KR101080622B1 - Ｖｉｉｉ:ｃ 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및 VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 포함하는 액체로부터 분별 침전에 의해 고분자량의 폰 빌레브란트 인자 다량체의 함량이 증가되고 vWF:Ag에 대한 vWF:RCoF 활성의 비율이 1을 초과하는 VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
폰 빌레브란트 인자, VIII:C 인자, 분별 침전

Description

ＶＩＩＩ:Ｃ 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물 및 이의 제조방법{Concentrate of a factor VIII:C-containing von Willebrand factor and the process relating thereto}
본 발명은 이의 특정 조성 때문에 치료학적 장점을 갖는 VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물에 관한 것이다.
당단백질인 기능성 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor: vWF)는 소위 다량체로서 분자량이 다양하게 분포하여 혈류를 순환하고 다량체는 분자량 분포가 500 kd 내지 20000 kd일 수 있다. 당해 다량체내의 최소 단위는 분자량이 약 550kd인 이량체로서 디설파이드 브릿지에 의해 서로 연결된 2개의 단량체로 구성된다. 추가로, 이들 이량체의 디설파이드 연결에 의해 소위 다량체인 중합체가 생성되고 분자량은 20000kd 이하이다. 폰 빌레브란트 다량체의 분자량 분포는 아가로스 겔 전기영동에 의해 정량적으로 및 정성적으로 측정될 수 있다[참조문헌: 1, 2, 3]. 폰 빌레브란트 인자의 생리학적 기능은 손상 내피에 접착하여 혈소판을 응집시키는 성질을 갖는다는 것이다[참조문헌: 4]. 이로써 소위 1차 지혈 과정을 유도하는데 초기에 혈소판 플러그를 형성함에 따라서 초기에 출혈을 막고 이어서 소위 제2 지혈 과정인 응고 다단계증폭반응(cascade)를 유도하여 최종적으로 상처를 아물게한다.
폰 빌레브란트 인자의 추가로 중요한 기능은 VIII:C 인자(FVIII:C)와의 복합체를 형성하는 능력이고 이러한 vWF와의 복합체 형성은 혈장중에서 단백질 분해로부터 FVIII:C를 보호한다. 건강한 유기체에서는 vWF와의 복합체에 존재하는 FVIII:C의 수준이 항상 충분히 높다. 이와 관련하여, 2개의 단백질 FVIII:C 및 vWF는 FVIII:C의 경쇄의 N-말단과 vWF 서브유니트의 N-말단이 비공유 결합하여 연결되는 것으로 추정된다[참조문헌: 5, 6].
상기 유형의 연합은 예를 들어, 폰 빌레브란트 환자에서의 대용을 위해 건강한 증여자의 혈장 기원의 냉침전물의 사용시 관측가능하다. 정상적인 냉침전물로의 대체는 환자에서 수시간 지속적으로 FVIII:C의 증가를 유도한다. vWF의 반감기에 따라서 서서히 감소한다.
항혈우병 인자인 VIII 응고 단백질 인자(FVIII:C)는 비공유적으로 결합된 복합체로서 vWF와 함께 혈장을 순환하고 vWF/FVIII:C 복합체의 예비 분리는 가능하지만 어렵다. 오랜 기간 동안 vWF와 FVIII:C가 체내에서 상이한 위치(FVIII:C는 간에서 합성되고 vWF는 내피 세포 및 거핵세포에서 합성된다)에서 합성되는 2개의 상이한 단백질임이 밝혀지지 않았다[참조문헌: 9, 10].
vWF의 부재 또는 심지어 이의 감소조차도 지속적인 출혈을 유도하고 심각한 출혈 경향을 유도한다. 병리학적 상태는 폰 빌레브란트 증후군으로서 불리우고 몇가지 형태로 나타날 수 있다. 이들은 vWF 다량체의 비정상적인 크기 분포로부터 기능성 폰 빌레브란트 인자의 부분적 부재 또는 완전한 부재(소위 III형 폰 빌레브란트 증후군)의 범위에 이른다. 이들 경우에, 고분자량의 다량체 및 저분자량의 다량체 둘 다가 감소되거나 심지어 완전히 부재일 수 있다. 폰 빌레브란트 증후군(예를 들어, III형)은 FVIII:C를 결핍시키고 따라서 혈우병 A을 발병시키는데 그 이유는 FVIII:C가 vWF와의 복합체로서 보호되어야만 하는데 이것 없이는 혈장에서 매우 짧은 시간내에 단백질 분해되기 때문이다.
혈우병 환자에서 대용으로 정상적인 냉침전물의 사용시 측정 가능한 FVIII:C 활성이 단지 신속하게 일시적으로 증가하는 것으로 관찰된다[참조문헌: 7, 8]. 그러나, 폰 빌레브란트 환자의 대용으로 혈우병을 앓는 환자 기원의 혈장 또는 냉침전물의 사용시에, 역설적으로 또한 FVIII가 측정가능하게 증가한다. 이것은 vWF에 의한 안정화에 의해 설명될 수 있다. 폰 빌레브란트 환자는 FVIII를 합성하지만 FVIII는 방출 후 혈장에서 연속적으로 단백질 분해되어 절단된다.
vWF는 정상적인 응고를 위해 FVIII:C와 함께 매우 중요하다. vWF의 혈장 농도는 약 10㎍/ml이다. FVIII:C는 질량 관점에서 약 0.2㎍/ml의 매우 소량인 단백질이다.
