ES2555684T3

ES2555684T3 - Preparación de un preparado de factor de von Willebrand usando hidroxilapatita

Info

Publication number: ES2555684T3
Application number: ES05791971.4T
Authority: ES
Inventors: Michael Kretschmar; Wolfgang Möller
Original assignee: Biotest AG
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 2004-09-14
Filing date: 2005-09-09
Publication date: 2016-01-07
Anticipated expiration: 2025-09-09
Also published as: EP1789444A1; DE102004044419B4; US7939643B2; WO2006029773A1; EP1789444B1; US20070299250A1; DE102004044419A1

Abstract

Procedimiento para la purificación de VWF, caracterizado porque (i) una composición que contiene VWF y una o varias proteínas contaminantes se pone en contacto con una matriz de hidroxilapatita de modo que al menos una proteína contaminante se une a la matriz de hidroxilapatita, mientras que VWF esencialmente no se une a la matriz de hidroxilapatita, y dado el caso (ii) se separa VWF no unido de la matriz de hidroxilapatita.

Description

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DESCRIPCION

Preparacion de un preparado de factor de von Willebrand usando hidroxilapatita

La invencion se refiere a un procedimiento para la purificacion del factor de von Willebrand, realizandose al menos una cromatograffa de flujo continuo con hidroxilapatita, en la que no se une VWF esencialmente, mientras que se unen protemas contaminantes al medio de cromatograffa.

El factor de von Willebrand es una glicoprotema que se sintetiza en celulas endoteliales y megacariocitos. El peso molecular del monomero asciende a aproximadamente 225.000 Da. Mediante formacion de puentes disulfuro se forman dfmeros en la celula, que a su vez se asocian para dar oligomeros de hasta 40 subunidades dimericas igualmente a traves de enlaces disulfuro. La concentracion del factor de von Willebrand (VWF) emitido al plasma asciende a de 5 -10 mg/l.

En la hemostasia primaria, el VWF tiene el objetivo de mediar la adhesion de trombocitos al subendotelio lesionado y fomentar la agregacion de trombocitos en condiciones de altas fuerzas de cizallamiento, tal como en el sistema arterial. Como funcion en la hemostasia secundaria, VWF une el factor VIII, un cofactor importante en la coagulacion de la sangre, en un complejo no covalente. El factor VIII se estabiliza debido a ello y se protege frente a la degradacion prematura.

El smdrome de von Willebrand (VWS) es una hemofilia que se produce mediante la modificacion cuantitativa o cualitativa del VWF. Con una prevalencia del 0,8 - 1,3 % es el vWs la hemofilia hereditaria mas frecuente. Esta afecta, a diferencia de la hemofilia A, de igual manera a hombres y mujeres. El VWS se clasifica en distintos tipos: los pacientes del tipo 1 presentan un nivel en sangre de VWF mas bajo. En el VWS tipo 2 estan englobados todos los defectos cualitativos del VWF en el plasma. Pueden aparecer alteraciones en la hemostasia primaria y/o secundaria. En pacientes del tipo 3 falta completamente el VWF. Algunos subtipos del tipo 2 y del tipo 3 se designan como forma grave del VWS. En la forma grave del VWS son necesarias terapias de sustitucion con preparados que contienen VWF.

Con frecuencia, para el tratamiento de la forma grave del VWS se usan preparados plasmaticos del factor VIII que contienen una proporcion relativamente alta de VWF. Si bien con ello pueden cortarse hemorragias, sin embargo al mismo tiempo aumenta el riesgo de trombosis, especialmente con el uso frecuente o prolongado. Esto se debe a una sobredosificacion del factor VIII. Es esencialmente favorable en el sentido de la seguridad del paciente el tratamiento de enfermedades de VWS con concentrados de VWF muy puros, libres de o con bajo contenido de factor VIII.

En la bibliograffa se han descrito distintos procedimientos para la purificacion y obtencion de VWF:

El documento EP-A-0 416 983 da a conocer la obtencion de un complejo de VWF-factor VIII a partir de plasma humano mediante precipitacion con una combinacion de cloruro de bario e hidroxido de aluminio y cromatograffa de intercambio de aniones posterior en Fractogel DEAE.

El documento EP 0 469 985 describe un procedimiento, en el que se obtiene VWF de crioprecipitado usando un intercambiador de aniones. A este respecto se une el factor VIII a una concentracion salina de 250 mM, mientras que VWF permanece en el sobrenadante. El sobrenadante se une tras la reduccion de la concentracion salina hasta 100 - 150 mM a un segundo intercambiador de aniones y se eluye con NaCl 300 - 350 mM.

En el documento EP 0 503 991 se describe la purificacion de VWF de crioprecipitado humano mediante un procedimiento de 3 etapas: 1. Cromatograffa de intercambio de aniones con Fractogel DEAE y elucion del VWF mediante NaCl 0,15 M. 2. Nueva cromatograffa en Fractogel DEAE y elucion del VWF mediante NaCl 0,17 M. 3. Separacion de fibronectina y fibrinogeno mediante cromatograffa de afinidad en gelatina-sefarosa. VWF se encuentra a este respecto en el flujo continuo. Como tampon se usan soluciones que contienen iones calcio y aminoacidos.

El documento WO 89/12065 describe la separacion de protemas plasmaticas de crioprecipitados de plasma mediante union de las protemas en Fractogel DEAE y elucion gradual mediante adicion creciente de NaCl. El procedimiento es adecuado en particular para la obtencion de concentrados del factor VIII, asf como para la preparacion de concentrados de fibrinogeno, fibronectina y VWF.

