Antecedente da Invenção
Fibrinogênio, da mesma forma conhecido como fator de coagulação I, desempenha um papel fundamental em hemostasia e cura de ferida. É uma glicoproteína sintetizada no fígado com um peso molecular aparente de 340.000 Da, é composto de dois dímeros, cada um deles construído de três pares de cadeias de polipeptídeo não idênticas chamado Aa, Bβ e Y ligada por pontes de dissulfeto. Circula na corrente sanguínea em uma concentração de aproximadamente 150 - 400 μg/ml. Após lesão de vasos sanguíneos, plaquetas sanguíneas são ativadas e uma tomada é formada. Fibrinogênio está envolvido em hemostasia primária ajudando-se reticulação de plaquetas ativadas.
Em paralelo ativação da cascata de coagulação é iniciada. Como o ponto final, fibrinogênio é convertido em fibrina por liberação proteolítica de fibrinopeptídeo A e em uma taxa mais lenta - fibrinopeptídeo B por trombina. Os monômeros de fibrina solúveis são reunidos em fibrilas retorcidas de filamento duplo. Subsequentemente estas fibrilas são dispostas de uma maneira lateral, resultando em fibras mais grossas. Estas fibras são em seguida reticuladas por FXIIIa em uma rede de fibrina, que estabiliza a tomada de plaqueta por interações da fibrina com plaquetas ativadas, resultando em um coágulo estável.
Distúrbios e deficiências
Afibrinogenaemia congênita é um distúrbio de hemorragia raro, onde pacientes estão sofrendo coagulação inadequada do sangue devido a falta ou mau funcionamento de fibrinogênio. Esta condição médica poderia levar a episódios de hemorragia espontâneos ou hemorragia excessiva depois de traumas menores ou durante procedimentos intervencionais.
Deficiências adquiridas em fibrinogênio são muito mais comuns do que afibrinogenaemia congênita e podem ser induzidas por hemodiluição ou outros eventos tais como perdas de sangue durante cirurgia, trau-mas, coagulação intravascular disseminada (DIC) ou sépsis.
Deficiências de fibrinogênio podem ser corrigidas em níveis de fibrinogênio normais em plasma de cerca de 1,5-3 g/l por terapia de substituição com infusão intravenosa de plasma congelado fresco ou crioprecipitado. Entretanto, estes tratamentos são aflitos com o risco de introdução de pató- 5 genos, por exemplo, vírus ou príons, em um paciente e existem por gerar distúrbios adicionais. É desse modo aconselhável intravenosamente aplicar composições de fibrinogênio inativadas por vírus para restabelecer fibrino- gênrcrem níveis fisiológicos_de uma maneira suave.
Enquanto existe fibrinogênio em preparações chamadas cola de 10 fibrina, adesivo de fibrinogênio, cola de tecido e similar, estas preparações são pretendidas para uso tópico como pós, pastas, espumas ou em combinação com tecidos como emplastro em feridas, eles não são usáveis para aplicação intravenosa como sua consistência e composição imediatamente iniciaria eventos trombóticos ao ser injetado. Estas preparações adicional- 15 mente contêm trombina, sais de cálcio e quantidades relativamente altas de fator de coagulação XIII. Exemplos para tais preparações são U- SA12008/003272, WOA95/22316 ou USA12008/181878.
Processos para produção de fibrinogênio são conhecidos a partir de EPB11 240 200 que refere-se a um método de purificar fibrinogênio a 20 partir de uma solução contendo fibrinogênio, compreendendo, aplicação de uma solução contendo fibrinogênio em uma matriz de troca iônica, sob condições tal que fibrinogênio liga-se à matriz, lavando a matriz de troca iônica com uma solução de tampão compreendendo pelo menos um co-aminoácido, eluindo o fibrinogênio a partir da matriz com um tampão consistindo em 10 25 mM de Tris, 10 mM de citrato, 45 mM de sacarose; e NaCI em uma concentração de 200mM a 1,0M, e opcionalmente recuperando o fibrinogênio a partir do eluato.
