PT93128B

PT93128B - Processo para a preparacao de um concentrado de factor de von willebrand purificado e pasteurizado

Info

Publication number: PT93128B
Application number: PT93128A
Authority: PT
Inventors: Norbert Heimburger; Klaus Wellner; Gerhardt Kumpe
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1990-02-13
Publication date: 1995-12-29
Also published as: DK0383234T3; AU4933990A; IE900511L; ES2066020T3; PT93128A; JP2930243B2; KR0149999B1; EP0383234A3; EP0383234B1; JPH02264799A; CA2009946A1; ATE114669T1; CA2009946C; US6239261B1; EP0383234A2; KR900012615A; DE3904354A1; AU638969B2; DE59007785D1

Description

DESCRIÇÃO

A invenção refere—se a um processo para a preparação de um concentrado de factor de von Willebrand purificado e pasteurizado, bem como a um tal concentrado preparado de acordo com este processo, que é adequado para o tra tamento do sindroma de von Willebrand.

Este estado clínico caracteriza-se por uma deficiência congénita e/ou uma falta da proteína de von Willbrand.

É necessário um concentrado de factor de von Willebrand puro e isento de virus, pois que se utilizam para o tratamento da hemofilia A concentrados de factor VIII:

C oada vez mais purificados, que só contem vestígios de factor de von Willebrand.

Uma vez que os doentes do sindroma de voz. * Willebrand têm de ser tratados durante toda a vida e por vezes

PS.

ça Ao preparado. Tfa ea preparaçSee pobres a* ílbrl0 factor do voa willebrand olxcala ao plana auaa coaeeatração de 5-10 ag/1 o ae fora* da «a eoaplexo aSo ligado covaleateaeate aaa o factor VXII. a efcaaada glabalia* cnti-hnofllloa· So ao-pxeelpitado o factor da voa tUlebrod aaoaatra-ca, ooao eoaplexo da factor da voa VlUaferead/£aeter TXXI, aolto e&rlçuedde a poda por laaa isolar» «ao a partir do plane oa da fraoçSo do pleeaa, por saio da aítodos do fraoeioaaaeate ooabeoidee.

Do registo da pataata eleaão 5 504 585 (ϋδΡ,4,57β,21β) ooabece-ee oa processo para a trataaoato da eoaplexo do factor ΤΣΖΖ, n çea ao liga oaa preparaçao da faetor TUI a oa* aatrls laeolâvel, que ocntd* grupos sulfato livres, por exeaplo aolfato do dextraa, aão soado acatado olareaaata poaafvel oaa aaperaçSo do οαφίβχο da factor TZU aa fsetor YXXIt C o factor do voa Wlllebraad.·

Sa GB 2 079 292 deccrovo-cc oa procccco para a preparação do aa factor do voa Wlllebrand a partir do eopreelpltade, çee eoatado taabda aSo aspara o factor TIXXx 0 do factor do voa Ullabread.

Sa SP 0 022 052 (OSP 4,210,580) dcaerovo» -cc oa praaaao, oa çao ao trata ao plane cca hcparlac da eddlo, precipitaste flbreaeetlaa Juataaaata cca o factor da voa Slllcbraad. A partir da cneda ecbrooaâaata racupara-aa o f aotor aatl-hmofíllco· Oroaatogrefa-ee o precipitado ea celulose DSA£ e isole-ae a flbxoaeetlaa· Sef are -ae çae, çuaate ea atiUea para a erooategrafla gel de cgerccc, o factor do voa Wlllbra&d. alui-ae ao *vold volne* (voloae aorta). A bepariaa d .ρ—μΛ4 λβ· asa çpuuxbldsdes otlllaadn w oaa filtra— ção da gel < oa ?aaao licitante para oaa produção ã escala la»

dustrial. Além disso trabalha-se com KSCN que é tóxico.

No registo de patente europeu 0 083 483 repefer-se que, no estado da técnica, se descreve um processo no J. Lab. Clin. Med. 95,40 (1879)·» para a separação do factor VIII: C e do factor de von Willebrand, separação essa efectua da por imunoadsorpção. Nesse processo, contudo, apenas ae obtém o factor VIII: C com uma pureza razoável.

Um outro processo para a separação destes dois factores encontra-se descrito no Brit. J. Hematol. 43,669(1979)« ¹¹⁰ qual se utiliza aminohexil-agarose · Também este processo é inadequado para a obtenção do factor de von Willbrand.