El documento WO 96/10584 describe un procedimiento para la obtencion de VWF recombinante muy puro por medio de cromatograffa combinada de intercambio de aniones/de afinidad con heparina y el documento EP 0 705 846 describe la separacion de fracciones de alto y bajo peso molecular de VWF recombinante por medio de cromatograffa de afinidad con heparina.

El documento WO 98/38219 describe un procedimiento para la obtencion de VWF, en el que el VWF con una concentracion salina baja se une a un intercambiador de cationes y mediante elucion fraccionada se obtiene VWF con actividad espedfica alta.

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En “The factor VIII / von Willebrand factor complex: basic and clinical issues”, Augusto B. Federici, Haematologica vol. 88 (suplemento 9) se describen composiciones que contienen VWF.

El documento US 5.128.245 describe el uso de hidroxiapatita para la purificacion de VWF.

En “studies on the structure and subunit composition of human antihaemophilic factor”, J. J. Gorman, Thrombosis Research, vol. 12, n.° 2, 1978 se describe un procedimiento para la purificacion del complejo de factor VIII-VWF mediante union del complejo a hidroxilapatita.

En “Chromatography of vWF on dextran sulphate sepharose”, R.H. Saundry, Thrombosis research vol. 48, n.° 6, 1987 se describe un procedimiento para la purificacion de VWF con ayuda de dextranosulfato-agarosa.

Los procedimientos descritos hasta ahora tienen inconvenientes. Una cromatograffa de intercambio de aniones presenta una resolucion no satisfactoria. Para la obtencion de un preparado muy puro es necesaria por regla general una combinacion con una cromatograffa de afinidad. Las cromatograffas de afinidad son a su vez caras. En la combinacion de cromatograffa de intercambio de aniones y de intercambio de cationes se obtuvieron para un preparado de VWF plasmatico actividades espedficas de como maximo 83 E/mg de protema. Igualmente, en un procedimiento en el que se usaron para la purificacion de un VWF recombinante la cromatograffa de intercambio de aniones, cromatograffa de inmunoafinidad y cromatograffa de intercambio de cationes, se consiguio una actividad espedfica de solo 59,2 E/mg de protema.

Un objetivo de la presente invencion es poner a disposicion un procedimiento de preparacion sencillo, eficaz, con el que pueda prepararse de manera economica un preparado de VWF muy puro, esencialmente libre de factor VIII con una alta actividad espedfica.

Sorprendentemente se encontro que una etapa de cromatograffa con hidroxilapatita como matriz de cromatograffa muestra resultados ventajosos. Se determino sorprendentemente que hidroxilapatita puede usarse no solo como cromatograffa de union, en la que se une VWF y las impurezas permanecen no unidas o se eluyen en otra etapa, sino tambien como cromatograffa de flujo continuo, en la que VWF no unido fluye a traves de la columna y las impurezas se unen.

De acuerdo con la invencion se usa por tanto hidroxilapatita como medio de cromatograffa de flujo continuo para la purificacion del VWF. La presente invencion se refiere a un procedimiento para la purificacion de VWF, caracterizado porque se realiza al menos una cromatograffa con hidroxilapatita, en la que no se une VWF esencialmente, mientras que las protemas contaminantes se absorben en el medio de cromatograffa.

Preferentemente se une menos del 30 %, mas preferentemente menos del 25 %, aun mas preferentemente menos del 20 %, lo mas preferentemente menos del 10 % del VWF existente en la solucion de carga a la matriz de hidroxilapatita.

La hidroxilapatita es una forma de fosfato de calcio con la composicion Ca5(PO4)3OH o Ca1o(PO4)6OH2, que puede usarse como fase estacionaria para la cromatograffa de protemas, acido nucleicos y otras macromoleculas. Ademas de la forma cristalina de la hidroxilapatita puede usarse tambien una forma ceramica que puede obtenerse mediante sinterizacion. La hidroxilapatita puede adquirirse por ejemplo por la empresa Bio-Rad (Munich, Alemania). Su hidroxilapatita ceramica se pone a disposicion en dos formas (tipo 1 y tipo 2). El material tipo 1 tiene debido a superficies mas grandes una capacidad de union mas alta para moleculas mas pequenas, por ejemplo protemas pequenas. Por el contrario, el material tipo 2 presenta poros mas grandes en las parffculas, que permite una introduccion y con ello una mejor union de moleculas grandes, por ejemplo ADN o protemas grandes. Los materiales presentan preferentemente las siguientes propiedades:

Tabla 1

: Capacidad de union dinamica Diametro de poro nominal

Tipo 1: >13,7 mg de lisozima/ml de CHT* 600-800 A

Tipo 2: >6,8 mg de lisozima/ml de CHT* 800-1000 A

*CHT= ceramic hydroxy apatite

La hidroxilapatita cristalina o ceramica esta libremente disponible. En el estado de la tecnica se conocen procedimientos para su preparacion.

El procedimiento de acuerdo con la invencion comprende que (i) se lleve a contacto una composicion que contiene VWF y una o varias protemas contaminantes con una matriz de hidroxilapatita, de modo que al menos una protema contaminante se une a la matriz de hidroxilapatita, mientras que VWF no se une esencialmente a la matriz de hidroxilapatita, y dado el caso a continuacion (ii) se separa VWF no unido de la matriz de hidroxilapatita. Esta forma

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de realizacion se designa en la presente solicitud como “cromatograffa de flujo continuo”.

