CN108366967A

CN108366967A - 凝血酶微胶囊

Info

Publication number: CN108366967A
Application number: CN201680072297.XA
Authority: CN
Inventors: E.伊兰; A.格乔诺维特奇; R.考夫曼
Original assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Current assignee: Omrix Biopharmaceuticals Ltd
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: IL259185A; AU2016367536A1; JP6918799B2; WO2017098493A1; BR112018011504A2; CN108366967B; CA3007900A1; IL259185B; EP3386487A1; KR20180091035A; IL242984A0; AU2016367536B2; JP2019501893A

Abstract

提供了包含微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末、该粉末的制备方法以及该粉末的用途。

Description

凝血酶微胶囊

技术领域

本发明涉及药物领域，更具体地涉及包含微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末、该粉末的制备方法以及该粉末的用途。

背景技术

凝血酶是在血液凝结中具有多种功能的蛋白水解酶。凝血酶由凝血酶原(凝血因子II)，即血浆中的循环酶原前体蛋白质形成。该凝血酶原在凝血级联中被蛋白水解裂解以形成凝血酶。凝血酶继而起到丝氨酸蛋白酶的作用，将可溶性纤维蛋白原转化成不溶性纤维蛋白链，以及催化许多其它凝结相关的反应。

凝血酶作为凝血因子广泛用于临床应用中，通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白来止住伤口出血。它是外科敷料的常见组分，并且已与纤维蛋白原和其它凝血蛋白质组合用于二组分止血系统(诸如纤维蛋白胶、粘合剂和密封剂)中。

用于制备药物组合物的凝血酶粉末常常由冻干溶液来制备。

术语“冻干”通常是指冷冻溶液然后降低水浓度(例如通过升华到不维持生物反应或化学反应的水平)的过程。

冻干是一个分批过程，受冷冻干燥机的容量限制，并且通常持续若干天。因此整个干燥批次在较长时间内处于风险，直至过程完成。此外，将所得冻干“块”加工成粉末需要执行另外的步骤，例如破碎、筛分和/或研磨以进一步减小粒度。这些步骤可减小干燥产物的效能和质量收率。有利地，使用喷雾干燥过程而非冻干提供节省成本的连续高容量过程，其中立即获得呈干粉而非“块”的形式干燥产物。

如本文所用，术语“块”或“固体块”是指冻干过程得到的多孔、海绵结构样组合物。

喷雾干燥涉及液体(诸如溶液、悬浮液或乳液)的雾化，例如通过喷雾嘴喷雾，同时与雾化气体接触以形成喷雾颗粒；通过双流体喷嘴雾化，其中通过液体流和气体流的组合产生喷雾，其中雾化能量由气体流提供；或通过离心雾化，其中溶液在旋转盘中传送，使得喷雾通过由盘的旋转产生的能量来产生。或者可使用压力喷嘴使液体流变成喷雾，其中液体流被迫通过小孔，压力的变化将液体流转变成小液滴的喷雾。

喷雾颗粒形成之后，在由干燥气体导管提供的热气体(例如空气或氮气)流中干燥该喷雾。喷雾颗粒迅速干燥成粉末，该粉末随后在旋风除尘器装置中与热空气流分离，并且可收集在例如小瓶的容器中。喷雾干燥方法由若干关键工艺参数控制，这些参数包括干燥空气流速和温度、雾化空气流速、溶液流速等。

一般来讲，诸如凝血酶的酶对现有技术喷雾干燥方法中所使用的高温和剪切应力条件敏感，这通常引起酶的变性和后续的效能损耗。例如，溶液中的凝血酶对约45℃或以上的温度敏感。

现有技术通过在用于喷雾干燥的溶液中使用相对低的凝血酶浓度或通过提高溶液中的碳水化合物(诸如海藻糖)的浓度来解决此问题。这些条件得到包含低浓度的凝血酶(通常至多约1IU/mg)的喷雾干燥的粉末。

用于生产凝血酶粉末的喷雾干燥方法的背景技术及凝血酶粉末的用途的示例包括美国专利6,113,948；美国专利公布2012/0315305；PCT专利公布WO 92/18164；美国专利6,416,739；欧洲专利EP0713388B1；美国专利8,846,105；美国专利6,703,047；美国专利公布20120121532；美国专利公布20100249044；PCT专利公布WO 14/135689；JMicroencapsul.2013；30(7):624-31.Doi号：10.3109/02652048.2013.770097.Epub 2013年3月14日；Biotechnol Appl Biochem.1995年10月；22(Pt 2):203-14；以及由Priyadarsini Pattnayak在National institute of technology,Rourkela,India在Gyana Ranjan Satpathy教授的指导下为生物技术和医学工程学的技术硕士学位在2010年9月完成的论文-Excipient Mediated Biostabilization of Protein Using SprayDrying Technique。

