ES2586698T3

ES2586698T3 - Proceso para la producción de fibrinógeno

Info

Publication number: ES2586698T3
Application number: ES11757875.7T
Authority: ES
Inventors: Rainer Pape; Werner Gehringer; Petra Schulz
Original assignee: Octapharma AG
Current assignee: Octapharma AG
Priority date: 2010-09-20
Filing date: 2011-09-20
Publication date: 2016-10-18
Anticipated expiration: 2031-09-20
Also published as: MX2013002657A; WO2012038410A1; CN106046147B; RU2013118323A; RU2603103C2; EP2619225B1; MX347190B; BR112013006384B1; CN106046147A; EP2619225A1; CN103328503B; AU2011304364B2; US9371355B2; JP2013537215A; US9938318B2; KR20130112031A; CN103328503A; US20130274444A1; BR112013006384A2; AU2011304364A1

Abstract

Un proceso para la purificación de fibrinógeno a partir de una fuente que contiene fibrinógeno empleando cromatografía en resinas de intercambio aniónico, en el que la resina de intercambio aniónico es un polímero de metacrilato hidroxilado en el que se han insertado grupos trimetilamino a través de un grupo de enlace.

Description

DESCRIPCION

Proceso para la produccion de fibrinogeno 5 Antecedentes de la invencion

El fibrinogeno, tambien conocido como factor de coagulacion I, tiene una funcion clave en la hemostasia y en la curacion de las heridas. Es una glucoprotema sintetizada en el tngado con un peso molecular aparente de 340 000 Da; esta compuesto por dos dfmeros, cada uno de los cuales esta formado por tres pares de cadenas 10 polipeptfdicas no identicas denominadas Aa, Bp y y unidas por puentes disulfuro. Circula en el flujo sangumeo a una concentracion de aproximadamente 150 a 400 |jg/ml. Tras una lesion de los vasos sangumeos, las plaquetas sangumeas se activan y forman un tapon. El fibrinogeno esta implicado en la homeostasia primaria mediante la adicion de entrecruzamiento a las plaquetas activadas.

15 En paralelo se inicia la activacion de la cascada de coagulacion. Como punto final, el fibrinogeno se convierte en fibrina mediante la liberacion proteolftica del fibrinopeptido A y, a una velocidad mas lenta, del fibrinopeptido B mediante la trombina. Los monomeros solubles de fibrina se agrupan en fibrillas helicoidales de doble cadena. Posteriormente estas fibrillas se disponen de forma lateral, lo que da lugar a fibras mas gruesas. A continuacion, estas fibras se entrecruzan mediante el factor FXIIIa para obtener una red de fibrina que estabiliza el tapon de 20 plaquetas mediante interacciones de la fibrina con plaquetas activadas, lo que da lugar a un coagulo estable.

Enfermedades y deficiencias

La afibrinogenemia congenita es un trastorno hemorragico raro, en el que los pacientes sufren una coagulacion de la 25 sangre inadecua debido a la carencia o funcionamiento defectuoso del fibrinogeno. Esta enfermedad podna llevar a episodios hemorragicos espontaneos o a sangrado excesivo tras un traumatismo menor o durante los procedimientos intervencionistas.

Las deficiencias adquiridas en fibrinogeno son mucho menos frecuentes que la afibrinogenemia congenita y pueden 30 estar inducidas por hemodilucion u otros acontecimientos como perdidas de sangre durante la cirugfa, traumatismos, coagulacion intravascular diseminada (CID) o septicemia.

Las deficiencias de fibrinogeno pueden corregirse hasta niveles normales de fibrinogeno en plasma de aproximadamente 1,5 a 3 g/l mediante terapia de sustitucion con infusion intravenosa de plasma fresco congelado o 35 crioprecipitado. No obstante, estos tratamientos se ven afectados por el riesgo de introducir patogenos, por ejemplo, virus o priones, en un paciente y generar de este modo trastornos adicionales. Por tanto, es conveniente aplicar por via intravenosa composiciones de fibrinogeno inactivadas para reestablecer el fibrinogeno a niveles fisiologicos de forma segura.

40 Aunque existe fibrinogeno en las preparaciones denominadas pegamentos de fibrina, adhesivo de fibrinogeno, pegamiento tisular y similares, estas preparaciones estan pensadas para uso topico como polvos, pastas, espumas o en combinacion con tejidos como parches sobre las heridas, y no pueden utilizarse para aplicacion intravenosa ya que su consistencia y composicion podnan iniciar inmediatamente acontecimientos trombodticos durante su inyeccion. Estas preparaciones adicionalmente contienen trombina, sales de calcio y cantidades relativamente altas 45 de factor de coagulacion XIII. Aparecen ejemplos de dichas preparaciones en los documentos US-A1-2008/003272, WO-A-95/22316 o US-A1-2008/181878.