EPB10 771 324 refere-se a um processo para produção de um concentrado de fibrinogênio livre de vírus é obtido submetendo-se uma fra- 30 ção de plasma solubilisada contendo fibrinogênio em um tratamento inativa- ção virai químico, isto é um tratamento S/D ou de solvente/detergente, submetendo a fração inaticada virai resultante a precipitação em uma solução contendo um aminoácido em um pH ácido para obter um sobrenadante, filtrando o sobrenadante para obter um concentrado de fibrinogênio purificado, e recuperando o concentrado de fibrinogênio purificado. O concentrado de fibrinogênio recuperado é submetido a radiação ultra violeta para uma segunda inativação de vírus. O produto é estabilizado e liofilizado antes de uma terceira inativação de vírus.
EPB11 519 944 ensina o uso de uma matriz de cromatografia de -afinidade-de-íonde-metaHmobiltzada-sob-condições-queo~fibriríõgenioê plasminogênio ligam-se à matriz, e seletivamente eluindo o fibrinogênio e 93% de plasminogênio separadamente a partir da matriz.
EPB10 555 135 descreve um método para produção de um fibrinogênio intravenosamente aplicável por purificação de uma solução de fibrinogênio em um gel de troca aniônica com base em agarose reticulada compreendendo grupos amina quaternários. O fibrinogênio produzido é referido estar livre de fator VIIlc.
EPB11 457 497 refere-se a um processo para remover vírus em soluções de fibrinogênio caracterizadas por estabilização e congelamento da solução e descongelamento subsequente do mesmo. Separação de materiais não dissolvidos ocorre antes da diluição da proteína e é seguida por na- nofiltração da solução resultante usando filtros de um tamanho de poro menor do que 35 nm.
USA12006/0009376 da mesma forma descreve um método para fabricar fibrinogênio. Seguindo dissolução repetida e precipitação de fibrinogênio para remover fator XIII.
Goheen, S., C. e outro relatado em Journal of Chromatography A. 816 (1998) 89-96, cerca de cromatografia de troca iônica HPLC da albumina de proteínas de plasma, fibrinogênio, e imunoglobulina (G) em materiais de coluna não porosos contendo amina quaternária ou grupos funcionais de sulfopropila.
Sumário da invenção
Um objetivo da invenção é fornecimento de um concentrado de fibrinogênio com patógeno dedicado eliminando e/ou inativando etapas no
processo de produção para superar reações adversas ou desenvolvimento de doenças relacionadas a patógeno. Os referidos patógenos são selecionados a partir dos grupos de bactérias, vírus e príons, tal como escefa- lopatia espongiforme de proteína de príon (PrPsc). Aplicação sistêmica de um tal produto de fibrinogênio por meio de rotina intravenosa permite tratamento de afibrinogenemia congênita e deficiências de fibrinogênio adquiridas. Aplicação deste concentrado de fibrinogênio padronizado permite tratamento -rápido-em-situações-de-emergênciasem~descongelamento—demõrãdõdeT plasma congelado fresco e carga de volume diminuída e propriedades de coagulação seguras devido a composição essencialmente constante.
Um outro objetivo deste pedido é fornecimento de um processo para fabricar um concentrado em um nível industrial, isto é várias centenas a milhares de litros de material de partida, tal como sangue ou plasma de sangue, embora uma produção em escala pequena, isto é algum 1/10 litro a alguns litros, é da mesma forma possível.
Estes e outros objetos são realizados por um processo de acordo com as reivindicações 1 a 14 e um produto obtenível pelo processo da invenção como reivindicado de acordo com as reivindicações 15 a 19.
