ES2299653T3 - Concentrado de un factor de von willebrand que contiene el factor viii, y procedimiento correspondiente. - Google Patents
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Abstract
Concentrado de un factor de von Willebrand que contiene el factor VIII:C, que tiene una relación de la actividad de las unidades de vWF:RCoF a las unidades de vWF:Ag mayor que 1, caracterizado porque se puede obtener mediante un procedimiento, en el que un líquido que contiene el factor VIII:C y el factor de von Willebrand es sometido a una precipitación fraccionada, que incluye las siguientes etapas: 1) precipitación mediante glicina en una concentración de 0,93 a 2,13 mol/l (de 70 a 160 g/l) y 2) precipitación mediante cloruro de sodio en una concentración de 1,17 a 2,74 mol/l (de 100 a 160 g/l).
Description
Concentrado de un factor de von Willebrand que
contiene el factor VIII, y procedimiento correspondiente.
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Es objeto del presente invento un concentrado de
un factor de von Willebrand que contiene el factor VIII:C, el cual,
debido a su composición especial, presenta ventajas
terapéuticas.
El factor de von Willebrand (vWF) funcional, que
es una glicoproteína, circula en la circulación sanguínea con una
distribución diversa de pesos moleculares, en forma de los
denominados multímeros, pudiendo tener los multímeros una
distribución de pesos moleculares de desde 500 kiloDalton (kD) hasta
20.000 kD. La unidad más pequeña es en este caso el dímero con un
peso molecular de aproximadamente 550 kD; éste se compone de dos
monómeros, que están unidos uno con otro a través de puentes de
disulfuro. A partir de estos dímeros, por medio de adicionales
enlaces de disulfuro resultan unos polímeros, los denominados
multímeros, que tienen un peso molecular de hasta 20.000 kD. La
distribución de pesos moleculares de los multímeros del factor de
von Willebrand se puede determinar mediante la electroforesis en
geles de agarosa, tanto cuantitativamente como también
cualitativamente (véanse las citas bibliográficas 1, 2, 3). La
función fisiológica del factor de von Willebrand es su propiedad de
adherirse junto al endotelio dañado y de conglomerar a los
trombocitos (véase la cita bibliográfica 4). De esta manera se
llega, en la denominada hemostasis primaria, primeramente a la
formación de un tapón de trombocitos y por consiguiente a un primer
restañamiento de la sangre; ulteriormente se llega al desarrollo de
la cascada de coagulación, la denominada hemostasis plasmática, y
finalmente a la oclusión de la herida (cicatrización).
Una importante función adicional del factor de
von Willebrand es su capacidad para formar complejos con el factor
VIII:C (FVIII:C); mediante esta formación de complejos con el vWF,
el FVIII:C es protegido en el plasma contra una degradación
proteolítica. En el caso de un organismo sano existe siempre un
nivel suficientemente alto de FVIII:C en el complejo con el vWF. En
este caso, se parte del hecho de que las dos proteínas, el FVIII:C
y el vWF, están unidas por medio de un enlace no covalente entre el
extremo terminal de N de la cadena ligera del FVIII:C y el extremo
terminal de N del vWF (véanse las citas bibliográficas 5, 6).
Tales conexiones se pudieron observar p.ej. en
el caso de la sustitución de pacientes de von Willebrand por un
precipitado criogénico procedente del plasma de donantes sanos. En
los pacientes, la sustitución por un precipitado criogénico normal
inducía un aumento del FVIII:C en el transcurso de varias horas. La
disminución se efectuaba lentamente con el período de tiempo de
semidesintegración del vWF.
El factor antihemofílico, la proteína de
coagulación del factor VIII (FVIII:C), circula en el plasma en común
con el vWF en forma de un complejo unido por enlaces no covalentes,
pudiéndose separar el complejo de vWF y FVIII:C sólo difícilmente
de una manera preparativa. Durante un largo período de tiempo no se
conocía que el vWF y el FVIII:C son dos proteínas diferentes, que se
sintetizan en el organismo también en sitios diferentes: el FVIII:C
en el hígado, el vWF en células endoteliales y en megacariocitos
(véanse las citas bibliográficas 9, 10).
La ausencia del vWF, o también sólo su
disminución, tiene como consecuencia un período de tiempo de
hemorragia prolongado y una grave tendencia a la hemorragia; el
cuadro patológico es denominado como el síndrome de von Willebrand
y puede aparecer en varias formas de presentación. En este caso se
extiende desde una distribución anormal de tamaños de los multímeros
de vWF hasta llegar a la ausencia parcial o total de un factor de
von Willebrand funcional, el denominado tipo III del síndrome de
von Willebrand. En este caso, los multímeros tanto los de alto peso
molecular como también los de bajo peso molecular pueden haber
disminuido o incluso pueden faltar totalmente. El síndrome de von
Willebrand (p.ej. el del tipo III) tiene también como consecuencia
una deficiencia del FVIII:C y, por consiguiente, una hemofília A,
puesto que el FVIII:C es protegido con el vWF en un complejo y sin
éste es descompuesto proteolíticamente dentro de un período de
tiempo muy breve en el plasma.
