JPS5944322A - 抗血友病性因子濃厚物の調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高度に精製された人間の抗血友病性因子調製
物の新規な調製法に関する。本弁明の更なる目的は以下
の記述から明らかになるであろう。

なお本明細書において、部及びバーセン１−は断らない
限り重量によるものとする。

人間の血液の凝固か、１３の異なる因子の中介する一連
の反応を含む複雑な過程で起こることは公知である。ま
た血友病の原因は固体が抗血友病性因子としているいろ
知られているこれらの因子の１つ、ＡＨＦ、ＡＨＧ、因
子■父は因子■Ｃを適度の凝固をもたらすのに十分な量
で合成重る能力のないことであることも公知Ｃある。血
友病患者の約４０％は△ｌ−Ｉ　Ｆを合成する能ノＪに
欠（）、一方伯は能力が弱いとされている。血友病患者
に対しＣ出血の処置に又はｆ術に際Ｌ（投りり−るｌこ
めにＡｌ−１Ｆ濃厚物の乾燥調製物が市販されＣいる。

この△１−１Ｆ濃厚物は公知の技術を用いることにより
人間の供与者の血漿から冑らｈる。、使用萌には、乾燥
哨原物を無菌水に溶解し、ｉＱられる（Ｈ液を静脈内に
投与ずく）。

凹通の市販の八ＨＦ調製物は科忰なΔｌ−Ｉ　Ｆ　ｔ−
ない。むしろぞれは而明から冑られる△ＨＦに冨んだ画
分てあり、曲の成分を含有するつ△ｆ−Ｉ　Ｆ　ｉ騎り
物はできる限り純粋Ｃあることか望ましいが、△１−Ｉ
　Ｆを自明から分離ダる方法を改良１ノて帥度を高める
ことは自明成力の分離が困φＩｆなために実際上は容易
−でない。Δ１−（［は血漿中のイの含量が（（（り月
つその活性が不安定なために分１１ａｔと精製が全く困
難である。公知の八ＨＦ　濃厚物は、Ｃｏ１団のＬタノ
ール分別法により血漿から分離した画分■或いは血漿を
７Ｆ＃桔し、次いでで−れを低温で融解づることによっ
て得られるクリＡ７レシビデー１−＜　ｃｒｙｏｐｒｅ
ｃｉｐｉｔａｔｅ　＞から調製される。しかしながらそ
れらはすｌ＼°Ｃが低純度の粗生成物であり、多量のａ
ｌｌを素原を含んでいる。これを多量に或いはしばしば
繰返して投与する場合、それらはＩｌｉ！ｉ環系に過負
荷の線帷素原をもたらすから、患者の状態を臨床的に全
く危険にするかも知れない。史に、各調製剤の活性には
バラツキがあるから正確な投与量を決めることは困難で
ある。上述の理由のために、現在の傾向は、高度に精製
され且つ高度に濃縮されたＡＩ−Ｉ　Ｆ　ｇｌｉｌ製物
を多量の血漿から１りることにある。従来開示されてい
る高性能のＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆ　Ｗ４厚物は一般に先′？ｌ
’　Ａ　ＨＦの粗両分例えはＣ０ＩＩ＋１の画分■又は
クリオブレシビテ−１へを調製づることによって製造さ
れる。

ＡＨＦ淵厚物の従来の分別法は、濃厚物かｈラムクロマ
トクラフィー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は
ポリプロピレンクリコール（１〕ＰＧ）ｌｔ１Ｍ法、ク
リシン（又は他のアミノ酸）沈殿法、並びにアルコール
沈殿法により線帷素源及び他の蛋白質から分離できるこ
とを示しＣいる。英国特許第１５０７１９８月及び米Ｉ
）特許第３９７３０　Ｃ’＞　２４は１）目と温度の調
節を利用しく△ＨＦａ厚物をいくらか精製し、中位の純
度の低性能調製物を製造している。これらの特８１に記
ｊＩされている方法は、クリＡプレシビテー１〜自体よ
りもクリＡブレシビテ−１〜から抽出した両分を利用し
ている。更に１）Ｈと冷却の調節の′１リイクル後に５
７別を停止しＣいる。他のものも１叶１と冷加の調節の
１サイクルを用いる効果を認めている（Ｊ、Ｋ。

３ｎ＋ｉｔｌ＋ら、’Ｊ　ｒａｎｓｆｕｓｓｉｏｎ　　
１９　、　２９　！ｌ−３０６＜１９７９））。

上述の方法によって轡られる△１」トの組成物は、比較
的、低Ｗ４度（０１１当りのへ１−（［活１′１が約５
〜１５単位程度）且つ似紬度（蛋白質１１（１当りの△
ＨＦ活性が１中位以ト）のものである。

ポリ上チレンクリコール分別及びグリシン沈−９分別法
による△ＨＦ濃厚物の調製は、米国特許第３４１５８０
４号、第３　（３８２ｔ３　Ｆｌ　１号、第３７７０６
３１号、第４０２７０１　Ｓ３号、第３８３９３１４号
、第４０６９２１６号、第３６３１０１８号、第３６５
２５３０号、第４０７３８８６号及び第４０８５０９５
号に記述され−Ｃいる。