Na própria EP 0 083 483 descreve-se um processo para a preparação do factor VIII: C, que apenas contém pequenas quantidades do factor de von Willebrand. Não se refere aí, contudo, qualquer processo para o isolamento do factor de von Willebrand.

Todos estes processos têm uma caracteris tica comum que é a de não conduzirem a uma dissociação completa do complexo com o isolamento consequente de um F VIII: C nativo e do vWP. Nenhum destes processos descreve um produto pasteurizado e por isso isento de viras. Para proteger o vWF de uma decomposição proteolítica durante a purificação, utilizam-se nestes processos substancias tóxicas como DFP e inibidor da tripoina de soja ou ainda tampões como KSCN ou NaN^· Finalmente estes processos desvantagens, uma vez que incluem passos que são limitantes para a produção em larga escala. Entre eles destacam-se, por exemplo, filtrações em ge isto é, separações com base no peso molecular, ou passos croma tográficos utilizando um gradiente salino para a eluição.

A presente invenção descreve um processo com o qual se consegue, surpreendentemente, dissociar o eomple

- 5 ~ xo do factor VIII: C β do factor de von Willebrand e isolar o factor de von Willebrand purifificado e pasteurizado com eleva do rendimento· 0 objectivo desta invenção é a preparação de um agente terapêutico coagnlante, purificado, pasteurizado e por isso isento de virus, para o tratamento do síndroma de von Willebrand.

ob^ectivo da invenção é um processo para a preparação de um concentrado de factor de von Willebrancl. pasteurizado, caracterizado por se tratar uma solução que contém o factor de von Willebrand (vWF) como complexo com o P VIII C num tampão de aminoácido de pH 5,5 a 6,5 e numa concentração de hidratos de carbono de 5 a 30% em peso, com um permutador aniónico, ao qual se liga ο Ρ VIII: C, e se isolar a partir da solução o concentrato de factor de von Willebrand.

Como material de partida para a preparação de um concentrado de vWF podem utilizar-se soluções nas quais o vWP se encontra presente como complexo com ο Ρ VIII: 0„ p. ex.plasma e fracções dele obtidas como crioprecipitados, fracção dohn I ou ainda camadas sobrenadantes e extractos de culturas celulares.

material de partida, de preferencia os crioprecipitados ou as fracções intermédias deles obtidas, pode ser pasteurizado.

vWP pode proteger-se da inactivaçao térmica durante a pasteurização, pela adição de hidratos de carbono, de preferência sacarose, de preferência em concentrações de 10 a 60 % em peso, e/ou de aminoácidos, de preferência glicina, de preferência em concentrações de 0,3 a 5,0 mol/1, e/ou de sais de cálcio, de preferência em concentrações de 1 a 20 mmol/1. Por meio destas medidas pode também impedir-se ao mesmo tempo a precipitação de proteínas sensíveis ao melo ácido, por exemplo a fibronectina.

Os hidratos de carbono servem não só para proteger as proteínas da uma inactivação térmica ou de uma desnaturação, mas também como solubilizantes na zona de pH áci do de 6,5 a 5»5» β neste caso em especial para o fibrinogénio e para o vWP· impedindo surpreendentemente a sua precipitação·

Pode manter-se o vWF em solução após adsorpção do Ρ VIII: C ao permutador iônico a pH 5,5» separar— -se da solução o fibrinogénio por adição de glicina em concentrações de 0,5 a 5»0 mol/1, de preferência 2,7 mol/1 e, a partir da camada sobrenadante de glicina precipitar-se o vWF com concentrações de NaCl correspondentes a 2 a 15 % em peso, de preferência 6 % em peso.

vWF pode pasteurizar-se uma segunda vez, como produto intermediário, para aumentar a segurança virai · vW? pasteurizado e altamente purificadc pode filtrar-se em condições estéreis e liofilizar-se, por exemplo com glicina (2 % em peso), albumina (0,5 %) em citrato (0,02 mol/l)-NaCl (0,06 mol/1) como estabilizadores.

