CN102105141A - 保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法。保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法以及由该方法制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，所述制造方法包括：将由聚乙醇酸构成的生物可吸收性片浸渍于凝血酶溶液中，然后进行干燥，所述凝血酶溶液含有作为活性成分的凝血酶、作为软化剂的甘油、作为渗透剂的Tween 80、和任选的作为稳定剂的组氨酸和海藻糖。

Description

保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法
技术领域
本发明涉及保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法。特别地，本发明涉及保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法，以及由该方法制造的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，所述方法包括在含有作为活性成分的凝血酶，作为添加剂的多羟基醇、表面活性剂、氨基酸和低聚糖的溶液中浸渍生物可吸收性的片状支持体，然后进行干燥。
背景技术
凝血酶是参与血液凝固的酶，且在止血血栓的形成或创伤的处理等生命的维持和发展中是不可或缺的。凝血酶通常以非活性凝血酶原的形式存在于血液中，但由于起因于例如血小板或组织细胞的损伤的凝固体系的活化而将可溶形式的纤维蛋白原转换为对止血和创伤处理有用的不溶性纤维蛋白。利用该原理的止血剂已在临床现场受到广泛应用。
尽管凝血酶一直被用作止血剂的活性成分，但利用常规液体形式的止血剂，无法对喷出性出血点或涌出性出血点进行压迫止血或压迫封闭，因而不能止血。
为了该喷出性出血或涌出性出血的止血，尝试了开发片型止血剂，其中凝血酶、纤维蛋白原和/或凝结因子被保持在胶原海绵、由海藻酸或聚乙醇酸构成的非制造织物、或由明胶或水凝胶构成的其它生物可吸收性支持体上(例如，参见专利文献1、2、3、4、5、6和7)。
然而，所述止血剂的大多由于较厚，并且在以其干燥形式应用于器官的封闭部位时由于支持体本身的刚性的影响而缺乏柔软性，导致难以与创伤点紧密地接触，因此不能发挥充分的粘合效果，导致尚未被投入实际使用。
唯一的已经市售的片型纤维蛋白粘合剂是下述产品，其中纤维蛋白原和牛凝血酶被保持在由马胶原构成的支持体上(产品名：TachoComb/CSL Behling)(例如，参见专利文献8)。然而，对于其厚度(约3mm)和源自动物的内含物来说，该粘合剂在操作性和危险因子的去除上仍具有改进的余地。
另一方面，有数个关于凝血酶的稳定剂的报告。例如，已经报道了保持具有稳定性的凝血酶的方法，对于液体制剂通过含有有机羧酸的盐(例如，参见专利文献9)或甘油(例如，参见专利文献10、11和12)，对于包装在小瓶内或铝袋包装中的干燥制剂通过含有糖、碱性氨基酸和液体有机酸(例如，参见专利文献13)，或明胶、甘氨酸和糖(例如，参见专利文献14)，或脂肪族多元羧酸和白蛋白(例如，参见专利文献15)，或人血清白蛋白和氨基酸(例如，参见专利文献16)。然而，在片型制剂的情形中，仅凝血酶的稳定化不能达到目的。
使用片制剂时，其有时被制成圆形或被折叠以使它可以紧密地接触创伤点。因此，为了避免所施加的力导致片的破坏或凝血酶成分的渗漏，必须改善片的柔软性或凝血酶保持力。
例如，如上述的含有糖、碱性氨基酸和液体有机酸的凝血酶制剂不适于片型制剂，因为当该凝血酶制剂被保持在片上时柔软性会损失。此外，当将非织造织物浸渍于凝血酶溶液中并单一地进行冻干时，凝血酶不会被保持在该非织造织物上。为了解决所述问题，报道了下述技术，将由几丁质制成的非织造织物作为支持体，交替地浸渍于三个溶液亦即比如硫酸软骨素、海藻酸或透明质酸的酸性高分子化合物溶液，比如壳聚糖的碱性高分子化合物溶液，以及凝血酶溶液中，以保持凝血酶，然后真空或通风干燥而制造片状止血剂或片状创伤用药剂(例如，参见专利文献17)。然而，采用该交替吸附技术，即便可确保片的柔软性，也不能避免凝血酶活性的降低和生产中操作的烦杂。因此，更有效的制剂方法的开发受到期待。
专利文献1：日本专利公开No.61-59737
专利文献2：日本专利公开No.05-163157
专利文献3：日本专利公开No.2002-515300
专利文献4：US专利4453939
专利文献5：日本专利公开No.9-510357
专利文献6：日本专利公开No.2000-510357
专利文献7：日本专利公开No.2001-513368
专利文献8：欧洲专利0059265
专利文献9：日本专利公开No.56-39782
专利文献10：日本专利公开No.62-106028
专利文献11：日本专利公开No.7-64747
专利文献12：日本专利公开No.63-192723
专利文献13：日本专利公开No.2-53732
专利文献14：日本专利公开No.7-165604
专利文献15：日本专利公开No.2002-193832
专利文献16：日本专利公开No.2006-117678
专利文献17：日本专利公开No.2006-306759
发明内容
本发明要解决的技术问题
如上所述，尽管含有凝血酶作为活性成分的片型制剂已被开发，但对于片制剂的柔软性、凝血酶的稳定性和保持力、以及烦杂的制造工艺和未知危险因子的除去方面，仍留有改进的余地。
因此，本发明的目的在于提供便利的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法和由该方法得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂。
(解决问题的方法)
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了深入研究，结果发现通过在凝血酶溶液中含有甘油，可以抑制冻干粉体的过量产生，可以维持片制剂的柔软性，从而可以避免干燥后粉体的逸散所致的非织造织物上凝血酶成分的损失或损坏。进而，本发明的发明人发现，Tween80的添加会增强凝血酶对非织造织物的渗透性，以及海藻糖和少量组氨酸的添加与制造干燥制剂时分别单独添加海藻糖或组氨酸相比显著地增强了凝血酶的稳定性。由此，本发明的发明人完成了本发明。因此，本发明如下所述。