En el caso de la sustitución de un paciente de
hemofilia con un precipitado criogénico normal, se observa sólo un
rápido y breve aumento de una actividad medible del FVIII:C. (véanse
las citas bibliográficas 7, 8). Si, no obstante, un paciente de von
Willebrand es sustituido con un plasma o un precipitado criogénico
de un donante hemofílico, entonces se medirá paradójicamente también
un aumento del FVIII. Este hecho se puede explicar por la
estabilización mediante el vWF. El paciente de von Willebrand
sintetiza el FVIII que, no obstante, después de su liberación
dentro del plasma, es disociado proteolíticamente de una manera
continua.
El vWF es de gran importancia para la
coagulación normal en común con el FVIII:C. La concentración del vWF
en el plasma es de aproximadamente 10 \mug/ml. El FVIII:C
constituye, desde el punto de vista de la masa, una proporción
mucho más pequeña de proteína, de aproximadamente 0,2 \mug/ml.
El vWF, como se ha mencionado al principio,
induce la agregación de los trombocitos y, por consiguiente, la
hemostasis primaria en los vasos lesionados. En común con otros
factores activos para la coagulación, tales como los denominados
factores de contacto, el FVIII:C, los fosfolípidos y calcio, a
través de la activación del factor X se efectúa la coagulación
ulterior de la sangre hasta llegar a la formación de fibrina y a la
oclusión de una herida (véase la cita bibliográfica 11).
El complejo de vWF y FVIII:C se puede separar
sólo difícilmente, y por lo tanto, el FVIII:C se encuentra en común
con el vWF en el precipitado criogénico, o respectivamente se eluye,
en el caso de filtraciones a través de geles, en común con el vWF
en el volumen de exclusión (véase la cita bibliográfica 12).
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para el enriquecimiento del complejo de vWF y
FVIII:C, en la industria de los plasmas se emplea frecuentemente el
procedimiento de la precipitación criogénica. En este caso, mediante
una descongelación planificada de un plasma congelado a muy bajas
temperaturas se forma un precipitado insoluble (el precipitado
criogénico). Si se separa este precipitado, entonces se obtiene,
junto al precipitado criogénico, el denominado plasma pobre
criogénicamente. En el precipitado criogénico se encuentra
enriquecido el complejo de vWF y FVIII:C en común con una parte de
las proteínas plasmáticas fibrinógeno y fibronectina. El espectro de
multímeros del vWF en el precipitado criogénico contiene una
composición eficaz de los multímeros, que es comparable con la del
plasma normal. En este caso, precipitan predominantemente los
multímeros de más alto peso molecular, encontrándose de nuevo en el
precipitado criogénico casi todos los multímeros de alto peso
molecular del vWF procedente del plasma. Aproximadamente un 20% del
vWF, que no tiene ninguna actividad medible, permanece en común con
el FVIII:C en el plasma pobre criogénica-
mente.
mente.
Una agrupación (en inglés pool) de plasma de
seres humanos sanos contiene por definición 1 UI/ml (unidad
internacional/mililitro) de actividad funcional, referida a todos
los factores de la coagulación. La actividad funcional del vWF es
medida habitualmente por medio de la agregación de los trombocitos
mediada por la ristocetina, que está en correlación con la
concentración del vWF intacto. Este fenómeno se describe como la
actividad del cofactor de vWF con ristocetina (vWF:RCoF) con los
datos de las concentraciones en UI/ml. La proteína asociada se
designa como antígeno de vWF, abreviadamente como vWF:Ag.
En el caso de enfermedades de von Willebrand con
alto grado de gravedad, la sustitución por un concentrado de vWF,
que tiene una alta proporción funcional de FVIII:C, es
considerablemente ventajosa; por una parte, el factor VIII:C
fijado, que es activo para la coagulación, constituye una medida de
la capacidad de fijación y señaliza a un vWF intacto, y por otra
parte, la presencia del FVIII:C conduce a un acortamiento
significativo del período de tiempo de hemorragia. Sin el FVIII:C,
en el caso del tratamiento de enfermedades de von Willebrand
mediante una sustitución, sería necesario aplicar adicionalmente
formulaciones del FVIII:C. La premisa para la rápida actividad en
el caso de enfermedades de von Willebrand es, por lo tanto, un vWF
con una capacidad de fijación normal del factor VIII:C, enriquecido
ventajosamente con una porción de multímeros de alto peso molecular
del vWF y con una porción del factor VIIII:C intacto.
La solicitud de patente europea EP 0.705.846
(véase la cita bibliográfica 13) describe un procedimiento
preparativo para la separación del factor de von Willebrand en una
fracción de alto peso molecular y en una fracción de bajo peso
molecular del vWF. Esta separación se consigue fijando el vWF sobre
un soporte de afinidad y luego eluyéndolo desde éste con diferentes
concentraciones salinas. De esta manera se pueden obtener fracciones
de vWF de alto peso molecular, que tienen una actividad fisiológica
especialmente alta.
También se conocen ya procedimientos
cromatográficos para la separación del vWF en multímeros de alto
peso molecular y de bajo peso molecular. En este caso, sin embargo,
no era posible obtener planificadamente unos complejos óptimos de
vWF y FVIII:C con multímeros enriquecidos del vWF de alto peso
molecular.