처음에 언급한 바와 같이, vWF는 손상된 혈관에서 혈소판 응집에 이어서 1차 지혈 과정을 매개한다. 소위 접촉 인자, FVIII:C, 인지질 및 칼슘과 같은 또 다른 응고촉진 인자와 함께 피브린이 형성되고 상처가 아물때까지 추가의 응고가 VIII 인자의 활성화를 통해 일어난다[참조문헌: 11].
vWF/FVIII:C 복합체는 분리되기가 어려운데 이러한 이유 때문에 FVIII:C는 냉침전물에서 vWF와 함께 발견되고 겔 여과에서 공극 용적에서 vWF와 함께 용출된다[참조문헌: 12].
vWF/FVIII:C를 농축시키기 위한 혈장 산업에서 흔히 사용되는 과정은 냉침전법이다. 여기에서, 불용성 침전물(냉침전물)은 심층 동결된 혈장의 해동을 조절하여 수득된다. 당해 침전물을 제거함으로써 냉침전물 뿐만 아니라 소위 냉-결핍 혈장이 수득된다. 냉침전물은 몇몇 혈장 단백질 피브리노겐 및 피브로넥틴과 함께 농축된 vWF/FVIII:C 복합체를 포함한다. 냉침전물에서 vWF 다량체 스펙트럼은 정상적인 혈장과 비교하여 효과적인 조성의 다량체를 포함한다. 당해 과정에서 침전되는 다량체는 주로 고분자량의 다량체이고 혈장으로부터 거의 모든 고분자량의 vWF 다량체가 냉침전물로서 회수된다. 어떠한 측정가능한 활성을 나타내지 않는 vWF의 약 20%는 냉 결핍 혈장중에 FVIII:C와 함께 잔류한다.
건강한 사람 기원의 풀링(pool)된 혈장은 정의에 따라 모든 응고 인자를 기준으로 1 IU/ml 기능 활성을 갖는다. vWF의 기능 활성은 통상적으로 온전한 vWF의 농도와 관련있는 리스토세틴 매개 혈소판 응집에 의해 측정된다. 이것은 농도를 IU/ml로서 나타내면서 vWF 리스토세틴 조인자 활성(vWF:RcoF)으로서 기재한다. 연합 단백질은 vWF 항원(약칭: vWF:Ag)으로서 언급된다.
중증 폰 빌레브란트 질환의 경우에, FVIII:C의 높은 기능성 함량을 함유하는 vWF 농축물의 높은 기능성 함량을 사용한 대체는 상당한 장점이 있다. 한편으로는, 결합된 응고촉진 VIII:C 인자는 결합 능력에 대한 척도이고 온전한 vWF를 나타내며, 다른 한편으로는 FVIII:C의 존재가 출혈 시간을 상당히 단축시킨다. FVIII:C가 없는 경우, 추가의 FVIII:C 제품을 투여하는 대체가 폰 빌레브란트 질환에 필요할 것이다. 폰 빌레브란트 질환에서 신속한 효능에 대한 전제 조건은 vWF가 정상적인 FVIII:C 인자 결합 능력을 갖고 유리하게 고분자량의 vWF 다량체의 함량이 풍부하고 온전한 VIII:C 인자의 함량이 풍부해야만 한다는 것이다.
유럽 특허원 제0 705 846호(참조문헌: 13)는 폰 빌레브란트 인자를 vWF의 고분자량의 분획물과 저분자량의 분획물로 분리시키는 분취 방법을 기술하고 있다. 이러한 분리는 vWF가 친화성 지지체에 결합하고 이로부터 상이한 염 농도에서 용출됨으로써 성취된다. 이러한 방식으로, 특히 생리학적 활성이 높은 고분자량의 vWF 분획물을 수득할 수 있다.
vWF를 고분자량의 다량체와 저분자량의 다량체로 분획시키기 위한 크로마토그래피 방법이 이미 보고되어 있다. 그러나, 이들 경우에, 고분자량의 vWF 다량체가 풍부한 최적의 vWF/FVIII:C 복합체를 특이적으로 수득할 수 없었다.
또한, 재조합 FVIII이든지 또는 폰 빌레브란트 인자로부터 해리된 혈장 FVIII간에 FVIII:C는 반복적으로 고농도로 투여된다면 목적하지 않은 면역 반응을 유도할 수 있고 항체 생산은 제조 방식 및 순도에 따라 상이한 정도로 유도될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 혈우병 A 억제인자 또는 FVIII:C 억제인자로 불리우는 이들 항체는 문헌[참조: Thrombos. Diathes haemorrh. (Stuttg.), 1975, 34, 869(참조문헌:14)]에 기재된 바와 같이 "베테스다 단위"로 정량적으로 측정될 수 있고 목적하지 않은 역효과를 유도하며 경우에 따라 출혈을 유도한다.