El procedimiento puede realizarse en forma de una cromatograffa en columna o en el procedimiento discontinuo; se prefiere la realizacion de una cromatograffa en columna. En el caso de una cromatograffa en columna se encuentra VWF en el flujo continuo y al menos una protema contaminante, por ejemplo fibronectina y/o fibrinogeno, se une a la hidroxilapatita. La cromatograffa con hidroxilapatita se realiza de acuerdo con esta forma de realizacion con un valor de pH de 6,5 a 8,5, preferentemente de 6,8 a 8,5, mas preferentemente de 6,8 a 7,5, lo mas preferentemente de 7,0 a 7,5. Habitualmente tienen el mismo valor de pH el tampon de migracion, de lavado y de elucion, asf como la solucion de protemas que va a cargarse. Sin embargo son practicables tambien variantes en las que estas soluciones presentan distintos valores de pH.

La composicion que contiene VWF, que se pone en contacto con la matriz de hidroxilapatita, contiene preferentemente fosfato de sodio y/o fosfato de potasio. La concentracion total de fosfato de sodio y/o de fosfato de potasio en la solucion es por ejemplo de 0 a 100 mM, preferentemente de 10 a 50 mM, los mas preferentemente de 20 a 40 mM, es decir como tampon de migracion puede usarse una solucion de tampon con las concentraciones mencionadas.

La solucion que contiene VWF, por ejemplo una solucion de crioprecipitado previamente purificada, se carga en una columna de hidroxilapatita con una concentracion salina baja de fosfato de sodio o de potasio 0 - 100 mM, preferentemente a 10 - 50 mM, con un pH de preferentemente 6,8 a 8,5, de manera especialmente preferente con un pH de 7,0 - 7,5. La hidroxilapatita es en esta forma de realizacion preferentemente hidroxilapatita ceramica, de manera especialmente preferente del tipo 1, tal como se comercializa por Bio-Rad (Munich, Alemania). Con estas condiciones no se une la mayor parte de las moleculas de VWF a la matriz y se encuentra en el flujo continuo, mientras que las protemas contaminantes, tales como por ejemplo fibrinogeno o fibronectina, se unen en gran parte a la matriz.

Mediante la cromatograffa de flujo continuo de acuerdo con la invencion pueden obtenerse preparaciones de VWF que contienen solo bajas cantidades de fibrinogeno y fibronectina. Por regla general, la concentracion de anffgeno de fibrinogeno en la fraccion de flujo continuo es menor de 25 |ig/ml, preferentemente menor de 15 |ig/ml, preferentemente menor de 10 |ig/ml, lo mas preferentemente como maximo 5 |ig/ml. La concentracion de anffgeno de fibronectina en la fraccion de flujo continuo es habitualmente menor de 250 |ig/ml, preferentemente menor de 150 |ig/ml, mas preferentemente menor de 100 |ig/ml, lo mas preferentemente como maximo 50 |ig/ml. La concentracion de anffgeno de fibrinogeno y de anffgeno de fibronectina puede determinarse mediante procedimientos en sf conocidos, por ejemplo tal como se describen en los ejemplos de la presente solicitud. El empobrecimiento de fibronectina y fibrinogeno se recomienda en particular debido a que estas protemas pueden originar problemas tecnicos del procedimiento debido a su tendencia a la agregacion, por ejemplo en filtraciones. La fibronectina y el fibrinogeno en productos finales liofilizados impiden con frecuencia la solubilidad completa de un preparado.

Cuando la solucion de carga que se pone en contacto con la matriz de hidroxilapatita contiene fibrinogeno y/o fibronectina (por ejemplo porque se trata de una fraccion de plasma), puede conseguirse un empobrecimiento considerable de las protemas contaminantes fibrinogeno y fibronectina. Asf, la concentracion de fibrinogeno en la fraccion de flujo continuo es preferentemente menor del 10 %, mas preferentemente menor del 5 %, aun mas preferentemente menor del 2,5 % de la concentracion de fibrinogeno en la solucion de carga (antes de la cromatograffa de flujo continuo). La concentracion de fibronectina en la fraccion de flujo continuo es preferentemente menor del 10 %, mas preferentemente menor del 5 %, aun mas preferentemente menor del 2,5 % de la concentracion de fibronectina en la solucion de carga (antes de la cromatograffa de flujo continuo).

El rendimiento de la cromatograffa de flujo continuo (con respecto al equilibrio de masas) es por regla general mayor del 50 %, preferentemente mayor del 60 %, lo mas preferentemente mayor del 75 %.

La actividad espedfica (actividad de cofactor de ristocetina por mg de protema total) puede elevarse mediante la cromatograffa de flujo continuo en al menos el 100 %, preferentemente en al menos el 150 %, lo mas preferentemente en al menos el 200 %.

Para una purificacion fina puede unirse VWF a una matriz de hidroxilapatita y a continuacion eluirse. Esta forma de aplicacion se designa como “cromatograffa de union”. Habitualmente, la cromatograffa de union comprende que

(a) VWF se una a la matriz de hidroxilapatita,

(b) las impurezas se separen por lavado con concentracion salina mas baja y

(c) a continuacion se eluya la fraccion de valor que contiene VWF a concentracion salina mas alta.

En la etapa (a) se pone en contacto una solucion que contiene VWF y una o varias protemas contaminantes, con la matriz de hidroxilapatita. La concentracion total de fosfato de sodio y/o de potasio en esta solucion es habitualmente de 0 a 200 mM, preferentemente de 1 a 100 mM, mas preferentemente de 1 a 50 mM, lo mas preferentemente de 10 a 30 mM.

En la etapa de lavado (b) se lava la matriz de hidroxilapatita con un tampon de baja concentracion salina. La concentracion total de fosfato de sodio y/o de potasio en este tampon de lavado es por regla general de 100 a 300

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mM, preferentemente de 150 a 250 mM, lo mas preferentemente de 180 a 240 mM.

