente una modificación u
optimización de estos parámetros por la simple variación de la
superficie de nanofiltración, que por su elevado coste es el factor
limitante del proceso.
En una realización preferente se procede a una
prefiltración por un nanofiltro de un tamaño de poro entre 35 y 100
nm previa a la nanofiltración por un poro inferior a 35 nm. El
ratio de áreas entre prefiltro y nanofiltro (< 35 nm) se sitúa
entre 1:2 y 1:4.
También es posible realizar una doble
nanofiltración por 20 nm (20 nm + 20 nm), con lo que se incrementa
el beneficio de seguridad añadida al producto por la
nanofiltración.
Por la presente invención se obtiene un FVW o
complejo de FVIII/FVW nanofiltrado que permite la preparación de un
medicamento de alta pureza, apto para el tratamiento de la EVW y de
la Hemofilia A, con una actividad de FVW superior a 100 UI
FVW:RCo/ml y una relación entre las actividades de FVW y FVIII
igual o mayor a 0,4 y en el que la estructura multimérica del FVW
incluye los multímeros de alto peso molecular (más de 11
bandas).
De entre los nanofiltros comerciales
disponibles, para ejemplificar la invención se han utilizado los
nanofiltros Planova®, de Asahi Kasei Corporation, Japón, fabricados
a partir de celulosa regenerada y cuyo tamaño de poro es
aproximadamente de 35\pm2 nm en el caso del Planova 35N y de
19\pm1 nm en el caso del Planova 20N. Este tipo de filtros
admiten tanto un modo de filtración terminal ("dead end"),
como tangencial. En los siguientes ejemplos, la nanofiltración por
Planova se ha realizado en modo terminal pero a efectos de la
presente invención, es válido también su uso en modo tangencial,
así como el uso de nanofiltros de otras marcas comerciales y
composición, que el experto en la materia conoce. Tanto el montaje,
como forma de operación y comprobación de la integridad de los
nanofiltros a los que se refiere la presente invención están
perfectamente definidos en las instrucciones de los
fabricantes.
La solución del complejo de FVIII/FVW previa a
la nanofiltración, procedente de plasma humano, puede ser obtenida,
por ejemplo, a partir del crioprecipitado solubilizado, por
precipitación con Polietilenglicol y posterior purificación por
cromatografía de afinidad, como muestra la patente EP 0411810. La
solución nanofiltrada puede ser posteriormente purificada, para
conseguir un producto de alta pureza, por ejemplo por precipitación
con glicina, como muestra la patente EP 0639203. Alternativamente,
el FVIII o el FVW o ambos pueden proceder de biosíntesis mediante
la tecnología del ADN recombinante en células o en animales
transgénicos [Wood W.I. y otros, Nature (1984) 312:
330-337]; [Toole, JJ. y otros, Nature (1984) 312:
342-347].
A partir de 14,7 litros de una solución del
complejo de FVIII/FVW parcialmente purificada, con una actividad
específica de 10,4 UI FVIII/UA_{280 \ nm} y con una concentración
de FVW:RCo de 5,69 UI/ml, equivalente a 0,235 UA_{280 \ nm}, en
presencia de histidina 25 mM y 0,14 M de calcio a un pH de 6,77 y
temperatura de 20\pm5ºC se procede a la filtración en serie por
un filtro Planova 35N de 0,12 m^{2} y un filtro Planova 20N de
0,3 m^{2}. La filtración tiene lugar a caudal constante de
aproximadamente 14 L/h/m^{2}, manteniéndose una presión
diferencial en el Planova 20N entre 0,20 y 0,30 bar durante la
filtración de toda la solución, la cual finaliza tras un tiempo de
3,3 horas. La productividad, por unidad de área y de tiempo es de
3,6 UI FVIII/cm^{2}/hora, 8,2 UI FVW RCo/cm^{2}/hora
(proporción FVW:RCo/FVIII:C = 2,3) y de 9,8 UI
FVW:Ag/cm^{2}/hora. La recuperación de actividad es de 94% de
FVIII y de 95% de FVW RCo.
Se procesaron, según se ilustra en el ejemplo
2, 7 lotes diferentes de material de partida. En todos los casos se
parte del complejo FVIII/FVW, con una actividad específica próxima
o superior a 10 UI FVIII/UA_{280 \ nm} y con una concentración
proteica de 0,3\pm0,2 UA_{280 \ nm}, en presencia de histidina
25 mM y 0,14 M de calcio a un pH de 6,8\pm0,2 y temperatura de
20\pm5ºC. Se procedió a la clarificación por 0,1 \mum y
posterior nanofiltración en serie por Planova 35N y Planova 20N.