Opreparado de acordo com a invenção é mais ou menos isento de proteínas inconvenientes, ao contrário dos crioprecipitados anti-hemofílicos, do crioprecipitado bruto ou das suas criofracções, que até agora têm sido utilizados para o tratamento do síndroma de vW.

processo de acordo com a invenção correspondeu às elevadas exigências de pureza, rendimento e isenção de virus: juntamente com as proteínas indesejáveis eliminam-se também pelo processo de purificação outros virus possivelmente presentes e inactivam-se por meio de pasteurização.

A actividade específica de um produto preparado de acordo com O processo descrito situa-se acima de 100 E de F VIII Eí Co F/iag de proteína.

Pode proceder-se da seguinte maneira:

crioprecipitado dissolvido, fortemente enriquecido com o factor de von Willebrand e com o factor VIII , libertado dos factores do complexo de protrombina por meio de adsorção em Al(OH)^, estabiliza-se para protecção contra inacti vação térmica, por meio de um método conhecido, por adição de hidratos de carbono, aminoácidos e iões cálcio, e aquece-se em solução aquosa, de preferência durante 10 horas a 60°C,

A solução pasteurizada pode diluir-se ató ao dobro do volume com um tampão de condutividade fisiológica (12 - 15 mS) e a ua pH de 5»5i com a composição de 0,2 mol/1 de lisina e 0,2 mol/1 de acetato de sõdio, ajusta-se o pH da solução a 5,5 e aplica-se a um permntador aniónico a 20°C.

Nestas condições, o factor VIII liga-se a permutadores iõnicos básicos oom DEAE e QAE como grupos funcionais ligados a ^fiSephadex, ^fiSepharose, celulose ou ^Practogel· como matriz, enquanto que o vWF permanece em solução, paara este fim equilibram-se previamente estes permutadores com o seguinte tampão: 0,1 mol/1 de acetato de sódio; 0,1 mol/1 de lisina; 0,017 mol/1 de NaCl; pH 5»5·

Uma vez que, nas condições mencionadas, o vWP permanece na camada sobrenadante juntamente com fibrino— génio e fibronectina, ocorre evidentemente a dissociação do complexo de vWF como factor VIII, nas condições mencionada.

permutador aniónico carregado com F TT. pode lavar-se com uma solução tampão contendo 0,1 mol/1 de lisina; 0,1 mol/1 de acetato de sódio; 0,017 mol/1 de acetato de sódio; 0,01.7 mol/1 de NaCl; pH 5» ou com outros tampões com uma condutividade de 12 - 15 mS. Para a eluição utilizam-se tampões com elevadas concentrações salinas, por exemplo 0,5-1 mol/1 de NaCl ou de outros halogenetos alcalinos ou alcalinoterrosos ·

- 6 0 eluído pode, conforme o caso, tratar-se de modo a obter-εβ um concentrado de F VIII: C pasteurizado e altamente purificado.

A dissociação descrita e a adsorpção selectiva a pH ácido só é possível quando o fibrinogénio, que constitui a componente principal da proteína em solução, não precipita; pois é sabido que as englobulinas, às quais pertence o fibrinogénio, precipitam em solução aquosa por acidificação a pH 5 a 5»5·

Isto não é válido para o processo de acordo com a invenção, porque os hidratos de carbono que ficam em solução após a pasteurização e o cálcio e o fibrinogénio também se mantém em solução a um pH ácido.

Este passo do processo é também objectivo e matéria da presente invenção, mesmo quando a pasteurização das proteínas se efectua mais tarde.

factor de von Willebrand, isento da actividade do factor VIII: C, continua justamente com o fibrinogénio e com a fibroneactiva na camada sobrenadante (processo •batch*) ou passa pela coluna e pode em seguida separar-se, por meio de passos de fraççionamento apropriados, das proteínas em grande excesso que o acompanham, por exemplo por meio de um fraççionamento com glicina e precipitação com NaCl da camada sobrenadante do permutador aniónico.

Para este fim ajusta-se o pH da camada sobrenadante de DEAE a 7,3 e precipita-se a 37°C com 0,5-3 mol^. de glicina, de preferência com 2,7 mol/1, e separa-se o fibrinogénio precipitado.