Se conocen procesos de produccion de fibrinogeno a partir del documento EP-B1-1 240 200 en el que se hace referencia a un procedimiento de purificacion de fibrinogeno a partir de una solucion que contiene fibrinogeno, que 50 comprende la aplicacion de una solucion que contiene fibrinogeno a una matriz de intercambio ionico, en condiciones tales que el fibrinogeno se une a la matriz, el lavado de la matriz de intercambio ionico con una solucion tampon que contiene al menos un aminoacido w, la elucion del fibrinogeno a partir de la matriz con un tampon compuesto por Tris 10 mM, citrato 10 mM, sacarosa 45 mM y NaCl a una concentracion de 200 mM a 1,0 M, y la recuperacion opcional del fibrinogeno del elrndo.

55

En el documento EP-B1-0 771 324 se hace referencia a un proceso de produccion de un concentrado de fibrinogeno libre de virus que se obtiene sometiendo a una fraccion plasmatica solubilizada que contiene fibrinogeno a un tratamiento qmmico de inactivacion vmca, es decir, un tratamiento S/D o solvente/detergente, sometiendo a la fraccion inactivada en virus resultante a precipitacion en una solucion que contiene un aminoacido a pH acido para

obtener un sobrenadante, filtrando el sobrenadante para obtener un concentrado de fibrinogeno purificado y recuperando el concentrado de fibrinogeno purificado. El concentrado de fibrinogeno recuperado se somete a radiacion ultravioleta para una segunda inactivacion vmica. El producto se estabiliza y liofiliza antes de una tercera inactivacion vmica.

5

En el documento EP-B1-1 519 944 se muestra el uso de una matriz cromatografica de afinidad de iones metalicos inmovilizados en condiciones en las que el fibrinogeno y el plasminogeno se unen a la matriz y, selectivamente, se eluye el fibrinogeno y el 93% del plasminogeno independientemente a partir de la matriz.

10 En el documento EP-B1-0 555 135 se describe un procedimiento para la produccion de un fibrinogeno aplicable por via intravenosa mediante la purificacion de una solucion de fibrinogeno sobre un gel de intercambio anionico a base de agarosa entrecruzada que contiene grupos amina cuaternaria. Se dice que el fibrinogeno producido esta libre de factor VIIIc.

15 En el documento EP-B1-1 457 497 se hace referencia a un proceso para la eliminacion de virus en soluciones de fibrinogeno caracterizada por la estabilizacion y congelacion de la solucion y su posterior descongelacion. La separacion de los materiales no disueltos se produce antes de la dilucion de la protema y va seguida de nanofiltracion de la solucion resultante usando filtros de un tamano de poro menor de 35 nm.

20 En el documento US-A1-2006/0009376 tambien se describe un procedimiento para la fabricacion de fibrinogeno. A continuacion se realiza una disolucion y precipitacion repetidas del fibrinogeno para eliminar el factor XIII.

Goheen, S. C. y col., publican en Journal of Chromatograph A. 816 (1998) 89-96, sobre cromatograffa de intercambio ionico mediante HPLC de las protemas plasmaticas albumina, fibrinogeno e inmunoglobulina (G) sobre

25 materiales de columna no porosos que contiene grupos amina cuaternaria o sulfopropilo funcionales [vease la pagina 3a].

Resumen de la invencion

30 Un objeto de la invencion es proporcionar un concentrado de fibrinogeno fabricado con etapas espedficas de eliminacion y/o inactivacion de patogenos en el proceso de produccion para superar las reacciones adversas o el desarrollo de enfermedades relacionadas con patogenos. Dichos patogenos se seleccionan entre los grupos de bacterias, virus y priones, como la protema prionica infectiva (PrPsc). La aplicacion sistemica de dicho producto de fibrinogeno a traves de la via intravenosa permite el tratamiento de la afibrinogenemia congenita y de las deficiencias

35 de fibrinogeno adquiridas. La aplicacion de este concentrado de fibrinogeno estandarizado permite un tratamiento rapido en situaciones de urgencia sin la laboriosa descongelacion del plasma fresco congelado y una carga de volumen reducida, asf como propiedades de coagulacion estables debido a una composicion esencialmente constante.

40 En el documento US 6 037 457 se describen procedimientos de produccion de fibrinogeno recombinante en un sistema de cultivo de celulas de mamffero prolongado. Se describe un procedimiento para la produccion de fibrinogeno recombinante que comprende: crecer celulas de mamffero que expresan fibrinogeno recombinante en un medio sin suero durante un tiempo de al menos un mes a un nivel de al menos 5 pg/ml; y a continuacion recoger porciones del medio condicionado al menos dos veces durante el tiempo de cultivo de al menos un mes;

45 conteniendo cada porcion al menos 5 pg/ml de fibrinogeno recombinante. Tambien se describe un procedimiento para la produccion de fibrinogeno recombinante que comprende: crecer celulas de mamffero que expresan fibrinogeno recombinante en un medio sin suero a un nivel superior a 1 pg/ml; recoger al menos una porcion de medio condicionado y, a continuacion, purificar el fibrinogeno a partir del medio mediante cromatograffa de intercambio anionico o cromatograffa de afinidad. En algunas realizaciones, el medio se concentra antes de la etapa

50 de purificacion del fibrinogeno. En realizaciones alternativas, tanto las etapas de concentracion como las de purificacion se realizan en presencia de al menos un inhibidor de proteasas.