La filtración se mantuvo a caudal constante entre 10 y 20
litros/h/m^{2}. La presión operativa en el filtro Planova 20N se
mantuvo entre 0,2 y 0,4 bar durante toda la filtración y en todos
los casos.
Los resultados obtenidos (tabla 1) muestran que
la nanofiltración del complejo de FVIII/FVW por tamaño de poro de
20 nm en las condiciones establecidas no tiene impacto alguno sobre
la actividad y pureza (actividad específica) del nanofiltrado
obtenido.
El análisis comparativo de los ratios
FVW:RCo/FVIII y FVW:RCo/FVW:Ag (tabla 1) obtenidos en el material
antes y después de nanofiltrar permite constatar que, en las
condiciones establecidas es posible filtrar el FVW contenido en el
concentrado de FVIII/FVW por tamaño de poro de 20 nm sin afectar a
la funcionalidad de este FVW como cofactor de Ristocetina.
En la figura 1 se muestra la estructura
multimérica del FVW en diferentes lotes de producto final, con y
sin etapa de nanofiltración. En la fotografía original se pueden
contar al menos 16 bandas en carriles correspondientes al material
nanofiltrado.
Se procede a la filtración por Planova 35N de
una solución parcialmente purificada de FVIII/FVW, con una
actividad específica del FVIII de aproximadamente 10 UI/UA_{280 \
nm} y con concentraciones comprendidas en el intervalo
0,1-0,3 UA_{280 \ nm}, en las condiciones
descritas en los ejemplos 2 y 3. La nanofiltración se ajusta a
alta (0,8 bar) y baja presión (0,3 bar), obteniendo los resultados
mostrados en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Asimismo, a partir de esta solución de complejo
de FVIII/FVW prefiltrada por Planova 35N se procede a la filtración
por Planova 20N en las condiciones descritas en el ejemplo 2. La
nanofiltración se ajusta a alta (0,8 bar) y baja presión (0,3 bar),
obteniendo los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En la filtración por Planova 35N a alta presión
se produce una drástica caída de caudal, observando tan sólo el
10,6% y 14,6% del caudal inicial tras una hora de nanofiltración y,
en un caso, tan sólo el 7,9% del caudal inicial a las 3 horas. En
la filtración por Planova 35N a una presión diferencial de 0,3 bar
el caudal se mantiene en un 88,6% incluso tras 3 horas de
nanofiltración.
En la filtración por Planova 20N, tomando como
material de partida una solución de complejo de FVIII/FVW
prefiltrada por Planova 35N y a una presión diferencial de 0,8 bar
se obtiene una relación de caudal de un 40% tras una hora de
nanofiltración e interrumpiéndose la filtración antes de las 3
horas por colmatación del filtro. Cuando la filtración por Planova
20N se realiza a una presión diferencial de 0,3 bar el caudal se
mantiene en un 75,7% incluso tras 3 horas de nanofiltración.
De los ejemplos anteriores, se evidencia que el
mantenimiento de unas condiciones bajas de presión durante la
filtración por tamaño de poro igual o inferior a 35 nm evita que se
produzca una brusca caída de caudal. Consecuentemente, en estas
condiciones de presión no se observa fenómeno de bloqueo de parte
de los poros de la membrana filtrante debido a la deposición de
moléculas de alto peso molecular presentes en la solución de
FVIII/FVW como son las formas multiméricas del FVW que alcanzan
tamaños de hasta 20000000 Da.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de distintas soluciones del complejo
de FVIII/FVW parcialmente purificado, con una actividad específica
del FVIII de aproximadamente 10 UI FVIII/UA_{280 \ nm}, con una
actividad de FVW en relación a la actividad FVIII (FVW:RCo:FVIII) de
aproximadamente 2, y comprendiendo unas concentraciones en el
intervalo 0,1-0,65 UA_{280 \ nm} se procede a la
filtración por Planova 20N a una presión diferencial de
aproximadamente 0,5 bar y en las mismas condiciones de proceso y
composición de producto (excepto su concentración) descritas en los
ejemplos 1 y 2.