Ｋ　１ｓｋｅｒ　　（Ｔ　ｌｌｌ’ｏｍｌ）　、　Ｄ　
ｆａｔｌｌ、　ＨｅａｍＯｒｒｌｌｉｌ！７ＩＣａ。

１７．３８１　（１９６７））並びにｌ’ｅｎｉｃｋ及
び（３ｒ山＋ｋｈｏｕｓ　（△ｍｅｒ　　、　　Ｊ　　
、　　Ｍｅｄ、　　３ｃｉｅｎｃｅ、　　２　３２．４
３４　（１９５Ｇ））は、そのよ）な高能力Ａ　ＨＦ濃
厚物の調製過程において、特にΔＦＩＦの分離及び精製
の過程において、共存する１０１へロンビン複合体及び
その構成因子の活性形例えば’ｆｌａ　、　Ｘａなとか
ＡＨＦの安定性に対して著るしく致命的であり、時に△
）−ＩＦを不可逆的に損傷して不活性化することを指摘
している。それ故に八ＨＦの安定性、収率及び溶解性を
改善するためには、これらの不安定化因子を分離−精製
工稈の最も早い段階で不活性化し或いは除去ケることか
全く重要であり、また本質的に必要である。該不安定化
因子の不活性化法は、例えは米国特許第３８０３１１５
月に開示されている。また該不安定止置ｒは吸着剤例え
は水酸化アルミ−ラム、水酸化マグネシウム、炭酸バリ
ウム、硫口ηバリウム、リバノール（６，９−ジアミノ
−？−土トキシアノ７リシンラクテー１へ）１．イオシ
ダ杓（月０旨（△ｍｈｅｒ１−Ｈｅ　ＩＲＣ−５０＞、
クリシン１デル、１スアル％どを用いることによ−）（
除去７：きることも間示さしｘ　イル（Ｂ　ｉｄｗｅｌ
ｌ、　Ｅ　、　６、Ｂ　ｒｉｔ　、　Ｊ　、　ｌ−１ａ
−ｅｍａｔ、　、　　１３．５６８　［１９６７１：　
３ｏｕｌｉｅｒ。

Ｊ、Ｐ、ｂ−一、　　Ｐ　　Ｉ”ｅＳＳｅ　　ｍｅｄ、
、　　　７　２　　、　１　２　２　３　　ｔ　　Ｉ’
、、−）　　６　４　　］　　　；　　Ｓｕｒｇｅｎｏ
ｒ　　　、　　　Ｐ、　　　Ｍ、　　　１３−１　　（
）　、　　　ｒ’ｌ＋ｙ３゜Ｑｏｌｌｏｉｄ　　Ｃｈｅ
ｍ、、　５５．９　ｉ４　ｊ　１９５１１：ｔ−１ｏａ
ｇ　　　、　　　Ｎノ１．　　　Ｓ、　　　’）、４１
１、　　Ｊ　　、　　　ＣＩｉｎ　　　、　　　　Ｉ　
　ｎｖｅｓｔ、、　　　３９．５．５４［１９６０］）
、これらのうら水酸化アルミニウムは、該不安定化因子
の比較的良好な吸着剤であることが知られており、ＩＩ
ｔつて最も碩繁に使用されている（米国特許第４１７０
　Ｃ３３９号）。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｆ　Ｃ架橋したテキス１
−レンも、７［」１−ロンビン複合体の吸着及び除去に
使用されでいる（米国特許第４０９３６０８号）。

上；ホしたように、上述の従来法で得られるへＦ１Ｆｍ
ｌ厚物は、比較的低い比活性のもの、即ち蛋白質ｍり当
りの△ｌ−Ｉ　Ｆ活性が約１単位又はそれ以トのもので
ある。この時望ましくない不純物の′１つは変性された
ＡＨＦである。米国特許第４．２８９６９１号及び第４
３０２４４５号は蛋白質ｍｇ当り１〜３単位ＡＨＦ活性
の比活性を有づる△ＨＦ調製物の調製法を間示し、また
米国特許第４２９４８２６号はｍｇ当り約１〜１０単位
八ＨＦ活性の比活性を有する人間のＡ　ＨＦの調製法を
記ｊホし−Ｃいる。

本発明の方法は高度に精製された、生物学的に活性な人
間の△ＨＦ調製物を提供する。本方法においては、中程
麿の純度のＡ　ｌ−Ｉ　Ｆを含有する濃厚物、例えば市
販の△ｌ−（Ｆ　ｉｌｌ製物が人間の自明の分別によっ
て調製される。Ａ　ｌ−Ｉ　Ｆを含有する濃厚物をスト
ークス半径に基づく分離に供して、ＡＨＦをＡ　ＨＦ　
Ｒ厚物中の蛋白質のバルクから分ｍ　する。

△ＨＦ活性を有する上記工程からの両分を、ＴｍＦ３゜
アンモニウム、硫＠ノー１−リ「クムなどの添加による
沈殿、透析、Ｐ　Ｅ　Ｇ添加などで；９縮する。続い（
この濃厚物を水性媒体中にｉ′１１７Ｒ化（，７には平
廂化させ、次い（処理し℃△１」Ｅ分子σ）有効ストー
クス半径半を見か（）上低い値に変え、△ｌ−Ｉ　Ｆを
濃厚物から更に分離４るためにストークス半径 離に供する。この分離した△ｌ−Ｉ　Ｆ＝を透析によ−
】（脱カチオンし且つアニオン交換樹脂媒体でのり（」
７１−クラフィーＴ９！１即して、高度に精製された△
１１　Ｆ濃厚物を得る。

本発明の方法で製造される人間のへ１−（Ｆ調製物は蛋
白’Ｒｍｇ当すＦＪ　４０００〜８０　（’）　０１８
　（ｒｌ（７）　Ａ　ｌ−１Ｆ（プロ凝固）活性を右ブ
る（活性の１甲位は正常の人間の自明１ｍｌ中に見出さ
れるらのである）。

