JPS5944322A - 抗血友病性因子濃厚物の調製法 - Google Patents
抗血友病性因子濃厚物の調製法Info
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- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高度に精製された人間の抗血友病性因子調製
物の新規な調製法に関する。本弁明の更なる目的は以下
の記述から明らかになるであろう。
物の新規な調製法に関する。本弁明の更なる目的は以下
の記述から明らかになるであろう。
なお本明細書において、部及びバーセン1−は断らない
限り重量によるものとする。
限り重量によるものとする。
人間の血液の凝固か、13の異なる因子の中介する一連
の反応を含む複雑な過程で起こることは公知である。ま
た血友病の原因は固体が抗血友病性因子としているいろ
知られているこれらの因子の1つ、AHF、AHG、因
子■父は因子■Cを適度の凝固をもたらすのに十分な量
で合成重る能力のないことであることも公知Cある。血
友病患者の約40%は△l−I Fを合成する能ノJに
欠()、一方伯は能力が弱いとされている。血友病患者
に対しC出血の処置に又はf術に際L(投りり−るlこ
めにAl−1F濃厚物の乾燥調製物が市販されCいる。
の反応を含む複雑な過程で起こることは公知である。ま
た血友病の原因は固体が抗血友病性因子としているいろ
知られているこれらの因子の1つ、AHF、AHG、因
子■父は因子■Cを適度の凝固をもたらすのに十分な量
で合成重る能力のないことであることも公知Cある。血
友病患者の約40%は△l−I Fを合成する能ノJに
欠()、一方伯は能力が弱いとされている。血友病患者
に対しC出血の処置に又はf術に際L(投りり−るlこ
めにAl−1F濃厚物の乾燥調製物が市販されCいる。
この△1−1F濃厚物は公知の技術を用いることにより
人間の供与者の血漿から冑らhる。、使用萌には、乾燥
哨原物を無菌水に溶解し、iQられる(H液を静脈内に
投与ずく)。
人間の供与者の血漿から冑らhる。、使用萌には、乾燥
哨原物を無菌水に溶解し、iQられる(H液を静脈内に
投与ずく)。
凹通の市販の八HF調製物は科忰なΔl−I F t−
ない。むしろぞれは而明から冑られる△HFに冨んだ画
分てあり、曲の成分を含有するつ△f−I F i騎り
物はできる限り純粋Cあることか望ましいが、△1−I
Fを自明から分離ダる方法を改良1ノて帥度を高める
ことは自明成力の分離が困φIfなために実際上は容易
−でない。Δ1−([は血漿中のイの含量が(((り月
つその活性が不安定なために分11atと精製が全く困
難である。公知の八HF 濃厚物は、Co1団のLタノ
ール分別法により血漿から分離した画分■或いは血漿を
7F#桔し、次いでで−れを低温で融解づることによっ
て得られるクリA7レシビデー1−< cryopre
cipitate >から調製される。しかしながらそ
れらはすl\°Cが低純度の粗生成物であり、多量のa
llを素原を含んでいる。これを多量に或いはしばしば
繰返して投与する場合、それらはIli!i環系に過負
荷の線帷素原をもたらすから、患者の状態を臨床的に全
く危険にするかも知れない。史に、各調製剤の活性には
バラツキがあるから正確な投与量を決めることは困難で
ある。上述の理由のために、現在の傾向は、高度に精製
され且つ高度に濃縮されたAI−I F glil製物
を多量の血漿から1りることにある。従来開示されてい
る高性能のA I−I F W4厚物は一般に先′?l
’ A HFの粗両分例えはC0II+1の画分■又は
クリオブレシビテ−1へを調製づることによって製造さ
れる。
ない。むしろぞれは而明から冑られる△HFに冨んだ画
分てあり、曲の成分を含有するつ△f−I F i騎り
物はできる限り純粋Cあることか望ましいが、△1−I
Fを自明から分離ダる方法を改良1ノて帥度を高める
ことは自明成力の分離が困φIfなために実際上は容易
−でない。Δ1−([は血漿中のイの含量が(((り月
つその活性が不安定なために分11atと精製が全く困
難である。公知の八HF 濃厚物は、Co1団のLタノ
ール分別法により血漿から分離した画分■或いは血漿を
7F#桔し、次いでで−れを低温で融解づることによっ
て得られるクリA7レシビデー1−< cryopre
cipitate >から調製される。しかしながらそ
れらはすl\°Cが低純度の粗生成物であり、多量のa
llを素原を含んでいる。これを多量に或いはしばしば
繰返して投与する場合、それらはIli!i環系に過負
荷の線帷素原をもたらすから、患者の状態を臨床的に全
く危険にするかも知れない。史に、各調製剤の活性には
バラツキがあるから正確な投与量を決めることは困難で
ある。上述の理由のために、現在の傾向は、高度に精製
され且つ高度に濃縮されたAI−I F glil製物
を多量の血漿から1りることにある。従来開示されてい
る高性能のA I−I F W4厚物は一般に先′?l
’ A HFの粗両分例えはC0II+1の画分■又は
クリオブレシビテ−1へを調製づることによって製造さ
れる。
AHF淵厚物の従来の分別法は、濃厚物かhラムクロマ
トクラフィー、ポリエチレングリコール(PEG)又は
ポリプロピレンクリコール(1〕PG)lt1M法、ク
リシン(又は他のアミノ酸)沈殿法、並びにアルコール
沈殿法により線帷素源及び他の蛋白質から分離できるこ
とを示しCいる。英国特許第1507198月及び米I
)特許第39730 C’> 24は1)目と温度の調
節を利用しく△HFa厚物をいくらか精製し、中位の純
度の低性能調製物を製造している。これらの特81に記
jIされている方法は、クリAプレシビテー1〜自体よ
りもクリAブレシビテ−1〜から抽出した両分を利用し
ている。更に1)Hと冷却の調節の′1リイクル後に5
7別を停止しCいる。他のものも1叶1と冷加の調節の
1サイクルを用いる効果を認めている(J、K。
トクラフィー、ポリエチレングリコール(PEG)又は
ポリプロピレンクリコール(1〕PG)lt1M法、ク
リシン(又は他のアミノ酸)沈殿法、並びにアルコール
沈殿法により線帷素源及び他の蛋白質から分離できるこ
とを示しCいる。英国特許第1507198月及び米I
)特許第39730 C’> 24は1)目と温度の調
節を利用しく△HFa厚物をいくらか精製し、中位の純
度の低性能調製物を製造している。これらの特81に記
jIされている方法は、クリAプレシビテー1〜自体よ
りもクリAブレシビテ−1〜から抽出した両分を利用し
ている。更に1)Hと冷却の調節の′1リイクル後に5
7別を停止しCいる。他のものも1叶1と冷加の調節の
1サイクルを用いる効果を認めている(J、K。
3n+itl+ら、’J ransfussion
19 、 29 !l−306<1979))。
19 、 29 !l−306<1979))。
上述の方法によって轡られる△1」トの組成物は、比較
的、低W4度(011当りのへ1−([活1′1が約5
〜15単位程度)且つ似紬度(蛋白質11(1当りの△
HF活性が1中位以ト)のものである。
的、低W4度(011当りのへ1−([活1′1が約5
〜15単位程度)且つ似紬度(蛋白質11(1当りの△
HF活性が1中位以ト)のものである。
ポリ上チレンクリコール分別及びグリシン沈−9分別法
による△HF濃厚物の調製は、米国特許第341580
4号、第3 (382t3 Fl 1号、第37706
31号、第402701 S3号、第3839314号
、第4069216号、第3631018号、第365
2530号、第4073886号及び第4085095
号に記述され−Cいる。
による△HF濃厚物の調製は、米国特許第341580