Un objeto adicional de esta solicitud es proporcionar un proceso para la fabricacion de un concentrado a nivel industrial; es decir, varios cientos a miles de litros de material de partida, como sangre o plasma sangumeo, aunque

55 tambien es posible la produccion a pequena escala, es decir, algunos decilitros a varios litros.

Estos y otros objetos se consiguen mediante el proceso de las reivindicaciones 1 a 12 y un producto que se obtiene mediante el proceso de la invencion segun se reivindica en las reivindicaciones 13 y 14.

En general, se describe un proceso para la purificacion o fabricacion de fibrinogeno a partir de fuentes que contienen fibrinogeno que comprende las etapas de:

- formar un precipitado enriquecido en fibrinogeno anadiendo al menos un agente de precipitacion a la fuente que 5 contiene fibrinogeno;

- opcionalmente aislar el precipitado enriquecido en fibrinogeno, por ejemplo, mediante centrifugacion de dicho precipitado;

- recoger el precipitado enriquecido en fibrinogeno en un medio acuoso formando una solucion que contiene fibrinogeno, seguido opcionalmente de filtracion y/o ultra/diafiltracion;

10 - someter la solucion que contiene fibrinogeno a cromatograffa en fase estacionaria con grupos de intercambio anionico fuertes poniendo en contacto dicha solucion con dicha fase en condiciones en las que el fibrinogeno se une a dicha fase;

- seguido de una elucion del fibrinogeno de la fase estacionaria mediante una solucion acuosa con una fuerza ionica superior a la fuerza ionica de la etapa anterior, lo que produce una fraccion enriquecida en fibrinogeno que se

15 recoge;

- opcionalmente seguido de etapas posteriores de dilucion y/o concentracion de la fraccion enriquecida en fibrinogeno;

- y opcionalmente distribuir la fraccion enriquecida en fibrinogeno en viales adecuados.

20 En una realizacion del proceso de fabricacion de la invencion la fuente que contiene fibrinogeno se selecciona a partir del grupo compuesto por plasma sangumeo, fracciones de plasma, como la fraccion I, o crioprecipitado, cultivos celulares que producen fibrinogeno y/o sobrenadantes de dichos cultivos celulares. Si no es utiliza el crioprecipitado como material de partida, se produce un producto intermedio que contiene fibrinogeno como material de partida mediante procedimientos bien conocidos descritos por Cohn, Kistler-Nitschmann y modificaciones de los 25 mismos.

Para obtener un producto farmaceuticamente util es ventajoso que la fuente que contiene fibrinogeno se someta a un proceso de inactivacion vmca, por ejemplo, un proceso solvente detergente.

30 Segun otra realizacion de la invencion la inactivacion vmca se realiza antes de obtener un precipitado enriquecido en fibrinogeno. No obstante, tambien es posible realizar la inactivacion vmca en una etapa diferente.

Segun la invencion, la eliminacion de las sustancias inactivadoras de virus se realiza mediante extraccion de aceite y/o cromatograffa con intercambiadores ionicos fuertes.

35

Un agente de precipitacion tfpico para su uso en el proceso de fabricacion de la invencion se selecciona a partir del grupo compuesto por aminoacidos como glicina, concentraciones altas de sales (desalado) o polietilenglicol.

Segun aun otra realizacion de la invencion el material obtenido se resuspende a partir de una pasta en un tampon 40 con un pH de 7,5 a 8,5.

Segun una realizacion adicional de la invencion la fase estacionaria tiene grupos amino terciario o cuaternario.

Las etapas cromatograficas del proceso de fabricacion de la invencion pueden realizarse, en particular, en una 45 columna.

Tfpicamente, la forma de conservacion de la fraccion enriquecida en fibrinogeno para relleno de viales esta en estado lfquido, en estado congelado, preferiblemente a < -15°C, mas preferiblemente por debajo de -30°C, o como un liofilizado.

50

El tema de la presente invencion tambien es una fraccion enriquecida en fibrinogeno que se obtiene segun el proceso de fabricacion de la invencion. La fraccion enriquecida en fibrinogeno de la invencion contiene, por ejemplo, de 0,01 a 9,0 ng de fibrinopeptido A por mg de fibrinogeno. La fraccion enriquecida en fibrinogeno de la invencion contiene ademas de 0,80 a 1,10 mg de antfgeno de fibrinogeno por mg de fibrinogeno, determinado mediante el 55 metodo de Clauss; actividad VWF:Ag <0,1 UI por mg de fibrinogeno; actividad de factor de coagulacion XIII >0,07 UI por mg de fibrinogeno; de 0,01 a 1,00 |jg de fibronectina por mg de fibrinogeno y menos de 0,03 UI de trombina por mg de fibrinogeno.

El concentrado de fibrinogeno se distribuye en recipientes finales tras su esterilizacion mediante filtracion y puede

conservarse en forma Ifquida, congelado como Uquido o liofilizado.