이들 FVIII:C 생성물이 다량체 폰 빌레브란트 인자와 예비 항온처리되는 경 우, 이들 항-FVIII 면역글로불린의 생성이 실질적으로 예방되고 비교적 대량이 이들 역효과에 대해 염려할 필요 없이 반복적으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 생성물은 사용시 상당한 장점을 갖고 있다. 이러한 관계는 혈우병 마우스 모델에서 입증되었다[참조문헌: 15].
특허청구범위 제1항에서 청구된 발명은 고분자량의 vWF 다량체가 풍부하고 vWF:Ag에 대한 vWF:RCoF 활성의 비율이 1을 초과하는 VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물을 제조하는데 있어서의 문제점을 근거로 한 것이다.
상기된 문제점은 특허청구범위 제1항에 기재된 농축물에 의해 해결된다. 당해 농축물은 VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 함유하는 액체로부터 분별 침전시켜 수득되고 폰 빌레브란트 인자의 고분자량 다량체의 함량이 증가되었고 vWF:Ag에 대한 vWF:RCoF 활성의 비율이 1을 초과한다.
본 발명에 의해 성취되는 장점은 VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 포함하는 액체로부터 단순한 예비 분별 침전에 의해 수득될 수 있는 VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물을 제공할 수 있다는 것이고 농축물의 고분자량의 다량체의 함량이 증가되고 vWF:Ag에 대한 vWF:RCoF 활성의 비율이 1를 초과한다는 것이다. 당해 방식으로 수득된 농축물은 중증 폰 빌레브라트 질환의 경우에 대용물로서 적합하다. 결합된 응고촉진 인자 VIII:C가 vWF에 의해 안정화됨에 따라서 출혈 시간을 상당히 단축시키기 때문에 VIII:C 인자의 존재가 이와 관련하여 매우 중요하다. 고함량의 고분자량의 다량체는 이의 신속한 효능을 위한 필수 전제 조건이다.
추가로, 본 발명의 유리한 양태가 특허청구범위 제2항에 기재되어 있다.
본 발명의 농축물은 사람 혈장, 혈장 분획물, 예를 들어, 냉침전물 또는 유전학적으로 변형된 세포 물질로부터 수득될 수 있다. 이를 위한 바람직한 출발 물질은 혈장 단백질 피브리노겐 및 피브로넥틴 뿐만 아니라 vWF-FVIII:C 복합체를 포함하는 사람 냉침전물이다. 이러한 냉침전물은 가열을 조절(평형화)하여 0 내지 +2℃에서 액체 상태로 전환되는 심층 동결된 시트레이트화된 혈장으로부터 수득되고, 피브리노겐, 피브로넥틴 및 vWF:FVIII:C 복합체의 일부가 침전물로서 잔류하고 예를 들어, 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 당해 방식으로 수득된 냉침전물은 심층 동결되어 일시적으로 저장될 수 있고 정제된 vWF/FVIII:C 복합체를 수득하기 위한 출발 물질로서 사용된다.
본 발명의 농축물은 바람직하게 아미노산, 특히, 글라이신 및 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 바람직하게, 염화나트륨을 사용하는 분별 침전에 의해 수득된다. 이를 위해서는, 피브리노겐이 용액으로부터 실질적으로 거의 침전될때까지 글라이신이 교반된 수용액에 첨가될 필요가 있다. 이어서, 침전된 피브리노겐 잔사를 원심분리로 제거한다. vWF/FVIII:C 복합체는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 교반과 함께 첨가하여, 바람직한 양태에서는 염화나트륨을 교반과 함께 첨가하여 상등액으로부터 침전되고 원심분리에 의해 제거된다. 당해 방식으로 수득된 vWF/FVIII:C-함유 침전물은 등장 완충액으로 용해시키고 슈크로스 및 글라이신으로 안정화시킴에 이어서 저온 살균(pasteurization)시킨다.
특히, 글라이신 70 내지 160g/l 및 염화나트륨 100 내지 160g/l의 농도를 이용하여 vWF/FVIII:C-함유 침전물을 침전시키는 것이 유리하다. 상기 농도 범위를 조정하여 vWF:RCoF 활성을 보다 높이는 쪽으로 활성/비율을 전환시킬 수 있고 이것은 고분자량의 vWF 다량체가 풍부한지 여부와 연관되어 있다. 또한, 침전을 위해서, 글라이신 이외에 기타 생리학적 아미노산 또는 심지어 비생리학적 아미노산, 예를 들어, α-알라닌, α-, β- 또는 γ-아미노부티르산, 라이신, 발린, 아스파라긴 및 글루탐산 및 유사한 화학 구조를 갖는 물질이 적합하다. 따라서, 예를 들어, 침전물은 글라이신과 유사한 방식으로 β-알라닌을 사용하여 수득된다.
알칼리 금속 및 알칼리 토금속 그룹으로부터 유래된 5 내지 30중량%의 염(바람직하게는 염화나트륨)의 범위에서 적합한 이온 강도와 함께, 침전제, 예를 들어, 아미노산, 바람직하게, 글라이신의 특정 농도 범위를 조정하여 활성 비율을 vWF:RCoF 활성을 보다 높이는 쪽으로 전환시킬 수 있고 이것은 고분자량의 vWF 다량체를 풍부하게 한다. 여기에서, 글라이신 농도가 주요 역할을 하며 본 발명은 또한 이에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 초기에 용해된 냉침전물을 수산화알루미늄 현탁액과 혼합하여 소량으로 포집되는 프로트롬빈 복합체를 흡수함에 이어서 교반시키고 제거하는 방식으로 간편하게 수행된다. 이어서, 상등액은 분별 침전에 의해 수득되는 VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 함유한다.