[1]生物可吸收性片制剂的制造方法，其包括以下工序(1)至(3)：
(1)将活性成分与含有软化剂和渗透剂的溶液混合的工序；
(2)将(1)的溶液滴加至生物可吸收性片或将生物可吸收性片浸渍在所述(1)的溶液中的工序；和
(3)对所述(2)的生物可吸收性片进行干燥的工序。
[2]上述[1]的方法，其中所述活性成分是凝血酶或纤维蛋白原。
[3]上述[2]的方法，其中凝血酶的浓度为1,000-2,000单位/mL。
[4]上述[1]-[3]中任一项的方法，其中所述软化剂是多羟基醇或氨基多糖，且所述渗透剂是表面活性剂。
[5]上述[4]的方法，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组，所述氨基多糖选自由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和硫酸乙酰肝素构成的组，且所述表面活性剂选自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷。
[6]上述[1]-[5]中任一项的方法，其中所述溶液进一步含有氨基酸和低聚糖。
[7]上述[6]的方法，其中所述氨基酸选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸构成的组，且所述低聚糖选自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤藓醇构成的组。
[8]上述[1]-[3]中任一项的方法，其中所述溶液含有甘油、Tween80、组氨酸和海藻糖作为添加剂。
[9]上述[1]-[8]中任一项的方法，其中所述软化剂的浓度为1-2％，且所述渗透剂的浓度为0.01-1％。
[10]上述[6]-[9]中任一项的方法，其中所述氨基酸的浓度为2.4-180mM，且所述低聚糖的浓度为5-40mg/mL。
[11]上述[1]-[10]中任一项的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
[12]保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，其含有作为活性成分的凝血酶，和作为添加剂的软化剂、渗透剂、氨基酸和少量低聚糖。
[13]上述[12]的制剂，其中凝血酶的浓度为1,000-2,000单位/mL。
[14]上述[12]或[13]的制剂，其中所述软化剂是多羟基醇或氨基多糖，且所述渗透剂是表面活性剂。
[15]上述[14]的制剂，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组，所述氨基多糖选自由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和硫酸乙酰肝素构成的组，且所述表面活性剂选自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷。
[16]上述[12]-[15]中任一项的制剂，其中所述氨基酸选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸构成的组，且所述低聚糖选自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤藓醇构成的组。
[17]上述[12]或[13]的制剂，其中所述制剂含有作为添加剂的甘油、Tween 80、组氨酸和海藻糖。
[18]上述[12]-[17]中任一项的制剂，其中所述软化剂的浓度为1-2％，所述渗透剂的浓度为0.01-1％，所述氨基酸的浓度为2.4-180mM，且所述低聚糖的浓度为5-40mg/mL。
[19]上述[12]-[18]中任一项的制剂，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
[20]多羟基醇作为生物可吸收性片制剂的软化剂的用途。
[21]上述[20]的用途，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组。
[22]上述[20]或[21]的用途，其中所述多羟基醇的浓度为1-2％。
[23]上述[20]-[22]中任一项的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
[24]上述[20]-[23]中任一项的用途，其中所述生物可吸收性片制剂是将凝血酶或纤维蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
[25]表面活性剂作为生物可吸收性片制剂中活性成分的渗透剂的用途。
[26]上述[25]的用途，其中所述表面活性剂选自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷构成的组。
[27]上述[25]或[26]的用途，其中所述表面活性剂的浓度为0.01-1％。
[28]上述[25]-[27]中任一项的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
[29]上述[25]-[28]中任一项的用途，其中所述生物可吸收性片制剂是将凝血酶或纤维蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
发明效果
根据本发明，提供保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂及其制造方法。本发明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可通过例如将由聚乙醇酸构成的生物可吸收性片浸渍于含有甘油、Tween 80、海藻糖和少量组氨酸的凝血酶溶液中，然后进行冻干而制造。通过含有甘油，可避免凝血酶成分从生物可吸收性片脱落并且可赋予保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂以柔软性。通过含有Tween 80，可增强凝血酶对生物可吸收性片的渗透而促进凝血酶的保持。进而，通过含有海藻糖和少量组氨酸，可在制造干燥制剂时充分维持凝血酶的活性。因此，本发明可促进保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造。通过本发明的方法制造的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可拥有凝血酶的稳定性和生物可吸收性片制剂所需的柔软性。