4号、第3 (382t3 Fl 1号、第37706
31号、第402701 S3号、第3839314号
、第4069216号、第3631018号、第365
2530号、第4073886号及び第4085095
号に記述され−Cいる。
K 1sker (T lll’oml) 、 D
fatll、 HeamOrrllil!7ICa。
fatll、 HeamOrrllil!7ICa。
17.381 (1967))並びにl’enick及
び(3r山+khous (△mer 、 J
、 Med、 3cience、 2 32.4
34 (195G))は、そのよ)な高能力A HF濃
厚物の調製過程において、特にΔFIFの分離及び精製
の過程において、共存する101へロンビン複合体及び
その構成因子の活性形例えば’fla 、 Xaなとか
AHFの安定性に対して著るしく致命的であり、時に△
)−IFを不可逆的に損傷して不活性化することを指摘
している。それ故に八HFの安定性、収率及び溶解性を
改善するためには、これらの不安定化因子を分離−精製
工稈の最も早い段階で不活性化し或いは除去ケることか
全く重要であり、また本質的に必要である。該不安定化
因子の不活性化法は、例えは米国特許第3803115
月に開示されている。また該不安定止置rは吸着剤例え
は水酸化アルミ−ラム、水酸化マグネシウム、炭酸バリ
ウム、硫口ηバリウム、リバノール(6,9−ジアミノ
−?−土トキシアノ7リシンラクテー1へ)1.イオシ
ダ杓(月0旨(△mher1−He IRC−50>、
クリシン1デル、1スアル%どを用いることによ−)(
除去7:きることも間示さしx イル(B idwel
l、 E 、 6、B rit 、 J 、 l−1a
−emat、 、 13.568 [19671:
3oulier。
び(3r山+khous (△mer 、 J
、 Med、 3cience、 2 32.4
34 (195G))は、そのよ)な高能力A HF濃
厚物の調製過程において、特にΔFIFの分離及び精製
の過程において、共存する101へロンビン複合体及び
その構成因子の活性形例えば’fla 、 Xaなとか
AHFの安定性に対して著るしく致命的であり、時に△
)−IFを不可逆的に損傷して不活性化することを指摘
している。それ故に八HFの安定性、収率及び溶解性を
改善するためには、これらの不安定化因子を分離−精製
工稈の最も早い段階で不活性化し或いは除去ケることか
全く重要であり、また本質的に必要である。該不安定化
因子の不活性化法は、例えは米国特許第3803115
月に開示されている。また該不安定止置rは吸着剤例え
は水酸化アルミ−ラム、水酸化マグネシウム、炭酸バリ
ウム、硫口ηバリウム、リバノール(6,9−ジアミノ
−?−土トキシアノ7リシンラクテー1へ)1.イオシ
ダ杓(月0旨(△mher1−He IRC−50>、
クリシン1デル、1スアル%どを用いることによ−)(
除去7:きることも間示さしx イル(B idwel
l、 E 、 6、B rit 、 J 、 l−1a
−emat、 、 13.568 [19671:
3oulier。
J、P、b−一、 P I”eSSe med、
、 7 2 、 1 2 2 3 t I’
、、−) 6 4 ] ; Surgeno
r 、 P、 M、 13−1 (
) 、 r’l+y3゜Qolloid Che
m、、 55.9 i4 j 19511:t−1oa
g 、 Nノ1. S、 ’)、41
1、 J 、 CIin 、 I
nvest、、 39.5.54[1960])
、これらのうら水酸化アルミニウムは、該不安定化因子
の比較的良好な吸着剤であることが知られており、II
tつて最も碩繁に使用されている(米国特許第4170
C339号)。D E A F C架橋したテキス1
−レンも、7[」1−ロンビン複合体の吸着及び除去に
使用されでいる(米国特許第4093608号)。
、 7 2 、 1 2 2 3 t I’
、、−) 6 4 ] ; Surgeno
r 、 P、 M、 13−1 (
) 、 r’l+y3゜Qolloid Che
m、、 55.9 i4 j 19511:t−1oa
g 、 Nノ1. S、 ’)、41
1、 J 、 CIin 、 I
nvest、、 39.5.54[1960])
、これらのうら水酸化アルミニウムは、該不安定化因子
の比較的良好な吸着剤であることが知られており、II
tつて最も碩繁に使用されている(米国特許第4170
C339号)。D E A F C架橋したテキス1
−レンも、7[」1−ロンビン複合体の吸着及び除去に
使用されでいる(米国特許第4093608号)。
上;ホしたように、上述の従来法で得られるへF1Fm
l厚物は、比較的低い比活性のもの、即ち蛋白質mり当
りの△l−I F活性が約1単位又はそれ以トのもので
ある。この時望ましくない不純物の′1つは変性された
AHFである。米国特許第4.289691号及び第4
302445号は蛋白質mg当り1〜3単位AHF活性
の比活性を有づる△HF調製物の調製法を間示し、また
米国特許第4294826号はmg当り約1〜10単位
八HF活性の比活性を有する人間のA HFの調製法を
記jホし−Cいる。
l厚物は、比較的低い比活性のもの、即ち蛋白質mり当
りの△l−I F活性が約1単位又はそれ以トのもので
ある。この時望ましくない不純物の′1つは変性された
AHFである。米国特許第4.289691号及び第4
302445号は蛋白質mg当り1〜3単位AHF活性
の比活性を有づる△HF調製物の調製法を間示し、また
米国特許第4294826号はmg当り約1〜10単位
八HF活性の比活性を有する人間のA HFの調製法を
記jホし−Cいる。
本発明の方法は高度に精製された、生物学的に活性な人
間の△HF調製物を提供する。本方法においては、中程
麿の純度のA l−I Fを含有する濃厚物、例えば市
販の△l−(F ill製物が人間の自明の分別によっ
て調製される。A l−I Fを含有する濃厚物をスト
ークス半径に基づく分離に供して、AHFをA HF
R厚物中の蛋白質のバルクから分m する。
間の△HF調製物を提供する。本方法においては、中程
麿の純度のA l−I Fを含有する濃厚物、例えば市
販の△l−(F ill製物が人間の自明の分別によっ
て調製される。A l−I Fを含有する濃厚物をスト
ークス半径に基づく分離に供して、AHFをA HF
R厚物中の蛋白質のバルクから分m する。
△HF活性を有する上記工程からの両分を、TmF3゜
アンモニウム、硫@ノー1−リ「クムなどの添加による
沈殿、透析、P E G添加などで;9縮する。続い(
この濃厚物を水性媒体中にi′117R化(,7には平
廂化させ、次い(処理し℃△1」E分子σ)有効ストー
クス半径半を見か()上低い値に変え、△l−I Fを
濃厚物から更に分離4るためにストークス半径 離に供する。この分離した△l−I F=を透析によ−
】(脱カチオンし且つアニオン交換樹脂媒体でのり(」
71−クラフィーT9!1即して、高度に精製された△
11 F濃厚物を得る。
アンモニウム、硫@ノー1−リ「クムなどの添加による
沈殿、透析、P E G添加などで;9縮する。続い(
この濃厚物を水性媒体中にi′117R化(,7には平
廂化させ、次い(処理し℃△1」E分子σ)有効ストー
クス半径半を見か()上低い値に変え、△l−I Fを
濃厚物から更に分離4るためにストークス半径 離に供する。この分離した△l−I F=を透析によ−
】(脱カチオンし且つアニオン交換樹脂媒体でのり(」
71−クラフィーT9!1即して、高度に精製された△
11 F濃厚物を得る。
本発明の方法で製造される人間のへ1−(F調製物は蛋
白’Rmg当すFJ 4000〜80 (’) 018
(rl(7) A l−1F(プロ凝固)活性を右ブ