냉침전물을 교반과 약한 가열에 의해 등장 완충액에 용해시켜 단백질 농도가 2 내지 3%가 되게한다. 당해 방식으로 수득된 조 냉 용액을 이어서 수산화알루미늄과 혼합하고 프로트롬빈 복합체 인자를 흡수하고 잔류하는 프로트롬빈 인자가 교반동안에 흡수되고 Al(OH)3 펠렛과 함께 제거된다. 프로트롬빈 복합체 인자를 제거한 후, DE 44 44 045에 따라 냉 용액을 저온 살균하거나 아크리딘 또는 아크리딘 유도체로 바이러스 불활성화시키고 안정화시킬 수 있는데 안정화를 위해 칼슘 이온이 특히 적합하다.
이어서, 바이러스 불활성화 후 수득된 냉 용액에 교반과 함께 글라이신을 첨가하고 피브리노겐을 침전시키고 원심분리로 제거한다. 이어서, NaCl을 수득한 상등액에 교반과 함께 첨가하고 이어서 vWF/FVIII:C를 침전시킴에 이어서 원심분리에 의해 제거한다. 수득한 vWF/FVIII:C-함유 침전물을 등장 완충액에 용해시키고 슈크로스 및 글라이신으로 안정화시킴에 이어서 10시간동안 60℃에서 가열한다. 저온 살균 후, 수득한 용액을, 고분자량의 다량체 함량이 풍부한 vWF/FVIII:C 복합체를 수득하기 위한 출발 물질로서 사용한다.
본 발명의 예시된 양태는 실시예 1 내지 6에 기재되어 있다.
실시예 1
냉침전물의 용해, Al(OH) 3 흡수 및 피브리노겐 제거
냉침전물 200g을 0.1M NaCl/글라이신 용액 800ml중에 용해 분리시킨다. 냉 용액을 1.5% 농도의 Al(OH)3 현탁액 10용적%와 혼합하고 15분 동안 교반시키고 원심분리한다. 제거된 Al(OH)3 펠렛을 버린다. 피브리노겐이 용액으로부터 퇴적될 때까지 글라이신을 교반된 Al(OH)3 상등액(820ml)에 첨가한다. 침전물을 원심분리하고 vWF/FVIII:C 복합체 함유 상등액을 추가로 가공한다.
vWF/FVIII:C 복합체 침전, 용해, 안정화, 저온 살균
15% NaCl을 교반된 글라이신-함유 상등액에 첨가하고 vWF/FVIII:C 복합체를 정량적으로 침전시킨다. 침전물을 NaCl/글라이신 완충액 64ml중에 용해시키고 슈크로스(1g/ml)과 글라이신(150g/l)으로 안정화시키고 60℃에서 10시간동안 저온 살균한다. 냉각 후, 저온 살균된 용액을 동일한 용적의 글라이신/NaCl 완충액으로 희석시킨다.
고분자량의 다량체 함량이 증가된 vWF/FVIII:C 분획물의 침전
침전 배지 0.75부를 교반과 함께 각각 3개의 뱃치 a, b, c중에 희석된 용액(220ml)[1.6g/l의 NaCl 및 124.4g/l의 글라이신 함유]에 첨가하여 침전 뱃치 글라이신 함량이 a) 80g/l, b) 90g/l 및 c) 100g/l이 되게하고 모든 경우에 NaCl의 최종 농도는 122g/l에 도달한다. 각각 경우에 미세 침전물이 생성되고 약 45분 동안 교반시킨 후 원심분리한다. 이어서 등장 완충액중에 용해된 분획물(각각의 경우 44ml)은 하기 표 1에 수치 비율로서 나타낸 바와 같이 고분자량의 다량체가 풍부한 vWF 및 FVIII:C를 함유한다. vWF: RCoF 활성, vWF: Ag 및 FVIII: C에 대한 분석은 하기의 비율과 같다.
실시예 1의 뱃치중에 FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
출발 물질 1:3.1 1:2.5 1:1.2
뱃치 a 1:2.4 1:0.7 1:3.6
뱃치 b 1:3.1 1:1.3 1:2.4
뱃치 c 1:3.5 1:1.8 1:2.4
Al(OH)3 흡수에 다른 냉 용액(참조) 1:1.6 1:2.6 1:0.6
표 1은 출발 물질에서 vWF:Ag 대 vWF:RCoF의 비율이 1에 근사치임을 보여준다. 뱃치 a 내지 c에서, 비율은 vWF:Ag와 비교하여 vWF:RCoF 활성을 선호하여 3배 증가한다.
실시예 2
이 경우에, 고분자량의 다량체가 풍부한 분획물을 수득하기 위한 출발 물질은 냉침전물로부터 수득된, 예비 분획되고, 저온살균된 vWF:FVIII:C-함유 용액이다. 용액은 청명하고 균질하며 이러한 공정 단계에서 1.6g/l의 NaCl 및 124.4g/l의 글라이신을 함유한다.