El fibrinogeno producido segun este proceso se caracteriza por cantidades muy bajas de impurezas lo que verifica el estado natural del producto y permite el tratamiento prolongado de las personas que lo necesiten. Preferiblemente, 5 el FXIII esta a la concentracion contenida, ya que mantiene la estabilizacion de la fibrina formada, al tiempo que se evita la sobrecarga de esta transglutaminasa.

El termino “comprendiendo”, “comprende” o “comprendido” tambien puede sustituirse por “consistiendo”, “consiste” o “consistido” sin alterar el descubrimiento de la descripcion.

10

Descripcion detallada

Aunque en principio pueden usarse todas las fuentes que contienen fibrinogeno segun la invencion, la fuente preferida es el crioprecipitado y, en adelante, el crioprecipitado sirve como fuente tfpica de fibrinogeno en la 15 descripcion adicional del proceso de fabricacion de la invencion.

Tfpicamente, el crioprecipitado se reconstituye o solubiliza en condiciones adecuadas de tampon en especial aproximadamente a pH neutro (6,9-7,0 por ejemplo en una solucion tampon que contiene citrato sodico y NaCl), se somete a adsorcion en particular con Al(OH)3 y se elimina el gel resultante, por ejemplo, mediante centrifugacion. A 20 continuacion, pueden inactivarse los virus en el sobrenadante por ejemplo, mediante tratamiento solvente/detergente (S/D). Este procedimiento es bien conocido por los expertos en la materia y se describio originalmente en el documento EP-A-131 740. Los compuestos S/D como el Triton (O-[4-(1,1,3,3-tetrametilbutil) fenoxi]polietoxietanol) y TnBP (Tri-n-butil-fosfato) se eliminan en particular mediante extraccion con aceite de ricino. Para una purificacion adicional, la fase acuosa puede someterse a un proceso cromatografico. Tfpicamente, esto puede realizarse 25 poniendo en contacto la fase acuosa con un gel de intercambio ionico fuerte, el tri-metil-amino-etilo (TMAE) insertado sobre material de matriz, como Fractogel® EMD-TMAE. Se obtienen buenos resultados si se realiza la cromatograffa con tampones con un valor de pH de 6,9 a 7,1 y una osmolalidad de 570 a 610 mOsmol/l. En estas condiciones el fibrinogeno no se une a la fase estacionaria y, por tanto, se encuentra en el flujo de paso o en el sobrenadante, en este ultimo si se realiza un proceso de cromatograffa en tandem.

30

La solucion de fibrinogeno no unido, que contiene tfpicamente aproximadamente 40 g/l (metodo turbidimetrico de Clauss) se ajusta a pH= 7,0-8,0, en especial a pH = 7,3-7,5. Tras la adicion de un agente de precipitacion adecuado, por ejemplo, glicina, a una concentracion de 0,8 a 12 M, en particular, de 0,9 a 1,1 M, la solucion resultante puede agitarse durante 60 a 120 min para que precipite el fibrinogeno. El precipitado que contiene fibrinogeno, a 35 continuacion, puede separarse mediante centrifugacion y esta pasta intermedia de fibrinogeno puede conservarse a <-70 °C, preferiblemente de -100°C a -70°C, durante hasta un mes. Ya en una unica precipitacion, por ejemplo con glicina, se obtiene una pasta de fibrinogeno suficientemente pura para su procesamiento adicional.

El producto intermedio preparado de este modo puede resuspenderse en un tampon Tris de 10 a 30 mM (pH = 7,5 a 40 8,5), en particular un tampon Tris de 15 a 25 mM con pH = 7,5 a 8,5. La suspension obtenida puede filtrarse a continuacion y someterse a ultra/diafiltracion por ejemplo frente a 5 veces el volumen de suspension del mismo tampon o de un tampon diferente.

La solucion que contiene fibrinogeno resultante se carga a continuacion en un gel de intercambio ionico fuerte 45 seleccionado preferiblemente a partir de un grupo de grupos de amino terciario o cuaternario como ligandos insertados en una matriz. Dichos grupos funcionales se seleccionan a partir de los grupos bien conocidos dietil- amino-etilo (DEAE), tri-metil-amino, tri-metil-amino-etilo (TMAE) y otros grupos en los que el material vehfculo puede estar compuesto por celulosa, agarosa, sflice, material polimerico o ceramico. Se consiguen buenos resultados, en particular en la reduccion de fibronectina y vitronectina, con grupos trimetil-amino unidos a un polfmero de 50 metacrilato hidroxilado a traves de un grupo de enlace como GigaCap Q-650M®. Esto es muy sorprendente ya que el qmmicamente similar Marco-Prep High Q®, un copolfmero de metacrilato compuesto por dietilen-glicol- dimetacrilato/glicidil-metacrilato tambien con ligandos trimetil-amino pero con perdida de la funcionalidad hidroxilo en su esqueleto polimerico, es menos eficaz en la reduccion de dichas dos protemas. La reduccion eficaz de la fibronectina pegada es muy ventajosa para filtraciones opcionales, como ultra/diafiltracion o nanofiltracion, ya que 55 aumenta el tiempo de vida de los filtros debido a la reduccion de la obstruccion. Si se pretende que el proceso incluya nanofiltracion, se prefiere realizar el proceso con una solucion diluida (concentracion de fibrinogeno de aproximadamente 2 g/l), en particular con una cascada de nanofiltros. El gel o la resina cromatografica, en particular, se preequilibra con el mismo tampon utilizado para resuspender la pasta de fibrinogeno intermedia antes de aplicar la solucion de fibrinogeno. Las sustancias debilmente unidas se eliminan mediante lavado con tampon de equilibrado

seguido de tampon de lavado (1,5 g/l de citrato sodico, 6,0 g/l de cloruro sodico, ajustado a pH = 6,8 a 7,2, preferiblemente de 6,9 a 7,1 y con una conductividad de 11,0 a 13,0 mS/cm a una temperatura ambiente de 20 a 25°C.