Por meio de adição de NaCl sólido nem solução ao sobrenadante de glicina até uma concentração final

de 2 a 25 % em peso, de preferência 6 % em peso, precipita-se selectivamente o factor de von Willebrand e separa-se, por exemplo, numa centrífuga.

precipitado dissolvido pode purificar-se p

por tratamento com Aerosil até um grau de pureza superior·

A uma determinada concentração de albumina, ajustada pela OD (densidade óptica) a 280nm, ligam-se ao Aerosil de preferencia as proteínas acompanhantes do vWF, nomeadamente fibrinogénio, fibronectina e imunoglobulina; diminuindo-se também claramente ao isoaglutininas indesejadas· 0 tratamento com ae.

rosil pode efectuar-se tanto antes como depois da Pasteurização.

precipitado de factor de von Willebrand assim preparado dissolver-se, juntar-se com sacarose-glicina e aquecer-se novamente durante 10 horas a 60°C para aumentar a segurança contra virus. Esta pasteurização é surpreendentemente possível praticamente sem perda de actividade· A partir da solução diluida arrefecida separa-se o fibrinogénio ainda presente por meio de uma precipitação com gllcina de 0,5—5«0 mol/1, de preferência 2,2 mol/1. Através de uma precipitação subsequente, com cloreto de sédio, da camada sobrenadante, com 2 a 25 % em peso, de preferência 8 % em peso, pode isolar-se o factor de von Willebrand numa forma de elevada pureza e com um baixo teor em isoaglutinina.

Apés dissolução do factor de von Willebrand num tampão de 0,02 mol/1 de citrato, 0,0 6 mol/1 de NaCl, pH 6,8, e estabilização por adição da aminoácidos e albumina, segue-se uma diálise; filtra-se então o produto em condições estéreis e, conforme o caso, liofillsa—se· 0 teor em vWF deter minou-se através de actividade do F VIIIfixCoF, de acordo com o método da aglutinação.

As plaquetas estabilizadas aglutinam—se na presença de F VIIISsCoF e do antibiótico xistocetina A.

- 8 —

Processo da determinação:

iíisturam-se 50 jol de reagente de von Willebrand, Behringwerke (ressuspendido em 1 ml de água destilada) e 50 jal de plasma ou de diluição de plasma, sobre uma placa de vidro e agitam-se durante um minuto à temperatura ambiente, quer numa máquina de agitação, quer manualmente; sendo importante uma boa mistura. Apás um minuto de repouso compara-se o grau de aglutinação com um controle de cloreto de sódio. Lê-se o grau de diluição que ainda á positivo em relação ao controle e multiplica-se pela sensibilidade do reagente. Obtem -se o teor de F VIIIRíCoF em percentagem.

Descreve-se em seguida, com exemplos, a preparação de um concentrado de factor de von Willebrand. pasteurizado e de elevada pureza.

Exemplo 1

1. Material de partida

Dissolveu-se 1 kg de crioprecipitado bruto, por aquecimento a 30-57°0, em 3 1 de um tampão que continha 0,08 mol/1 de NaCl; 0,27 iíol/1 de glicina; 0,13 E/l de anti-

trombina III e 0,66 USPE/ml de de solução com um valor de pH e concentrações seguintes:	heparina. de 6,8-6,9	Obtiveram-se 4 1 e com os componentes
NaCl	0,06	mol/1
Glicina	0,2	mol/1
AT III	0,1	E/ml
Heparina	0,5	E/ml.

2. Adeorpção em Al(OH)^

Α 1000 al da solução do ponto 1 adicionaram-se 80 al de ume suspensão de Al(OH)^ a 1 % (Behringwerke, láarburg) e agitou-se durante 15 minutos, à temperatura de 28-30°C, Ea seguida centrifugou-se durante 15 minutos a 3000 x g, regeitou—ee o resíduo e adicionaram—se estabilizadores à fase líquida e pasteurizou-se.

3· Estabilização e pasteurização

Trataram-se 1000 al da fase liquida do ponto 2 com os seguintes estabilizadores:

al de solução de CaClg» 1 aol/1 (5 aaol/1)

1000 g de sacarose (500 g/kg de solução)

150 β de glicina (2 aol para 1 1 de solução)· valor de pE ajustou-se a 7,3 com RaOH2N.

volume de solução aumentou coa a adição. A partir de lkg de crioprecipitado obtiveram-se 6,8 1 de solução estabilizada que se aqueceu durante 10 horas a 60°C em banho aaria.