본 발명에 따라 vWF/FVIII:C 복합체의 제1 침전물을 침전시키기 위해, 여러 뱃치중 각 경우에 따라 채택된 침전 배지를 첨가하여 NaCl/글라이신 평형을 조정함으로써 고분자량의 vWF 다량체를 우선적으로 침전시키고 이것은 vWF:Ag에 대한 vWF:RCoF 활성 농도 비율에 의해 조사될 수 있고 명백하게 1를 초과한다.
제1 침전물을 원심분리한 후, 상등액내 글라이신 농도를 각각 증가시키고(제2 침전) 상등액중에 잔류하는 vWF를 또한 침전시킨다. 이러한 제2 침전물에서 고분자량의 함량은 명백히 감소하고 이것은 항원 농도에 대한 vWF:RCoF 활성 비율이 감소함으로써 명백해진다.
3개의 침전 뱃치, a, b, c에 대한 기재
출발 물질 용적에 0.75배인 침전 배지 용적(150ml)을 각각 출발 물질 200ml에 첨가하고 첨가가 종료될 때까지 교반한다. 미세 침전물을 제조하고 원심분리한다.
vWF/FVIII:C-함유 출발 물질 200ml은 이미 1.6g/l 농도의 NaCl 및 124.4g/l 농도의 글라이신을 함유하고 있다.
제1 침전물을 수득하기 위해, 침전 배지는 하기 농도의 NaCl 및 글라이신을 갖는다.
뱃치 a에 대한 침전 배지 283g/l NaCl 글라이신 부재
뱃치 b에 대한 침전 배지 283g/l NaCl 45g/l 글라이신
뱃치 c에 대한 침전 배지 283g/l NaCl 90g/l 글라이신
상응하는 침전 배지 150ml을 뱃치 a 내지 c 각각의 출발 물질 200ml에 첨가하여 특정 침전 뱃치중에 하기와 같은 NaCl 및 글라이신의 최종 농도가 되게한다.
NaCl 글라이신
뱃치 a 122.2g/l 71.1g/l
뱃치 b 122.2g/l 90.4g/l
뱃치 c 122.2g/l 109.6g/l
수득한 침전물을 제거하고 용해시킨다. vWF:RCoF, vWF:Ag 및 FVIII:C 농도는 용해된 침전물(∼ 42ml)에 대해 측정하고 하기 표 2에 나타낸다.
FVIII:C[IU/ml] vWF:RCoF[IU/ml] vWF:Ag[IU/ml]
출발 물질 14.7 39.8 35.0
뱃치 a 11.2 24.2 8.2
뱃치 b 44.7 138.7 87.2
뱃치 c 46.3 150.3 113.7
첨가제 각각의 비율은 표 2로부터 계산되고 표 3에 나타낸다.
실시예 2의 뱃치들중의 FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
출발 물질 1:2.7 1:2.4 1:1.1
뱃치 a 1:2.2 1:0.7 1:3.0
뱃치 b 1:3.1 1:2.0 1:1.6
뱃치 c 1:3.5 1:2.5 1:1.3
뱃치 a 내지 c에서 달성되는 vWF:Ag 대 vWF:RCoF 활성 비율은 출발 물질과 비교하여 vWF:RCoF 활성을 선호하는 방향으로 전환되는데 이것은 고분자량의 다량체가 증가하였음을 의미한다.
뱃치 a 내지 c의 상등액으로부터의 침전물 또는 제2 침전
뱃치 a 내지 c의 상등액에 글라이신을 교반시키면서 첨가하여 모든 3개의 뱃치의 글라이신 농도가 각각 160g/l이 되게한다. 수득한 침전물을 원심분리하고 용해시킨다. vWF:RCoF, vWF:Ag 및 FVIII:C의 농도를 측정한 후 수치 비율을 계산한다. 비율은 표 4에 나타낸다.
실시예 2 뱃치의 FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
뱃치 a의 제2 침전 1:4.5 1:3.7 1:1.1
뱃치 b의 제2 침전 1:7.65 1:12.1 1:0.63
뱃치 c의 제2 침전 1:5.9 1:15.4 1:0.26
표 4에 나타낸 제2 침전은 vWF:Ag 대 vWF:RCoF 비율이 vWF:RCoR 활성에서 명백히 감소하였음을 보여주고 이것은 고분자량의 다량체의 양이 감소함에 따라서 vWF 기능이 감소하였음을 시사한다.
실시예 3
실시예 2에서와 같이, 예비 분획되고 저온 살균된 vWF 및 FVIII:C를 함유한 완전히 청정한 용액을 사용하고 이러한 제조 단계에서 당해 용액은 1.6g/l의 NaCl 및 124.4 g/l의 글라이신을 함유한다. 각각의 경우 동일한 NaCl/글라이신 농도를 갖는 4개의 침전 뱃치에서 첨가 시간 및 항온 처리 시간을 다양하게 한다.
글라이신 농도가 실시예 1 및 실시예 2와 비교하여 침전 뱃치에서 보다 높다. 침전 뱃치 1 내지 4는 첨가 시간 및 항온 처리 시간만이 상이하여 침전을 일으키는 vWF:Ag/vWF:RCoF 비율이 노출 시간에 의존하지 않고 주로 글라이신 농도에 의존함을 확립하고 입증할 수 있다.