Em geral, o processo da invenção para purificação ou fabricação de fibrinogênio a partir de fibrinogênio contendo fontes compreende as etapas de:- formar um precipitado enriquecido por fibrinogênio adicionando-se pelo menos um agente de precipitação à fonte contendo fibrinogênio;- opcionalmente isolar o precipitado enriquecido por fibrinogênio por exemplo por centrifugação do referido precipitado;- empregar o precipitado enriquecido por fibrinogênio em um meio aquoso formando uma solução contendo fibrinogênio, opcionalmente seguido por filtração e/ou ultra/diafiltração;- submeter a solução contendo fibrinogênio a uma cromatografia em uma fase estacionária tendo o grupos de trocadores aniônicos fortes contatando-se a referida solução com a referida fase sob condições que fibrinogênio liga-se a referida fase; - seguido por um eluição de fibrinogênio a partir da fase estacionária por meios de uma solução aquosa tendo uma resistência iônica mais alta do que a resistência iônica da etapa anterior, rendendo uma fração enriquecida por fibrinogênio que é coletada; - opcionalmente seguido por etapas subsequentes de diluição e/ou concentração da fração enriquecida por fibrinogênio;- e opcionalmente carregamento da fração enriquecida por fibri- _nogênio_emfrasconetesadequados; —
Em uma modalidade do processo de fabricação da invenção a fonte contendo fibrinogênio é selecionada a partir do grupo consistindo em plasma de sangue, frações de plasma, tal como fração I, ou crioprecipitado, culturas de célula produzindo fibrinogênio e/ou sobrenadantes das referidas culturas de célula. Se crioprecipitado não for usado como material de partida, um fibrinogênio contendo intermediário como material de partida é produzido por métodos bem conhecidos como descrito por Cohn, Kistler-Nitschmann e modificações do mesmo.
Para obter um produto utilizável farmacêutico é vantajoso que a fonte contendo fibrinogênio seja submetida a um processo de inativação de vírus, por exemplo, um processo detergente de solvente.
De acordo com outra modalidade da invenção a inativação de vírus é realizada antes de formar um precipitado enriquecido por fibrinogênio. Entretanto, é da mesma forma possível realizar uma inativação de vírus em um estágio diferente.
De acordo contudo outra modalidade da invenção a remoção de substâncias de inativação de vírus é realizada por extração de óleo e/ou cromatografia com trocadores de ânion fortes.
Agente de precipitação típico para uso no processo de fabricação da invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em aminoácidos tais como glicina, concentrações de sal altas (precipitação por saturação) ou polietileno glicol.
De acordo com ainda outra modalidade da invenção a absorção é ressuspensa de uma pasta em um tampão tendo um pH de 7,5 a 8,5.
De acordo com uma outra modalidade da invenção a fase estacionária tem grupos aminos terciários ou quaternários.
As etapas de cromatografia no processo de fabricação da invenção podem em particular ser realizadas em uma coluna.
Tipicamente a forma de armazenamento da fração enriquecida por fibrinogênio carregada está em estado líquido, estado congelado, preferivelmente a <-15°C, preferivelmente abaixo de -30°C, ou como liofilizado.
Matéria_objeto-da-preseRte-invenção-é-da-rnesrrra-fornTa_cnTra fração enriquecida por fibrinogênio obtenível de acordo com o processo de fabricação da invenção. A fração enriquecida por fibrinogênio da invenção contém, por exemplo, 0,01-9,0 ng de fibrinopeptídeo A por mg de fibrinogênio. Além disso a fração enriquecida por fibrinogênio da invenção contém 0,80-1,10 mg de fibrinogênio-antígeno por mg de fibrinogênio, determinado pelo método de Clauss; atividade de VWF:Ag de < 0,1 IU por mg de fibrinogênio; atividade de fator de coagulação XIII >0,07IU por mg de fibrinogênio; 0,01-1,00 μg de fibronectina por mg de fibrinogênio e menos do que 0,03 IU de trombina por mg de fibrinogênio.
O concentrado de fibrinogênio é carregado em recipientes finais depois da filtração estéril e o pode ser armazenado em forma líquida, líquida congelada ou liofilizada.
Fibrinogênio produzido de acordo com este processo é caracterizado por quantidades muito baixas de impurezas que averiguam a natividade do produto e permitem tratamento a longo prazo das pessoas em necessidade. FXIII é preferível na concentração contida, porque suporta estabilização da fibrina formada, enquanto uma sobrecarga desta transglutaminase é evitada.