蛋白質Ｊ）当り少くとも約４００　Ｃ１甲ＩＱの△（１
「活性を有する生成物は均一に見え、高速液体り［」７
１−り−ｙ　７　イー　（ＨＰ　Ｉ−Ｃ）　ニョｌ）　
２　（’）　００００　＝−／１０００００タル（・ン
の分子用を右する。

本発明の基本的な利点は、光り第１に高ｌｉＴ！庸及び
高活性の人間の八ＨＦ調製物が１ｑら１すること−Ｃあ
る。上述のように、本発明の調製物は均一であり、従っ
てｍｌ１ｔ素原、フィブロネクチン、フォノ・ウィレプ
ラン１〜蛋白質、ヒタミンに依存性の凝固因子、及び他
の望ましくない又は不安定化させる酵素又は蛋白質を本
質的に含有しＣいイヱい。

本発明の改良された方法は従来１ｑられなかった上記の
人間の調製物を調製する利点を有する。本調製物中のＡ
　ＨＦのすべでの分子は１〜ロンヒンによって開裂する
ことができ、八ＨＦがその元のく即ち不安定化されてな
い〉状態で存在することがわかる。

第１〜４図は、本弁明の方法の工程にｄ５い−（、ＡＨ
Ｆ（因子■Ｃ）をクロア１〜クラフイーＣ分離する例を
示す。

第５図は、本発明に従って製造される調製物に関する６
％ゲル中でのＳＤＳポリアクリルアミ１〜・ゲル電気法
＃ｊＪ　（Ｌ　ａｅｍｍｌｉ、　Ｎ　ａｔｕｒｅ　、　
２７７　。

６８０〜６８５　（１９７０）、参考文献として引用さ
れる）の結果を示す。

本発明の出発物質は、人間の面１７’Ｊから冑られる△
ＨＦのｉ１１厚物、例えは市販のΔ（」「濃厚物である
。標準的な方法によれは、血漿−コレクション・廿ンタ
ーから凍結した（　−２（Ｊ　”Ｃマはで４１以上の）
人間の自明を１ｑる。この凍結し１．：自明を処理して
Δ１」１１す物とづる；例えは凍結しｌこ血漿をクリオ
ブレシビテ−１−を生成するのに−１分な導度に保ち、
或いはエタ、／−ルで処理し−１（：、　ｏｌ＋ｎ　「
ｒａｃｔ　−１ｏｎ　１を得る。△ｌ−Ｉ　Ｆ　ＦＩＡ
厚物は、通常の技術、例え１シクリオノ゛レシピデー１
−に対する連４＞　５）　Ｈにより自明から分離される
。次いて△１１１−濃庁物を公知の方法で処Ｉ」シ、池
の凝結蛋白質１例えはグし１１−　ｕン゛ヒン複合蛋白
買、紳維素原、ｊフルフミシ、及び他の蛋白質を完全に
父は一部除去し且つΔ１−１１：を更に濃縮する。上述
の蛋白Ｈの除去は１本明細書に参考文献どし−（引用さ
れる前述の特許に記ｊホされている如き公知の方法で達
成りることがＣきる。例えば゛上記蛋白質は△１（トを
含有づるクリＡブレシビテー１−　ｉ１’ｌ厚物から、
クリＡプレシビデートを水性媒体中に溶解し、水酸化ア
ルミニウムを添加して必要のない蛋白質を沈澱させ、ｐ
＋−＋と増の濃度を調整し、そして超）濾過によりＶｏ
ｌ−ロンビン複合蛋白質、線帷素原、アルブミンなどが
実質的に減少したＡＨＦＩＷ物とすることによって除去
できる。池に又は更に、上記蛋白質はポリエチレングリ
コール及び、・又はグリシン沈殿法によりＡＨＦのクリ
オブレシビデ−１−１厚物から除去しうる。

このように調製したＡ　ＨＦの濃厚物を超）濾過、凍結
乾燥又は双りの組合せにより処理しＣ−１その含む水量
を部分的又は完全に減する。

ＡＨＦの濃厚物をストークス半径に基つく分離に供し、
見かけ上高いストークス半径を示Ｊ’ＡＨＦから低分子
量の蛋白質を分離する。この分離は挿々の方法により、
例えば△ＨＦＷ４原物を、架橋アガロース（例えばＢｉ
ｏｇｅｌ△−１５ｍ又は３ｅ−＋＋ｌ＋ａｒｏｓｅ　Ｃ
Ｌ　−４Ｂ　）に基ツ＜’ｙ’ルーバーミＩ　−ジョン
・クロマトグラノィーに、或いは調節された孔径のカラ
ス・ヒース処理に、或いはスクロースの密度勾配超）濾
過に供φるεどによ−）で行なうことが−Ｃきる。この
技法のりｌ＼（は技術的に一１分公知である。好ま１７
＜はΔ１（Ｆ湖庁物を例えは衆ｔｇアカＬ１−ス又はポ
リアクリルｊ２ミ１−に阜づくゲル・バーミ」−−ジョ
ン・クロマ１−り＞２フイーに供する。クロマ］−クラ
フィー媒（本（平檜ｉ化さけたｉ稽、Δｌ−Ｉ　Ｆを、
イオン強度的０．１へ−０，４及び吋］約６．０〜７．
５のＰ４衝された塩溶液で流出さける。