5 A continuacion, el fibrinogeno puede eluirse de la columna cromatografica con un tampon de elucion que contiene 1,5 g/l de citrato sodico y 10,0 g/l de glicina en particular ajustado al mismo intervalo de pH que el tampon de lavado, por ejemplo, mediante Hcl y/o NaOH y ajustado con aproximadamente 7,0 g/l de NaCl a una conductividad de 13,1 a 15 mS/cm a temperatura ambiente de 20 a 25°C. Se recupera en el eluido aproximadamente el 74% del fibrinogeno aplicado a la columna, mientras que se elimina practicamente por completo la fibronectina del eluido que 10 contiene fibrinogeno.

Esta solucion de fibrinogeno filtrada puede concentrarse adicionalmente mediante ultra/diafiltracion hasta aproximadamente de 20 a 26 g/l y se esteriliza mediante filtracion con membranas de < 0,2 pm de tamano de poro nominal. Los expertos en la materia saben que tambien pueden conseguirse otras concentraciones, como de 1 a 15 19,9 g/l o de 26,01 a 30 g/l, o incluso mas altas. El concentrado de fibrinogeno de la presente invencion tambien puede formularse con adyuvantes y estabilizantes conocidos por los expertos en la materia como hidratos de carbono, por ejemplo, sacarosa, trehalosa, aminoacidos, por ejemplo, glicina, histidina, alanina, arginina y detergentes, por ejemplo, poli-oxietilen-(20)-sorbitan-monoleato (TWEEN 80®). Este material a granel esterilizado por filtracion se conserva opcionalmente durante hasta 5 dfas a -70°C o inferior, en particular, a de -70°C a -80°C, antes 20 de esterilizarse por filtracion por segunda vez y distribuirse en recipientes finales y, opcionalmente, liofilizarse o directamente distribuirse en los recipientes finales y, opcionalmente, liofilizarse sin una segunda esterilizacion por filtracion.

No es necesario anadir tampones, estabilizantes, adyuvantes u otros compuestos adicionales, como factor de 25 coagulacion XIII (F XIII). El factor de coagulacion XIII esta presente en el concentrado con actividades >0,05 UI por mg de fibrinogeno (metodo de Clauss), en particular, de 0,07 a 0,3 UI por mg de fibrinogeno, de 0,06 a 0,5 UI por mg de fibrinogeno, o de 0,05 a 1 UI por mg de fibrinogeno.

El concentrado de fibrinogeno producido segun el proceso presentado muestra su estado natural a traves de una 30 relacion fibrinogeno-antfgeno/fibrinogeno-Clauss de 0,80 a 1,10 en particular de 0,85 a 1,05, o de 0,90 a 1,00; un contenido de fibrinopeptido A de 0,01 a 9,0 ng por mg de fibrinogeno (metodo de Clauss), en particular de 0,05 a 8,0 ng por mg de fibrinogeno o de 0,08 a 6,0 ng por mg de fibrinogeno; una actividad VWF:Ag de <0,1 UI por mg de fibrinogeno (metodo de Clauss), en particular de 0,001 a 0,09 UI por mg de fibrinogeno, de 0,002 a 0,07 UI por mg de fibrinogeno, o de 0,002 a 0,04 UI por mg de fibrinogeno; una actividad de factor XIII >0,07 UI por mg de 35 fibrinogeno (metodo de Clauss), en particular de 0,07 a 0,3 UI por mg de fibrinogeno, de 0,08 a 0,5 UI por mg de fibrinogeno, o de 0,07 a 1 UI por mg de fibrinogeno; un contenido de fibronectina de 0,01 a 1,00 pg por mg de fibrinogeno (metodo de Clauss), en particular de 0,03 a 0,70 pg por mg de fibrinogeno o de 0,05 a 0,40 pg por mg fibrinogeno; y una actividad de plasminogeno de 1 a 11 mUI por mg de fibrinogeno. Se determino que la actividad trombina era inferior al lfmite detectable de 0,15 UI/ml para todas las determinaciones y a las mismas 40 concentraciones de fibrinogeno que las presentadas en la tabla 1, la cual es equivalente a menos de 0,007 UI por mg de fibrinogeno o de 0,0069 a 0,0001 UI/mg.

La invencion se explica adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitante.