此外，本发明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂由于可极其快速地溶出至溶液中，故凝血酶可在保持有凝血酶的片与液体纤维蛋白原或血液接触后立即发挥其酶活性。即，期待利用本发明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，凝血酶可在粘合封闭面或在活动性出血点快速地溶出而发挥其利用纤维蛋白原作为底物的酶活性，迅速地提供纤维蛋白变换，提供组织粘合/封闭效果和止血效果。
附图说明
图1显示利用添加和未添加甘油的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的形状。
图2显示利用添加或未添加甘油的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。
图3显示利用添加或未添加人血清白蛋白的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。
图4显示利用添加各种低聚糖的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。
图5显示利用添加各种浓度的甘露糖醇或海藻糖的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。
图6显示利用添加各种氨基酸的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。
图7显示利用添加各种浓度的海藻糖和组氨酸的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中的凝血酶在保存一定时间后的残留活性。No.1：未添加组氨酸、No.2：2.4mM的组氨酸、No.3：4.8mM的组氨酸、No.4：9.6mM的组氨酸、No.5：22.5mM的组氨酸、No.6：45mM的组氨酸、No.7：90mM的组氨酸、No.8：180mM的组氨酸。
图8显示浸渍在添加和未添加各种表面活性剂的凝血酶溶液中的生物可吸收性片于一定时间所吸附的液体重量。No.1：未添加表面活性剂、No.2：Tween 80、No.3：聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、No.4：PluronicF-68、No.5：蔗糖单月桂酸酯、No.6：胆酸钠、No.7：Tween 20、No.8：Triton X-100、No.9：Nonidet P40、No.10：硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)-二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、No.11：正辛基葡萄糖苷、No.12：正十二烷基麦芽糖苷、No.13：毛地黄皂苷。
图9显示浸渍在添加和未添加各种浓度的Tween 80的凝血酶溶液中的生物可吸收性片于一定时间所吸附的液体重量。
图10显示保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性比较试验方法。
图11显示保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性比较试验结果。
具体实施方式
本发明的特征在于保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造方法，及由该方法得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，所述方法采用含有作为制剂用软化剂有效的多羟基醇、用作增强凝血酶对生物可吸收性片的渗透性的表面活性剂、和维持凝血酶稳定性的特定氨基酸和低聚糖的溶液。
此处所使用的凝血酶成分可以是市售的凝血酶(例如来自人血浆的凝血酶(Sigma-Aldrich，编码No.T6884等))、或由动物血液通过低温乙醇分馏或色谱法制备的来自生物体的凝血酶、或由重组DNA技术得到的重组体凝血酶。优选地，可使用重组体凝血酶以排除未知感染因子或危险因子的污染。在使用重组DNA技术时，可优选使用从将要施行止血的动物种类获得的凝血酶基因。
在生物体中，凝血酶以维生素K依存性的方式在肝细胞中被合成为前体凝血酶原，并被细胞膜的磷脂上的FXa-FVa限制性降解(切断发生在凝血酶原的Arg320-ILe321和Arg271-Thr272这两个位点)而产生凝血酶。在通过重组DNA技术得到凝血酶的情形中，可先完成凝血酶原的表达，将其纯化后，用蝰蛇毒(ecarin)处理而转换为凝血酶。
例如，人凝血酶原基因可按照如Sambrook等人所教导的一般重组DNA技术(Molecular Cloning，A Laboratory Manual Second EditionCold Spring Harbor Laboratory Press，N.Y.，1989)，起始于总RNA、mRNA或基因组DNA来制备。现在，可使用各种市售的试剂盒。例如，可以使用用于RNA提取的试剂比如TRIzol试剂(Invitrogen)、ISOGEN(NIPPON gene CO.，LTD.)、StrataPrep Total RNA Purification Kit(TOYOBO)；用于mRNA纯化的试剂盒比如mRNA Purification Kit(Amersham Bioscience)、Poly(a)Quick mRNA Isolation Kit(TOYOBO)、mRNA Separator Kit(Clontech)；用于转换为cDNA的T-Primed First Strand Kit(Amersham Pharmacia)、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning(Invitrogen)、cDNAsynthesis Kit(TAKARA SHUZO CO.，LTD.)、SMART PCR cDNA synthesis Library Construction Kits(Clontech)、Directionary cDNA Library Construction systems(Novagen Inc.)、GeneAmp PCR Gold(Applied Biosystems)。