上記の流出さＵた△Ｈ［を含む両５）を集め、これを技
術的に公知の方法で、例えは硫酸アンモニウム、ｆＩｊ
ｌＩ醸ｊトリウムなとての）先殿により、透析により、
Ｐ　Ｅ　Ｇ添加によるなどしく濃縮づる。例えばΔＨＦ
の集めた両分を硫酸？ンＬニウム（３０〜／１０％、重
串　容量）Ｃ処理しＣΔＨＦを沈殿さける。濃縮後、Ａ
Ｉ−ＩＦをｐｌ−１約６．０〜７゜５及びイオン強度的
０．１〜０．／ｌの水性ＩＪＪ　ＰＨ’ｆＭ液に溶解し
又は平衡化させる。集めたＡＨＦ両分の濃縮中に硫酸ア
ンモニウムのような塩を添加する場合には、次の工程に
先立って、公知の方法により、例えば透析、シアフィル
トレージョン（ｄ＋ａｆｉｌｔｒａｆｉＯｎ　）などに
よ−）Ｔそのような塩を除去する。

次いでＡＨＦＩｉ厚物を処理して△ＨＦ分子の右動スト
−クス半径を見かけ上低い値に変化させる。

この目的のためには、２価のカチオン源例えはノ」ルシ
ウム又はマクネシウム源を添加することができる。この
場合には、△ＨＦＷＡ厚物の容量部当りに、２価のカチ
オン約１〜３Ｍの溶液１部を含む蛋白質溶液的５−１０
容量部を使用づ−る。ストークス半径の上述の減少は、
ＡＨＦの溶液中に高イオン強度（例えば塩化ナトリウム
の場合的１〜４Ｍ）を達成す゛ること或いはＡＨＦを△
ト１「濃厚物１部当り約０，０１〜０．００１部のｌ〜
ロンヒンと共に保温することによっても達成することが
できる（　Ｌ　ｅｏｎ　Ｗ、　Ｈｏｙｅｒ、　Ｈｅｍｏ
ｐｈｉｌｉａ　ａ面１−１ｅ−ｍｏｓｌ−１ｅ−、ＩＩ
　Ｔ　＋１ｅ　　Ｆ　ａｃｔｏｒ■Ｃ０ｍ１）ｌｅＸ　
：　３　ｔｒＬｌＣｔ旧’ｅ　　　Ｆ１１１１０口０「
１　　°°　、Δｆａｎ　　［Ｑ　、　　ｌ　ｉｓｓ　
　。

ｌ　ｎｃ、　　、、７頁　（１９８’Ｉ　　）　　）　
　。

ΔＦ１Ｆ分子のストークス半径の減少に続い（、Δ１１
Ｆを公知の方法、例えば’ｒ’ｌ＝析Ｖ（よジ））フィ
ル１〜レーシヨンで処理しく２価のカチオンを除去し、
次いで上述の手段のいずれかによりスト−クス半径に基
づく分離に供する。好ましくは、Δｌ−Ｉ　Ｆ　ｉｎ厚
物を、架橋アカロー又又はポリアクリル戸ミ１〜に基づ
くゲル・バーミ土−ション・り目？１〜クラノイーに供
し、り【」７トクラフ【−媒体Ｃ平衡化させ、イオン強
度的０．１〜０．／Ｉ及び１１１−４約６゜０〜７．５
の緩衝された塩溶液（−流出させる。

△Ｈ’Ｆ活性を含む流出した両分を集め、１ｌｉｌｉ時
含水量を減することによって１するつこの１的のために
は、集めた画分を透析、ジノ′ノイル１〜１）−ジョン
などによ−）で１−縮してもよい。透析溶液内の溶液か
ら水を抽出するために、両分を例えば固体Ｐ　Ｅ　Ｇ　
２０００　（、）に浸ずことかＣきる。Ｍｉｌｌた物質
を、１中約６．０〜７，６の緩別液に月する透析、シア
フィルトレージョンにより処理して。

２価のカチオンを除去す゛る。

上記濃縮工程に続いＣ１△ｌ−ｔ　Ｆ活性を含有づる画
分をアニオン交換媒体、例えば４級アミ、ノエヂル（Ｑ
ＡＦンセルロース、ジエチルアミノＪ−’ｆル（ＤＥＡ
Ｅ）セルロース、父は間係のアニオン交換体に基づくク
ロマ［〜グラノィーに供する。

クロマ１〜グラフイ一媒体を、Ａ　ＨＦてｈい結合して
ない蛋白質を除去するのに十分なイオン強度、即ちＯ〜
０．２（０〜０．２ｔｖｌ塩化−ノートリウムなと〉を
有する緩衝された水溶液で洗浄する。Ｒ後にクロマ１〜
グラフイ一媒体を、ＡＨＦを流出さけるのに十分なイオ
ン強度、即ち約０．２〜０．６を有する水溶液（例えば
０．２〜０．６Ｍ塩化すｌヘリウムなど）で流出させ、
八ＨＦを含有する両分を４％　、次いてこれを集める。

上記クロマトグラフィーから集めた両分は、蛋白質ｍｇ
当り少くとも約４０００ＡＨＦ単位の比活性を有する八
Ｈ’Ｆを含み、Ｑ　Ａ　Ｅ　ｔルロースに基づくイＡン
交操クロマ１〜クラフ（−及び１−゛テシル硫酸プ１ヘ
リウム（８１つＳ）ポリノアクリルアミ１〜・グル電気
泳動（ｌ　ｅａｍｍｌ　ｉ　）’　ｆこ塁づい（実質的
に均一な調製物である。ぞのようなくト成物は従来法で
記述、開示又は提案されＣ−いない、、結果としく集め
た両分は自明中で見出されるものよりも少くども約３５
００００　ＩＱに精製さＰｃ　ｉｓ　ｍ　＊　Ａ　ｔ−
１ト調製物である。これは無菌で）濾過し、凍結乾燥着
ることができる。