る(活性の1甲位は正常の人間の自明1ml中に見出さ
れるらのである)。
白’Rmg当すFJ 4000〜80 (’) 018
(rl(7) A l−1F(プロ凝固)活性を右ブ
る(活性の1甲位は正常の人間の自明1ml中に見出さ
れるらのである)。
蛋白質J)当り少くとも約400 C1甲IQの△(1
「活性を有する生成物は均一に見え、高速液体り[」7
1−り−y 7 イー (HP I−C) ニョl)
2 (’) 0000 =−/100000タル(・ン
の分子用を右する。
「活性を有する生成物は均一に見え、高速液体り[」7
1−り−y 7 イー (HP I−C) ニョl)
2 (’) 0000 =−/100000タル(・ン
の分子用を右する。
本発明の基本的な利点は、光り第1に高liT!庸及び
高活性の人間の八HF調製物が1qら1すること−Cあ
る。上述のように、本発明の調製物は均一であり、従っ
てml1t素原、フィブロネクチン、フォノ・ウィレプ
ラン1〜蛋白質、ヒタミンに依存性の凝固因子、及び他
の望ましくない又は不安定化させる酵素又は蛋白質を本
質的に含有しCいイヱい。
高活性の人間の八HF調製物が1qら1すること−Cあ
る。上述のように、本発明の調製物は均一であり、従っ
てml1t素原、フィブロネクチン、フォノ・ウィレプ
ラン1〜蛋白質、ヒタミンに依存性の凝固因子、及び他
の望ましくない又は不安定化させる酵素又は蛋白質を本
質的に含有しCいイヱい。
本発明の改良された方法は従来1qられなかった上記の
人間の調製物を調製する利点を有する。本調製物中のA
HFのすべでの分子は1〜ロンヒンによって開裂する
ことができ、八HFがその元のく即ち不安定化されてな
い〉状態で存在することがわかる。
人間の調製物を調製する利点を有する。本調製物中のA
HFのすべでの分子は1〜ロンヒンによって開裂する
ことができ、八HFがその元のく即ち不安定化されてな
い〉状態で存在することがわかる。
第1〜4図は、本弁明の方法の工程にd5い−(、AH
F(因子■C)をクロア1〜クラフイーC分離する例を
示す。
F(因子■C)をクロア1〜クラフイーC分離する例を
示す。
第5図は、本発明に従って製造される調製物に関する6
%ゲル中でのSDSポリアクリルアミ1〜・ゲル電気法
#jJ (L aemmli、 N ature 、
277 。
%ゲル中でのSDSポリアクリルアミ1〜・ゲル電気法
#jJ (L aemmli、 N ature 、
277 。
680〜685 (1970)、参考文献として引用さ
れる)の結果を示す。
れる)の結果を示す。
本発明の出発物質は、人間の面17’Jから冑られる△
HFのi11厚物、例えは市販のΔ(」「濃厚物である
。標準的な方法によれは、血漿−コレクション・廿ンタ
ーから凍結した( −2(J ”Cマはで41以上の)
人間の自明を1qる。この凍結し1.:自明を処理して
Δ1」11す物とづる;例えは凍結しlこ血漿をクリオ
ブレシビテ−1−を生成するのに−1分な導度に保ち、
或いはエタ、/−ルで処理し−1(:、 ol+n 「
ract −1on 1を得る。△l−I F FIA
厚物は、通常の技術、例え1シクリオノ゛レシピデー1
−に対する連4> 5) Hにより自明から分離される
。次いて△111−濃庁物を公知の方法で処I」シ、池
の凝結蛋白質1例えはグし11− uン゛ヒン複合蛋白
買、紳維素原、jフルフミシ、及び他の蛋白質を完全に
父は一部除去し且つΔ1−11:を更に濃縮する。上述
の蛋白Hの除去は1本明細書に参考文献どし−(引用さ
れる前述の特許に記jホされている如き公知の方法で達
成りることがCきる。例えば゛上記蛋白質は△1(トを
含有づるクリAブレシビテー1− i1’l厚物から、
クリAプレシビデートを水性媒体中に溶解し、水酸化ア
ルミニウムを添加して必要のない蛋白質を沈澱させ、p
+−+と増の濃度を調整し、そして超)濾過によりVo
l−ロンビン複合蛋白質、線帷素原、アルブミンなどが
実質的に減少したAHFIW物とすることによって除去
できる。池に又は更に、上記蛋白質はポリエチレングリ
コール及び、・又はグリシン沈殿法によりAHFのクリ
オブレシビデ−1−1厚物から除去しうる。
HFのi11厚物、例えは市販のΔ(」「濃厚物である
。標準的な方法によれは、血漿−コレクション・廿ンタ
ーから凍結した( −2(J ”Cマはで41以上の)
人間の自明を1qる。この凍結し1.:自明を処理して
Δ1」11す物とづる;例えは凍結しlこ血漿をクリオ
ブレシビテ−1−を生成するのに−1分な導度に保ち、
或いはエタ、/−ルで処理し−1(:、 ol+n 「
ract −1on 1を得る。△l−I F FIA
厚物は、通常の技術、例え1シクリオノ゛レシピデー1
−に対する連4> 5) Hにより自明から分離される
。次いて△111−濃庁物を公知の方法で処I」シ、池
の凝結蛋白質1例えはグし11− uン゛ヒン複合蛋白
買、紳維素原、jフルフミシ、及び他の蛋白質を完全に
父は一部除去し且つΔ1−11:を更に濃縮する。上述
の蛋白Hの除去は1本明細書に参考文献どし−(引用さ
れる前述の特許に記jホされている如き公知の方法で達
成りることがCきる。例えば゛上記蛋白質は△1(トを
含有づるクリAブレシビテー1− i1’l厚物から、
クリAプレシビデートを水性媒体中に溶解し、水酸化ア
ルミニウムを添加して必要のない蛋白質を沈澱させ、p
+−+と増の濃度を調整し、そして超)濾過によりVo
l−ロンビン複合蛋白質、線帷素原、アルブミンなどが
実質的に減少したAHFIW物とすることによって除去
できる。池に又は更に、上記蛋白質はポリエチレングリ
コール及び、・又はグリシン沈殿法によりAHFのクリ
オブレシビデ−1−1厚物から除去しうる。
このように調製したA HFの濃厚物を超)濾過、凍結
乾燥又は双りの組合せにより処理しC−1その含む水量
を部分的又は完全に減する。
乾燥又は双りの組合せにより処理しC−1その含む水量
を部分的又は完全に減する。
AHFの濃厚物をストークス半径に基つく分離に供し、
見かけ上高いストークス半径を示J’AHFから低分子
量の蛋白質を分離する。この分離は挿々の方法により、
例えば△HFW4原物を、架橋アガロース(例えばBi
ogel△−15m又は3e−++l+arose C
L −4B )に基ツ<’y’ルーバーミI −ジョン
・クロマトグラノィーに、或いは調節された孔径のカラ
ス・ヒース処理に、或いはスクロースの密度勾配超)濾
過に供φるεどによ−)で行なうことが−Cきる。この
技法のりl\(は技術的に一1分公知である。好ま17
<はΔ1(F湖庁物を例えは衆tgアカL1−ス又はポ
リアクリルj2ミ1−に阜づくゲル・バーミ」−−ジョ
ン・クロマ1−り>2フイーに供する。クロマ]−クラ
フィー媒(本(平檜i化さけたi稽、Δl−I Fを、
イオン強度的0.1へ−0,4及び吋]約6.0〜7.
5のP4衝された塩溶液で流出さける。
見かけ上高いストークス半径を示J’AHFから低分子
量の蛋白質を分離する。この分離は挿々の方法により、
例えば△HFW4原物を、架橋アガロース(例えばBi
ogel△−15m又は3e−++l+arose C
L −4B )に基ツ<’y’ルーバーミI −ジョン
・クロマトグラノィーに、或いは調節された孔径のカラ
ス・ヒース処理に、或いはスクロースの密度勾配超)濾
過に供φるεどによ−)で行なうことが−Cきる。この
技法のりl\(は技術的に一1分公知である。好ま17
<はΔ1(F湖庁物を例えは衆tgアカL1−ス又はポ
リアクリルj2ミ1−に阜づくゲル・バーミ」−−ジョ
ン・クロマ1−り>2フイーに供する。クロマ]−クラ
フィー媒(本(平檜i化さけたi稽、Δl−I Fを、
イオン強度的0.1へ−0,4及び吋]約6.0〜7.