En la etapa (c) puede eluirse la fraccion de valor que contiene VWF con un tampon de concentracion salina mas alta. El tampon de elucion contiene por regla general fosfato de sodio y/o de potasio de 200 a 500 mM, preferentemente de 250 a 400 mM.

Mediante desplazamiento de las concentraciones salinas pueden modificarse el rendimiento y la pureza. Cuanto mas alta sea la concentracion salina en el tampon de lavado, mas pura es la fraccion de valor obtenida. Sin embargo debido a ello se reduce el rendimiento. Ademas, el valor de pH seleccionado influye en la concentracion salina optima para el tampon de lavado. Cuanto mas bajo sea el valor de pH, mas fuerte es la union de VWF a la matriz de hidroxilapatita. De manera correspondiente, las concentraciones salinas seleccionadas pueden ser mas altas con valores de pH bajos, por el contrario pueden ser mas bajas con valores de pH mas altos.

La cromatograffa de union con hidroxilapatita se realiza con un valor de pH de 5 a 7,5, preferentemente de 5,5 a por debajo de 6,8, lo mas preferentemente de 6,0 a 6,5. Habitualmente tienen el mismo valor de pH el tampon de migracion, de lavado y de elucion, asf como la solucion de protemas que va a cargarse. Sin embargo son practicables tambien variantes en las que estas soluciones presentan distintos valores de pH.

En esta forma se carga la solucion que contiene VWF, por ejemplo una solucion de crioprecipitado previamente purificada, con una concentracion salina baja, preferentemente fosfato de potasio o de sodio 0 -100 mM, de manera especialmente preferente a 10 - 30 mM, con un valor de pH de 5,5 - 6,8, preferentemente de 6,0 - 6,5, en una columna de hidroxilapatita, por ejemplo hidroxilapatita ceramica tipo 2. La mayor parte de las moleculas de VWF se une en estas condiciones. Mediante lavado con una solucion con concentracion salina mas alta con por ejemplo fosfato de potasio o de sodio, por ejemplo fosfato de sodio 230 mM pH 6,0, pueden separarse por lavado impurezas, por ejemplo fibronectina. La fraccion de valor se eluye a continuacion con soluciones salinas muy concentradas, por ejemplo soluciones de fosfato, tales como por ejemplo fosfato de sodio 400 mM pH 6,0.

Mediante la cromatograffa de union, a partir de las fracciones de VWF purificadas mediante la cromatograffa de flujo continuo pueden obtenerse preparaciones de VWF que ya no contienen practicamente ninguna cantidad detectable de fibrinogeno ni de fibronectina. Cuando la solucion de carga que se pone en contacto con la matriz de hidroxilapatita es una fraccion de plasma y/o contiene fibrinogeno o fibronectina, puede conseguirse una eliminacion practicamente cuantitativa de las protemas contaminantes, fibrinogeno y fibronectina, de la solucion. Asf, la concentracion de fibrinogeno en la fraccion de elucion es preferentemente menor del 25 % de la concentracion de fibrinogeno en la solucion de carga (antes de la cromatograffa de union). La concentracion de fibronectina en la fraccion de elucion es preferentemente menor del 10 %, mas preferentemente menor del 5 % de la concentracion de fibronectina en la solucion de carga (antes de la cromatograffa de union). Las concentraciones de fibrinogeno o fibronectina en la fraccion de elucion (fraccion de valor) estan por regla general por debajo del ffmite de deteccion de aproximadamente 1 |ig/ml.

Mediante una cromatograffa de union realizada a continuacion de la cromatograffa de flujo continuo de acuerdo con la invencion pueden obtenerse preparaciones de VWF con alta actividad espedfica. La actividad espedfica en la fraccion de elucion puede ser superior a 50 E/mg de protema, preferentemente esta es superior a 75 E/mg de protema, mas preferentemente superior a 85 E/mg de protema, lo mas preferentemente al menos 100 E/mg de protema. La actividad de VWF se determina con el ensayo de cofactor de ristocetina, que determina la capacidad de union de VWF al receptor plaquetario glicoprotema Ib/IX bajo la influencia del antibiotico ristocetina. La actividad de VWF espedfica puede determinarse tal como se describe en los ejemplos.

Para la preparacion de un preparado de VWF especialmente puro pueden combinarse entre sf la cromatograffa de flujo continuo con hidroxilapatita de acuerdo con la invencion y la cromatograffa de union con hidroxilapatita o con otras tecnicas de purificacion. Como especialmente adecuado se ha mostrado concretamente realizar en primer lugar, segun el procedimiento anteriormente descrito, una cromatograffa de flujo continuo con hidroxilapatita para el empobrecimiento de las impurezas principales. A continuacion se titula la fraccion de valor por ejemplo con HCl 1 M hasta 6,0. La muestra se carga, tal como se describe para la cromatograffa de union, en una columna de hidroxilapatita. Las moleculas de VWF se unen y se eluyen selectivamente.

En una forma de realizacion especial se realiza por tanto en primer lugar una cromatograffa de flujo continuo con hidroxilapatita, no uniendose vWf a la matriz de hidroxilapatita y a continuacion se cromatograffa de nuevo la fraccion de flujo continuo en condiciones de union y se eluye la fraccion de VWF.

Los rendimientos de las etapas se encuentran entre el 65 % y el 85 %, lo que es muy bueno en cuanto a la alta efectividad de purificacion. Para la cromatograffa de flujo continuo es conveniente, sin embargo no necesario, usar iones fosfatos como sustancia tampon. Para la elucion de VWF en la cromatograffa de union es fosfato un agente espedfico.