각각의 뱃치 1 내지 4에서, 283.01g/l의 NaCl 및 133.58g/l의 글라이신을 함유한 침전 배지 150ml을 각각 교반과 함께 출발 물질 200ml에 첨가한다. 변수는 첨가 시간 및 항온 처리 시간이고 NaCl 및 글라이신 농도는 표 5에서 명백한 바와 같이 모든 뱃치에서 동일하다.
실시예 3의 침전 뱃치에서 첨가 시간 및 항온 처리 시간
첨가[분] 항온 처리[분] NaCl 농도[g/l] 글라이신 농도[g/l]
뱃치 1 120 30 122.2 128.3
뱃치 2 60 60 122.2 128.3
뱃치 3 60 90 122.2 128.3
뱃치 4 60 240 122.2 128.3
수득한 침전물을 원심분리하고 용해시킨다. 추가의 결정 글라이신 농도가 160g/l이 되도록 뱃치 1의 상등액을 조정하고 2시간동안 교반시킨다. 수득한 침전물을 또한 용해시킨다. FVIII:C, vWF:RCoF 및 vWF:Ag 활성 함량을 측정하고 서로에 대한 비율을 계산한다. 이들은 표 6에 나타낸다.
실시예 3 뱃치의 FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율; FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
뱃치 1 1:2.4 1:2.7 1:0.9
뱃치 1의 제2 침전 글라이신 1:1.4 1:5.3 1:0.3
뱃치 2 1:2.1 1:2.9 1:0.7
뱃치 3 1:2.3 1:2.7 1:0.9
뱃치 4 1:2.3 1:3.0 1:0.8
이 경우에, 뱃치 1 내지 4는 상이한 첨가 시간 및 항온 처리 시간에도 불구하고 측정된 첨가제의 비율이 거의 유사한 것으로 나타난다. NaCl 농도 및 글라이신 농도는 모두 4개의 뱃치에서 동일하다.
뱃치 1의 제2 침전만이 명백히 상이하다. vWF 리스토세틴 조인자 함량이 명백히 감소하였고 vWF:Ag 함량은 크게 증가하였다. 고분자량의 다량체가 용해된 제2 침전(나타내지 않음)에서는 확실히 존재하지 않았다.
실시예 4
본 경우에 출발 물질은 또한 1.6g/l의 NaCl 및 124.4g/l의 글라이신을 함유하는 예비 정제된 vWF/FVIII:C 분획물이다.
뱃치 1: 본 경우에, 283.01g/l의 NaCl 및 133.5g/l의 글라이신을 함유하는 침전 배지 150ml을 교반시키면서 출발 물질 200ml에 첨가한다. 침전이 완료될때까지 계속 교반함에 이어서 침전물을 원심분리하고 용해시키고 활성을 측정한다.
뱃치 1a: 농도가 160g/l에 도달할때까지 추가의 글라이신을 잔류 상등액에 교반시키면서 첨가하고[제2 침전] 제2 침전의 침전물을 원심분리하고 용해시키고 활성을 뱃치 1에서와 같이 측정한다.
뱃치 2: 300g/l의 NaCl을 함유하지만 글라이신을 함유하지 않는 또 다른 침전 배지 1부를 동일한 출발 물질 1부에 첨가한다. 첨가를 종료한 후에, 글라이신 농도는 66.7g/l이고 NaCl 농도는 151.5g/l이다. 수득한 침전물을 원심분리하고 용해시키고 활성을 뱃치 1에서와 같이 측정한다.
뱃치 2a: 글라이신 농도 160g/l에 도달할때까지 글라이신을 첨가하여 뱃치 2의 잔류 상등액을 또한 추가로 침전시킨다. 침전물을 원심분리하고 용해시키고 활성을 측정한다(제2 침전).
침전 글라이신 및 NaCl 농도
침전 뱃치에서 NaCl 농도[g/l] 침전 뱃치에서 글라이신 농도[g/l]
뱃치 1 122.2 128.3
제2 침전 1a 122.2 160.0
뱃치 2 151.5 66.7
제2 침전 2a 151.5 160.0
vWF:RCoF, vWF:Ag 및 FVIII:C를 측정하여 표 8에 나타낸 바와 같은 비율을 수득한다.
실시예 4 뱃치의 FVIII:C, vWF:RCoF, vWF:Ag 비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
뱃치 1 1:2.7 1:2.9 1:0.9
제2 침전 1a 1:10.5 1:11.3 1:0.9
뱃치 2 1:2.4 1:1.8 1:1.3
제2 침전 2a 1:2.6 1:4.8 1:0.6
표 8에서, 뱃치 1 및 뱃치 2는 vWF 농축물에 유리한 다량체 분포를 나타내고 심지어 뱃치 2에서 보다 높은 고분자량의 다량체가 제공된다. 고분자량의 함량은 뱃치 1a 및 특히, 뱃치 2a(나타내지 않음)에서 감소한다.
실시예 5
뱃치 A
고분자량의 vWF 다량체가 풍부한 농축물의 제조
실시예 1에서와 같이, 3.64kg의 냉침전물을 vWF 및 FVIII:C-함유 희석된 저온 살균된 용액 약 4000ml로 가공한다.