45 Ejemplo

El crioprecipitado, producido a partir de plasma mediante procedimientos estabilizados, se reconstituyo o solubilizo por encima de pH neutro, se sometio a adsorcion con Al(OH)3 y el gel resultante se elimino mediante centrifugacion. A continuacion, el sobrenadante se trato para inactivar los virus mediante tratamiento solvente/detergente (S/D). Los 50 compuestos S/D, Triton y TnBP se extrajeron con aceite vegetal y la fase acuosa se puso en contacto con Fractogel® EMD-TMAE. Se emplearon condiciones cromatograficas (valor de pH de 6,9 a 7,1 y una osmolalidad de 570 a 610 mOsmol/l) con las cuales el fibrinogeno no se urna al gel y, por tanto, se encontraba en el flujo de paso o en el sobrenadante.

55 La solucion de fibrinogeno no unido se agito durante aproximadamente 90 minutos tras la adicion de glicina (1 mol/l de concentracion final y pH = 7,4) para precipitar el fibrinogeno.

El precipitado que contema fibrinogeno se separo a continuacion mediante centrifugacion, rindiendo una pasta intermedia de fibrinogeno.

El compuesto intermedio preparado de este modo se resuspendio en tampon Tris 20 mM (pH = aproximadamente 8,0). La suspension obtenida se filtro a continuacion y se sometio a ultra/diafiltracion.

5 La solucion que contema fibrinogeno resultante se cargo a continuacion en GigaCap Q-650M® y el gel o resina cromatografica se preequilibro con el mismo tampon Tris utilizado para la resuspension antes de aplicar la solucion de fibrinogeno. Las sustancias debilmente unidas se eliminaron lavando con el tampon de equilibrado seguido de lavado con un tampon de lavado (1,5 g/l de citrato sodico, 6,0 g/l de cloruro sodico, ajustado aproximadamente a pH = 7,0 y una conductividad de aproximadamente 12,0 mS/cm). A continuacion, el fibrinogeno se eluyo de la columna 10 cromatografica con un tampon de elucion (1,5 g/l de citrato sodico y 10,0 g/l de glicina ajustado al mismo pH que el tampon de lavado y ajustado con aproximadamente 7,0 g/l de NaCl a una conductividad de 13,1 a 15 mS/cm).

La solucion de fibrinogeno resultante se concentro, formulo y esterilizo mediante filtracion. Esta solucion a granel esterilizada mediante filtracion se conservo durante 5 dfas a -80°C antes de esterilizarse mediante filtracion una 15 segunda vez y se distribuyo en los recipientes finales. Una parte de los recipientes finales se liofilizaron mientras que otra parte se mantuvo como formulacion lfquida.

Se analizaron los productos de cuatro ensayos de produccion diferentes tras la reconstitucion del producto liofilizado. La reconstitucion de los liofilizados se consiguio mediante la adicion de agua para inyeccion (API) hasta la 20 concentracion previa a la liofilizacion. Todos los ensayos de produccion se realizaron esencialmente de la misma forma que se presenta en el ejemplo. Los resultados se presentan en la tabla 1.

N.° de ensayo: 1 2 3 4 Intervalo

Fibrinogeno segun Clauss (turbidimetrico) [mg/mll: 22,1 22,6 25,0 25,0 22,1-25,0

Antfgeno de Fibrinogeno [mg/mll: 20,7 19,1 22,0 23,0 19,1-23,0

F XIII [Ul/ml]: 2,9 2,5 2,4 2,6 2,4-2,9

VWF:Ag [Ul/mll: 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Fibronectina [Mg/mll: 3,3 4,9 4,5 3,8 3,3-4,9

Fibrinopeptido A [ng/mll: 36 20 10 11 10-36

Tabla 1 25

En la tabla 2 se presenta la normalizacion de los valores medidos mediante el calculo del contenido o la actividad por mg de fibrinogeno, determinado mediante el metodo de Clauss.

N.° de ensayo: 1 2 3 4 lntervalo

Fibrinogeno segun Clauss [mg/mll: 22,1 22,6 25,0 25,0 22,1-25,0

mg de antfgeno de Fibrinogeno /mg Fibr.-Clauss: 0,937 0,845 0,880 0,920 0,845-0,937

Ul de F Xlll/mg Fibr.-Clauss: 0,131 0,111 0,096 0,104 0,096-0,131

Ul de VWF:Ag/mg de Fibr.-Clauss: 0,005 0,004 0,004 0,004 0,004-0,005

Mg de Fibronectina/mg de Fibr.-Clauss: 0,149 0,217 0,180 0,152 0,149-0,217

ng de Fibrinopeptido A/mg de Fibr.-Clauss: 1,629 0,885 0,400 0,440 0,400-1,629

30 Tabla 2

Comparacion con productos comerciales.

En la tabla 3 se muestran los valores medidos de concentrados de fibrinogeno disponibles en el mercado. Todos los 35 productos eran productos liofilizados y se reconstituyeron segun las directrices del fabricante. Tambien se muestra el intervalo de valores de los ensayos 1 a 4 segun la presente invencion como ya se ha mostrado en la tabla 1.