En una forma de realizacion especial, en lugar de hidroxilapatita pura como matriz de cromatograffa puede usarse fluoroapatita. La fluoroapatita se prepara mediante reaccion de hidroxilapatita con una sustancia que contiene fluoruro. La empresa Bio-Rad (Munich, Alemania) genera por ejemplo fluoroapatita ceramica mediante una conversion al 90 % de hidroxilapatita ceramica con un reactivo de fluoruro. La fluoroapatita es en comparacion con la

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hidroxilapatita claramente mas estable en condiciones de pH acidas. Por lo tanto se usa fluoroapatita habitualmente para realizar cromatograffas a pH mas bajo que para hidroxilapatita tecnicamente conveniente. Para una purificacion de moleculas de VWF con fluoroapatita puede realizarse la cromatograffa de manera similar al procedimiento propuesto para hidroxilapatita. Las concentraciones salinas deben adaptarse al valor de pH seleccionado (>= 5,0).

El procedimiento de acuerdo con la invencion puede comprender ademas una o varias de las siguientes etapas:

(1) congelacion ultrarrapida a una temperatura inferior a -30 °C y descongelacion proxima a 0 °C (crioprecipitacion)

(2) precipitacion con etanol o adsorcion en hidroxido de aluminio

(3) inactivacion de virus de la composicion que contiene VWF mediante tratamiento con disolventes/detergentes

(4) cromatograffa de intercambio de aniones

(5) precipitacion de fibronectina mediante ajuste de un valor de pH inferior a pH 5,4

(6) cromatograffa de afinidad

(7) diafiltracion o ultrafiltracion

(8) intercambio de tampon mediante dialisis o filtracion en gel

(9) esterilizacion por filtracion

(10) liofilizacion

(11) inactivacion de virus mediante tratamiento con calor (por ejemplo durante aproximadamente 30 min a aproximadamente 100 °C)

Las etapas de procedimiento (1) a (5) se realizan preferentemente antes de la cromatograffa con hidroxilapatita. Sin embargo pueden realizarse tambien menos de las 5 etapas de procedimiento. El orden de las etapas no es obligatorio.

Las etapas (6) a (11) pueden realizarse, en caso deseado. En particular la cromatograffa de afinidad no es sin embargo necesaria, dado que puede obtenerse ya mediante la cromatograffa con hidroxilapatita una alta pureza.

Como material de partida para los procedimientos de la presente invencion puede usarse por consiguiente una fraccion de plasma previamente purificada. Segun esto puede tratarse de una solucion de crioprecipitado adicionalmente purificada. La solucion de crioprecipitado puede hacerse precipitar por ejemplo con hidroxido de aluminio y/o puede purificarse adicionalmente mediante cromatograffa. Asf puede hacerse precipitar la solucion de crioprecipitado, por ejemplo, con hidroxido de aluminio y a continuacion puede purificarse adicionalmente por medio de cromatograffa de intercambio de aniones. Es igualmente preferente que la solucion de crioprecipitado se someta a una inactivacion de virus. Un procedimiento preferente para la inactivacion de virus es un tratamiento con disolventes/detergentes, tal como se ha descrito en la patente US n.° 4.540.573.

Como material de partida puede usarse igualmente una solucion de protemas que contiene VWF recombinante (rVWF) de sobrenadantes de cultivo celular. La expresion “rVWF” comprende tambien variantes con una secuencia de aminoacidos modificadas con respecto a VWF de tipo natural, pudiendose sustituir, deleccionar y/o anadir uno o varios aminoacidos. Las variantes presentan por regla general actividad de VWF. Los procedimientos para la preparacion de vectores de expresion adecuados, para la infiltracion de los vectores en las celulas huesped y para el cultivo de las celulas huesped se conocen en sf por el experto (Fischer et al. Structural analysis of recombinant von Willebrand factor: identification of hetero and homo-dimers. FEBS Lett 1994; 351:345-348. Fischer et al. Structural analysis of recombinant von Willebrand factor produced at industrial scale fermentation of transformed CHO cells coexpressing recombinant furin. FEBS Lett 1995; 375:259-262).

En particular con el uso de fracciones de plasma puede realizarse antes de la cromatograffa con hidroxilapatita una precipitacion con pH para la separacion de fibronectina. La precipitacion con pH para la separacion de fibronectina de una fraccion de plasma comprende por ejemplo que

(i) se ajuste el valor de pH de la fraccion de plasma hasta por debajo de pH 5,4, de modo que se forme un precipitado y

(ii) se separe el precipitado formado.

La expresion “fraccion de plasma” designa en este contexto una composicion que se obtuvo del plasma y contiene distintas protemas plasmaticas. La fraccion de plasma que se usa como composicion de partida en la etapa (i) es una composicion ffquida. Preferentemente, la composicion ffquida es una solucion o una suspension, lo mas preferentemente la composicion es una solucion. En una forma de realizacion especial, la fraccion de plasma es crioprecipitado disuelto. Este crioprecipitado disuelto puede estar previamente purificado mediante distintos procedimientos. Los ejemplos son tratamiento con hidroxido de aluminio, tratamiento con disolventes/detergentes y/o cromatograffa de intercambio de aniones. La concentracion de cloruro de sodio o cloruro de potasio en la fraccion de plasma es preferentemente de 50 a 250 mM, mas preferentemente de 100 a 200 mM, lo mas preferentemente de 120 a 150 mM. La fraccion de plasma puede contener por ejemplo las siguientes sustancias tampon: iones citrato, iones acetato, iones fosfato y/o aminoacidos.

La concentracion de fibronectina en la fraccion de plasma que se somete a la etapa (i) es por regla general al menos 0,05 g/l, preferentemente al menos 0,1 g/l, aun mas preferentemente al menos 0,25 g/l, lo mas preferentemente al

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menos 0,5 g/l. La concentracion de fibronectina en la fraccion de plasma puede ser por ejemplo de 0,1 a 5 g/l, preferentemente de 0,1 a 2 g/l.