这样得到的人凝血酶基因可被插入适合的表达载体，并利用所得表达载体实施寄主细胞例如动物细胞的转化。此处所用的表达载体没有特别限定，但可添加有适于外源基因的启动子等的表达调控区域、终止密码子、poly A添加信号序列、kozack序列、分泌信号等。所述表达载体中所含的启动子基于用作宿主的动物细胞来选定，可为任意启动子，只要引起外源基因的表达即可，比如SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒启动子、鸡β-肌动蛋白启动子。优选地，可使用鸡β-肌动蛋白启动子系表达质粒pCAGG(日本专利公开No.3-168087)。用于选择或基因扩增的标志基因可以是本领域公知的，比如neo基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、嘌呤霉素抗性酶基因或谷氨酰胺合成酶(GS)基因。
此处所用宿主可以是来自各种哺乳动物的任意培养细胞，且包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、来自人的293细胞、来自鸡的细胞等。向动物细胞导入基因可没有特别限制地施行，例如通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、利用Lipofectin脂质体的方法，原生质体聚乙二醇融合法、电穿孔法等，它们可取决于所使用的寄主细胞而适当选择(Molecular Cloning(3rd Ed.)，Vol.3，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。用于培养的培养基，由其形状分类包括琼脂培养基、液体培养基，或由其种类分类包括YMM-01、DMEM、RPMI、αMEM等，可取决于细胞、培养目的或培养阶段而适当选择。按照各自的规程，可使用其中添加了血清、氨基酸、维生素、糖、抗生素、pH调节缓冲液等的培养基。培养基的pH可调节为6-8的范围，培养温度可为30℃-39℃的范围。培养基的量、添加物和培养时间可取决于培养规模而适当调节。
人凝血酶原产生细胞可利用采用抗凝血酶抗体的特异性反应的检测方法，比如斑点印迹、Western印迹、夹层ELISA等，通过检测存在于克隆的耐药性细胞的培养液中的人凝血酶原而得到。可使由此得到的产生人凝血酶原的细胞适合于无血清培养基，然后在工业生产水平下大量培养。大量培养可通过例如补料分批培养(fed batch culture)、分批培养等，没有特别限制地进行。
对于由所述人凝血酶原产生细胞纯化人凝血酶原，可使用通常蛋白质化学中所用的纯化方法，比如例如盐析、超滤、等电点沉淀、电泳、离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲合色谱法、疏水色谱法、羟磷灰石色谱法等。在实践中，由于各种细胞碎屑的存在有时可采用上述方法的组合。
可优选地使用重组体蝰蛇毒用于将人凝血酶原转换为人凝血酶。重组体蝰蛇毒可如专利公开(WO2003/004641)中所述地制备。简要地，如Nishida等人所教导地制备蛇毒蝰蛇毒cDNA(S.Nishida et al.，Biochemistry，34，1771-1778，1995)，并整合至此处所用的鸡β-肌动蛋白启动子系表达质粒pCAGG中。将所得表达载体导入动物细胞，例如CHO细胞，以提供产生重组体蝰蛇毒的细胞。可通过阳离子交换色谱法和凝胶过滤来纯化重组体蝰蛇毒。这样纯化的重组体蝰蛇毒可作用于人凝血酶原，以将其转换为人凝血酶。反应条件可与通常的酶促反应的条件相同。例如，可向1000μg/mL的人凝血酶原添加2-8单位/mL终浓度的蝰蛇毒，在36-38℃反应1-4小时以完成人凝血酶原向人凝血酶的转换。
在由用蝰蛇毒处理后的溶液纯化人凝血酶时，可通过将该溶液进行如上述的纯化蛋白质的方法来进行。优选地，可使用利用苯甲脒色谱法和阳离子交换色谱法的组合的纯化方法。苯甲脒色谱法中，人凝血酶可被吸附至用含有0.3-0.7M NaCl、pH7-9的缓冲液平衡的柱上，并可在用该缓冲液洗涤后，用补充有0.1M苯甲脒盐酸盐的该缓冲液溶出。
接着，可对上述人凝血酶的溶出液进行阳离子交换色谱。已开发出比如磺基丙基型或羧甲基型的阳离子交换体并可适宜选择使用。本发明中使用SP Toyopearl 550C(Tosoh Corporation)。人凝血酶可吸附在用含有0.2M NaCl、pH6-7的10mM柠檬酸盐缓冲液平衡的柱上，并可在用该缓冲液洗涤后，用含有0.6M NaCl的该缓冲液溶出。通过这些步骤，可得到高纯度的人凝血酶。
这样得到的人凝血酶的活性单位可通过凝固活性和合成底物(S-2238)切断活性来指示。凝固活性值表示相对于标准品的校正曲线的纤维蛋白原凝固所需的时间，所述标准品包括日本药典标准品和WHO国际标准品(NIB SC)的凝血酶。基于凝血酶及其特异性底物之间的反应的S-2238切断活性，可经由OD405/650的吸光度变化，通过测定合成底物S-2238被凝血酶切断时释放的对硝基苯胺的量来测定。
可将这样得到的重组体人凝血酶(以下也仅称作“凝血酶”)保持在生物可吸收性片上。生物可吸收性片可为任意形状，只要可确保一定程度的柔软性和弹性即可，比如通过将生物可吸收性合成纤维加工为片而制备的纺织品、织造织物或非织造织物。生物可吸收性合成纤维可选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。优选地，可使用聚乙醇酸非织造织物，其通过下述制备，即作为基材针织或机织聚乙醇酸，并针刺该针织品或织物而制备非织造织物。
不仅可向用于将凝血酶保持在生物可吸收性片上的溶液(以下也称为“凝血酶溶液”)中添加作为止血剂活性成分的凝血酶，还可添加用于维持凝血酶本身活性的稳定剂，用于避免保持在生物可吸收性片上的凝血酶成分的损失或逸散的软化剂，以及用于增强凝血酶对生物可吸收性片的渗透性的渗透剂。凝血酶溶液中可含的凝血酶的浓度为发挥止血活性的浓度，例如为100-5,000单位/mL，优选1,000-2,000单位/mL的终浓度。