También es sabido, que un FVIII:C, bien sea en
este caso un FVIII recombinante o uno plasmático, en el caso de una
administración repetida y en concentraciones más altas, disociado
del factor de von Willebrand, puede conducir a reacciones
inmunológicas indeseadas, puesto que la formación de anticuerpos
puede ser inducida de manera diferentemente fuerte según sean el
modo de preparación y la pureza,. Estos anticuerpos, los denominados
cuerpos inhibidores de la hemofilia A o inhibidores del FVIII:C,
que se pueden determinar cuantitativamente en "unidades de
Bethesda" de acuerdo con una publicación: Thrombos, Diathes
haemorrh. (Stuttgart), 1975, 34, 869 (véase la cita bibliográfica
14), conducen a unos efectos secundarios indeseados y eventualmente
a hemorragias.
Si estas formulaciones de FVIII:C se incuban
previamente con un factor de von Willebrand multímero, la formación
de estas inmunoglobulinas anti-FVIII es suprimida
amplísimamente y se pueden utilizar repetidamente unas cantidades
mayores, sin que se tengan que temer estos efectos secundarios. La
formulación conforme al invento tiene, por consiguiente, una
importante ventaja para la utilización. Como se pudo demostrar, esta
conexión se encontró en un modelo de ratón con hemofilia (véase la
cita bibliográfica 15).
Heimburger N. y colaboradores (1981),
Arzneimittelforschung 31: 619-622, describen unos
concentrados del factor VIII, que contienen un factor de von
Willebrand (vWF o factor VIII R:Ag), purificándose previamente un
precipitado criogénico agrupado por medio de una adsorción a
hidróxido de aluminio y mediante una adición de glicina, separándose
fibrinógeno en el caso de una precipitación fraccionada con glicina.
A partir del material sobrenadante con glicina, a través de una
precipitación mediante cloruro de sodio se separa el complejo de
factor VIII y vWF, se estabiliza con sacarosa y glicina, y se
pasteuriza durante 10 horas a 60ºC.
El documento de patente de los EE.UU. US
5.288.853 divulga un procedimiento para la purificación del complejo
del factor VIII y de vWF, precipitándose el complejo a partir de un
líquido por medio de una mezcla de glicina y NaCl, y presentándose
la glicina en una concentración de 1,5-2,5 M y el
NaCl en una concentración de 1-2 M.
El invento indicado en la reivindicación 1 de
esta patente está basado en el problema de poner a disposición un
concentrado de un factor de von Willebrand que contiene el factor
VIII:C, el cual contiene multímeros de alto peso molecular,
enriquecidos, del vWF, y tiene una relación de la actividad de
vWF:RCoF al vWF:Ag mayor que 1.
El problema anteriormente descrito es resuelto
mediante el concentrado mencionado en la reivindicación 1. Este
concentrado se obtiene mediante una precipitación fraccionada a
partir de un líquido que contiene el factor VIII:C y el factor de
von Willebrand, y tiene un contenido aumentado de multímeros de alto
peso molecular del factor de von Willebrand y una relación de la
actividad de vWF:RCoF al vWF:Ag mayor que 1.
Las ventajas conseguidas con el invento
consisten en que se puede poner a disposición un concentrado de un
factor de von Willebrand, que contiene el factor VIII:C, y que se
puede obtener mediante una sencilla precipitación fraccionada
preparativa a partir de un líquido, que contiene el factor VIII:C y
el factor de von Willebrand, teniendo el concentrado un contenido
aumentado de multímeros de alto peso molecular del factor de von
Willebrand y una relación de la actividad de vWF:RCoF al vWF:Ag
mayor que 1. El concentrado obtenido de esta manera se adecua para
la sustitución en el caso de enfermedades de von Willebrand de alto
grado de gravedad; la presencia del factor VIII:C tiene en este
caso una considerable importancia, puesto que el factor VIII:C
activo para la coagulación, que se ha fijado, es estabilizado por el
vWF, y conduce de esta manera a un acortamiento significativo del
período de tiempo de hemorragia. La alta proporción de multímeros de
alto peso molecular es una premisa esencial para su rápida
actividad.
Otras formas ventajosas de realización del
invento se indican en las reivindicaciones 2 y siguientes.
El concentrado conforme al invento se puede
obtener a partir de un plasma humano, de una fracción de plasma, tal
como p.ej. un precipitado criogénico, o a partir de un material
celular modificado por medios de tecnología genética. El material
de partida preferido para esto es un precipitado criogénico humano,
que contiene el complejo de vWF y de FVIII:C junto a las proteínas
plasmáticas fibrinógeno y fibronectina. Este precipitado criogénico
se obtiene a partir de un plasma al citrato congelado a muy bajas
temperaturas, que se transforma, mediante un calentamiento
deliberado (atemperación), al estado líquido, quedando atrás como un
precipitado una parte del fibrinógeno, de la fibronectina y del
complejo de vWF y FVIII:C, a unas temperaturas comprendidas entre 0
y +2ºC, y pudiéndose separar éste mediante p.ej. una centrifugación.