上述の集めた両分は、無変性条１′１Ｆに随峙ＨＰｔ−
Ｃに１銭することがＣきる。この目的のためには通常の
ＨＰ　Ｌ　Ｃ装置が使用Ｃき、八ＨＦの）Ｒ出はス１−
−、ス半径に基つく標準的なｈ法Ｃ行なわれる。

八ＨＥを含む両分は、合計で生成物の１０％の収串であ
る。Δ［−１Ｆは蛋白質ｍｇ当り少くとも約４０００△
ＨＦ！１位の比活性を有する、両分は無菌濾過Ｃき、超
）濾過、凍結乾燥又はこれらの相合ｌのいずれかによっ
て含水量を減することかＣきる。

この△）−ＩＦ調製物はｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ及ＵＳＰＳ
ポリアクリルアミド・グル電気泳動（ＰＡＧＥ　）　　
（Ｌａｅｍ−ｍｌｉ　）により均質性を示す。即ちこの
△ＨＦ調製物は、本質的に均一であり月っ本質的に因子
■、Ｗ、ＩＸ、Ｘ、線帷素原、アルブミン、フィブロネ
クチン、フォン・ライレフラン１〜因子を含まり゛（即
ち非ＡＨＦ蛋白質を合計して約１９も以下でしか含有せ
ず〉、また活性化されてない部分的１−ロンボブラスチ
ン時間試験において本質的に活性を示さない。これは精
製された蛋白質が凝血カスケードにおいて八Ｈ「依存性
工程を妨げる活性化されてない凝血因子を本質的に含有
してないことを示す。

本発明の八ＨＦ調製物は、面友病性自明にあける凝血欠
陥を補止り−る能力に加えて次の特性も有する： （ａ〉トロンビンでの処理に続いて生物学的活性が増加
し、推定的なポリペブチ１〜＠が変えられる。精製され
た蛋白質はトロンビンの処理で活性化することによりＡ
ＨＦ活性を４〜２０１８にす゛ることができる。

（ｂ）生物学的活性は古典的な血友病をｈづるある患者
に見出される△１」、　Ｆにり・］ツる禁止剤にノ：り
遮ｌ＼いＣきる。数倍過剰量（中位；単位）のΔ１−Ｉ
　Ｆ禁止剤と混合した時、測定し）る△ＨＦ活１１の９
５〜９９％が無効にＣきる。

（Ｃ）精製された元のＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆは２００〜４００
０００グル１〜ンの分子量ｔこ相当づる流出容量を右ツ
る。還元及びＳ　Ｄ　Ｓ　Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ後、約１００
０００の見かけの分子量を有ゴる単一のポリ／＼ノ°チ
ト鎖が存在する。１−ロンヒンとの保ｒＲｔ％、１００
　’０００のポリペブチ１〜の実質的に１／＼てか消え
、分子！　７．５０００を右づる単一なＩｌｌ広いパン
１−が現われる。それより低分子量の更なるパン１−は
兇られない。

（ｄ）精製した八ＨＦは重大なノロテアーゼ活性を、そ
して本質的にずべ又の（１！Ｉの自明蛋白質を実質的に
含んＣ゛いないようであイ〉。

（ｅ）精製した△ｌ−Ｉ　ＦはＡ　Ｉ−Ｉ　Ｆ抗原〈因
子■。

Ａ（＋）を実質的に含まない。△（」Ｆ：△ｌ−（Ｆ抗
原の比は普通的５０：１又はそれ以上であり、一般には
約５０：１〜１５０：１である。

本発明の人間のへＨＦ調製物のアミノ酸組成を第１表に
示する。

瓜−１−六 人間のΔ１−（Ｆのアミノ酸相成 一一］Ｗ　　　　　　　　　　　ｊ）１員１００，００
０のりノー１−；７に当りの残り監 シスチーｒン酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１３ｊ′スバル°ｆン酸　　　　　　　　　　　　　　
　　６５スレオニン　　　　　　　　　　　　　　　　
　・１）７レリン　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１１１グルタミン酸　　　　　　　　　　　　　
　　　１１０プロリン　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　３０クリシン　　　　　　　　　　　　　　　
　　１５７アラニン　　　　　　　　　　　　　　　　
　　５０メヂオニンスル小キシド又は カルボキシメチルシスティン　　　　　　　　１（、）
イソロイシン　　　　　　　　　　　　　　　２４Ｕイ
シン　　　　　　　　　　　　　　　　　　４７ヂロシ
ン　　　　　　　　　　　　　　　　　２３フエニルア
ラニン　　　　　　　　　　　　　　２２ヒスデシン　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１７リジン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　４ｒ１アルギニン　
　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｇ全残基−８３３ −１−リブ１−ファンは系に検出−（きなかった。

−酸化された誘導体の同定は、酸化の前後にこ擾しらと
同一の残基が検出されたから仮のものである。

−メヂオニン父は半システィンは検出できなかった。

実　　施　　例 次の実施例は本光明を更に説明する。

飢−組 １〉凝血分析　深刻なＡＨＦ欠乏症（△ＨＦ　１９６以
下）の唐者からのＩｈＪ切を基質として用い且つ凝結時
間を決定するためにフィブロメータを用い（、△ｌ−Ｉ
　Ｆを１段凝血分析法で分析した。△ＨＦの１単位は集
められた正常の人間の面１７１１ｍｌ中に存在するその
量として定義される。＜　Ｌ　ａｎｇｄｅｌｌ　ら、Ｊ
、　Ｌ　ａｌ）、　Ｃｌ１ｎ　、　Ｍｅｄ、　、　４１
．６３７〜６４４　（１９５３））。