凝血酶活性的损失或减小起因于保存时凝血酶的聚集。因此，对于凝血酶的稳定剂，可使用能够抑制凝血酶的聚集形成的物质。该物质可包括例如白蛋白、特定氨基酸和低聚糖的蛋白质。
氨基酸可包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸。谷氨酸和组氨酸作为稳定剂被期望特别有效。然而，对于谷氨酸，大量使用时会有神经毒性的危险。因此，从安全性方面考虑，可优选使用组氨酸。氨基酸的终浓度可在2.4-180mM的范围内。
可使用在保存时有效维持凝血酶活性的低聚糖。这样的低聚糖可包括甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤藓醇。据报道，海藻糖若在外科手术时供给至器官表面，则可抑制组织的变性和防止干燥性粘连(http://www.vm.a.u-tokyo.ac.jp/vmc/achievement/treharose.html，或http://www.next21.info/press/images/20050624Treha.pdf)。因此，海藻糖不仅被期待作为稳定剂有效，而且还被期待对于减少封闭处置表面与其它器官的粘连。因此，可优选使用海藻糖。低聚糖的终浓度可在5-40mg/mL的范围内。
通过将氨基酸和低聚糖一起使用，与它们各自单独使用相比可获得稳定凝血酶的协同作用。因此，本发明的凝血酶溶液可含有氨基酸和低聚糖两者，且这两者的比例可在上述范围内适当调节。优选地，可使用22.5-180mM的氨基酸和30-40mg/mL的低聚糖。最优选的实施方案是180mM的组氨酸和40mg/mL的海藻糖。
可使用不影响凝血酶活性且可维持生物可吸收性片柔软性的软化剂和渗透剂。该软化剂可包括多羟基醇和比如透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和硫酸乙酰肝素的氨基多糖，优选多羟基醇。多羟基醇可包括甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇。可优选使用甘油，因为其已在多种药物和疫苗中被用作稳定剂。可使终浓度在1-2％范围内的软化剂。
对于渗透剂，可使用比如Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷的表面活性剂，优选Tween 80。可使用浓度在0.01-1％、优选0.01-0.1％范围内的渗透剂。本发明的软化剂和渗透剂不仅可在保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中使用，而且可在保持有其它止血蛋白质例如纤维蛋白原的生物可吸收性片制剂中使用。
用于制备凝血酶溶液的缓冲液可包括磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液等，pH范围为6.0-8.0。可视情况添加适量的其它添加剂，例如氯化钙、氯化钠等盐，或蔗糖和甘露糖醇等赋形剂。
本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可通过，例如，将凝血酶溶液滴加至放于适当容器中的聚乙醇酸构成的生物可吸收性片，或将该生物可吸收性片浸渍于容器中的凝血酶溶液中，并在-80℃下冻干后，将该片干燥来获得。可选地，可对填充有凝血酶溶液的生物可吸收性片进行自然干燥。通过在凝血酶溶液中含有渗透剂，可增强凝血酶对所述生物可吸收性片的渗透性。在通过干燥除去水分的过程中，凝血酶可包覆于稳定剂和软化剂中而稳定地保持在生物可吸收性片的纤维上。所得保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可与干燥剂一起密封包装于双层(聚乙烯-铝)薄膜包装中在室温下保存。
这样得到的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的评价可通过检测保持于生物可吸收性片上的凝血酶的保持率、成型后的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性、凝血酶的稳定性等来进行。
凝血酶在生物可吸收性片上的保持率可通过比较将该片浸渍于生理盐水或合适的缓冲液中并摇振后从该片溶出的凝血酶的活性与保持在该片上的凝血酶的活性来计算。对于凝血酶活性的测定，可使用如上述的凝固活性和合成底物切断活性。根据本发明，可得到具有80％以上保持率的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂。
本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性可如下所述进行评价。即，将保持有凝血酶的生物可吸收性片剪切成合适的片，并将该片的一端固定在基座上。然后对从该基座水平地突出的部分滴加制备为约55mg/mL的纤维蛋白原溶液。所述纤维蛋白原在保持于所述生物可吸收性片上的凝血酶的作用下立即转换为纤维蛋白，使得所述片因纤维蛋白的重量而下垂。柔软性可通过测定所述凸出部分的前端自水平水准线下垂了多少来评价。
本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的稳定性可通过评估长期保存后的凝血酶的残留酶活性或凝血酶分子的聚集或降解程度来评价。凝血酶的残留酶活性可通过与如上述检测凝血酶的保持率相同的方式测定酶活性来检测。凝血酶分子的聚集或降解程度可通过将从所述片溶出的凝血酶的一部分进行SDS-PAGE或尺寸排阻高效液相色谱来检测。
本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可通过将该制剂施加于创伤或止血点而用作粘合剂。取决于出血的严重程度，所述保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可单独或与纤维蛋白粘合剂制剂成分的纤维蛋白原一起应用。
在消化器官的外科领域中，对于肝或脾的部分切离或部分破裂等损伤时发生的涌出性出血，可将保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂单独施加至患部表面，然后按压3-5分钟完成止血。另一方面，若与纤维蛋白粘合剂制剂的成分的纤维蛋白原一起施加，则可增强封闭效果或止血效果。例如，在呼吸器的外科领域中，可以有效地封闭产生肺的膨胀和收缩压力的肺胸膜的剥离面、肺叶实质切离面、或支气管切断边缘处的漏气位点。在大量血管网络遍布的子宫和胎盘周围的涌出性出血的情形中，切开和切除时的出血的风险高，止血处理由于出血点不明而变得极其困难，但本发明却可以以单次处置同时封闭一定面积。