고분자량의 vWF 다량체 및 FVIII:C가 풍부한 분획물을 수득하기 위한 침전 과정
침전 배지(24.44g의 NaCl, 24.15g의 글라이신, 2000ml의 WFI, pH 6.8) 3000ml을 60분에 걸쳐 교반시키면서 저온살균된 희석된 vWF/FVIII:C 용액 4000ml에 첨가하고 90분 동안 교반 없이 계속 항온 처리한다. 형성된 침전물을 6000 x g에서 45분 동안 원심분리기로 원심분리한다. 수득한 침전물(침전물 1)을 용해 완충액(1.46g의 NaCl, 10.14g의 글라이신, 500ml의 WFI, pH 7.0)으로 400ml중에 용해시킨다.
안정화, 최종 제제, 동결건조
고분자량의 vWF 다량체가 풍부한 수득한 용액을 0.5% 사람 알부민을 사용하여 안정화시키고 3.5g/l의 NaCl, 5.8g/l의 트리-Na 시트레이트 x 2H2O, 20g/l의 글라이신을 함유하는 완충액(pH 7.0)으로 투석한다. 투석한 후 30000 x g에서 60분 동안 용액을 초원심분리한다. 초원심분리한 후의 상등액을 버린다. 초원심분리된 용액을 이어서 I부 및 II부로 분할한다. I부는 여과에 의해 안정화시키고 용기에 담아 동결건조시킨다. II부는 그대로 방치하고 용기에 담아 동결건조시킨다. 미생물이 대부분 고속 초원심분리동안에 제거되는 것으로 공지되어 있다. 분할하는 목적은 당해 비율에 대해 여과에 의한 안정화 효과 및 여과에 의한 안정화 후 고분자량의 다량체의 스펙트럼이 변화되지 않는지의 여부를 조사하기 위한 것이다.
이후에, 표 9에 나타낸 바와 같이, 당해 비율 및 또한 이에 따른 고분자량의 다량체 스펙트럼은 약간의 생성물 희석과 조작 손실과는 별도로 유지한다.
WFI과의 동결 건조 및 재구성은 농축물이 vWF:Ag와 비교하여 보다 높은 vWF:RCoF 농도를 갖게한다. 이것은 고분자량의 vWF 다량체의 함량이 비교적 높기 때문이고 vW 증후군의 징후에 특정 장점을 제공한다.
뱃치 B
고분자량의 다량체가 감소된 분획의 vWF/FVIII:C-함유 농축물의 제조
주로 저분자량의 다량체 분획물을 후기에 추가의 제조 뱃치로부터 수득한다[뱃치 B 및 침전물 2로서 언급됨].
실시예 1에서와 같이, 냉침전물 3.64kg을 vWF 및 FVIII:C를 함유하는 희석된 저온 살균된 용액 약 4000ml로 가공한다. 침전시켜 고분자량의 vWF 다량체 및 FVIII:C가 감소된 분획물을 수득한다.
침전 배지(350g의 NaCl, 165.1g의 글라이신, 1000ml, WFI, pH 6.8) 3000ml을 60분에 걸쳐 교반시키면서 저온 살균된 희석된 vWF/FVIII:C 용액 4000ml에 첨가하고 교반 없이 90분 동안 계속 항온 처리한다. 형성된 침전물을 6000 x g에서 45분 동안 원심분리기로 원심분리한다. 수득한 침전물을 용해 완충액(용해 완충액: 1.46g의 NaCl, 10.14g의 글라이신, 500ml의 WFI, pH 7.0) 400ml중에 용해시킨다.
상기 분획물은 뱃치 A의 침전물 1과 거의 동일하고 추가로 사용될 때까지 심층 동결시키고 당해 뱃치로부터 수득한 상등액을 저분자량의 vWF 다량체 분획물을 수득하는데 사용한다.
글라이신 농도를 증가시켜 상등액을 추가로 침전시킨다.
약 40l의 상등액을 교반과 함께 25 ± 2℃에서 60분에 걸쳐 30g/l의 글라이신을 추가로 첨가하여 침전시키고 추가로 교반 없이 60분 동안 항온처리한다. 뱃치의 최종 농도는 122g/l의 NaCl 및 158g/l의 글라이신이다. 형성된 침전물을 60분 동안 6000 x g에서 원심분리기로 원심분리한다. 이어서 수득한 침전물(침전물 2)을 용해 완충액(1.46g의 NaCl, 10.14g의 글라이신, 500ml의 WFI, pH 7.0) 250ml중에 용해시킨다. 상등액을 버린다.
고분자량의 vWF 다량체의 함량이 감소된 수득한 용액을 0.5% 사람 알부민으로 안정화시키고 3.5g/l의 NaCl, 5.8g/l의 트리-Na 시트레이트 x 2H2O, 20g/l의 글라이신, pH 7.0)을 함유한 완충액으로 투석한다.
투석 후 용액을 60분 동안 30000 x g에서 초원심분리한다. 초원심분리 후 상등액을 버리고 여과하여 안정화시키고 용기에 담는다.