El precipitado criogénico obtenido de esta manera se puede
almacenar de manera intermedia en una forma congelada a muy bajas
temperaturas, y sirve como un material de partida para la obtención
del complejo purificado de vWF y FVIII:C.
El concentrado conforme al invento se obtiene
preferiblemente mediante una precipitación fraccionada por medio de
glicina y cloruro de sodio. En este caso, una solución acuosa del
precipitado criogénico se mezcla mediando agitación con glicina
hasta que el fibrinógeno se haya precipitado amplísimamente desde la
solución. El residuo de fibrinógeno precipitado se separa a
continuación mediante una centrifugación. A partir del material
sobrenadante, mediando agitación, por adición de una sal de un
metal alcalino o alcalino-térreo, en una forma de
realización preferida por la adición de cloruro de sodio, se
precipita el complejo de vWF y FVIII:C y se separa mediante una
centrifugación. El precipitado que contiene vWF y FVIII:C, que se ha
obtenido en este caso, se disuelve con un tampón isotónico, se
estabiliza con sacarosa y glicina, y a continuación se
pasteuriza.
En el procedimiento conforme al invento la
precipitación del precipitado que contiene vWF y FVIII:C se lleva a
cabo con unas concentraciones de 0,93 a 2,13 mol/l (de 70 a 160 g/l)
de glicina y de 1,17 a 2,74 mol/l (de 100 a 160 g/l) de cloruro de
sodio. Mediante este ajuste de un intervalo de concentraciones se
puede desplazar la relación de actividad en favor de una actividad
de vWF:RCoF más alta, lo cual va acompañado por un enriquecimiento
de multímeros de vWF de alto peso molecular.
Mediante el ajuste de un determinado intervalo
de concentraciones del agente de precipitación glicina, con una
concentración de 1,17 a 2,74 mol/l de cloruro de sodio, se puede
desplazar la relación de actividades en favor de una actividad de
vWF:RCoF más alta, lo cual es un resultado del enriquecimiento con
multímeros de vWF de alto peso molecular. En este caso, la
concentración de la glicina desempeña un cometido clave, lo cual
también constituye un objeto de este invento.
El procedimiento conforme al invento se lleva a
cabo convenientemente de tal manera que primeramente se mezcla el
precipitado criogénico disuelto para la adsorción del complejo con
protrombina, que está incluido en pequeñas cantidades, con una
suspensión de hidróxido de aluminio, luego se agita y se separa. El
material sobrenadante contiene entonces el factor VIII:C y el factor
de von Willebrand, que se obtienen mediante una precipitación
fraccionada.
El precipitado criogénico se disuelve mediante
agitación y un calentamiento ligero en un tampón isotónico, de tal
manera que se obtiene una concentración de proteínas de 2 a 3%. La
solución criogénica en bruto, obtenida de esta manera, se mezcla
luego, para la adsorción de los factores del complejo de
protrombina, con una suspensión de hidróxido de aluminio y mediando
agitación se adsorben los restantes factores de protrombina, y se
separan en común con el sedimento de Al(OH)_{3}.
Después de haber eliminado los factores del complejo de protrombina,
se puede someter la solución del precipitado criogénico a una
desactivación de los virus mediante una pasteurización o con
acridina o derivados de acridina, en concordancia con el documento
de patente alemana DE 44.44.045, y se puede estabilizarla, para lo
que se adecuan particularmente bien los iones de calcio.
La solución criogénica, obtenida después de la
desactivación de los virus, se mezcla a continuación con glicina
mediando agitación, el fibrinógeno se precipita y se separa
mediante centrifugación. Al material sobrenadante obtenido se le
añade a continuación NaCl mediando agitación y de esta manera se
precipita el complejo de vWF y FVIII:C, y se separa mediante una
subsiguiente centrifugación. El precipitado obtenido, que contiene
el complejo de vWF y FVIII:C, se disuelve en un tampón isotónico, se
estabiliza con sacarosa y glicina y a continuación se calienta a
60ºC durante 10 horas. Después de haberse efectuado una
pasteurización, la solución obtenida sirve como material de partida
para la obtención del complejo de vWF y FVIII:C con una proporción
enriquecida de multímeros de alto peso molecular.
Ejemplos de realización de los inventos se
representan en los Ejemplos 1 hasta 6.
200 g de un precipitado criogénico se
desmenuzaron y disolvieron con una solución 0,1 M de NaCl y glicina
en
800 ml. La solución criogénica se mezcló con 10% en volumen de una suspensión al 1,5% de Al(OH)_{3}, se agitó durante 15 min y se separó por centrifugación. El sedimento de Al(OH)_{3} separado se desechó. El material sobrenadante de Al(OH)_{3} (820 ml) se mezcló con glicina mediando agitación, hasta que el fibrinógeno se hubiese separado desde la solución. El precipitado se separó por centrifugación, y el material sobrenadante, que contenía el complejo de vWF y FVIII:C, se trató ulteriormente.