对于应用于有高血压的动脉的损伤部位或人造血管的缝合处置处的喷出性出血，本发明可发挥最高效果，在维持纤维蛋白原在患部足够量的同时，使得纤维蛋白迅速且牢固地形成，从而完成止血。
如上述的粘合于封闭效果归因于下述事实，即本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂为高柔软性因而可追随组织的凹凸以致紧密地粘附，以及凝血酶被迅速地溶出而将纤维蛋白原转换为纤维蛋白。
以下借助实施例对本发明进行更详细地说明，但并不应受实施例的束缚。
EXAMPLE
实施例1：通过添加甘油抑制冻干干燥粉体的过量形成
将含有终浓度1％、1.5％或2％的甘油、1875单位/mL的凝血酶、10mg/mL的人血清白蛋白、40mM的凝血酶溶液(pH6.0)、5mg/mL的甘露糖醇和0.1％的Tween 80的凝血酶溶液(pH6.0)以1mM的厚度倒入铺有生物可吸收性片(聚乙醇酸生物可吸收性合成非织造织物，产品名：Neoveil(Gunze Limited))的容器中，并且在-80℃冻干2小时后，真空干燥而制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂。将该制剂与用不含甘油的凝血酶溶液以上述相同方式制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂进行比较。
如图1所示，通过添加甘油，在保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂中，冻干干燥粉体的过量形成得到抑制。
实施例2：添加甘油对凝血酶稳定性的效果
将实施例1中得到的添加或未添加甘油的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，作为在容器中的样子，与干燥剂一起放于双层(聚乙烯-铝)薄膜袋中密封包装，并在室温下(22-25℃)保存。保存1、2、3、8周后，将样品开封，将保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂从所述容器剥离并切成2cm×2cm(4cm2)的片，将其浸渍于生理盐水(1.0mL)中充分混合以使凝血酶溶出。将所得凝血酶溶出液按照日本药典“凝血酶的定量方法”检测凝固活性。以下，对“凝血酶的定量方法”进行简要说明。
首先，凝固时间定义为在混合纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液后，所得含有纤维蛋白的溶液达到0.3的吸光度(450nm)所需要的时间。将用申请人自己的凝血酶标准制备的标准溶液(四种单位)与一定浓度的纤维蛋白原溶液混合，并测定凝固时间。制成了显示凝血酶的活性单位与凝固时间之间关系的标准直线，其中横轴表示活性单位而纵轴表示凝固时间。对于上述凝血酶溶出液，同样地测定凝固时间，并使用该标准直线获得凝血酶活性单位，计算每片面积的残留凝血酶活性单位(单位/cm2)。图2显示添加或未添加甘油的样品中的残留凝血酶活性，其中横轴表示保存时间，纵轴表示与保存之前相比的保存后凝血酶溶出液的凝固活性值(单位/cm2)。
作为添加和未添加甘油的样品之间的比较结果，可知添加甘油并不降低凝血酶活性。
实施例3：添加人血清白蛋白对凝血酶稳定性的效果
使用实施例1中所得的添加有1％甘油的凝血酶溶液和由所述凝血酶溶液除去了白蛋白的2种凝血酶溶液，如实例1和2所述制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，密封包装并保存于37℃。
保存1和2周后，将样品开封，获取凝血酶溶出液并测定相对于保存前的活性而维持的残留凝血酶活性，表示在图中如图3所示。
结果，保存2周后，添加有人血清白蛋白的样品维持了保存前活性的80％，但未添加人血清白蛋白的样品显示活性减少至20％。
实施例4：添加低聚糖对凝血酶稳定性的效果
使用具有表1所示组成的凝血酶溶液，如实例1和2所述制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，密封包装并保存于65℃。对于表1中的低聚糖，使用蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、赤藓醇、乳糖，并且作为对照使用之前报道的成分即甘露糖醇。保存8天后，将样品开封，获取凝血酶溶出液并测定相对于保存前活性所维持的残留凝血酶活性，表示在图中如图4所示。
结果，证实蔗糖、海藻糖和山梨糖醇显示了与甘露糖醇相当的对凝血酶的稳定效果。
表1
  凝血酶溶液
  凝血酶   1,000单位/mL
  低聚糖   10mg/mL
  甘油   1％
  人血清白蛋白   10mg/mL
  Tween 80   0.1％
  柠檬酸盐缓冲液   50mM，pH 6.0
实施例5：低聚糖的浓度对凝血酶稳定性的效果
使用具有如表2中所示组成的含有5、8、10、15或30mg/mL中任一浓度的低聚糖的凝血酶溶液，如实例1和2所述制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，密封包装并保存于65℃。保存3天后，将样品开封，获取凝血酶溶出液并测定残留凝血酶活性。对于表2中的低聚糖，使用了甘露糖醇和海藻糖。如图5的图所示，证实在8mg/mL以上的高浓度下，海藻糖比甘露糖醇在维持活性的效果中更优异。
表2
  凝血酶溶液
  凝血酶   1,875单位/mL
  低聚糖   5，8，10，15，30mg/mL
  甘油   1％
  人血清白蛋白   10mg/mL
  Tween 80   0.1％
  柠檬酸盐缓冲液   50mM，pH 6.0
实施例6：添加氨基酸对凝血酶稳定性的影响
使用具有如表3所示组成的凝血酶溶液，如实例1和2所述制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，密封包装并保存于65℃。对于表3中的氨基酸，使用了作为简单氨基酸的甘氨酸、作为酸性氨基酸的谷氨酸和天冬氨酸、作为碱性氨基酸的精氨酸、组氨酸和赖氨酸。作为对照，使用了未添加氨基酸的凝血酶溶液和含有人血清白蛋白来代替氨基酸的凝血酶溶液。