En la tabla 4 se muestran los resultados
obtenidos:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La reducción de caudal observada durante la
nanofiltración es directamente proporcional a la concentración del
material de carga. Así, el caudal observado tras una hora de
nanofiltración es del 80,7%; 63,6%; 60,7%; 52,9% y 16,2%, con
respecto al caudal inicial, para concentraciones de 0,106 UA, 0,17
UA, 0,314 UA, 0,343 UA y 0,648 UA, respectivamente. En relación
con el caudal observado tras 3 horas de nanofiltración, el descenso
hasta valores de un 30,5% del caudal inicial es atribuible al hecho
de llevar a cabo la nanofiltración en las condiciones de presión
que representan el límite superior de proceso.
Para una concentración de carga próxima a 0,3
UA se obtienen los valores óptimos de productividad (7,8 UI de
FVW:RCo/cm^{2}/h equivalentes a 46,8 UI de FVW:RCo/cm^{2}) así
como de recuperación de proteína (ver tabla). Cuando la
concentración del material de carga es máxima (0,648 UA) se observa
colmatación de la filtración desde el inicio de filtración y los
valores de productividad y recuperación descienden drásticamente
hasta valores inferiores a 2 UI de FVW:RCo/cm^{2}/h y 46,8% de
recuperación total de proteína, resultando inviable la
nanofiltración a esta concentración.
De estos resultados se puede establecer que el
rango viable de concentración para la nanofiltración de la solución
de FVIII/FVW con actividad específica de aproximadamente 10 UI
FVIII/UA_{280 \ nm} es \leq 0,6 UA, aproximadamente equivalente
a \leq 6 UI/ml de EVIII y \leq 12 UI/ml de FVW:RCo.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de distintas soluciones del complejo
de FVIII/FVW formulado con albúmina con una actividad específica
superior a 10 UI FVIII/UA_{280} y una actividad de FVIII entorno
a 3 UI/ml, equivalente aproximadamente a 4 UI/ml de FVW:RCo, se
procede a la filtración por un filtro de tamaño de poro de 20 nm en
presencia de arginina 0,1 M, histidina 25 mM y de calcio 0,05 mM a
un pH de 7,3\pm0,1. La filtración se lleva a cabo manteniendo
una presión diferencial en el Planova 20N de aproximadamente 0,5
bar. En la tabla 5 se muestran los parámetros más relevantes
obtenidos en los ensayos llevados a cabos con dos lotes de producto
independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados indican que la práctica
ausencia de calcio (0,05 mM) y su sustitución por arginina (0,1M)
produce una caída de productividad relevante alcanzándose valores
de 1,6 UI FVIII/cm^{2}/hora y 2,0 UI FVW RCo/cm^{2}/hora en
ambos casos, remarcablemente inferiores a los observados en el
ejemplo 2 (3,6 UI FVIII/cm^{2}/hora y 8,2 UI FVW
RCo/cm^{2}/hora), con similar actividad de FVIII en el material
de partida.
Asimismo, la recuperación de actividad de FVIII
observada en ambos ensayos desciende hasta valores de 43,3% y 46,6%
respectivamente. Sin embargo, aún en estas condiciones, es factible
la nanofiltración del complejo macromolecular de FVIII y FVW con
proporciones entre las actividades de FVW y FVIII similares a las
encontradas en la naturaleza (1:1).
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de una solución parcialmente
purificada del complejo de FVIII/FVW proveniente de más de 3000
litros de plasma y con una actividad específica de 15,6 UI
FVIII/UA_{280} se procede a la filtración en serie por un filtro
de tamaño de poro nominal de 35 nm (Planova 35N) de 4 m^{2} y dos
filtros de tamaño de poro nominal de 20 nm (Planova 20N) de 4
m^{2} en presencia de histidina 25 mM y de calcio 0,14 M a pH
6,80. La filtración se lleva a cabo a caudal constante a 107 L/h
aproximadamente y manteniendo una presión diferencial en el Planova
20N entre 0,20 y 0,35 bar, habiéndose alcanzado la carga de
aplicación (solución de producto + postlavado) de 120,2 kg/m^{2}
de Planova 20N. La actividad total aplicada por unidad de área fue
de 8,9 UI FVIII/cm^{2} y 19,1 UI FVW:RCo/cm^{2}. La recuperación
de actividad de la nanofiltración fue del 70,4% de FVIII y del
77,3% de FVW:RCo. Al incluir el postlavado y tras concentrar el
producto nanofiltrado obtenido la recuperación de actividad
observada fue de 97,5% de FVIII y de 86,8% de FVW:RCo.
La precipitación con cloruro sódico y glicina
posterior (según EP 0639203) da lugar a un concentrado de
FVIII/
FVW nanofiltrado y de alta pureza.