２〉蛋白の計画はＱｉｌｆｏ＋・６２５０分光光度計を
用いて行なった。づべての試料を２８０　ｎｍ及び３２
０１１ｍで読み、次の式に従って光散乱に対し吸光度を
補正した。

△！８ｏ補正値−Ａ　２　！１０未補正値−１，７（△
３２０） 但しＡはＡにを意味し、比活性の旧粋のために１０．０
のそれが仮定される。

３）パリアクＩルアミぐ・ノ“ルＷＪｋＪＩ＝　＊Ｊ＋
Ｊ２ｊ−４。

５％スタッキング・ケル（５ｔａｃｋｉｎｕ　ｇｅｌ　
）を６％セパＬ／　−：ｒ　インク・グル（Ｓ　ｅｌ＋
ａｒ＊目１１（Ｊ　ｇｅｔ　）と共に用いるＯ　−Ｆ　
ａｒｅｌｌの方法に１ｆγつ（１〜アシル硫酸ツートリ
ウム−ポリアミ（〜・ゲル電気泳動物を準備した。電気
泳動を２５ｎ）Δ（・１１ｒ′ｆ間行なった。

無変性条件上てのポリアクリルアミ１−・ゲル電気泳動
は、５％ゲル及び２５ｍ１’ｖｌｌ−リス及び１９２ｍ
　ＭクリシンをｐＨ８、ａ　Ｃ用いた。電気泳動を４′
ＣＦに３時間２５０ポルｌ−Ｔ：行なっＩこ（０′Ｆａ
ｒｒｅｌｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、　Ｃｌｌ０ＩＩ＋、
、　２５０．４００７〜４０１２　（１９７５））、、
クルは哨醸銀を用いＣ蛋、白質に対して染色した。ぞし
Ｃ５ｍ１＋１間隔で（璋層に切り且つ名簿−を、５　Ｑ
　ｍ　Ｍ　ｔ・リスー塩０１！塩、Ｉｌｌ　７　、　Ｑ
、１５０ｍＭＮａ（じ１及び２００μす、・Ａバルーノ
ミ２ｍｌのＱ、３＋１１１に添加することにより、染色
され−Ｃないゲルから蛋白質を流出させた。混合物を２
〜３Ｒ間４　”Ｃｔ−保濃し、△）−（Ｆｑ）凝結促進
活性を上述のようにＭ′ＶＴｏ　Ｌ／だ。

４）　　■：Ｃ△９分析　Ｒｅ１ｓｎｅｒらの方法に従
った。抗体は親切にもｌ−１ｏｗａｒｄ　Ｒｅｌｓｎｅ
ｒによッＣ提供してもらった。＜　Ｒｅｉｓｎｅｒら、
　Ｔ　ｈｒｏｍｂ。

Ｒｅ５ｅａｒｃ１１　、　１４．　１３５〜２３９　　
（１９７９））。

５ン△Ｉ−Ｉ　Ｆ活性の禁止　これはＡＨＦを含む試料
１容量を、ＡＨＦに対する禁止剤を含む人間の血漿同容
量と混合することによって測定した。禁止剤の濃度は常
にＡＦＨの１１１度より数倍過剰であった。指示する期
間保温した後、残存へＨＦを分析した。

６）八ＨＦのＴ　Ｉ＋ｒｏｍｂｉｎ活性（３ｗｉ　ｊＺ
Ｏｒう、Ｊ。

Ｂ　ｉｏｌ　　、　　ＣＩ＋ｅｍ、、　　　２　５　５
．　　１　０６０６　・〜　１　０６　１１　（１９８
０））。

７）フｔン・ウィレブラン・蛋　　５析（Ｖｏｌ−１ｅ
ｒ　　ら、　３ｕ１１．Ｗｏｒｌｄ　　　Ｉ−（ｅａｌ
ｔｈ　　Ｑｒｇａｎ、　　、　　５３゜５５〜６３　（
１９７６）＞。

８）銀染色（Ｍｅｒｒｉｌｌら、　３ｃｉｅｎｃｅ、　
２１１　、１４３７〜１４３８　（１９８０））。

大−Ｊａｒ 出光原料はＣＵｔｔＯｒｌ　ａ１１０１’ａｔｏｌ’＋
（！Ｓ　、　　７１１０．か’＞４７）Ａ　ＨＦ？＋’
ｊｌｉＬ／Ｆ１＃　（Ｋｏａｔｅ””　）　。あ−、。

。 １）第１図を参照しＵ　、　［３ｉｏｇｅｌ△−１５ｍ
（３ｉｏ　　Ｒａｄ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　　
、　　１０（−３−２０（１メツシユ）の２．（３ｘ９
０ｃｍのノノラ１＼（、二おい（。