保存8天后，将样品开封，获取凝血酶溶出液并测定凝血酶活性以获得相对于保存前的溶出液活性的残留活性。
如图6的图中所示，确认了与用未添加氨基酸的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂相比，用添加氨基酸的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂在维持凝血酶活性的效果中更优异。添加谷氨酸、组氨酸或赖氨酸的组比用添加人血清白蛋白的凝血酶溶液制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂显示了更高的稳定效果。
表3
Figure BPA00001277841700161
Figure BPA00001277841700171
实施例7：组氨酸和海藻糖的最优比例的研究
使用如表3所示添加有氨基酸的组成的凝血酶溶液，其中各自以表4中所示浓度含有作为氨基酸的组氨酸和作为低聚糖的海藻糖，如实施例1和2所述制备保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，密封包装并保存于65℃。对于添加有组氨酸的凝血酶溶液，未添加柠檬酸盐缓冲液。保存8天后，将样品开封，获得凝血酶溶出液并测定凝血酶活性以获得保存后的残留活性。
结果，如图7所示，当以海藻糖5-40mg/mL或组氨酸2.4-90mM各自单独添加时，该残留凝血酶活性低至0.8-2.4％，而当海藻糖和组氨酸同时添加时，取决于各自成分浓度与海藻糖或组氨酸各自单独添加相比，所述残留活性提高。
例如，海藻糖为5mg/mL时，通过添加90-180mM的组氨酸残留活性提高至5.6％-23.1％。海藻糖为15mg/mL时，通过添加22.5-180mM的组氨酸残留活性提高至6.6％-36.4％。同样地，海藻糖为30mg/mL或40mg/mL时，通过添加2.4-180mM的组氨酸，所述残留活性提高至21.4％-62.0％。
添加组氨酸的效果在海藻糖为较高浓度时显著。海藻糖为30-40mg/mL时，甚至在以2.4mM的较低浓度添加组氨酸时也可见协同作用。特别地，在以22.5-180mM添加组氨酸时协同作用卓越，其中凝血酶残留活性提高至35％以上。
表4
Figure BPA00001277841700181
*：组氨酸的配合浓度
实施例8：添加表面活性剂对凝血酶溶液渗透至片的影响
将实施例1中所述的生物可吸收性片浸渍在具有如表5所示组成的凝血酶溶液中15秒，并测量浸渍后该片的增重。对于表5中的表面活性剂，使用了Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷。
如图8所示，各种表面活性剂的添加改进了凝血酶溶液对生物可吸收性片的渗透性。
表5
Figure BPA00001277841700191
实施例9：Tween 80的最优浓度的研究
将实施例1中所述的生物可吸收性片浸渍于具有如表5所示组成的、以各种浓度含有Tween 80作为表面活性剂的凝血酶溶液中15秒，并测定浸渍后该片的增重。使用了终浓度0.0001、0.001、0.01、0.1和1％的Tween 80。作为对照，使用了如表5所示未添加表面活性剂的凝血酶溶液。
如图9所示，确认了添加0.01-1％的Tween 80卓越地改进了凝血酶溶液对片的渗透性。实施例10：保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性评价试验
对使用具有如表6所示组成的凝血酶溶液，如实施例1中所述制备的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的柔软性进行评价。如图10所示，将本发明的片(2cm×3cm)的一部分(2cm×1cm)固定于基座上，并对自该基座水平突出的该片的剩余部分(2cm×2cm)滴加55mg/mL的纤维蛋白原溶液。测定所述突出部分的顶端自水平水准线下垂的距离和角度，评价柔软性。作为对照，使用了保持有纤维蛋白粘合剂的胶原片(产品名：TachoComb/CSL Behling)。由于对照胶原片制剂已将纤维蛋白原通过干燥预先保持其上，故使用生理盐水作为滴加溶液，并在使粘合面向上的条件下施行试验。所述测定在溶液滴加后静置5分钟后进行，并将三次测定的平均值和标准偏差如图11中所示显示在图中。
结果，对照胶原片制剂显示，在滴加生理盐水0.1mL的时刻下垂距离低于5mm，但本发明的片却很柔软，以致其在滴加纤维蛋白原溶液前就因自重而下垂，且在滴加纤维蛋白原溶液0.1mL后显示下垂约20mm的距离。在滴加纤维蛋白原溶液0.3mL时，该片严重下垂而无法测定距离。
表6
  凝血酶填充液
  凝血酶   1,875单位/mL
  氨基酸(组氨酸)   180mM
  低聚糖(海藻糖)   30mg/mL
  甘油   1％
  氯化钙   20mM
  表面活性剂(Tween 80)   0.1％
  柠檬酸盐缓冲液   50mM，pH 6.0
产业实用性
根据本发明，提供保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂及其制造方法。本发明的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可通过例如将由聚乙醇酸构成的生物可吸收性片浸渍于含有甘油、Tween 80、海藻糖和少量组氨酸的凝血酶溶液中，然后进行冻干来制造。通过含有甘油，可以避免凝血酶成分从生物可吸收性片脱落，并赋予保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂以柔软性。通过含有Tween 80，可增强凝血酶对生物可吸收性片的渗透性而促进凝血酶的保持。进而，通过含有海藻糖和少量组氨酸，可在制造干燥制剂时充分维持凝血酶的活性。因此，本发明可促进保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂的制造。通过本发明的方法制造的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂可拥有凝血酶的稳定性和生物可吸收性片制剂所需的柔软性。