WFI와 함께 동결 건조 및 재구성은 농축물이 vWF:Ag와 비교하여 보다 적은 vWF:RCoF 농도를 갖도록 한다.
실시예 5의 재구성된 농도의 활성/비율
활성
FVIII:C[IU/ml] vWF:RCoF[IU/ml] vWF:Ag[IU/ml]
침전물 1
I 부		 25.1 75.0 26.1
침전물 1
II 부		 35.7 93.0 34.2
침전물 2 12.8 60.5 63.8
비율
FVIII:C 대 vWF:RCoF FVIII:C 대 vWF:Ag vWF:Ag 대 vWF:RCoF
침전물 1
I 부		 1:3.0 1:1.0 1:2.9
침전물 1
II 부		 1:2.4 1:1.0 1:2.7
침전물 2 1:4.7 1:5.0 1:0.9

실시예 6
78IU/ml의 vWF:RCoF, 80IU/ml의 vWF:Ag 및 미량의 FVIII:C를 함유하는 폰 빌레브란트 인자 농축물 기원의 혈장을 3개의 뱃치(a, b, c) 각각에 100IU의 재조합 FVIII:C를 함유하는 항온 처리 상등액 200ml에 첨가한다. 항온 처리 용액을 1.6g/l NaCl 및 124g/l의 글라이신으로 조정한다. 하기의 글라이신/NaCl 조성의 침전 배지 150ml을 각각의 뱃치에 첨가하고 교반시킨다.
뱃치 a 122.2g/l의 NaCl 71.1g/l의 글라이신
뱃치 b 122.2g/l의 NaCl 90.4g/l의 글라이신
뱃치 c 122.2g/l의 NaCl 109.6g/l의 글라이신
형성된 침전물을 60분 동안 30000 x g에서 원심분리기로 원심분리한다. 수득한 침전물을 용해 완충액(1.46g의 NaCl, 10.14g의 글라이신, 500ml의 WFI, pH 7.0)중에 용해시키고 분석한다.
본 경우에, 동일한 NaCl 함량 및 낮은 글라이신 농도에서 제1 FVIII:C 침전물과 함께 주로 고분자량의 다량체를 관찰할 수 있다.
이로부터 크기에 따른 vWF 다량체의 분별은 재조합 FVIII:C 및 혈장 vWF 둘 다를 함유할 수 있는 항온처리 상등액중에서 NaCl 및 글라이신을 사용하여 평형을 적절히 조정하여 성취될 수 있다.
참조문헌 목록
Figure 112003036813581-pat00001
Figure 112003036813581-pat00002
본 발명의 침전법에 의해, 고분자량의 다량체가 매우 풍부한 FVIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물을 수득할 수 있다.

Claims (11)

1) 0.93 내지 2.13mol/ℓ (70 내지 160g/ℓ) 농도의 글라이신을 사용하는 침전 단계 및
2) 1.17 내지 2.74mol/ℓ (100 내지 160g/ℓ) 농도의 염화나트륨을 사용하는 침전 단계를 포함하는, VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 함유하는 액체를 분별 침전시키는 방법에 의해 수득됨을 특징으로 하는, vWF:Ag 단위(unit)에 대한 vWF:RCoF 활성 단위의 비율이 1을 초과하는, VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물.
제1항에 있어서, 사람 혈장, 혈장 분획물 또는 유전학적으로 변형된 세포 물질로부터 수득됨을 특징으로 하는 농축물.
제1항에 따른 농축물을 포함함을 특징으로 하는, 혈우병 A 및 폰 빌레브란트 증후군을 치료하기 위한 약제.
제3항에 있어서, 안정화제로서 칼슘 이온을 포함함을 특징으로 하는 약제.
제3항 또는 제4항에 있어서, 침전 단계 1)이 0.93 내지 1.46mol/ℓ (70 내지 110g/ℓ) 농도의 글라이신을 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 약제.
1) 0.93 내지 2.13mol/ℓ (70 내지 160g/ℓ) 농도의 글라이신을 사용하는 침전 단계 및
2) 1.17 내지 2.74mol/ℓ (100 내지 160g/ℓ) 농도의 염화나트륨을 사용하는 침전 단계
를 포함하는, VIII:C 인자 및 폰 빌레브란트 인자를 함유하는 액체를 분별 침전시킴을 특징으로 하는, VIII:C 인자-함유 폰 빌레브란트 인자의 농축물을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 농축물내 폰 빌레브란트 인자 다량체의 양 및 리스토세틴 조인자 활성이, 글라이신 및 NaCl의 농도를 조정하여 낮은 농도에서 우선적으로 고분자량의 다량체를 침전시키고 고농도에서 저분자량의 다량체를 침전시킴에 의해 조절됨을 특징으로 하는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 농축물 또는 이의 제조 동안에 수득한 전구체 생성물이 안정화되고 저온 살균되는 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 액체를 수산화알루미늄 현탁액과 혼합하여 소량으로 포집되는 프로트롬빈 복합체를 흡수함에 이어서 교반시키고 제거하며 피브리노겐을 글라이신으로 침전시켜 제거하고 이어서 vWF:FVIII:C 복합체를 침전시키고 용해, 안정화 및 저온 살균 시킨 후 제6항에 따라 분별 침전시킴을 특징으로 하는 방법.
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