5のP4衝された塩溶液で流出さける。
上記の流出さUた△H[を含む両5)を集め、これを技
術的に公知の方法で、例えは硫酸アンモニウム、fIj
lI醸jトリウムなとての)先殿により、透析により、
P E G添加によるなどしく濃縮づる。例えばΔHF
の集めた両分を硫酸?ンLニウム(30〜/10%、重
串 容量)C処理しCΔHFを沈殿さける。濃縮後、A
I−IFをpl−1約6.0〜7゜5及びイオン強度的
0.1〜0./lの水性IJJ PH’fM液に溶解し
又は平衡化させる。集めたAHF両分の濃縮中に硫酸ア
ンモニウムのような塩を添加する場合には、次の工程に
先立って、公知の方法により、例えば透析、シアフィル
トレージョン(d+afiltrafiOn )などに
よ−)Tそのような塩を除去する。
術的に公知の方法で、例えは硫酸アンモニウム、fIj
lI醸jトリウムなとての)先殿により、透析により、
P E G添加によるなどしく濃縮づる。例えばΔHF
の集めた両分を硫酸?ンLニウム(30〜/10%、重
串 容量)C処理しCΔHFを沈殿さける。濃縮後、A
I−IFをpl−1約6.0〜7゜5及びイオン強度的
0.1〜0./lの水性IJJ PH’fM液に溶解し
又は平衡化させる。集めたAHF両分の濃縮中に硫酸ア
ンモニウムのような塩を添加する場合には、次の工程に
先立って、公知の方法により、例えば透析、シアフィル
トレージョン(d+afiltrafiOn )などに
よ−)Tそのような塩を除去する。
次いでAHFIi厚物を処理して△HF分子の右動スト
−クス半径を見かけ上低い値に変化させる。
−クス半径を見かけ上低い値に変化させる。
この目的のためには、2価のカチオン源例えはノ」ルシ
ウム又はマクネシウム源を添加することができる。この
場合には、△HFWA厚物の容量部当りに、2価のカチ
オン約1〜3Mの溶液1部を含む蛋白質溶液的5−10
容量部を使用づ−る。ストークス半径の上述の減少は、
AHFの溶液中に高イオン強度(例えば塩化ナトリウム
の場合的1〜4M)を達成す゛ること或いはAHFを△
ト1「濃厚物1部当り約0,01〜0.001部のl〜
ロンヒンと共に保温することによっても達成することが
できる( L eon W、 Hoyer、 Hemo
philia a面1−1e−mosl−1e−、II
T +1e F actor■C0m1)leX
: 3 trLlCt旧’e F11110口0「
1 °° 、Δfan [Q 、 l iss
。
ウム又はマクネシウム源を添加することができる。この
場合には、△HFWA厚物の容量部当りに、2価のカチ
オン約1〜3Mの溶液1部を含む蛋白質溶液的5−10
容量部を使用づ−る。ストークス半径の上述の減少は、
AHFの溶液中に高イオン強度(例えば塩化ナトリウム
の場合的1〜4M)を達成す゛ること或いはAHFを△
ト1「濃厚物1部当り約0,01〜0.001部のl〜
ロンヒンと共に保温することによっても達成することが
できる( L eon W、 Hoyer、 Hemo
philia a面1−1e−mosl−1e−、II
T +1e F actor■C0m1)leX
: 3 trLlCt旧’e F11110口0「
1 °° 、Δfan [Q 、 l iss
。
l nc、 、、7頁 (198’I ) )
。
。
ΔF1F分子のストークス半径の減少に続い(、Δ11
Fを公知の方法、例えば’r’l=析V(よジ))フィ
ル1〜レーシヨンで処理しく2価のカチオンを除去し、
次いで上述の手段のいずれかによりスト−クス半径に基
づく分離に供する。好ましくは、Δl−I F in厚
物を、架橋アカロー又又はポリアクリル戸ミ1〜に基づ
くゲル・バーミ土−ション・り目?1〜クラノイーに供
し、り【」7トクラフ【−媒体C平衡化させ、イオン強
度的0.1〜0./I及び111−4約6゜0〜7.5
の緩衝された塩溶液(−流出させる。
Fを公知の方法、例えば’r’l=析V(よジ))フィ
ル1〜レーシヨンで処理しく2価のカチオンを除去し、
次いで上述の手段のいずれかによりスト−クス半径に基
づく分離に供する。好ましくは、Δl−I F in厚
物を、架橋アカロー又又はポリアクリル戸ミ1〜に基づ
くゲル・バーミ土−ション・り目?1〜クラノイーに供
し、り【」7トクラフ【−媒体C平衡化させ、イオン強
度的0.1〜0./I及び111−4約6゜0〜7.5
の緩衝された塩溶液(−流出させる。
△H’F活性を含む流出した両分を集め、1lili時
含水量を減することによって1するつこの1的のために
は、集めた画分を透析、ジノ′ノイル1〜1)−ジョン
などによ−)で1−縮してもよい。透析溶液内の溶液か
ら水を抽出するために、両分を例えば固体P E G
2000 (、)に浸ずことかCきる。Millた物質
を、1中約6.0〜7,6の緩別液に月する透析、シア
フィルトレージョンにより処理して。
含水量を減することによって1するつこの1的のために
は、集めた画分を透析、ジノ′ノイル1〜1)−ジョン
などによ−)で1−縮してもよい。透析溶液内の溶液か
ら水を抽出するために、両分を例えば固体P E G
2000 (、)に浸ずことかCきる。Millた物質
を、1中約6.0〜7,6の緩別液に月する透析、シア
フィルトレージョンにより処理して。
2価のカチオンを除去す゛る。
上記濃縮工程に続いC1△l−t F活性を含有づる画
分をアニオン交換媒体、例えば4級アミ、ノエヂル(Q
AFンセルロース、ジエチルアミノJ−’fル(DEA
E)セルロース、父は間係のアニオン交換体に基づくク
ロマ[〜グラノィーに供する。
分をアニオン交換媒体、例えば4級アミ、ノエヂル(Q
AFンセルロース、ジエチルアミノJ−’fル(DEA
E)セルロース、父は間係のアニオン交換体に基づくク
ロマ[〜グラノィーに供する。
クロマ1〜グラフイ一媒体を、A HFてhい結合して
ない蛋白質を除去するのに十分なイオン強度、即ちO〜
0.2(0〜0.2tvl塩化−ノートリウムなと〉を
有する緩衝された水溶液で洗浄する。R後にクロマ1〜
グラフイ一媒体を、AHFを流出さけるのに十分なイオ
ン強度、即ち約0.2〜0.6を有する水溶液(例えば
0.2〜0.6M塩化すlヘリウムなど)で流出させ、
八HFを含有する両分を4% 、次いてこれを集める。
ない蛋白質を除去するのに十分なイオン強度、即ちO〜
0.2(0〜0.2tvl塩化−ノートリウムなと〉を
有する緩衝された水溶液で洗浄する。R後にクロマ1〜
グラフイ一媒体を、AHFを流出さけるのに十分なイオ
ン強度、即ち約0.2〜0.6を有する水溶液(例えば
0.2〜0.6M塩化すlヘリウムなど)で流出させ、
八HFを含有する両分を4% 、次いてこれを集める。
上記クロマトグラフィーから集めた両分は、蛋白質mg
当り少くとも約4000AHF単位の比活性を有する八
H’Fを含み、Q A E tルロースに基づくイAン
交操クロマ1〜クラフ(−及び1−゛テシル硫酸プ1ヘ
リウム(81つS)ポリノアクリルアミ1〜・グル電気
泳動(l eamml i )’ fこ塁づい(実質的
に均一な調製物である。ぞのようなくト成物は従来法で
記述、開示又は提案されC−いない、、結果としく集め
た両分は自明中で見出されるものよりも少くども約35
0000 IQに精製さPc is m * A t−
1ト調製物である。これは無菌で)濾過し、凍結乾燥着
ることができる。
当り少くとも約4000AHF単位の比活性を有する八
H’Fを含み、Q A E tルロースに基づくイAン
交操クロマ1〜クラフ(−及び1−゛テシル硫酸プ1ヘ
リウム(81つS)ポリノアクリルアミ1〜・グル電気
泳動(l eamml i )’ fこ塁づい(実質的
に均一な調製物である。ぞのようなくト成物は従来法で
記述、開示又は提案されC−いない、、結果としく集め
た両分は自明中で見出されるものよりも少くども約35
0000 IQに精製さPc is m * A t−
1ト調製物である。これは無菌で)濾過し、凍結乾燥着
ることができる。
上述の集めた両分は、無変性条1′1Fに随峙HPt−
Cに1銭することがCきる。この目的のためには通常の
HP L C装置が使用Cき、八HFの)R出はス1−
−、ス半径に基つく標準的なh法C行なわれる。
Cに1銭することがCきる。この目的のためには通常の
HP L C装置が使用Cき、八HFの)R出はス1−
−、ス半径に基つく標準的なh法C行なわれる。
八HEを含む両分は、合計で生成物の10%の収串であ
る。Δ[−1Fは蛋白質mg当り少くとも約4000△
HF!1位の比活性を有する、両分は無菌濾過Cき、超