Os termos "compreendendo", "compreende" ou "compreendem" podem da mesma forma ser substituído por "consistindo"," consiste" ou" consistem" sem alterar a descrição da descrição.
Descrição Detalhada
Embora em princípio todas as fontes contendo fibrinogênio podem ser usadas de acordo com a invenção, crioprecipitado é uma fonte pre- ferida e o seguinte crioprecipitado serve como uma fonte típica de fibrinogênio na outra descrição do processo de fabricação da invenção.
Tipicamente crioprecipitado é reconstituído ou solubilizado sob condições de tampão adequadas em particular a cerca de pH neutro (6,9-7,0 5 por exemplo em um tampão de solução contendo Na-citrato e NaCI), submetido a absorção em particular com AI(OH)3 e o gel resultante removido por exemplo por centrifugação. O sobrenadante podem em seguida se tornar vírus ínativado. Dor_exemplo. -por-tratamente-de solvente/detergente (S/D): Este método é bem conhecido à pessoa versada e foi descrito originalmente 10 em EP-A-131 740. Compostos de S/D tal como Triton (O-[4-(1,1,3,3- Tetrametilbutil)fenoxi]-polietoxietanol) e TnBP (Tri-n-butil-fosfato) são em particular removidos por extração com óleo de rícino. Para outra purificação a fase de água pode ser submetida a um processo cromatográfico. Tipicamente isto pode ser realizado contatando-se a fase de água com um gel de 15 troca aniônica forte, tri-metil-amino-etil (TMAE) enxertado em material de matriz, tal como Fractogel® EMD-TMAE. Bons resultados são obteníveis se a cromatografia é realizada com tampões tendo um valor de pH de 6,9-7,1 e uma osmolaridade de 570-610 mosmol/l. Sob estas condições de fibrinogênio não é ligado à fase estacionária e consequentemente encontrada no flu- 20 xo total ou sobrenadante, o último se um processo de batelada-cromato- grafia é realizado.
Uma solução de fibrinogênio não ligada, contendo tipicamente cerca de 40 g/l (método Clauss'turbidometric) é ajustada em pH=7,0-8,0, em particular em pH=7,3-7,5. Depois da adição de um agente de precipitação 25 adequado, por exemplo, glicina, em uma concentração de 0,8-1,2 M, em particular 0,9-1,1M a solução resultante pode ser agitada durante 60-120 minutos para precipitar fibrinogênio. Os precipitados contendo fibrinogênio pode em seguida ser separado por centrifugação e esta pasta de fibrinogênio intermediária poderia ser armazenado a < -70°C, preferivelmente a -100°C a -70°C, para até um mês. Já uma única precipitação, por exemplo, com glicinafornece uma pasta de fibrinogênio suficientemente pura para outro processamento.
O intermediário desse modo preparado pode ser ressuspenso em um tampão de Tris de 10-30 mM (pH=7,5 a 8,5), em particular um tampão de Tris de 15-25 mM com pH=7,5-8,5. A suspensão obtida pode em seguida ser filtrada e ser submetida a ultra/diafiltração, por exemplo, contra 5 5 vezes do volume de suspensão do mesmo ou um tampão diferente.