800 ml. La solución criogénica se mezcló con 10% en volumen de una suspensión al 1,5% de Al(OH)_{3}, se agitó durante 15 min y se separó por centrifugación. El sedimento de Al(OH)_{3} separado se desechó. El material sobrenadante de Al(OH)_{3} (820 ml) se mezcló con glicina mediando agitación, hasta que el fibrinógeno se hubiese separado desde la solución. El precipitado se separó por centrifugación, y el material sobrenadante, que contenía el complejo de vWF y FVIII:C, se trató ulteriormente.
El material sobrenadante que contenía glicina se
mezcló mediando agitación con NaCl al 15% y el complejo de vWF y
FVIII:C se precipitó cuantitativamente. El precipitado se disolvió
en 64 ml de un tampón de NaCl y glicina, se estabilizó con sacarosa
(1 g/ml) y con glicina (150 g/l) y se pasteurizó durante 10 horas a
60ºC. Después de haberse enfriado, la solución pasteurizada se
diluyó con el mismo volumen de un tampón de glicina y NaCl.
La solución diluida (220 ml), que contenía 1,6
g/l de NaCl y 124,4 g/l de glicina, se mezcló mediando agitación en
3 tandas a, b, c, en cada caso con 0,75 partes de un medio de
precipitación, de tal manera que la tanda de precipitación
contenía
- a)
- 80 g/l
- b)
- 90 g/l
- c)
- 100 g/l
de glicina, y la concentración final de NaCl
llegó en todos los casos a 122 g/l. En este contexto, resultó cada
vez un precipitado fino, que, después de haber agitado durante 45
min, se separó por centrifugación. La fracción disuelta en un
tampón isotónico (en cada caso 44 ml) contenía entonces el vWF y el
FVIII:C, enriquecido con multímeros de alto peso molecular, lo cual
se pone de manifiesto en la siguiente Tabla 1 en cifras de
relaciones. La evaluación en cuanto a la actividad de vWF:RCoF, al
vWF:Ag y al FVIII:C proporcionó la siguiente relación:
La Tabla 1 muestra que la relación del vWF:Ag al
vWF:RCoF en el material de partida estaba cerca de 1. En el caso de
las tandas a) hasta c), la relación se había hasta triplicado en
favor de la actividad de vWF:RCoF en comparación con el vWF:Ag.
El material de partida para la obtención de una
fracción con multímeros de alto peso molecular enriquecidos, era
aquí una solución pasteurizada, fraccionada previamente, que
contenía el complejo de vWF y FVIII:C, obtenida a partir del
precipitado criogénico. La solución era transparente y homogénea y
contenía en esta etapa del procedimiento 1,6 g/l de NaCl y 124,4 g/l
de glicina.
Para la precipitación de un primer precipitado
del complejo de vWF y FVIII:C se ajustó conforme al invento en
varias tandas el equilibrio entre NaCl y glicina mediante la adición
de un medio de precipitación adaptado en cada caso, de tal manera
que precipitaron preferentemente los multímeros de vWF de alto peso
molecular, lo que se podía controlar mediante la relación de las
concentraciones de la actividad de vWF:RCoF al vWF:Ag, y era
manifiestamente mayor que 1.
Después de que se hubo separado por
centrifugación el primer precipitado, se aumentó en el material
sobrenadante en cada caso la concentración de glicina (precipitación
posterior) y se separó por precipitación todavía también el vWF
remanente en el material sobrenadante. En este 2º precipitado, la
porción de alto peso molecular estaba manifiestamente disminuida,
lo que era observable por la disminución de la relación de la
actividad de vWF:RCoF a la concentración de antígenos.
En cada caso 200 ml de un material de partida se
mezclaron con un volumen múltiplo en 0,75 de un medio de
precipitación (150 ml) mediando agitación hasta la adición completa.
Se formó un precipitado fino, que se separó por precipitación.
200 ml de un material de partida que contenía el
complejo de vWF y FVIII:C, contenía ya las siguientes
concentraciones de NaCl y glicina:
1,6 g/l de NaCl, 124,4 g/l de glicina:
A fin de obtener el 1^{er} precipitado, los
medios de precipitación tenían las siguientes concentraciones de
NaCl y glicina:
En cada caso a 200 ml de un material de partida
se les añadieron en las tandas A hasta C 150 ml de un
correspondiente medio de precipitación, de este modo resultaron las
siguientes concentraciones finales de NaCl y de glicina en la
respectiva tanda de precipitación:
Los precipitados resultantes se separaron y
disolvieron. De los precipitados disueltos (\sim 42 ml) se
determinaron las concentraciones de vWF:RCoF, de vWF:Ag y de
FVIII:C, y se representaron en la siguiente Tabla 2.
Se calculó la respectiva relación de las
actividades tomadas de la Tabla 2 y se representó en la Tabla 3.
La relación de vWF:Ag a vWF:RCoF conseguida en
las tandas A hasta C se había desplazado, en comparación con el
material de partida, en favor de la actividad de vWF:RCoF, lo que
significaba un aumento de los multímeros de alto peso molecular.
Los materiales sobrenadantes de las tandas A
hasta C se mezclaron con glicina mediando agitación, y ciertamente
de tal manera, que las 3 tandas alcanzaron una concentración de
glicina en cada caso de 160 g/l. Los precipitados resultantes se
separaron por precipitación y se disolvieron.