)濾過、凍結乾燥又はこれらの相合lのいずれかによっ
て含水量を減することかCきる。
る。Δ[−1Fは蛋白質mg当り少くとも約4000△
HF!1位の比活性を有する、両分は無菌濾過Cき、超
)濾過、凍結乾燥又はこれらの相合lのいずれかによっ
て含水量を減することかCきる。
この△)−IF調製物はl−I P L C及USPS
ポリアクリルアミド・グル電気泳動(PAGE )
(Laem−mli )により均質性を示す。即ちこの
△HF調製物は、本質的に均一であり月っ本質的に因子
■、W、IX、X、線帷素原、アルブミン、フィブロネ
クチン、フォン・ライレフラン1〜因子を含まり゛(即
ち非AHF蛋白質を合計して約19も以下でしか含有せ
ず〉、また活性化されてない部分的1−ロンボブラスチ
ン時間試験において本質的に活性を示さない。これは精
製された蛋白質が凝血カスケードにおいて八H「依存性
工程を妨げる活性化されてない凝血因子を本質的に含有
してないことを示す。
ポリアクリルアミド・グル電気泳動(PAGE )
(Laem−mli )により均質性を示す。即ちこの
△HF調製物は、本質的に均一であり月っ本質的に因子
■、W、IX、X、線帷素原、アルブミン、フィブロネ
クチン、フォン・ライレフラン1〜因子を含まり゛(即
ち非AHF蛋白質を合計して約19も以下でしか含有せ
ず〉、また活性化されてない部分的1−ロンボブラスチ
ン時間試験において本質的に活性を示さない。これは精
製された蛋白質が凝血カスケードにおいて八H「依存性
工程を妨げる活性化されてない凝血因子を本質的に含有
してないことを示す。
本発明の八HF調製物は、面友病性自明にあける凝血欠
陥を補止り−る能力に加えて次の特性も有する: (a〉トロンビンでの処理に続いて生物学的活性が増加
し、推定的なポリペブチ1〜@が変えられる。精製され
た蛋白質はトロンビンの処理で活性化することによりA
HF活性を4〜2018にす゛ることができる。
陥を補止り−る能力に加えて次の特性も有する: (a〉トロンビンでの処理に続いて生物学的活性が増加
し、推定的なポリペブチ1〜@が変えられる。精製され
た蛋白質はトロンビンの処理で活性化することによりA
HF活性を4〜2018にす゛ることができる。
(b)生物学的活性は古典的な血友病をhづるある患者
に見出される△1」、 Fにり・]ツる禁止剤にノ:り
遮l\いCきる。数倍過剰量(中位;単位)のΔ1−I
F禁止剤と混合した時、測定し)る△HF活11の9
5〜99%が無効にCきる。
に見出される△1」、 Fにり・]ツる禁止剤にノ:り
遮l\いCきる。数倍過剰量(中位;単位)のΔ1−I
F禁止剤と混合した時、測定し)る△HF活11の9
5〜99%が無効にCきる。
(C)精製された元のA I−I Fは200〜400
000グル1〜ンの分子量tこ相当づる流出容量を右ツ
る。還元及びS D S P A G E後、約100
000の見かけの分子量を有ゴる単一のポリ/\ノ°チ
ト鎖が存在する。1−ロンヒンとの保rRt%、100
’000のポリペブチ1〜の実質的に1/\てか消え
、分子! 7.5000を右づる単一なIll広いパン
1−が現われる。それより低分子量の更なるパン1−は
兇られない。
000グル1〜ンの分子量tこ相当づる流出容量を右ツ
る。還元及びS D S P A G E後、約100
000の見かけの分子量を有ゴる単一のポリ/\ノ°チ
ト鎖が存在する。1−ロンヒンとの保rRt%、100
’000のポリペブチ1〜の実質的に1/\てか消え
、分子! 7.5000を右づる単一なIll広いパン
1−が現われる。それより低分子量の更なるパン1−は
兇られない。
(d)精製した八HFは重大なノロテアーゼ活性を、そ
して本質的にずべ又の(1!Iの自明蛋白質を実質的に
含んC゛いないようであイ〉。
して本質的にずべ又の(1!Iの自明蛋白質を実質的に
含んC゛いないようであイ〉。
(e)精製した△l−I FはA I−I F抗原〈因
子■。
子■。
A(+)を実質的に含まない。△(」F:△l−(F抗
原の比は普通的50:1又はそれ以上であり、一般には
約50:1〜150:1である。
原の比は普通的50:1又はそれ以上であり、一般には
約50:1〜150:1である。
本発明の人間のへHF調製物のアミノ酸組成を第1表に
示する。
示する。
瓜−1−六
人間のΔ1−(Fのアミノ酸相成
一一]W j)1員100,00
0のりノー1−;7に当りの残り監 シスチーrン酸
13j′スバル°fン酸
65スレオニン
・1)7レリン
111グルタミン酸
110プロリン
30クリシン
157アラニン
50メヂオニンスル小キシド又は カルボキシメチルシスティン 1(、)
イソロイシン 24Uイ
シン 47ヂロシ
ン 23フエニルア
ラニン 22ヒスデシン
17リジン
4r1アルギニン
2G全残基−833 −1−リブ1−ファンは系に検出−(きなかった。
0のりノー1−;7に当りの残り監 シスチーrン酸
13j′スバル°fン酸
65スレオニン
・1)7レリン
111グルタミン酸
110プロリン
30クリシン
157アラニン
50メヂオニンスル小キシド又は カルボキシメチルシスティン 1(、)
イソロイシン 24Uイ
シン 47ヂロシ
ン 23フエニルア
ラニン 22ヒスデシン
17リジン
4r1アルギニン
2G全残基−833 −1−リブ1−ファンは系に検出−(きなかった。
−酸化された誘導体の同定は、酸化の前後にこ擾しらと
同一の残基が検出されたから仮のものである。
同一の残基が検出されたから仮のものである。
−メヂオニン父は半システィンは検出できなかった。
実 施 例
次の実施例は本光明を更に説明する。
飢−組
1〉凝血分析 深刻なAHF欠乏症(△HF 196以
下)の唐者からのIhJ切を基質として用い且つ凝結時
間を決定するためにフィブロメータを用い(、△l−I
Fを1段凝血分析法で分析した。△HFの1単位は集
められた正常の人間の面1711ml中に存在するその
量として定義される。< L angdell ら、J
、 L al)、 Cl1n 、 Med、 、 41
.637〜644 (1953))。
下)の唐者からのIhJ切を基質として用い且つ凝結時
間を決定するためにフィブロメータを用い(、△l−I
Fを1段凝血分析法で分析した。△HFの1単位は集
められた正常の人間の面1711ml中に存在するその
量として定義される。< L angdell ら、J
、 L al)、 Cl1n 、 Med、 、 41
.637〜644 (1953))。
2〉蛋白の計画はQilfo+・6250分光光度計を
用いて行なった。づべての試料を280 nm及び32
011mで読み、次の式に従って光散乱に対し吸光度を
補正した。
用いて行なった。づべての試料を280 nm及び32
011mで読み、次の式に従って光散乱に対し吸光度を
補正した。
△!8o補正値−A 2 !10未補正値−1,7(△
320) 但しAはAにを意味し、比活性の旧粋のために10.0
のそれが仮定される。
320) 但しAはAにを意味し、比活性の旧粋のために10.0
のそれが仮定される。
3)パリアクIルアミぐ・ノ“ルWJkJI= *J+
J2j−4。
J2j−4。
5%スタッキング・ケル(5tackinu gel
)を6%セパL/ −:r インク・グル(S el+
ar*目11(J get )と共に用いるO −F
arellの方法に1fγつ(1〜アシル硫酸ツートリ
ウム−ポリアミ(〜・ゲル電気泳動物を準備した。電気
泳動を25n)Δ(・11r′f間行なった。
)を6%セパL/ −:r インク・グル(S el+
ar*目11(J get )と共に用いるO −F
arellの方法に1fγつ(1〜アシル硫酸ツートリ
ウム−ポリアミ(〜・ゲル電気泳動物を準備した。電気
泳動を25n)Δ(・11r′f間行なった。
無変性条件上てのポリアクリルアミ1−・ゲル電気泳動
は、5%ゲル及び25m1’vll−リス及び192m
MクリシンをpH8、a C用いた。電気泳動を4′
CFに3時間250ポルl−T:行なっIこ(0′Fa
rrell、 J、 Biol 、 Cll0II+、
、 250.4007〜4012 (1975))、、
クルは哨醸銀を用いC蛋、白質に対して染色した。ぞし
C5m1+1間隔で(璋層に切り且つ名簿−を、5 Q
m M t・リスー塩01!塩、Ill 7 、 Q
、150mMNa(じ1及び200μす、・Aバルーノ
ミ2mlのQ、3+111に添加することにより、染色
され−Cないゲルから蛋白質を流出させた。混合物を2
〜3R間4 ”Ct−保濃し、△)−(Fq)凝結促進