Para la separacion de fibronectina de la fraccion de plasma se ajusta el valor de pH de la fraccion de plasma hasta por debajo de pH 5,4. A este respecto se forma un precipitado que contiene fibronectina. Preferentemente se ajusta el valor de pH hasta por debajo de pH 5,3, aun mas preferentemente hasta por debajo de pH 5,2. El valor de pH ajustado se encuentra por consiguiente preferentemente en un intervalo de pH 4,5 hasta por debajo de 5,4, preferentemente en un intervalo de pH 4,7 a 5,3, mas preferentemente en un intervalo de pH 4,8 a 5,2, aun mas preferentemente en un intervalo de pH 4,9 a 5,1. Por regla general se consigue el ajuste del valor de pH mediante adicion de un componente acido. Como componente acido pueden usarse distintos acidos, por ejemplo acido clorlddrico, acido fosforico o acido acetico. El componente acido se anade habitualmente durante un determinado espacio de tiempo, por ejemplo gota a gota. Por consiguiente se ajusta (“se titula”) paulatinamente un valor de pH en el intervalo definido en mas detalle anteriormente.

Durante y tras el ajuste del valor de pH se mantiene la fraccion de plasma preferentemente en movimiento o se mezcla, por ejemplo mediante agitacion. Se prefiere ademas que tras el ajuste del valor de pH se mezcle adicionalmente la fraccion de plasma durante un determinado espacio de tiempo (por ejemplo mediante agitacion), en general durante al menos 10 minutos, preferentemente durante al menos 20 minutos, lo mas preferentemente durante un espacio de tiempo de 30 a 90 minutos. En este espacio de tiempo se forman agregados pegajosos que conservan fibronectina en una proporcion considerable. Por tanto esta previsto de acuerdo con una forma de realizacion preferente que se use un agitador adecuado, por ejemplo un agitador de anclas cruzadas o agitador de paletas, en cuya pala agitadora se pega el precipitado. La fibronectina precipitada puede extraerse por consiguiente facilmente de la solucion.

La precipitacion con pH para la separacion de fibronectina puede realizarse en un amplio espectro de temperatura, por ejemplo de aproximadamente 1 °C a aproximadamente 37 °C. Los intervalos de temperatura preferentes son de 4 °C a 35 °C, mas preferentemente de 10 °C a 30 °C, de la manera mas preferentemente se realiza el procedimiento a de 20 °C a 25 °C.

Mediante la precipitacion con pH para la separacion de fibronectina de fracciones de plasma puede reducirse la concentracion de fibronectina en la fraccion de plasma en al menos el 50 %. Preferentemente se reduce la concentracion de fibronectina en la fraccion de plasma en del 70 % al 99 %, mas preferentemente en del 80 % al 99 %, lo mas preferentemente en del 90 % al 98 % o en del 95 % al 98 %. En una forma de realizacion especial se encuentra la perdida de VWF en la etapa de precipitacion en como maximo el 50 %, preferentemente en como maximo el 40 %, mas preferentemente en como maximo el 30 %, aun mas preferentemente en como maximo el 20 %, lo mas preferentemente en como maximo el 10 %.

Otro aspecto de la presente divulgacion es una composicion que contiene VWF, que puede obtenerse mediante un procedimiento de acuerdo con la invencion, tal como se ha descrito en esta solicitud. Preferentemente se trata de una preparacion de VWF esencialmente pura. “Esencialmente pura” significa que la proporcion de protemas de la composicion contiene al menos el 70 % de moleculas de VWF.

Mediante el procedimiento de acuerdo con la invencion pueden conseguirse sin purificacion fina actividades espedficas de > 60 E por mg de protema y con purificacion fina de >100 E por mg de protema. La solucion de protemas puede someterse a continuacion a un cambio de tampon y liofilizarse. Opcionalmente son posibles tambien otras etapas de inactivacion de virus, tal como por ejemplo la incubacion del liofilizado a 100 °C durante 30 minutos.

La hidroxilapatita, en particular en su forma estabilizada de manera ceramica es extraordinariamente adecuada para realizar procesos a escala industrial. Puede usarse por ejemplo para la separacion de fibronectina de fracciones de plasma que contienen VWF de manera esencialmente mas economica y mas reproducible que por ejemplo gelatina- sefarosa u otros medios de cromatograffa de afinidad. Debido a sus propiedades de separacion, la hidroxilapatita ofrece una mejor resolucion que los medios de cromatograffa de intercambio de iones descritos de manera reiterada. En el procedimiento de purificacion con hidroxilapatita no deben anadirse a los tampones ni calcio ni aminoacidos.

Dado que hidroxilapatita permite esencialmente velocidades de flujo mas altas y tiempos de permanencia mas largos que los medios de cromatograffa de afinidad usados con frecuencia, se pone a disposicion con este procedimiento un procedimiento de preparacion extraordinariamente economico para un preparado de VWF muy puro. La excelente capacidad de higienizacion del material con por ejemplo NaOH 1 M conduce ademas a una seguridad del producto optima.

Las diversas formas de realizacion descritas en esta solicitud pueden combinarse entre sf.

Los siguientes ejemplos explican en mas detalle la invencion.