Después de la determinación de las
concentraciones de vWF:RCoF, de vWF:Ag y de FVIII:C se calcularon
las cifras de las relaciones. Las relaciones se representaron en la
Tabla 4.
Las precipitaciones posteriores, representadas
en la Tabla 4, mostraron en la relación de vWF:Ag a vWF:RCoF una
manifiesta disminución de la actividad de vWF:RCoF, lo que apuntaba
a una cantidad disminuida de multímeros de alto peso molecular y,
por consiguiente, también a una disminución de la funcionalidad del
vWF.
Como en el Ejemplo 2, se empleó una solución
totalmente transparente, que contenía vWF y FVIII:C, fraccionada
previamente y pasteurizada, que en este etapa de la preparación
contenía 1,6 g/l de NaCl y 124,4 g/l de glicina. En 4 tandas de
precipitación, en cada caso con la misma concentración de NaCl y de
glicina, se variaron aquí la adición y el período de tiempo de
incubación.
La concentración de glicina era más alta en la
tanda de precipitación, en comparación con el Ejemplo 1 y el Ejemplo
2; las tandas de precipitación 1 a 4 se diferencian sólo en el
período de tiempo de adición e incubación, a fin de explicar y
demostrar que la relación del vWF:Ag al vWF:RCoF resultante al
realizar la precipitación no dependía de los períodos de tiempo de
acción, sino en primer término de la concentración de glicina.
En los casos de las tandas 1 hasta 4, se
mezclaron en cada caso 200 ml de un material de partida mediando
agitación cada vez con 150 ml de un medio de precipitación, que
contenía 283,01 g/l de NaCl y 133,58 g/l de glicina. Las variables
eran el período de tiempo de adición y el período de tiempo de
incubación, las concentraciones de NaCl y glicina eran iguales en
todas las tandas, como se puede observar en la Tabla 5.
Períodos de tiempo de adición e incubación en la
tanda de precipitación del Ejemplo 3
Los precipitados resultantes se separaron por
centrifugación y se disolvieron. El material sobrenadante de la
tanda 1 se ajustó, con una cantidad adicional de glicina cristalina,
a una concentración de 160 g/l y se agitó durante 2 horas. El
precipitado resultante se disolvió asimismo. Se midieron los
contenidos de actividades de FVIII:C, de vWF:RCoF así como de
vWF:Ag, y se calcularon las relaciones entre ellas. Éstas se
representan en la Tabla 6.
Aquí se mostró que las tandas 1 hasta 4, a pesar
de tener unos períodos de tiempo de adición e incubación
diferentes, eran casi comparables en las relaciones de las
actividades medidas. En las 4 tandas, la concentración de NaCl y la
concentración de glicina eran iguales.
Sólo la precipitación posterior de la tanda 1 se
destacó manifiestamente: El contenido del co-factor
de vWF y ristocetina se había disminuido manifiestamente, el
contenido de vWF:Ag se había aumentado manifiestamente. En el
precipitado posterior disuelta faltaban inequívocamente los
multímeros de alto peso molecular (sin Figura).
El material de partida era aquí asimismo una
fracción del complejo de vWF y FVIII:C, purificada previamente, que
contenía 1,6 g/l de NaCl y 124,4 g/l de glicina.
- Tanda 1:
- Aquí se dispusieron previamente 200 ml de un material de partida y mediando agitación se añadieron 150 ml de un medio de precipitación, que contenía 283,01 g/l de NaCl y 133,5 g/l de glicina. Se agitó hasta que la precipitación fuese total, luego el precipitado se separó por centrifugación, se disolvió y se midió la actividad.
- Tanda 1a:
- El material sobrenadante remanente se mezcló ulteriormente mediando agitación con glicina (se precipitó posteriormente), hasta que se hubo alcanzado la concentración de 160 g/l, el precipitado de la precipitación posterior se separó por centrifugación y se disolvió, y la actividad se midió tal como en la tanda 1.
- Tanda 2:
- 1 parte del mismo material de partida se mezcló con 1 parte de otro medio de precipitación, que contenía 300 g/l de NaCl y no contenía nada de glicina. Después de la adición total, teníamos una concentración de glicina de 66,7 g/l, y la concentración de NaCl era de 151,5 g/l. El precipitado resultante se separó por centrifugación, se disolvió y se midió la actividad tal como en la tanda 1.
- Tanda 2a:
- El material sobrenadante remanente de la Tanda 2 se precipitó ulteriormente asimismo por adición de glicina, hasta que se alcanzó una concentración de glicina de 160 g/l; el precipitado se separó por centrifugación, se disolvió y se midió la actividad: (precipitación posterior).
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de vWF:RCoF, vWF:Ag y FVIII:C
proporcionó la siguiente relación, tal como se representa en la
Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Acerca de la Tabla 8: La tanda 1 y la tanda 2
mostraron para un concentrado de vWF una ventajosa distribución de
multímeros, en el caso de la tanda 2, los multímeros de alto peso
molecular estaban representados todavía más grandemente. En la
tanda 1a y especialmente en la tanda 2a, las porciones de alto peso
molecular habían disminuido (sin figura).