A solução contendo fibrinogênio resultante é em seguida carregada em um gel de troca de ânion forte preferivelmente selecionado a partir dejjm grupo_de_grupos-amino-terciários-ouquaternários-comoHigantesen^ xertados em uma matriz. Os referidos grupos funcionais são selecionados a 10 partir de dietil-amino-etila bem conhecido (DEAE), tri-meti-amino, tri-metil- amino-etila (TMAE) e outros grupos visto que o material de veículo pode ser composto de celulose, agarose, sílica, material polimérico ou cerâmica. Bons resultados, em particular na redução de fibronectina e vitronectina, podem ser obtidos com grupos trimetil-amino enxertados em um polímero metacríli- 15 co hidroxilado por meio de um grupo de ligação tal como GigaCap Q-650M®. Isto é muito surpreendente como o Marco-Prep Q® High quimicamente similar, um copolímero metacrílico composto de dietileno-glicol-dimetacrila- to/glicidil-metacrilato da mesma forma com ligantes de trimetil-amino, porém perde a funcionalidade de hidroxila em sua cadeia principal polimérica, é 20 menos eficiente na redução das referidas duas proteínas. A redução eficaz da fibronectina pegajoso é muito vantajosa para filtrações opcionais, tal como ultra/diafiltração ou nanofiltração, como a vida de filtros é aumentada devido a entupimento reduzido. Se o processo é pretendido incluir nanofiltração, é preferido realizar o processo com uma solução diluída (concentração 25 de fibrinogênio de cerca de 2 g/l), em particular com uma cascata de nanofil- tros. O gel cromatográfico ou resina é em particular pré-equilibrado com o mesmo tampão quando usado para ressuspender a pasta de fibrinogênio intermediária antes de aplicar a solução de fibrinogênio. Substâncias livremente ligadas foram lavadas fora com tampão de equilíbrio seguido por 30 tampão de lavagem (1,5 g /1 de citrato de sódio, 6,0 g /1 de cloreto de sódio, ajustado em pH=6,8-7,2, preferivelmente 6,9-7,1, e possuindo a condutivida- de de 11,0-13,0 mS/cm em temperatura ambiente de 20-25°C).
Fibrinogênio pode em seguida ser eluído da coluna cromatográ- fica com um tampão de eluição contendo 1,5 g/l de citrato de sódio, e 10,0 g/l de glicina ajustado em particular na mesma faixa de pH como o tampão de lavagem por exemplo por HCI e/ou NaOH e ajustado com cerca de 7,0 g/l NaCI à condutividade de 13,1-15 mS/cm em temperatura ambiente de 20- 25°C. Aproximadamente 74% do fibrinogênio aplicado sobre a coluna são recuperados no eluato, ainda fibronectina é quase completamente removida -do^eluato-contendo-fibrinogênio. —
Esta solução de fibrinogênio filtrada pode também ser concentrada por ultra/diafiltração a cerca de 20-26 g/l e filtrada estéril com membranas de <0,2 μm de tamanho de poro nominal. Pessoas versadas na técnica conecem que outras concentrações, tal como 1-19,9g/l ou 26,01-30 g/l ou ainda mais altas são da mesma forma realizáveis. O concentrado de fibrinogênio da presente invenção pode da mesma forma ser formulado com adjuvantes e estabilizadores conhecidos pela pessoa versada tal como carboidratos, por exemplo, sacarose, trealose, aminoácidos, por exemplo, glicina, histidina, alanina, arginina e detergentes, por exemplo monooleato de polio- xietileno-(20)-sorbitano (TWEEN 80®). Este volume filtrado estéril é opcionalmente armazenado durante até 5 dias a -70°C ou inferior, em particular a -70°C a -80°C, antes de ser filtrado estéril durante uma segunda vez e carregado em recipientes finais e opcionalmente secados por congelamento ou diretamente carregados em recipientes finais e opcionalmente secados por congelamento sem uma segunda filtração estéril.
Não é necessário adicionar tampões, estabilizadores, adjuvantes ou outros compostos, como fator de coagulação XIII (F XIII). Fator de coagulação XIII está presente no concentrado com atividades de >0,05IU mg por fibrinogênio (método de Clauss), em particular 0,07-0,3IU mg por fibrinogênio, 0,06-0,5IU mg por fibrinogênio, ou 0,05-1 IU mg por fibrinogênio.