FVW nanofiltrado y de alta pureza.
El concentrado de FVIII/FVW nanofiltrado y de
alta pureza obtenido se estabiliza y, previamente a la dosificación
del producto a viales, se ajusta de potencia.
El contenido relativo de FVW en relación al
contenido de FVIII, expresado como la relación entre FVW:RCo/FVIII.
a lo largo del proceso de purificación se muestra a continuación en
la tabla 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados indican que la implementación
de la nanofitración en el proceso de purificación del complejo
FVIII/FVW no afecta esencialmente a la etapa de purificación
posterior que conduce a un producto de alta pureza. Esto indica por
tanto que en las condiciones establecidas para la nanofiltración
del concentrado de FVIII/FVW por tamaño de poro de 20 nm no se
altera la proporción de formas multiméricas de mayor peso
molecular del FVW dado que tal alteración hubiera tenido
previsiblemente un impacto negativo en la purificación posterior
por precipitación.
El concentrado nanofiltrado FVIII/FVW presenta
una concentración relativa de FVW suficiente para su uso como
producto terapéutico en la EVW y un contenido de FVIII que también
permite su utilización para el tratamiento de la Hemofilia A, con
el beneficio adicional de la presencia de cantidades similares a
las encontradas en la naturaleza del FVW, estabilizante natural
del FVIII, cuyas propiedades beneficiosas en el tratamiento de la
Hemofilia A se han mencionado con anterioridad.
Si bien la invención ha sido explicada en base
a realizaciones preferentes de la misma y ejemplos ilustrativos, se
comprenderá que, en base a la materia que se ha dado a conocer, los
expertos en el sector podrán introducir múltiples variantes en las
realizaciones de la invención, que quedarán incluidas de manera
amplia en ésta teniendo en cuenta el contenido de las siguientes
reivindicaciones y sus equivalentes.
Claims (15)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Procedimiento para la obtención de un concentrado de factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand, de origen humano o recombinante, caracterizado por:- a)
- preparación de una solución de Factor von Willebrand o de complejo de Factor VIII/Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4;
- b)
- proceder a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de tamaño de poro menor de 35 nanómetros.
- 2. Procedimiento para la obtención de un concentrado de factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand, de origen humano o recombinante, caracterizado por:
- a)
- preparación de una solución de Factor von Willebrand o de complejo de Factor VIII/Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4;
- b)
- proceder a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de tamaño de poro menor de 35 nanómetros, a baja presión.
- 3. Procedimiento para la obtención de un concentrado de factor von Willebrand o del complejo Factor VIII/Factor von Willebrand, de origen humano o recombinante, caracterizado por:
- a)
- preparación de una solución de Factor von Willebrand o de complejo de Factor VIII/Factor von Willebrand que contiene FVW a una concentración de hasta 12 UI FVWRCo/ml y una proporción entre Factor von Willebrand/Factor VIII superior o igual a 0,4;
- b)
- proceder a la nanofiltración de la solución preparada en a) mediante un filtro de tamaño de poro menor de 35 nanómetros, a baja presión y en presencia de ión calcio.
- 4. Procedimiento, según la reivindicación 2, caracterizado porque la presión máxima de nanofiltración es de 0,5 bar.
- 5. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de ión calcio en la solución sometida a nanofiltración varía entre 0,05 y 0,2 M.
- 6. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el Factor von Willebrand recuperado después de la nanofiltración mantiene una estructura multimérica que incluye multímeros del orden de 11 ó superior.
- 7. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la recuperación del Factor von Willebrand después de la nanofiltración es mayor o igual al 60%.
- 8. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la recuperación del Factor VIII después de la nanofiltración es mayor o igual al 70%.
- 9. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se aplica una relación de carga hasta 50 UI de Factor von Willebrand por cm^{2} de superficie filtrante.
- 10. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la concentración máxima de la solución a filtrar es de 0,6 UA (DO_{280}).
- 11. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la nanofiltración se realiza a una presión entre 0,2 y 0,4 bar.
- 12. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el caudal normalizado de nanofiltración se sitúa entre 10 y 20 litros/hora/m^{2}.
- 13. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la nanofiltración se realiza por un filtro de un tamaño de poro menor de 35 nanómetros.
- 14. Procedimiento de nanofiltración, según las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la nanofiltración se realiza por un filtro de un tamaño de poro de 19\pm1 nanómetros.
- 15. Utilización del concentrado obtenido según el procedimiento de las reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de la Hemofilia A o de la enfermedad de von Willebrand.
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