: Producto 1 Producto 2 Producto 3 lnvencion actual

Fibrinogeno segun Clauss (turbidimetrico) [mg/mll: 11,5 9,8 23,7 22,1-25,0

Antfgeno de Fibrinogeno [mg/mll: 16,3 19,1 21,0 19,1-23,0

F Xlll [Ul/mll: <0,2 <0,2 1 2,4-2,9

VWF:Ag [Ul/mll: 14 1,3 3,8 0,1

Fibronectina [Mg/mll: 13,3 258,9 944,3 3,3-4,9

Fibrinopeptido A [ng/mll: 130 1843 814 10-36

Tabla 3

En la tabla 4 se presenta la normalizacion de los valores medidos de productos disponibles en el mercado mediante 5 el calculo del contenido o actividad por mg de fibrinogeno, determinado mediante el metodo de Clauss. Tambien se muestra el intervalo de valores de los ensayos 1 a 4 segun la presente invencion como tambien se muestra en la tabla 2.

: Producto 1 Producto 2 Producto 3 Invencion actual

Fibrinogeno segun Clauss (turbidimetrico) [mg/ml]: 11,5 9,8 23,7 22,1-25,0

mg de antfgeno de Fibrinogeno/mg Fibr.-Clauss: 1,417 1,949 0,886 0,845-0,937

Ul de F Xlll/mg Fibr.-Clauss: <0,017 <0,020 0,042 0,096-0,131

Ul de VWF:Ag/mg de Fibr.-Clauss: 1,217 0,133 0,160 0,004-0,005

Mg de Fibronectina/mg de Fibr.-Clauss: 1,157 26,418 39,844 0,149-0,217

ng de Fibrinopeptido A/mg de Fibr.-Clauss: 11,304 188,061 34,346 0,400-1,629

10 Tabla 4

Comparacion con una realizacion preferida del documento WO 01/48016.

Se extrajo 1 g de pasta de la fraccion I con 8,33 g de tampon de extraccion (NaCl 0,8 M, e-ACA 5 mM (acido epsilon- 15 aminocaproico), citrato sodico 20 mM, heparina a 60 Ul/ml y pH = 7,3, es decir, el tampon del parrafo 1.1.19 mejorado) a 37 °C durante 2 horas. Se anadieron 50 g de una solucion de hidroxido de aluminio al 2% (alhidrogel) al sobrenadante de la extraccion. La mezcla se agito durante 15 minutos a temperatura ambiente, se centrifugo a 5000 g durante 10 minutos y se descarto el sedimento. El sobrenadante del alhidrogel y un tampon de Glicina/NaCl (glicina 2,1 M, citrato sodico 20 mM, NaCl 3,6 M y CaCl2 2,4 mM) se llevaron a 30,2 °C y 29,7 °C, respectivamente, y 20 se anadio el sobrenadante al tampon durante 4,5 minutos. La mezcla de 1 parte de sobrenadante y 2,05 partes de tampon se agito durante 20 minutos a 30,2-31,1 °C y, a continuacion, se centrifugo durante 10 minutos a 5000 g. El precipitado de Gly/NaCl se redisolvio en tampon D, lo que representaba 1/3 del volumen del sobrenadante de la fraccion 1 de extraccion de la pasta a aproximadamente 21 °C con agitacion continua durante 2 horas. El precipitado redisuelto se trato a continuacion con el procedimiento S/D con Polisorbato 80 y TnBP durante 1 hora a 25 concentraciones del 1% (polisorbato 80) y 0,3 % (TnBP) a aproximadamente 23 °C. La cromatograffa de intercambio anionico se realizo con resina MacroPrep® HQ en una columna XK26 y una altura de lecho de aproximadamente 20 cm que representaba una columna de aproximadamente 100 ml a un caudal de 10 ml/min. El equilibrado se llevo a cabo con 2 volumenes de columna de tampon MQ mejorado (TRIS 50 mM, NaCl 100 mM, e-ACA 20 mM a pH =

8.0, parrafo 2.2.3) y una conductividad (tras la columna) que alcanzaba los lfmites de conductividad +/- 10% del 30 tampon MQ. Tras lavar con 6 volumenes de columna de tampon MQ, el fibrinogeno se eluyo en un unico pico con el

tampon ME mejorado (NaCl 500 mM, CaCl2 1,1 mM, citrato sodico 10 mM, Tris 10 mM y sacarosa 45 mM a pH =

7.0, es decir tampon D + 2x200 mM de NaCl).

Los resultados analfticos se presentan en la tabla 5.

: Documento WO 01/48016 lnvencion actual

Fibrinogeno segun Clauss (turbidimetrico) [mg/ml]: 5,90 22,1-25,0

mg de antfgeno de Fibrinogeno/mg Fibr.-Clauss: 0,845 0,845-0,937

Ul de F Xlll/mg Fibr.-Clauss: 0,440 0,096-0,131

Ul de VWF:Ag/mg de Fibr.-Clauss: 0,100 0,004-0,005

Mg de Fibronectina/mg de Fibr.-Clauss: 10,83 0,149-0,217

ng de Fibrinopeptido A/mg de Fibr.-Clauss: 6,02 0,400-1,629

Tabla 5

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un proceso para la purificacion de fibrinogeno a partir de una fuente que contiene fibrinogeno empleando cromatograffa en resinas de intercambio anionico, en el que la resina de intercambio anionico es un

5 polfmero de metacrilato hidroxilado en el que se han insertado grupos trimetilamino a traves de un grupo de enlace.
2. El proceso de la reivindicacion 1, en el que la fuente que contiene fibrinogeno se crioprecipita, preferiblemente se solubiliza a pH aproximadamente neutro.