Ejemplo 1: purificacion de una fraccion de plasma que contiene VWF por medio de cromatografia de flujo continuo con hidroxilapatita

La solucion de protemas que contiene VWF recorrio las siguientes etapas de purificacion previa, tal como se describen por ejemplo en el documento WO 9315105 A1: una solucion de crioprecipitado se sometio a una 5 precipitacion de hidroxido de aluminio. A continuacion se realizo una inactivacion de virus por medio de tratamiento con disolventes/detergentes. Durante la siguiente cromatografia de intercambio de aniones se produjo una fraccion de lavado que contema VWF, que estaba impurificada sobre todo con fibrinogeno y fibronectina. La solucion de protemas se sometio mediante titulacion hasta pH 5,2 a una etapa de precipitacion, en la que se separo una gran parte de la fibronectina y del fibrinogeno. A continuacion se realizo una ultrafiltracion y diafiltracion, concentrandose 10 la solucion de protemas aproximadamente 7 veces y diafiltrandose frente al tampon de migracion de la siguiente cromatografia. La solucion de protemas asf obtenida contema aproximadamente 930 |ig/ml de anfigeno de VWF, 270 |ig/ml de anfigeno de fibrinogeno y 2400 |ig/ml de anfigeno de fibronectina. La solucion de protemas se cargo en una columna de hidroxilapatita equilibrada en fosfato de Na 10 mM pH 7,0 (CHT tipo 1, Bio-Rad, Munich, Alemania). La fraccion de flujo continuo contema aproximadamente 560 |ig/ml de anfigeno de VWF, 5 |ig/ml de anfigeno de 15 fibrinogeno y 50 |ig/ml de anfigeno de fibronectina. El equilibrio de masas da como resultado un rendimiento de etapas del 78 % para el anfigeno de VWF. Debido a la muy buena efectividad de purificacion puede considerarse el rendimiento como excelente.

Tabla 2: purificacion de una fraccion de plasma que contiene VWF por medio de cromatografia de flujo continuo con

hidroxilapatita

: Anfigeno de VWF Anfigeno de fibrinogeno Anfigeno de fibronectina Rendimiento

Salida: 930 |ig/ml 270 |ig/ml 2400 |ig/ml

fraccion de flujo continuo: 560 |ig/ml 5 |ig/ml 50 |ig/ml 78 %

20

La concentracion de anfigeno de VWF se determino con ayuda de STA® Compact de la empresa Diagnostica Stago (Roche Diagnostics, Mannheim) y sus reactivos de ensayo (STA LIA vWF).

Para la determinacion de la cantidad de anfigeno de fibrinogeno y anfigeno de fibronectina se usaron procedimientos nefelometricos para la determinacion cuantitativa de la concentracion de anfigeno de fibrinogeno y de anfigeno de 25 fibrinogeno en Beckman-Array® 360 (Beckman Coulter, Monheim).

Ejemplo 2: purificacion fina usando una cromatografia de union con hidroxilapatita

Una solucion de protemas preparada segun el ejemplo 1 se titulo para la purificacion adicional hasta pH 6,0. A continuacion se cargo la solucion en una columna de hidroxilapatita (CHT tipo 1, Bio-Rad, Munich, Alemania), que se habfa equilibrado en el tampon de migracion (fosfato de sodio 20 mM pH 6,0). El VWF se unio cuantitativamente. 30 Una primera elucion se realizo con fosfato de sodio 230 mM pH 6,0, la segunda con fosfato de sodio 400 mM pH 6,0. La solucion de protemas cargada contema 540 |ig/ml de anfigeno de VWF, 4 |ig/ml de fibrinogeno y 48 |ig/ml de fibronectina. La primera fraccion de elucion contema 38 |ig/ml de anfigeno de VWF, 2 |ig/ml de anfigeno de fibronectina. La concentracion de anfigeno de fibrinogeno se encontraba por debajo del fimite de deteccion de 1 |ig/ml. La fraccion de valor (2a fraccion de elucion) presentaba una concentracion de anfigeno de VWF de 173 |ig/ml. 35 No pudo detectarse ni anfigeno de fibrinogeno, ni anfigeno de fibronectina. La actividad de VWF ascendfa a 23 E/ml, la concentracion de protema total (DO280nm) a 0,23 mg/ml. Se consiguio una actividad espedfica de 100 E / mg de protema.

Tabla 3: purificacion fina usando una cromatografia de union con hidroxilapatita

: Anfigeno de VWF Anfigeno de fibrinogeno Anfigeno de fibronectina Actividad espedfica

Salida: 540 mg/ml 4 mg/ml 48 mg/ml 56 E/mg

Fraccion de elucion 1: 38 mg/ml n.d. 2 mg/ml 12 E/mg

Fraccion de elucion 2: 173 mg/ml n.d. n.d. 100 E/mg

La actividad de VWF se determino como actividad de cofactor de ristocetina por medio de la aglutinacion de plaquetas con el BCT®-Analyser (Behring Coagulation Timer, Dade Behring, Schwalbach).

La determinacion de protemas se realizo segun la ley de Lambert-Beer (A=£-c d), en la que

A= absorcion a 280 nm

5 £= coeficiente de absorcion (en este caso coeficiente de absorcion teorico 0,75 cm2/mg)

c= concentracion de protemas en mg/ml d= espesor de capa en cm.