活性を上述のようにM′VTo L/だ。
は、5%ゲル及び25m1’vll−リス及び192m
MクリシンをpH8、a C用いた。電気泳動を4′
CFに3時間250ポルl−T:行なっIこ(0′Fa
rrell、 J、 Biol 、 Cll0II+、
、 250.4007〜4012 (1975))、、
クルは哨醸銀を用いC蛋、白質に対して染色した。ぞし
C5m1+1間隔で(璋層に切り且つ名簿−を、5 Q
m M t・リスー塩01!塩、Ill 7 、 Q
、150mMNa(じ1及び200μす、・Aバルーノ
ミ2mlのQ、3+111に添加することにより、染色
され−Cないゲルから蛋白質を流出させた。混合物を2
〜3R間4 ”Ct−保濃し、△)−(Fq)凝結促進
活性を上述のようにM′VTo L/だ。
4) ■:C△9分析 Re1snerらの方法に従
った。抗体は親切にもl−1oward Relsne
rによッC提供してもらった。< Reisnerら、
T hromb。
った。抗体は親切にもl−1oward Relsne
rによッC提供してもらった。< Reisnerら、
T hromb。
Re5earc11 、 14. 135〜239
(1979))。
(1979))。
5ン△I−I F活性の禁止 これはAHFを含む試料
1容量を、AHFに対する禁止剤を含む人間の血漿同容
量と混合することによって測定した。禁止剤の濃度は常
にAFHの111度より数倍過剰であった。指示する期
間保温した後、残存へHFを分析した。
1容量を、AHFに対する禁止剤を含む人間の血漿同容
量と混合することによって測定した。禁止剤の濃度は常
にAFHの111度より数倍過剰であった。指示する期
間保温した後、残存へHFを分析した。
6)八HFのT I+rombin活性(3wi jZ
Orう、J。
Orう、J。
B iol 、 CI+em、、 2 5 5
. 1 0606 ・〜 1 06 11 (198
0))。
. 1 0606 ・〜 1 06 11 (198
0))。
7)フtン・ウィレブラン・蛋 5析(Vol−1e
r ら、 3u11.World I−(eal
th Qrgan、 、 53゜55〜63 (
1976)>。
r ら、 3u11.World I−(eal
th Qrgan、 、 53゜55〜63 (
1976)>。
8)銀染色(Merrillら、 3cience、
211 、1437〜1438 (1980))。
211 、1437〜1438 (1980))。
大−Jar
出光原料はCUttOrl a1101’atol’+
(!S 、 7110.か’>47)A HF?+’
jliL/F1# (Koate”” ) 。あ−、。
(!S 、 7110.か’>47)A HF?+’
jliL/F1# (Koate”” ) 。あ−、。
。
1)第1図を参照しU 、 [3iogel△−15m
(3io Rad 1aboratories
、 10(−3−20(1メツシユ)の2.(3x9
0cmのノノラ1\(、二おい(。
(3io Rad 1aboratories
、 10(−3−20(1メツシユ)の2.(3x9
0cmのノノラ1\(、二おい(。
Ca C12(1m M> 、り」−ン醸1;l−1−
リウl−(5m M>、0.135MNaC1,5%γ
キスl−1]−ス、0.1%す1〜リウムアシトを流出
剤として+3)−17,35及び室温で用いること(、
より、クル・バージ1−ジョン・/7071−クラフィ
ーを(jなった。、△HFを最高潤度C含む画分く10
)を集め、4. O%W、、□vfm P ’、7’ン
モニウムCの)沈澱によりIII縮した。次のに稈のI
F備のために、沈澱を150mMNaClを含右する+
+I−l 7 、 Oの50mMイミタンール祠衝剤に
溶解し、投石し′C残存ト々酸アンモニウムを除去した
。
リウl−(5m M>、0.135MNaC1,5%γ
キスl−1]−ス、0.1%す1〜リウムアシトを流出
剤として+3)−17,35及び室温で用いること(、
より、クル・バージ1−ジョン・/7071−クラフィ
ーを(jなった。、△HFを最高潤度C含む画分く10
)を集め、4. O%W、、□vfm P ’、7’ン
モニウムCの)沈澱によりIII縮した。次のに稈のI
F備のために、沈澱を150mMNaClを含右する+
+I−l 7 、 Oの50mMイミタンール祠衝剤に
溶解し、投石し′C残存ト々酸アンモニウムを除去した
。
2)上記1からの透析した試牢81を、2.5MCaC
l!1容檗を蛋白質溶液9容量と混合ηる口どによって
CaC1t中250mMにした。次いC試料を、同一の
緩衝液であらかじめ平1−1化さけた3 ept+ar
ose 4 B −CLの2X100cmのカラス製
カラムによるクロマ1〜クラフイーにか&lた。)k出
媒体は150m MNa C1及び0.25CaCl
iを含むI)H7,Oの50%1Mイミタソール#1t
7液であった。第2図を参照すると、区+1i、 12
は集められるΔ1−IF活性を含む両分を表わダ。
l!1容檗を蛋白質溶液9容量と混合ηる口どによって
CaC1t中250mMにした。次いC試料を、同一の
緩衝液であらかじめ平1−1化さけた3 ept+ar
ose 4 B −CLの2X100cmのカラス製
カラムによるクロマ1〜クラフイーにか&lた。)k出
媒体は150m MNa C1及び0.25CaCl
iを含むI)H7,Oの50%1Mイミタソール#1t
7液であった。第2図を参照すると、区+1i、 12
は集められるΔ1−IF活性を含む両分を表わダ。
3〉上記工程力日ジ集めたAI−IF(12)を透析ハ
ング中に入れ、このバッグを固体PEG20000中に
浸すことによって濃縮した。次いで濃縮した試料を50
m NI+イミタゾール緩衝液、p)−17。
ング中に入れ、このバッグを固体PEG20000中に
浸すことによって濃縮した。次いで濃縮した試料を50
m NI+イミタゾール緩衝液、p)−17。
0及び0.15MJM化す[・リウムに対して透析し、
同一の緩衝液であらかじめ平衡化させたO A F t
?ルロースの2.5X10Cmプラスチック製カラムで
のクロマトグラフィーにかけた。AHI−のりべてをこ
れらの条件下に結合させた。今や第3図を参照して、結
合してない蛋白質(′l 6 )を0.15 M N
a (CI ′C洗い出し、同一の桟用剤中o、 20
MNaClの段階的り)ジ+−ンl−c操作しC△1−
I Fを殆んど又(よ全熱含有しない蛋白Hの更なるピ
ーク(18)を流出させた。、最1軒に、0.20=
l 、 01vlNaC1ノiPi’PM的りラシ[シ
Fにおいて、180m1t 17ml lFfま(−
流し/j、、/15白!・オの史なるピーク(20)を
流出さl!/J、cmのピークの柊り項に、△HF活性
がO,:IMNaに+イ’J i!iCシhま−)でか
なり鋭いピーク(i 4 ) C流出した。
同一の緩衝液であらかじめ平衡化させたO A F t
?ルロースの2.5X10Cmプラスチック製カラムで
のクロマトグラフィーにかけた。AHI−のりべてをこ
れらの条件下に結合させた。今や第3図を参照して、結
合してない蛋白質(′l 6 )を0.15 M N
a (CI ′C洗い出し、同一の桟用剤中o、 20
MNaClの段階的り)ジ+−ンl−c操作しC△1−
I Fを殆んど又(よ全熱含有しない蛋白Hの更なるピ
ーク(18)を流出させた。、最1軒に、0.20=
l 、 01vlNaC1ノiPi’PM的りラシ[シ
Fにおいて、180m1t 17ml lFfま(−
流し/j、、/15白!・オの史なるピーク(20)を
流出さl!/J、cmのピークの柊り項に、△HF活性
がO,:IMNaに+イ’J i!iCシhま−)でか
なり鋭いピーク(i 4 ) C流出した。
△]」1:活11に従って蛋白質を隼cV)たつ結合し
Cない蛋白質は第5図に24(示9’ (0’、()グ
ル中S]、)Sポリ?クリルアミj〜・ゲル電気ン永動
[1aen+m −1i] )・; 0.2NNaCl
で流出(5に蛋白質を26で表わし、そして0 、2
M N aCI C28(7) e−りを流出させた
。
Cない蛋白質は第5図に24(示9’ (0’、()グ
ル中S]、)Sポリ?クリルアミj〜・ゲル電気ン永動
[1aen+m −1i] )・; 0.2NNaCl
で流出(5に蛋白質を26で表わし、そして0 、2
M N aCI C28(7) e−りを流出させた
。
このように調製したAII F Fl’J 9’!物は
、696ケル中81つSポリアクリルアミ1〜・クル電