Tanda
A
Correspondientemente al Ejemplo 1 se trataron
3,64 kg de un precipitado criogénico para dar aproximadamente 4.000
ml de una solución pasteurizada diluida, que contenía vWF y
FVIII:C.
4.000 ml de la solución del complejo de vWF y
FVIII:C, diluida y pasteurizada, se mezclaron mediando agitación
con 3.000 ml de un medio de precipitación (24,44 g de NaCl, 24,15 g
de glicina, 2.000 ml de WFI, de pH 6,8) en el transcurso de 60
minutos y se incubaron posteriormente sin agitación durante otros 90
minutos. El precipitado formado se separó por centrifugación en una
centrífuga a 6.000xg durante 45 minutos. El precipitado obtenido
(precipitado 1) se disolvió hasta un volumen de 400 ml con un tampón
de disolución (tampón de disolución: 1,46 g de NaCl, 10,14 g de
glicina, 500 ml de WFI, de pH 7,0).
La solución resultante con los multímeros de vWF
de alto peso molecular enriquecidos, se estabilizó con albúmina
humana al 0,5% y se dializó hasta un contenido de un tampón de 3,5 g
de NaCl, 5,8 g/l de citrato de tri-Na x 2 H_{2}O,
20 g/l de glicina, de pH 7,0. Después de la diálisis, la solución se
ultracentrifugó durante 60 minutos a 30.000xg. El material
sobrenadante se decantó después de la ultracentrifugación. La
solución ultracentrifugada se dividió luego en la parte I y la
parte II.
La parte I se filtró en condiciones estériles,
se envasó y se liofilizó.
La parte II se dejó tal cual estaba, se envasó
asimismo y se liofilizó. Como es sabido, en el caso de una
ultracentrifugación a altas revoluciones se separan en su mayor
parte los gérmenes.
La finalidad de la división era la de investigar
qué influencia tiene la filtración en condiciones estériles sobre la
relación, o respectivamente si, después de la filtración en
condiciones estériles, el espectro de los multímeros de alto peso
molecular permanece inalterado.
Como se muestra posteriormente en la Tabla 9, la
relación permaneció inalterada y, por consiguiente, también el
espectro de multímeros de alto peso molecular permaneció inalterado,
con la excepción de una pequeña dilución del producto y una pérdida
por manipulación.
Después de una liofilización y una
reconstitución con WFI, estaba a disposición un concentrado que, en
comparación con el vWF:Ag, tenía una concentración más alta de
vWF:RCoF. Esto se había de atribuir a la proporción relativamente
alta de multímeros de vWF de alto peso molecular y constituye una
ventaja especial en la indicación del síndrome de vW.
Tanda
B
La fracción, que era predominantemente de bajo
peso molecular, se obtuvo en un momento posterior a partir de otra
tanda de preparación. (Tanda B y designada como precipitado 2).
Correspondientemente al Ejemplo 1, se trataron
3,64 kg de un precipitado criogénico para dar aproximadamente 4.000
ml de una solución pasteurizada, diluida, que contenía vWF y
FVIII:C. Se realizó la precipitación para dar una fracción con una
proporción disminuida de multímeros de vWF de alto peso molecular y
de FVIII:C.
4.000 ml de la solución diluida y pasteurizada
del complejo de vWF y FVIII:C se mezclaron con 3.000 ml de un medio
de precipitación (350 g de NaCl, 165,1 g de glicina, 1.000 ml de
WFI, de pH 6,8) en el transcurso de 60 minutos mediando agitación,
y se incubaron posteriormente durante otros 90 minutos sin
agitación. El precipitado formado se separó por centrifugación en
una centrífuga a 6.000xg durante 45 minutos. El precipitado
obtenido se disolvió hasta un volumen de 400 ml con un tampón de
disolución (tampón de disolución: 1,46 g de NaCl, 10,14 g de
glicina, 500 ml de WFI, de pH 7,0).
Esta fracción es prácticamente idéntica al
precipitado 1 de la tanda A y se congeló a muy bajas temperaturas
para una utilización adicional, el material sobrenadante que resultó
a partir de esta tanda sirvió para la obtención de la fracción de
multímeros de vWF de bajo peso molecular.
El material sobrenadante se precipitó
ulteriormente mediante aumento de la concentración de glicina:
Aproximadamente 40 l de un material sobrenadante
se precipitaron mediante una adición ulterior de 30 g/l de glicina
en el transcurso de 60 min a 25 \pm 2ºC mediando agitación y por
una incubación ulterior sin agitación durante 60 minutos. Las
concentraciones finales en la tanda fueron de 122 g/l de NaCl y 158
g/l de glicina. El precipitado resultante se separó por
centrifugación en una centrífuga a 6.000xg durante 60 minutos. El
precipitado obtenido entonces (precipitado 2) se disolvió hasta 250
ml con un tampón de disolución (tampón de disolución: 1,46 g de
NaCl, 10,14 g de glicina, 500 ml de WFI, de pH 7,0). Se desechó el
material sobrenadante.