Ejemplo 3: aumento de la actividad espedfica de una fraccion de plasma que contiene VWF previamente purificada por medio de cromatograffa de union con fluoroapatita

10 La solucion de partida se preparo de manera correspondiente al ejemplo 1. La solucion de protemas contema con una concentracion de protemas de 0,83 mg/ml una actividad espedfica de 64,8 E/mg. Mediante adicion de HCl se titulo la solucion de protema hasta un valor de pH de 6,0. A continuacion se cargo la solucion en una columna de fluoroapatita (CFT tipo 1, Bio-Rad, Munich, Alemania) con un volumen de lecho de gel de 13,2 ml, que se hada equilibrado en el tampon de migracion (fosfato de Na 20 mM pH 6,0). Una parte del VWF se unio. Una separacion de 15 impurezas se consiguio mediante una primera elucion con un tampon que contema fosfato de Na 241 mM pH 6,0 (fraccion de elucion 1). La fraccion de valor se eluyo a continuacion con fosfato de Na 400 mM pH 6,0. Mediante esta etapa cromatografica pudo elevarse la actividad espedfica hasta 77,0 E / mg de protema. Debido a la union mas debil de VWF en las condiciones de pH seleccionadas no tiene lugar ninguna union completa del VWF, de modo que se encuentra una parte en la fraccion de flujo continuo.

20 Tabla 4: aumento de la actividad de VWF espedfica de una fraccion de plasma que contiene VWF previamente

purificada por medio de cromatograffa con fluoroapatita

: Actividad espedfica [E por mg de protema]

Salida: 64,8

flujo continuo: 47,1

fraccion de elucion 1: 39,3

fraccion de valor: 77,0

Bibliografia complementaria

Las siguientes citas bibliograficas con respecto a distintos procedimientos analfticos se mencionan de manera 25 complementaria:

Actividad de VWF:

Veyradier A, Fressinaud E, Meyer D (1998): Laboratory diagnosis of von Willebrand disease. Int J Lab Res 28(4): 201-210.

Antfgeno de VWF:

30 Budde U, et al. (1984): Acquired von Willebrand's disease in the myeloproliferative syndrome. Blood 64 (5):

981-985.

Newman DJ, Henneberry H, Price CP (1992): Particle enhanced light scattering immunoassay. Ann Clin Biochem 29 (Pt1): 22-42.

Antigeno de fibronectina:

35 Sandberg L, et al. (1985): Plasma fibronectin levels in acute and recovering malnourished children. Clin

Physiol Biochem. 3(5):257-264.

Colli A, et al. (1986): Diagnostic accuracy of fibronectin in the differential diagnosis of ascites. Cancer.: 58(11):2489-2493.

Antigeno de fibrinogeno:

40 Ernst E, Resch KL (1993): Fibrinogen as a cardiovascular risk factor: a meta-analysis and review of the

literature. Ann Intern Med.: 118(12):956-963.

Jelic-Ivanovic Z, Pevcevic N (1990): Fibrinogen determination by five methods in patients receiving streptokinase therapy. Clin Chem.: 36(4):698-699.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la purificacion de VWF, caracterizado porque

(i) una composicion que contiene VWF y una o varias protemas contaminantes se pone en contacto con una matriz de hidroxilapatita de modo que al menos una protema contaminante se une a la matriz de hidroxilapatita, mientras que VWF esencialmente no se une a la matriz de hidroxilapatita, y dado el caso

(ii) se separa VWF no unido de la matriz de hidroxilapatita.
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque VWF se encuentra en el flujo continuo y al menos una protema contaminante se une a la hidroxilapatita.
3. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque la protema contaminante es fibronectina o fibrinogeno.
4. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la cromatograffa con hidroxilapatita se realiza con un valor de pH de 6,5 a 8,0, preferentemente de 6,8 a 7,5.
5. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque como tampon de migracion se usa una solucion que contiene fosfato de sodio y/o fosfato de potasio.
6. Procedimiento segun las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque VWF en otra etapa cromatografica se une a una matriz de hidroxilapatita y a continuacion se eluye.
7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, caracterizado porque en la otra etapa cromatografica

(a) VWF se une a la matriz de hidroxilapatita,

(b) las impurezas se separan por lavado y

(c) a continuacion la fraccion de valor que contiene VWF se eluye a concentracion salina mas alta.
8. Procedimiento segun la reivindicacion 7, caracterizado porque en la etapa (a) se pone en contacto una composicion que contiene VWF, una o varias protemas contaminantes y fosfato de sodio y/o de potasio de 1 a 200 mM, preferentemente de 1 a 50 mM, con la matriz de hidroxilapatita.
9. Procedimiento segun las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque en la etapa (b) se lava la matriz de hidroxilapatita con un tampon que contiene fosfato de sodio y/o de potasio de 100 a 300 mM, preferentemente de 150 a 250 mM.
10. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque en la etapa (c) se eluye la fraccion de valor que contiene VWF con un tampon que contiene fosfato de sodio y/o de potasio de 200 a 500 mM, preferentemente de 250 a 400 mM.
11. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 6 a 10, caracterizado porque la cromatograffa con hidroxilapatita se realiza con un valor de pH de 5 a 7,5, preferentemente de 5,5 a por debajo de 6,8.
12. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque en primer lugar se realiza una cromatograffa de flujo continuo con hidroxilapatita, no uniendose VWF a la matriz de hidroxilapatita, y a continuacion se cromatograffa de nuevo la fraccion de flujo continuo en condiciones de union y se eluye la fraccion de VWF.
13. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque como material de partida se usa una fraccion de plasma previamente purificada.
14. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque como material de partida se usa una solucion de crioprecipitado purificada adicionalmente.
15. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque como material de partida se usa una solucion de crioprecipitado precipitada con hidroxido de aluminio.
16. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque como material de partida se usa una solucion de crioprecipitado precipitada con hidroxido de aluminio, previamente purificada mediante cromatograffa.
17. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque antes de la cromatograffa con hidroxilapatita se realiza una precipitacion con pH para la separacion de fibronectina.
18. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque como material de partida se usa una solucion de protemas que contiene VWF de sobrenadantes de cultivo celular.
19. Procedimiento segun una de las reivindicaciones 1 a 18, caracterizado porque se usa hidroxilapatita que contiene iones fluoruro.