O concentrado de fibrinogênio produzido de acordo com o pro-cesso apresentado revela sua natividade através de uma relação de fibrino- gênio-antígeno/fibrinogênio-Clauss de 0,80-1,10 em particular 0,85-1,05, ou 0,90-1,00; um teor fibrinopeptídeo-A 0,01-9,0 ng por mg de fibrinogênio (mé todo de Clauss), em particular 0,05-8,0 ng por mg de fibrinogênio ou 0,08-6,0 ng por mg de fibrinogênio; uma atividade de VWF:Ag de < 0,1 IU por mg de fibrinogênio (método de Clauss), em particular 0,001-0,09 IU mg por fibrinogênio, 0,002-0,07IU mg por fibrinogênio, ou 0,002-0,04 IU mg por fibrinogênio; uma atividade de fator XIII de >0,07IU mg por fibrinogênio (método de Clauss), em particular 0,07-0,3IU mg por fibrinogênio, 0,08-0,5IU mg por fibrinogênio, ou 0,07-1 IU mg por fibrinogênio; um teor de fibronectina de 0,01- 1,00 μg mg por fibrinogênio ímétodo_de-ClaussUem-partiejjlar-O O3^0-7O pg mg por fibrinogênio ou 0,05-0,40 μg por mg de fibrinogênio; e uma atividade de plasminogênio de 1-11 mIU por mg de fibrinogênio. Atividade de trombina foi determinada ser mais baixa do que o limite detectável de 0,15IU/ml para todos os ciclos e às mesmas concentrações de fibrinogênio como apresentado na tabela 1, que é equivalente a menos do que 0,007 IU por mg de fibrinogênio ou 0,0069-0,0001 IU/mg.
A invenção é também explicada pelo seguinte exemplo não limi- tante.
Exemplo
Crioprecipitado, produzido de plasma por métodos estabelecidos, foi reconstituído ou solubilizado a cerca de pH neutro, submetido a adsorção com AI(OH)3 e o gel resultante removido por centrifugação. O sobrenadante foi em seguida inativado de vírus por tratamento de solvente/detergente (S/D). Compostos de S/D, Triton e TnBP foram extraídos com óleo vegetal e a fase de água foi contatada com Fractogel® EMD-TMAE. Condições croma- tográficas (valor de pH de 6,9-7,1 e uma osmolaridade de 570-610 mosmol/l) foram empregadas sob qual o fibrinogênio não ligou ao gel e consequentemente encontrou no fluxo total ou sobrenadante.
A solução de fibrinogênio não ligada foi agitada durante cerca de 90 minutos depois da adição de glicina (1mol/l concentração final e pH=7,4) para precipitar fibrinogênio. O precipitado contendo fibrinogênio foi em seguida separado por centrifugação, rendendo uma pasta de fibrinogênio intermediária.
O intermediário desse modo preparado foi ressuspenso em 20mM de tampão de Tris (pH = cerca de 8,0). A suspensão obtida foi em seguida filtrada e submetida a ultra/diafiltração.
A solução contendo fibrinogênio resultante foi em seguida carregada em GigaCap Q-650M® e o gel cromatográfico ou resina foi pré- 5 equilibrado com o mesmo tampão de Tris como usado para ressuspensão antes de aplicar a solução de fibrinogênio. Substâncias livremente ligadas foram lavadas com o tampão de equilíbrio seguido por lavagem com um tampão de lavagem_C1-5_g-/-Lde-citrato-de-sódio-6TQ-g-/-l-de-cforeto-de-sódT07 ajustado a cerca de pH=7,0 e uma condutividade de cerca de 12,0 mS/cm).
Fibrinogênio foi em seguida eluído da coluna cromatográfica com um tampão de eluição (1,5 g/l de citrato de sódio, e 10,0 g/l de glicina ajustado ao mesmo pH como o tampão de lavagem e ajustado com cerca de 7,0 g/l NaCI para a condutividade de 13,1-15 mS/cm.).
A solução de fibrinogênio resultante foi concentrada, formulada e 15 filtrada estéril. Este volume filtrado estéril foi armazenado durante 5 dias a - 80°C antes de ser filtrado estéril durante uma segunda vez e depositado em recipientes finais. Uma parte de recipientes finais foi liofilizada enquanto a outra parte foi mantida como uma formulação líquida.