4. Tratamento por permuta iónica

Diluiram-se 6,8 1 da solução do ponto 3 com 6,8 1 de um tampão que continha 0,2 mol/1 de acetato de sódio, pH 5»5 e 0,2 aol/1 de lisina. 0 valor de pH ajustou—se a 5»5 com ácido acético.

Tratou-se a solução com 300 ml de DEAEr^RSepharose CL 6 B, que tinha sido equilibrada com um tampão de pH 5,5 que continha 0,1 mol/1 de acetato de sódio, 0,1 aol/1 de lisina e 1 g/1 de NaCl. Agitou-se a suspensão durante 2-3 horas â temperatura ambiente e vigiou-se o decurso da adsozpção por meio de determinação contínua do P VIII. Em seguida aplicou—se a resina carregada a um filtro de Nylon e separou—se, lavou—se, eluiu—se e tratou—se o eluído para se obter um concentrado de Ρ VIII :C.

Isolamento do facto de von Willebrand a partir da camada sobrenadante de DEAE

5. Precipitação com glicina 2,7 M

Para a precipitação ajustou-se o pH da fase líquida de DEAE a 6,8 com NaOH 2 M, aqueceu-se a 37°C, e por adição de 2,1 mol/1 de glicina cristalina (157«5 g) levou—se a uma concentração final de 2,7 mol/1, já que o líquido de DEAE continha já 0,6 mol/1 de glicina vindo da solução pasteurizada. Doseia-se a glicina durante 30 minutos, lentamente, sob agitação. Precipita então o fibrinogénio e remove-se. A mistura de precipitação arrefece até 20-25°C. Separou-se o precipitado de fibrinogénio por meio de centrifugação a 3000 - 5000 x g.

6. Precipitação com NaCl a 6 %

Precipitou-se o factor de von Villabrand por meio de adição de NaCl cristalino à fase líquida contendo glicina 2,7 molar (60 g/1). A precipitou-se efectuou-se à tem peratura ambiente, adicionando-se o NaCl durante 30 minutos e agitmndo-se depois durante mais 30 minutos. Separou—se o precipitado fino numa centrífuga contínua a 15000 z g a 10°C e um caudal de 40 1/hora.

7· Dissolução do resíduo da precipitação com NaCl a 6 %, estabilização e pasteurização resíduo da precipitação com NaCl a 6 % dissolveu-se em 60 ml de água destilada. Obtiveram-ee 82,3 ml de uma solução com uma densidade éptica de 40 a 280 na. No caso de uma densidade éptica maior do que 30 dilui-se a este valor.

Para a estabilização adicionaram-se a

82,5 ml de solução 82,5 β de sacarose (1 g/ml) e 12,3 β de glicina (2 mol/1). 0 volume da solução estabilizada era de

140 ml, ο pH ajustou-ee a 6,0 com NaOH 2 Μ e aqueceu-se a solu ção estabilizada durante 10 horas a 60°C.

8. Isolamento do factor de von Willebrand pasteurizado a partir da solução de estabilizador

Diluição:

Após arrefecimento a 40°C diluiu-se a solução pasteurizada, na proporção de 1:5, oom 280 ml de um tamp pão que continha 0,05 mol/1 de NaCl e 0,02 mol/1 de tri-citra to de sódio. A densidade óptica da solução, a 280 na, era de 8,82 após diluição.

Pré-precipitação com glicina (2,2 mol/1)

Misturaram-se 420 ml da solução pasteurizada e diluida, que já continha 0,4 mol/1 de glicina, com

56,7 g de glicina (1,8 mol/1), a 55°C. k solução arrefeceu du rante a precipitação (50 minutos) e durante o tempo de agitação que se seguie (50 minutos) até è temperatura de 25°C.

Centrlfugou-se o precipitado a 5000 g e rejeitou-se

Precipitação com NaCl a 8 %

Misturou-se a camada sobrenadante de glicina 2,2 molar (420 ml) com 0,53 volumes de um agente de precipitação (159,6 ml) que continha 1,8 mol de glicina e J00 g de NaCl por litro. A temperatura quando da precipitação foi de 20°C, sendo o tempo total de precipitação e agitação de 1 hora. 0 residuo de NaCl a 8 %, que continha o factor de von Willebrand HS, centrlfugou-se a 5000 g·

Dissolução do resíduo de NaCl a 8 %, diálise e ultracentrifugação:

Dissolveu-se o resíduo de NaCl a 8 % em 55 al àe um tampão de pH 6,9 com a seguinte composição:

Tampão de dissolução: 0,06 mol/1 de NaCl

0,02 aol/1 de tri.-citrato de sódio 2 % de glicina

0,5 % de albumina humana,

Dialisou-se a solução durante 2 x 1,5 horas, a 20 °C, contra 1,2 1 de ua tampão de diálisa, sob agitação:

Tampão de diálise: 0,06 mol/1 de NaCl

0,02 aol/1 de tri-citrato de sódio 2 % de glicina (pH 6,8-6,9).

dialisado (69 al) levou-se a uaa concentração final de 0,5 % com albumina humana e centrifugou-se durante 60 minutos a 20°C e 15 000 g, atá se obter uaa solução límpida.

Para a filtração estéril ajustou-se o volume da solução ultracentrifugada a 110 al com tampão de dissolução ·

Filtração estéril, ajuste de concentração, enchimento e liofilização :

Filtrou-se em condições estéreis a solução ultracentrifugada do concentrado de factor de von Willebrai SS (110 ml), após aquecimento a 50-55°C, através de uaa placa filtrante de tamanho de poros 0,45 na e 0,2 na. A solução con tinha 160 E/ml de actividade de F VIII S: CoF.

Exemplo 2

Be acordo com o exemplo 1, ponto 6, preparou-se um precipitado com NaCl a 6% e purificou-se o factor de von Willebrand por tratamento com Aerosil. Para tal, dissolveu-se primeiro o precipitado em 60 ml de água destilada, mediu-se a densidade óptica (OB) a 280 nm e diluiu-se depois a solução até ao volume de 200 ml com uma OB de 10· A esta solução adicionou—se Aerosil 200 húmido (em relação à substância seca 5 mg/nl) e agitou-se a suspensão durante 30 minutos a 20°C; centrifugou-se então o Aerosil carregado com as proteínas acompanhantes do factor de von Willebrand e tratou-se a camada sobrenadante, como descrito no exemplo 1, até à obtenção do produto final· Este tinha, com rendimento bom e inalte rado, uma actividade especifica superior por um factor de 2 a

Claims

SEIVIHBCAÇÕES

- la Processo para a preparação de um concentrado de factor de von Willebrand pasteurizado, caracterizado por se tratar uma solução contendo o factor de von Willebrand (vWF) como complexo com o F VIII: C num tampão contendo aminoécidos a pH a 6,5 e & uma concentração de hidratos de carbono de 3 a % peso/peso, num permutador aniénico, ao qual se liga o F VIII íC, e se recuperar a partir da solução o conceçL trado de factor de von Willebrand.

- 2e Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se utilizar como solução contendo o factor de von Willebrand como complexo com o F VIII sG, plasma ou uma fracção a partir dele obtida, de preferência um coprecipitado ou fracção de Conh I, ou uma camada sobrenadante ou um extracto de uma cultura células·

- 3® Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se pasteurizar a solução que contém o factor de von Wlllebrand.

- 4® Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se pasteurizar a solução do factor de von ViUebrand e por se evitar uma inactivação térmica durante a pasteurização através da adição de sacarose, de preferência numa concentração de 10 a 60 % peso/volumm, de glicina, de preferência numa concentração de 0,3 a 3,0 mol/1 e de um sal de cálcio, de preferência numa concentração de 1 a 20 mol/1, impedindo-se ao mesmo tempo pela adição destas substancias a precipitação de proteínas sensíveis ao meio ácido, em especial do fibrogénio e da fibronectina.

- 5^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se tratar o precipitado de factor de von Wlllebrand, na forma em que se encontra antes ou depois da pasteurização, em solução com Aerosil.

- 6® Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por apés o tratamento por permuta iénica se prercipitar o fibrinogénio a partir da solução por adição de glici na numa concentração de 0,5 a 3 mol)l, de preferência 2,7 mol/

- 15 e se precipitar ο vNF a partir da camada sobrenadante cem uma concentração de NaCl de 2 a 15 % (peso/volume), de preferencia 6 % (peso/volume).

- 7* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ae filtrar em meio esterilizado e se liofilizar o vWF pasteurizado e purificado por meio da adição de glicina (2 % peso/volume), albumina (0,5 %) em citrato (0,02 mol/1)-NaCl (0,06 mol/1)·