10 3. El proceso de la reivindicacion 2, en el que la solucion se trata con Al(OH)3 y se elimina el gel

resultante.
4. El proceso de la reivindicacion 2 o 3, en el que se lleva a cabo una inactivacion vmca empleando un tratamiento solvente/detergente (S/D).

15
5. El proceso de la reivindicacion 4, en el que se realiza una extraccion de reactivos S/D con aceite vegetal y se pone en contacto la fase acuosa con una resina TMAE a un valor de pH de 6,9 a 7,1 y una osmolalidad de 570 a 612o mOsmol/l.

20 6. El proceso de la reivindicacion 4 o 5, en el que el fibrinogeno se precipita mediante glicina, en

particular, glicina a aproximadamente 1 M, y con separacion de la pasta de fibrinogeno formada.
7. El proceso de la reivindicacion 6, en el que la pasta de fibrinogeno se resuspende, preferiblemente en tampon TRIS a aproximadamente 20 mM a un pH de aproximadamente 8,0.

25
8. El proceso de la reivindicacion 7, en el que tras la filtracion la fraccion obtenida se carga sobre una resina de intercambio anionico fuerte que comprende grupos trimetilamino insertados en un esqueleto de polfmero de metacrilato hidroxilado a traves de grupos de enlace y las sustancias debilmente unidas se eliminan mediante lavado, preferiblemente con un tampon de lavado con una conductividad de aproximadamente 12,0 mS/cm.

30
9. El proceso de la reivindicacion 8, en el que el fibrinogeno se eluye con un tampon de elucion que contiene citrato sodico, cloruro sodico y glicina, preferiblemente aproximadamente a 1,5 g/l de citrato sodico, aproximadamente 7,0 g/l de cloruro sodico y aproximadamente 10,0 g/l de glicina, ajustado en particular a un pH de aproximadamente 7,0 y una conductividad de 13,1 a 15 mS/cm.

35
10. El proceso de la reivindicacion 9, en el que la fraccion obtenida se concentra, formula, esteriliza mediante filtracion y/o distribuye en recipientes.
11. El proceso de la reivindicacion 10, en el que la fraccion obtenida se liofiliza.

40
12. El proceso de la reivindicacion 1 que comprende las etapas de

a) solubilizacion del crioprecipitado, solubilizado a pH aproximadamente neutro,

b) someter a la solucion a adsorcion con AI(OH)3 y eliminar el gel resultante,

45 c) inactivar los virus en la solucion resultante de la etapa b) mediante un tratamiento solvente/detergente (S/D), extraccion de los reactivos S/D con aceite vegetal y poner en contacto la fase acuosa con una resina TMAE a un valor de pH de 6,9 a 7,1 y una osmolalidad de 570 a 610 mOsmol/l,

d) precipitacion de fibrinogeno, que se encuentra en el flujo de paso o en el sobrenadante de la etapa c), mediante aproximadamente glicina 1 M, y separacion de la pasta de fibrinogeno,

50 e) resuspension de la pasta de fibrinogeno en un tampon TRIS 20 mM a un pH de aproximadamente 8,0, filtracion y, f) cargar la solucion filtrada de la etapa e) en una resina de intercambio anionico fuerte que contiene grupos trimetilamino insertados en un esqueleto de polfmero de metacrilato hidroxilado a traves de grupos de enlace y eliminar mediante lavado las sustancias debilmente unidas con un tampon de lavado con una conductividad de aproximadamente 12,0 mS/cm,

55 g) elucion del fibrinogeno con un tampon de elucion que contiene aproximadamente 1,5 g/l de citrato sodico, aproximadamente 7,0 g/l de cloruro sodico y aproximadamente 10,0 g/l de glicina, ajustado en particular a un pH de aproximadamente 7,0 y una conductividad de 13,1 a 15 mS/cm, h) concentrar, formular, esterilizar mediante filtracion y distribuir en recipientes.
13. Un producto de fibrinogeno que se obtiene mediante el proceso de la reivindicacion 12, que tiene las

siguientes propiedades:

Fibrinogeno segun Clauss (turbidimetrico) [mg/mll

20-26,0

mg de antigeno de Fibrinogeno/mg Fibr.-Clauss

0,8-1,2

UI de F XIII/mg Fibr.-Clauss

0,09-0,14

Mg de Fibronectina/mg de Fibr.-Clauss

0,1-1,0

ng de Fibrinopeptido A/mg de Fibr.-Clauss

0,3-5,0

5 14.

El fibrinogeno de la reivindicacion 13, que se caracteriza porque esta en estado liofilizado.