此外，本发明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂由于可极其快速地溶出至溶液中，故凝血酶可在保持有凝血酶的片与液体纤维蛋白原或血液接触后立即发挥其酶活性。即，期待利用本发明所述的保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，凝血酶可在粘合封闭面或在活动性出血点快速地溶出而发挥其利用纤维蛋白原作为底物的酶活性，迅速地提供纤维蛋白变换，提供组织粘附/封闭效果和止血效果。

Claims (29)

1.生物可吸收性片制剂的制造方法，其包括以下工序(1)至(3)：
(1)将活性成分与含有软化剂和渗透剂的溶液混合的工序；
(2)将(1)的溶液滴加至生物可吸收性片或将生物可吸收性片浸渍在所述(1)的溶液中；和
(3)对所述(2)的生物可吸收性片进行干燥的工序。
2.权利要求1所述的方法，其中所述活性成分是凝血酶或纤维蛋白原。
3.权利要求2所述的方法，其中凝血酶的浓度为1,000-2,000单位/mL。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述软化剂是多羟基醇或氨基多糖，且所述渗透剂是表面活性剂。
5.权利要求4所述的方法，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组，所述氨基多糖选自由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和硫酸乙酰肝素构成的组，且所述表面活性剂选自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述溶液进一步含有氨基酸和低聚糖。
7.权利要求6所述的方法，其中所述氨基酸选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸构成的组，且所述低聚糖选自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤藓醇构成的组。
8.权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述溶液含有作为添加剂的甘油、Tween 80、组氨酸和海藻糖。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述软化剂的浓度为1-2％，且所述渗透剂的浓度为0.01-1％。
10.权利要求6-9中任一项所述的方法，其中所述氨基酸的浓度为2.4-180mM，且所述低聚糖的浓度为5-40mg/mL。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
12.保持有凝血酶的生物可吸收性片制剂，其含有作为活性成分的凝血酶，和作为添加剂的软化剂、渗透剂、氨基酸和少量低聚糖。
13.权利要求12所述的制剂，其中凝血酶的浓度为1,000-2,000单位/mL。
14.权利要求12或13所述的制剂，其中所述软化剂是多羟基醇或氨基多糖，且所述渗透剂是表面活性剂。
15.权利要求14所述的制剂，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组，所述氨基多糖选自由透明质酸、硫酸软骨素、硫酸角质素和硫酸乙酰肝素构成的组，且所述表面活性剂选自由Tween 80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷。
16.权利要求12-15中任一项所述的制剂，其中所述氨基酸选自由精氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸构成的组，且所述低聚糖选自由甘露糖醇、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇和赤藓醇构成的组。
17.权利要求12或13所述的制剂，其中所述制剂含有作为添加剂的甘油、Tween 80、组氨酸和海藻糖。
18.权利要求12-17中任一项所述的制剂，其中所述软化剂的浓度为1-2％，所述渗透剂的浓度为0.01-1％，所述氨基酸的浓度为2.4-180mM，且所述低聚糖的浓度为5-40mg/mL。
19.权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
20.多羟基醇作为生物可吸收性片制剂的软化剂的用途。
21.权利要求20所述的用途，其中所述多羟基醇选自由甘油、丙二醇、丁二醇和山梨醇构成的组。
22.权利要求20或21所述的用途，其中所述多羟基醇的浓度为1-2％。
23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
24.权利要求20-23中任一项所述的用途，其中所述生物可吸收性片制剂是将凝血酶或纤维蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
25.表面活性剂作为生物可吸收性片制剂中活性成分的渗透剂的用途。
26.权利要求25所述的用途，其中所述表面活性剂选自由Tween80、聚氧乙烯月桂基醚(Brij 35)、Pluronic F-68、蔗糖单月桂酸酯、胆酸钠、Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、硫酸-3-[(3-胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙烷(CHAPS)、正辛基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷和毛地黄皂苷构成的组。
27.权利要求25或26的用途，其中所述表面活性剂的浓度为0.01-1％。
28.权利要求25-27中任一项所述的用途，其中所述生物可吸收性片由基材合成，所述基材选自由聚乙醇酸、聚乳酸、羧甲基纤维素、几丁质、壳聚糖、海藻酸、胶原、明胶和水凝胶构成的组。
29.权利要求25-28中任一项所述的用途，其中所述生物可吸收性片制剂是将凝血酶或纤维蛋白原保持在所述生物可吸收性片上得到的。
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