La solución resultante, con la proporción
disminuida de multímeros de vWF de alto peso molecular, se
estabilizó con albúmina humana al 0,5%, y se dializó hasta un
contenido del tampón de 3,5 g/l de NaCl, 5,8 g/l de citrato de
tri-Na x 2 H_{2}O, 20 g/l de glicina, de pH
7,0.
\newpage
Después de una diálisis se ultracentrifugó la
solución durante 60 min a 30.000xg. El material sobrenadante se
decantó después de la ultracentrifugación, se filtró en condiciones
estériles y se envasó.
Después de una liofilización y una
reconstitución con WFI, estaba a disposición un concentrado que, en
comparación con el vWF:Ag, tenía una concentración más baja de
vWF:RCoF.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En cada caso 200 ml de un material sobrenadante
de cultivo, que contenía 100 UI de FVIII:C recombinante, se
mezclaron en 3 tandas (A, B, C) con un concentrado plasmático de
factor de von Willebrand, que contenía 78 UI/ml de vWF:RCoF, 80
UI/ml de vWF:Ag y trazas de FVIII:C. La solución de cultivo se
ajustó a 1,6 g/l de NaCl y a 124 g/l de glicina. Las tandas se
mezclaron en cada caso con 150 ml del medio de precipitación con la
siguiente composición de glicina y de NaCl, y se agitó:
El precipitado formado se separó por
centrifugación en una centrífuga a 30.000xg durante 60 minutos. El
precipitado obtenido se disolvió con un tampón de disolución
(tampón de disolución: 1,46 g de NaCl, 10,14 g de glicina,
500 ml de WFI, de pH 7,0) y se analizó.
500 ml de WFI, de pH 7,0) y se analizó.
Aquí también se pudo observar que, con el mismo
contenido de NaCl y con una concentración más baja de glicina,
precipitaron primero predominantemente multímeros de alto peso
molecular con actividad de FVIII:C.
A partir de esto se podía reconocer que también
en el material sobrenadante del cultivo, que puede contener tanto
FVIII:C recombinante como también vWF plasmático, mediante un ajuste
correspondiente del equilibrio con NaCl y glicina, se pudo
conseguir una distribución de los multímeros de vWF en cuanto a los
tamaños.
\vskip1.000000\baselineskip
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Kotitschke, Michael Kloft.
Claims (9)
1. Concentrado de un factor de von Willebrand
que contiene el factor VIII:C, que tiene una relación de la
actividad de las unidades de vWF:RCoF a las unidades de vWF:Ag mayor
que 1, caracterizado porque se puede obtener mediante un
procedimiento, en el que un líquido que contiene el factor VIII:C y
el factor de von Willebrand es sometido a una precipitación
fraccionada, que incluye las siguientes etapas:
- 1)
- precipitación mediante glicina en una concentración de 0,93 a 2,13 mol/l (de 70 a 160 g/l) y
- 2)
- precipitación mediante cloruro de sodio en una concentración de 1,17 a 2,74 mol/l (de 100 a 160 g/l).
2. Concentrado de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque se obtiene a partir de un plasma
humano, de una fracción de plasma, preferiblemente de un precipitado
criogénico o de un material celular modificado por tecnología
genética.
3. Medicamento para el tratamiento de la
hemofilia A y del síndrome de von Willebrand, caracterizado
porque contiene un concentrado de las reivindicaciones 1 a 2.
4. Medicamento de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizado porque como estabilizador contiene iones de
calcio.
5. Medicamento de acuerdo con las
reivindicaciones 3 y 4, caracterizado porque la precipitación
se lleva a cabo (1) mediante glicina en una concentración de 0,93 a
1,46 mol/l (de 70 a 110 g/l).
6. Procedimiento para la preparación de un
concentrado de un factor de von Willebrand que contiene el factor
FVIII:C, caracterizado porque un líquido que contiene el
factor FVIII:C y el factor de von Willebrand es sometido a una
precipitación fraccionada, que incluye las siguientes etapas:
- 1)
- precipitación mediante glicina en una concentración de 0,93 a 2,13 mol/l (de 70 a 160 g/l) y
- 2)
- precipitación mediante cloruro de sodio en una concentración de 1,17 a 2,74 mol/l (de 100 a 160 g/l).
7. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, caracterizado porque mediante el ajuste de
las concentraciones de glicina y de NaCl se regula la cantidad de
los multímeros del factor de von Willebrand y por consiguiente
también la actividad del cofactor de ristocetina en el concentrado,
precipitando preferiblemente, a unas concentraciones bajas, los
multímeros de alto peso molecular, y a unas concentraciones más
altas, los multímeros de bajo peso molecular.
8. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 6 a 7, caracterizado porque el concentrado,
o un producto precursor que resulta en el caso de su preparación,
es estabilizado y pasteurizado.
9. Procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque para la
absorción del complejo de protrombina incluido en pequeñas
cantidades, un precipitado criogénico disuelto se mezcla con una
suspensión de hidróxido de aluminio, luego se agita y se separa, el
fibrinógeno se precipita con glicina y se separa, y a continuación
se precipita el complejo de vWF y FVIII:C, el cual, después de una
disolución, una estabilización y una pasteurización, es sometido a
una precipitación fraccionada de acuerdo con la reivindicación
6.
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