気泳動(l eammli) ニア3 イT均M19(
30)を示し11.− 。
、696ケル中81つSポリアクリルアミ1〜・クル電
気泳動(l eammli) ニア3 イT均M19(
30)を示し11.− 。
この調製物の比活1/l:は蛋白質mり当りΔHF活性
が約5000単位であり、原料の血漿より350000
倍精製されたことを示づ。市販の△l−I F 11’
N物からの全回収率は10%が具現化された。
が約5000単位であり、原料の血漿より350000
倍精製されたことを示づ。市販の△l−I F 11’
N物からの全回収率は10%が具現化された。
4)工Pi!3>から集めた両分を、高速液体クロマト
グラフィー(HPLG>に先立って濃縮した。
グラフィー(HPLG>に先立って濃縮した。
HPLCはBeckmanTSK4001 X30cm
カラムを4opSi、流速0.5ml/時で用いること
によって行なった。傾向を第4図に示す。△)−)[は
第2のピーク(4=l)、即ちI (l M IIW8
90000)及びTgG (MWl 60000)の流
出位置の中間と一致して流出した。2つの最大のピーク
50及び52は△HF活性をもlJなか−)たので同定
しなかった。ピーク54はも甥1在≦へJムノーミン(
BSA)を表わした。第4図においC146,48及び
54における矢印は平()実験における公知の分子量の
マーカー蛋白質の流出容量を表わす:46=I(JIV
I(MW890000)及び48= 19G (MWl
60000)。
カラムを4opSi、流速0.5ml/時で用いること
によって行なった。傾向を第4図に示す。△)−)[は
第2のピーク(4=l)、即ちI (l M IIW8
90000)及びTgG (MWl 60000)の流
出位置の中間と一致して流出した。2つの最大のピーク
50及び52は△HF活性をもlJなか−)たので同定
しなかった。ピーク54はも甥1在≦へJムノーミン(
BSA)を表わした。第4図においC146,48及び
54における矢印は平()実験における公知の分子量の
マーカー蛋白質の流出容量を表わす:46=I(JIV
I(MW890000)及び48= 19G (MWl
60000)。
第5図を参照すると、上記工程4〉から集められた△l
−I Fは6%ゲル中5O3Iノ八〇E’(Lae−n
+ml+>において本質的に均一(32)Cある。この
調製物は蛋白質n1(J当り約50 C1(JΔHF
1位の比活性を有し、原料の血漿より35(JOO○倍
の精製係数を表わす。
−I Fは6%ゲル中5O3Iノ八〇E’(Lae−n
+ml+>において本質的に均一(32)Cある。この
調製物は蛋白質n1(J当り約50 C1(JΔHF
1位の比活性を有し、原料の血漿より35(JOO○倍
の精製係数を表わす。
第5図におい一’C,5DSF〕ΔGトに対する原11
は3/4ひ及びイオンフロンl〜(1oll ft’0
11t )は33Gで表わされる。カラム22は分子y
+ 2 (、) Oo 00のミオシン高分子鎖(38
)、分子量68000のBS△(40)、及び分子M
/I 3I) Q □のAバルブミン(42)を表わす
。
は3/4ひ及びイオンフロンl〜(1oll ft’0
11t )は33Gで表わされる。カラム22は分子y
+ 2 (、) Oo 00のミオシン高分子鎖(38
)、分子量68000のBS△(40)、及び分子M
/I 3I) Q □のAバルブミン(42)を表わす
。
上記操作及び結果4第2表に曹杓づる。
\
\
\、
\
\、
ニ21 □ −
i
g 藁 認 ♀
第1図〜第4図は1本弁明のIj法の−L程にi43い
て、AI−I F (因子■C)をりL171−フラノ
イーC分離りる例を示し、また ff15図は、本発明に従・)C製造される調製物(、
ニ閏する6%ゲル中CのS 1.) Sポリj′クリル
アミ1〜・ゲル電気原初の結果を示1.。 特許出願人 マイルλ・ラボラドリース・FIG、1 to 20 30 40画 青 FIG、3 10 20 30画 今一
て、AI−I F (因子■C)をりL171−フラノ
イーC分離りる例を示し、また ff15図は、本発明に従・)C製造される調製物(、
ニ閏する6%ゲル中CのS 1.) Sポリj′クリル
アミ1〜・ゲル電気原初の結果を示1.。 特許出願人 マイルλ・ラボラドリース・FIG、1 to 20 30 40画 青 FIG、3 10 20 30画 今一
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、 (a )−,71」l−uンヒン複合蛋白質、
線I[を素原及びアルブミンを完全に又は部分的にしか
含有しない抗血友病性因子濃厚物を(q、 (b)抗血友病性因子濃厚物をス1−−クス半径に基づ
く分離に供しで、児かit上高いス[−一りス半径値の
抗血友病性因子を他の蛋白質から分離し、(C)抗血友
病性因子*即物をα埋して一1抗血友病性囚子分子の有
効ス1−−クス半径を児かiJ上低い値に変化さけ、 (d)抗血友病性因子濃厚物をス1−−クス半径に基づ
く分離に供し支、児か()上低いスI・−クメ半(¥舶
の抗血友病性因子を他の蛋白11から分離し、(e)抗
血友病性因子)F!’ N物をアJン交換媒体Cのクロ
マ1〜グラフイーに供しC1高度に精製された実質的に
均一の抗血友病性因子)1厘物を得る、工程を含んでな
る高度に精製された実質的に均一の抗血友病性因子11
11厚物の調製法。 2、 工程(b)又は工程(d)における分離を、抗血
友病性因子濃厚物を架橋アカロース又は架橋ポリアクリ
ルアミドでのゲル・バーミエーシF1ン・りD71〜グ
ラフィーに供することによって行なう特許請求の範囲第
1項記載の方法。 3、 工程(b)又は工程((j)における分離を、抗
血友病性因子濃厚物を調節された孔性のカラス・ビーズ
・クロマトグラフィー−に供することによつ−C行なう
特許請求の範囲第1項記載の方法。 4、工程(b)又は工程(d)に、15ける分離を、ス
クロースの密度勾配用)濾過によって行なう特許請求の
範囲第1項記載の方法。 5、工程<C>における抗血友病性因子濃厚物を、2価
のカヂオン約1〜3Mの溶液1部当り抗血友病性囚子淵
厚物約5〜10容量部の量においで、2価の7Jチオン
源で処理Jる、特許請求の範囲第1項記載の方法。 6、(a)蛋白Nmg当り少くと1)約4000へ1−
1F単位の凝血促進活性: <b)tS帷素原、フィ70ネクT−ン、ノAン・ライ
レフラント蛋白質、及びヒタミン1く依存性凝固因子を
実質的に含まないごと:及び (C)実質的にすべてのへ1−11−活性が甲−ハシ1
〜内て検知される単一バントの電気泳動易動性、を特徴
とづ−る実質的に均一で、生物学的に活性な蛋白質物質
。 7、抗血友病性因子対抗血友病11因子抗原の比が約5
0:1又はそれ以上Cある特許請求の範囲第6項記載の
物質。 8.7オン・ライレフラン1〜因1、櫟帷素原、フイブ
ロネクチン及びヒタミン1〈依存19 ’/fk固因子
を実質的に含有せず、且つ実質的に1へての△l−I
F活性が単一バント内−C検知される単一ハン1−の電
気泳動易動性を示す゛、人−間の抗面I7.病性因子。 9、蛋白%mg当り少くとも約/l 000Δ1−1[
中112の凝血促進活性によ−)て更に特散っけられる
特許請求の範囲第8項記載の人間の抗血友病性因子。 10、活性化されてない部分的トロンボブラスヂン時間
分析において実質的に効果を有さない特許請求の範囲第
8項記載の抗血友病性因子。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US405456 | 1982-08-05 | ||
US06/405,456 US4495175A (en) | 1982-08-05 | 1982-08-05 | Preparation of highly purified human antihemophilic factor |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5944322A true JPS5944322A (ja) | 1984-03-12 |
Family
ID=23603775
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58141256A Pending JPS5944322A (ja) | 1982-08-05 | 1983-08-03 | 抗血友病性因子濃厚物の調製法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4495175A (ja) |