Ｃａ　Ｃ１２（１ｍ　Ｍ＞　、り」−ン醸１；ｌ−１−
リウｌ−（５ｍ　Ｍ＞、０．１３５ＭＮａＣ１，５％γ
キスｌ−１］−ス、０．１％す１〜リウムアシトを流出
剤として＋３）−１７，３５及び室温で用いること（、
より、クル・バージ１−ジョン・／７０７１−クラフィ
ーを（ｊなった。、△ＨＦを最高潤度Ｃ含む画分く１０
）を集め、４．　Ｏ％Ｗ、、□ｖｆｍ　Ｐ　’、７’ン
モニウムＣの）沈澱によりＩＩＩ縮した。次のに稈のＩ
Ｆ備のために、沈澱を１５０ｍＭＮａＣｌを含右する＋
＋Ｉ−ｌ　７　、　Ｏの５０ｍＭイミタンール祠衝剤に
溶解し、投石し′Ｃ残存ト々酸アンモニウムを除去した
。

２）上記１からの透析した試牢８１を、２．５ＭＣａＣ
ｌ！１容檗を蛋白質溶液９容量と混合ηる口どによって
ＣａＣ１ｔ中２５０ｍＭにした。次いＣ試料を、同一の
緩衝液であらかじめ平１−１化さけた３　ｅｐｔ＋ａｒ
ｏｓｅ　　４　Ｂ　−ＣＬの２Ｘ１００ｃｍのカラス製
カラムによるクロマ１〜クラフイーにか＆ｌた。）ｋ出
媒体は１５０ｍ　ＭＮａ　Ｃ１及び０．２５ＣａＣｌ　
ｉを含むＩ）Ｈ７，Ｏの５０％１Ｍイミタソール＃１ｔ
７液であった。第２図を参照すると、区＋１ｉ、　１２
は集められるΔ１−ＩＦ活性を含む両分を表わダ。

３〉上記工程力日ジ集めたＡＩ−ＩＦ（１２）を透析ハ
ング中に入れ、このバッグを固体ＰＥＧ２００００中に
浸すことによって濃縮した。次いで濃縮した試料を５０
　ｍ　ＮＩ＋イミタゾール緩衝液、ｐ）−１７。

０及び０．１５ＭＪＭ化す［・リウムに対して透析し、
同一の緩衝液であらかじめ平衡化させたＯ　Ａ　Ｆ　ｔ
？ルロースの２．５Ｘ１０Ｃｍプラスチック製カラムで
のクロマトグラフィーにかけた。ＡＨＩ−のりべてをこ
れらの条件下に結合させた。今や第３図を参照して、結
合してない蛋白質（′ｌ　６　）を０．１５　Ｍ　Ｎ　
ａ　（ＣＩ　′Ｃ洗い出し、同一の桟用剤中ｏ、　２０
ＭＮａＣｌの段階的り）ジ＋−ンｌ−ｃ操作しＣ△１−
Ｉ　Ｆを殆んど又（よ全熱含有しない蛋白Ｈの更なるピ
ーク（１８）を流出させた。、最１軒に、０．２０＝　
ｌ　、　０１ｖｌＮａＣ１ノｉＰｉ’ＰＭ的りラシ［シ
Ｆにおいて、１８０ｍ１ｔ　１７ｍｌ　　ｌＦｆま（−
流し／ｊ、、／１５白！・オの史なるピーク（２０）を
流出さｌ！／Ｊ、ｃｍのピークの柊り項に、△ＨＦ活性
がＯ，：ＩＭＮａに＋イ’Ｊ　ｉ！ｉＣシｈま−）でか
なり鋭いピーク（ｉ　４　）　Ｃ流出した。

△］」１：活１１に従って蛋白質を隼ｃＶ）たつ結合し
Ｃない蛋白質は第５図に２４（示９’　（０’、（）グ
ル中Ｓ］、）Ｓポリ？クリルアミｊ〜・ゲル電気ン永動
［１ａｅｎ＋ｍ　−１ｉ］　）・；　０．２ＮＮａＣｌ
　で流出（５に蛋白質を２６で表わし、そして０　、２
　Ｍ　Ｎ　ａＣＩ　Ｃ２８（７）　ｅ−りを流出させた
。

このように調製したＡＩＩ　Ｆ　Ｆｌ’Ｊ　９’！物は
、６９６ケル中８１つＳポリアクリルアミ１〜・クル電
気泳動（ｌ　ｅａｍｍｌｉ）　ニア３　イＴ均Ｍ１９（
３０）を示し１１．−　。

この調製物の比活１／ｌ：は蛋白質ｍり当りΔＨＦ活性
が約５０００単位であり、原料の血漿より３５００００
倍精製されたことを示づ。市販の△ｌ−Ｉ　Ｆ　１１’
Ｎ物からの全回収率は１０％が具現化された。

４）工Ｐｉ！３＞から集めた両分を、高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＧ＞に先立って濃縮した。

ＨＰＬＣはＢｅｃｋｍａｎＴＳＫ４００１　Ｘ３０ｃｍ
カラムを４ｏｐＳｉ、流速０．５ｍｌ／時で用いること
によって行なった。傾向を第４図に示す。△）−）［は
第２のピーク（４＝ｌ）、即ちＩ　（ｌ　Ｍ　ＩＩＷ８
９００００）及びＴｇＧ　（ＭＷｌ　６００００）の流
出位置の中間と一致して流出した。２つの最大のピーク
５０及び５２は△ＨＦ活性をもｌＪなか−）たので同定
しなかった。ピーク５４はも甥１在≦へＪムノーミン（
ＢＳＡ）を表わした。第４図においＣ１４６，４８及び
５４における矢印は平（）実験における公知の分子量の
マーカー蛋白質の流出容量を表わす：４６＝Ｉ（ＪＩＶ
Ｉ（ＭＷ８９００００）及び４８＝　１９Ｇ　（ＭＷｌ
　６００００）。