Os produtos de quatro ciclos de produção diferentes foram ana- 20 lisados depois da reconstituição de produto liofilizado. Reconstituição de liofi- lizados foi realizada por adição de água para injeção (WFI) até a concentração antes da liofilização. Todos os ciclos de produção foram realizados essencialmente da mesma maneira como apresentado no exemplo. Resultados são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 Tabela 2 apresenta a normalização de valores medidos por cálculo de teor ou atividade por mg de fibrinogênio, determinado pelo método de Clauss.
Tabela 2Comparação com produtos comercialmente disponíveis.
Tabela 3 descreve valores medidos de concentrados de fibrinogênio comercialmente disponíveis. Todos os produtos foram produtos liofili- zados e foram reconstituídos de acordo com diretrizes de fabricantes. Da mesma forma mostrado é a faixa de valores de ciclos 1-4 de acordo com a 10 presente invenção como mostrado na tabela 1.Tabela 3Tabela 4 apresenta a normalisação de valores medidos de produtos comercialmente disponíveis por cálculo de teor ou atividade por mg de fibrinogênio, determinado pelo método de Clauss. Da mesma forma mostra- 15 do é a faixa de valores de ciclos 1-4 de acordo com a presente invenção como mostrado na tabela 2.
![Figure img0004](https://patentimages.storage.googleapis.com/25/54/34/1f34fc621147bb/img0004.png)
Tabela 4Comparação com uma modalidade preferida de WO 01/48016.1g de pasta de Fração I foi extraído com 8,33g de tampão de extração (0,8M de NaCI, 5mM ε-ACA (epsilon-ácido aminocapróico), 20mM de 5 citrato de Na, 60 IU/ml de heparina e pH=7,3, isto é o tampão melhorado doparágrafo 1,1.19) a 37°C durante 2 horas. 50g de uma solução de hidróxido de alumínio a 2% (alidrogel) foi adicionada ao sobrenadante da extração. A mistura foi agitada 15 minutos em temperatura de ambiente, centrifugada a 5000g durante 10 minutos e a pelota foi descartada. O sobrenadante de ali- 10 drogei e um tampão de Glycin/NaCI (2,1M de glicina, 20mM de citrato de Na,3,6M de NaCI e 2,4mM de CaCI2) foi trazido respectivamente a 30,2°C 29,7°C e o sobrenadante foi adicionado ao tampão dentro de 4,5 minutos. A mistura de 1 parte de sobrenadante e 2,05 partes de tampão foi agitada durante 20 minutos a 30,2-31,1 °C e depois centrifugada durante 10 minutos a 15 5000g. O precipitado de Gly/NaCI foi ressolubilisado em tampão D representando 1/3 do volume do sobrenadante da extração de pasta de fração 1 a cerca de 21 °C em agitação contínua durante 2 horas. O precipitado ressolubilisado foi depois disso S/D tratado com Polissorbato 80 e TnBP durante 1 hora em concentrações de 1% (Polissorbato 80) e 0,3% (TnBP) a cerca de 20 23°C. Cromatografia de troca aniônica foi realizada com resina MacroPrepHQ em uma coluna XK26 e cerca de altura de leito de 20cm representando cerca de 100ml de volume de coluna em uma taxa de fluxo de 10ml/minutos. Equilíbrio ocorre com 2 volumes de coluna de tampão de MQ melhorado (50mM de TRIS, 100mM de NaCI, 20mM de ε-ACA em pH=8,0, parágrafo 2.2.3) e condutividade (pós coluna) alcançando os determinados limites de condutividade +-10% de tampão de MQ. Depois de lavar com 6 volumes de coluna de tampão de MQ, fibrinogênio foi eluído em um único pico com tampão melhorado ME (500mM de NaCI, 1,1 mM de CaCI2, 10mM de citrato deNa, 10mM de Tris e 45mM de sacarose em pH=7,0, isto é tampão D + 2x200mM de NaCI). Resultados analíticos são apresentados na tabela 5.
![Figure img0005](https://patentimages.storage.googleapis.com/0c/29/ba/ed7b093fe3834e/img0005.png)
Tabela 5