EP (1) | EP0104356B1 (ja) |
JP (1) | JPS5944322A (ja) |
AU (1) | AU567683B2 (ja) |
CA (1) | CA1213214A (ja) |
DE (1) | DE3369143D1 (ja) |
ES (1) | ES8501979A1 (ja) |
MX (1) | MX7309E (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61280866A (ja) * | 1985-06-07 | 1986-12-11 | アルフア・セラピユ−テイツク・コ−ポレイシヨン | 人血液凝固第8因子の分離方法 |
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---|---|---|---|---|
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US5043428A (en) * | 1984-08-31 | 1991-08-27 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Pasteurized, isoagglutinin-free factor VIII preparation and a process for its production |
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SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
GB8505882D0 (en) * | 1985-03-07 | 1985-04-11 | Central Blood Lab Authority | Purification of blood coagulation factor viii |
AT391808B (de) * | 1986-11-03 | 1990-12-10 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung einer faktor viii (ahf)-haeltigen fraktion |
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US5177191A (en) * | 1987-12-21 | 1993-01-05 | Miles, Inc. | Gel filtration of factor VIII |
WO1989009784A1 (en) * | 1988-04-08 | 1989-10-19 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Production of heat-stable factor viii concentrate |
EP0367840B1 (de) | 1988-11-05 | 1993-02-03 | Octapharma AG | Verfahren zur Herstellung eines hochreinen, nicht infektiösen Antihämophiliefaktors mittels Chromatographie |
FR2644064B1 (fr) * | 1989-02-17 | 1994-05-27 | Aquitaine Dev Transf Sanguine | Procede de fabrication du facteur antihemophilique fviiic ayant une tres haute purete et facteur antihemophilique fviiic ainsi obtenu, ainsi que composition pharmaceutique le contenant |
DE3926034C3 (de) * | 1989-08-07 | 1996-11-21 | Behringwerke Ag | Verfahren zur Herstellung eines stabilen Faktors VIII |
FR2651437A1 (fr) * | 1989-09-05 | 1991-03-08 | Lille Transfusion Sanguine | Procede de preparation de concentre du complexe facteur viii-facteur von willebrand de la coagulation sanguine a partir de plasma total. |
DK162233C (da) * | 1989-11-09 | 1992-03-16 | Novo Nordisk As | Fremgangsmaade til isolering af faktor viii fra blodplasma og pharmaceutisk praeparat indeholdende den saaledes isolerede fator viii |
IT1248723B (it) * | 1990-06-12 | 1995-01-26 | Scalvo S P A | Processo per la purificazione del fattore viii e fattore viii ottenuto con tale processo |
FR2681867B1 (fr) * | 1991-09-26 | 1993-12-31 | Pasteur Merieux Serums Vaccins | Procede de purification du facteur viii et preparations obtenues. |
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SE504074C2 (sv) * | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
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- 1982-08-05 US US06/405,456 patent/US4495175A/en not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-07-28 EP EP83107420A patent/EP0104356B1/en not_active Expired
- 1983-07-28 DE DE8383107420T patent/DE3369143D1/de not_active Expired
- 1983-07-29 CA CA000433578A patent/CA1213214A/en not_active Expired
- 1983-08-01 AU AU17472/83A patent/AU567683B2/en not_active Ceased
- 1983-08-03 JP JP58141256A patent/JPS5944322A/ja active Pending
- 1983-08-04 MX MX8310732U patent/MX7309E/es unknown
- 1983-08-05 ES ES524768A patent/ES8501979A1/es not_active Expired
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MX7309E (es) | 1988-05-10 |
AU1747283A (en) | 1984-02-09 |
ES8501979A1 (es) | 1984-12-16 |
CA1213214A (en) | 1986-10-28 |
US4495175A (en) | 1985-01-22 |
EP0104356B1 (en) | 1987-01-14 |
DE3369143D1 (en) | 1987-02-19 |
AU567683B2 (en) | 1987-12-03 |
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