第５図を参照すると、上記工程４〉から集められた△ｌ
−Ｉ　Ｆは６％ゲル中５Ｏ３Ｉノ八〇Ｅ’（Ｌａｅ−ｎ
＋ｍｌ＋＞において本質的に均一（３２）Ｃある。この
調製物は蛋白質ｎ１（Ｊ当り約５０　Ｃ１（ＪΔＨＦ　
１位の比活性を有し、原料の血漿より３５（ＪＯＯ○倍
の精製係数を表わす。

第５図におい一’Ｃ，５ＤＳＦ〕ΔＧトに対する原１１
は３／４ひ及びイオンフロンｌ〜（１ｏｌｌ　ｆｔ’０
１１ｔ　）は３３Ｇで表わされる。カラム２２は分子ｙ
＋　２　（、）　Ｏｏ　００のミオシン高分子鎖（３８
）、分子量６８０００のＢＳ△（４０）、及び分子Ｍ　
／Ｉ　３Ｉ）　Ｑ　□のＡバルブミン（４２）を表わす
。

上記操作及び結果４第２表に曹杓づる。

＼ ＼ ＼、 ＼ ＼、 ニ２１　□　− ｉ ｇ　　　　藁　　　　　認　　♀

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は１本弁明のＩｊ法の−Ｌ程にｉ４３い
て、ＡＩ−Ｉ　Ｆ　（因子■Ｃ）をりＬ１７１−フラノ
イーＣ分離りる例を示し、また ｆｆ１５図は、本発明に従・）Ｃ製造される調製物（、
ニ閏する６％ゲル中ＣのＳ　１．）　Ｓポリｊ′クリル
アミ１〜・ゲル電気原初の結果を示１．。 特許出願人　マイルλ・ラボラドリース・ＦＩＧ、１ ｔｏ　　　　　２０　　　　３０　　　　４０画　青 ＦＩＧ、３ １０　　　　　　２０　　　　　　３０画　今一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　（ａ　）−，７１」ｌ−ｕンヒン複合蛋白質、
   線Ｉ［を素原及びアルブミンを完全に又は部分的にしか
   含有しない抗血友病性因子濃厚物を（ｑ、 （ｂ）抗血友病性因子濃厚物をス１−−クス半径に基づ
   く分離に供しで、児かｉｔ上高いス［−一りス半径値の
   抗血友病性因子を他の蛋白質から分離し、（Ｃ）抗血友
   病性因子＊即物をα埋して一１抗血友病性囚子分子の有
   効ス１−−クス半径を児かｉＪ上低い値に変化さけ、 （ｄ）抗血友病性因子濃厚物をス１−−クス半径に基づ
   く分離に供し支、児か（）上低いスＩ・−クメ半（￥舶
   の抗血友病性因子を他の蛋白１１から分離し、（ｅ）抗
   血友病性因子）Ｆ！’　Ｎ物をアＪン交換媒体Ｃのクロ
   マ１〜グラフイーに供しＣ１高度に精製された実質的に
   均一の抗血友病性因子）１厘物を得る、工程を含んでな
   る高度に精製された実質的に均一の抗血友病性因子１１
   １１厚物の調製法。 ２、　工程（ｂ）又は工程（ｄ）における分離を、抗血
   友病性因子濃厚物を架橋アカロース又は架橋ポリアクリ
   ルアミドでのゲル・バーミエーシＦ１ン・りＤ７１〜グ
   ラフィーに供することによって行なう特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ３、　工程（ｂ）又は工程（（ｊ）における分離を、抗
   血友病性因子濃厚物を調節された孔性のカラス・ビーズ
   ・クロマトグラフィー−に供することによつ−Ｃ行なう
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、工程（ｂ）又は工程（ｄ）に、１５ける分離を、ス
   クロースの密度勾配用）濾過によって行なう特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５、工程＜Ｃ＞における抗血友病性因子濃厚物を、２価
   のカヂオン約１〜３Ｍの溶液１部当り抗血友病性囚子淵
   厚物約５〜１０容量部の量においで、２価の７Ｊチオン
   源で処理Ｊる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、（ａ）蛋白Ｎｍｇ当り少くと１）約４０００へ１−
   １Ｆ単位の凝血促進活性： ＜ｂ）ｔＳ帷素原、フィ７０ネクＴ−ン、ノＡン・ライ
   レフラント蛋白質、及びヒタミン１く依存性凝固因子を
   実質的に含まないごと：及び （Ｃ）実質的にすべてのへ１−１１−活性が甲−ハシ１
   〜内て検知される単一バントの電気泳動易動性、を特徴
   とづ−る実質的に均一で、生物学的に活性な蛋白質物質
   。 ７、抗血友病性因子対抗血友病１１因子抗原の比が約５
   ０：１又はそれ以上Ｃある特許請求の範囲第６項記載の
   物質。 ８．７オン・ライレフラン１〜因１、櫟帷素原、フイブ
   ロネクチン及びヒタミン１〈依存１９　’／ｆｋ固因子
   を実質的に含有せず、且つ実質的に１へての△ｌ−Ｉ　
   Ｆ活性が単一バント内−Ｃ検知される単一ハン１−の電
   気泳動易動性を示す゛、人−間の抗面Ｉ７．病性因子。 ９、蛋白％ｍｇ当り少くとも約／ｌ　０００Δ１−１［
   中１１２の凝血促進活性によ−）て更に特散っけられる
   特許請求の範囲第８項記載の人間の抗血友病性因子。 １０、活性化されてない部分的トロンボブラスヂン時間
   分析において実質的に効果を有さない特許請求の範囲第
   ８項記載の抗血友病性因子。