发明内容

在本发明的一些实施方案中，本发明涉及包括微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末、该粉末的制备方法以及该粉末的用途。

喷雾干燥的凝血酶粉末可通过控制以下参数中的一个或多个来生产：用于喷雾干燥方法的凝血酶溶液的组成、喷雾参数(例如溶液流速、雾化气体流速)、干燥气体参数(例如干燥气体流速、干燥气体温度)和粉末收集参数(例如冷却气体流)。

令人惊讶地发现，增加干燥气体流的速率导致喷雾干燥粉末的水含量降低，而不增加用于干燥过程的温度。

还发现，在干燥盘下游引入冷却气体会将干燥颗粒的温度降低至低于它们的玻璃化转变温度。颗粒在性质上变得粘合性较差而弹性较大，并因此倾向于较少地粘附到喷雾干燥器的内壁，从而导致质量收率的增加。

在一些实施方案中，该方法包括使用特定的水性凝血酶组合物，在一些实施方案中，该水性凝血酶组合物包含与本领域已知的此类载体和蛋白质的浓度相比相对较低浓度的稳定蛋白质载体和碳水化合物(例如糖)。例如，与本文所公开的载体蛋白质的0.06至约6.0％(w/v)的范围相比，美国专利6,416,739公开了10-20(％w/v)载体蛋白质的使用；而与本文所公开的0.2-5％(w/v)的范围相比，美国专利8,846,105公开了20-30％(w/v)的糖。

令人惊讶地发现，本文所述的喷雾干燥方法和水性组合物的使用导致产生凝血酶粉末，这些凝血酶粉末具有高凝血酶活性水平，即高度浓缩(在一些实施方案中，具有约20至约30IU/mg、诸如约24IU/mg的凝血酶含量)，是干燥的(在一些实施方案中，具有小于5％w/w的水含量)，并且具有高密度(在一些实施方案中，具有约0.1至约1.0g/ml的密度，诸如约0.46g/ml凝血酶)，同时保持高凝血酶活性(在一些实施方案中，高于90％)。

在一些实施方案中，相关密度为调整堆积密度。在一些实施方案中，相关密度为振实密度。

本发明的各方面和实施方案在下文说明书和所附权利要求书中描述。

根据本文所述的一些实施方案的一个方面，提供了包括微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末，该粉末包含：凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶(IU)与载体蛋白质(mg)的比率为约0.85:1至66,875:1，并且其中凝血酶(IU)与碳水化合物(mg)的比率为0.75:1至26,750:1。

在一些实施方案中，微胶囊包含：凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶(IU)与载体蛋白质(mg)的比率为约0.85:1至66,875:1，并且其中凝血酶(IU)与碳水化合物(mg)的比率为0.75:1至26,750:1。

在一些实施方案中，凝血酶(IU)与载体蛋白质(mg)的比率为约110:1至约285:1，任选地为约129:1至约219:1。

在一些实施方案中，凝血酶(IU)与碳水化合物(mg)的比率为约40:1至约64:1，任选地为约35:1至约75:1。

在一些实施方案中，载体蛋白质选自由以下项组成的组：白蛋白、酪蛋白、角蛋白以及它们的组合。

在一些实施方案中，载体蛋白质包含白蛋白，任选地包含人血清白蛋白。

在一些实施方案中，载体蛋白质为白蛋白，任选地为人血清白蛋白。

在一些实施方案中，载体蛋白质包含酪蛋白。在一些实施方案中，载体蛋白质为酪蛋白。

在一些实施方案中，载体蛋白质包含角蛋白。在一些实施方案中，载体蛋白质为角蛋白。

在一些实施方案中，碳水化合物为糖醇，任选地选自由以下项组成的组：甘油、山梨醇、木糖醇和甘露糖醇。在一些实施方案中，糖醇包含甘露糖醇。在一些实施方案中，糖醇为甘露糖醇。

在一些实施方案中，碳水化合物是糖类，诸如选自由以下项组成的组的糖类：单糖、二糖(任选地选自由以下项组成的组：蔗糖、海藻糖和它们的组合)、寡糖、多糖以及它们的组合。

在一些实施方案中，粉末包含凝血酶、白蛋白和甘露糖醇，其中凝血酶(IU)与白蛋白(mg)的比率为约0.85:1至66,875:1，并且其中凝血酶(IU)与甘露糖醇(mg)的比率为约0.75:1至约26,750:1，任选地为约35:1至约65:1，诸如约50:1。

在一些实施方案中，凝血酶(IU)与白蛋白(mg)的比率为约100:1至约300:1、约110:1至约285:1、约120:1至约240:1，诸如约129:1至约219:1。在一些实施方案中，凝血酶(IU)与白蛋白(mg)的比率为约160:1。

在一些实施方案中，凝血酶(IU)与甘露糖醇(mg)的比率为约35:1至约75:1，诸如约40:1至约64:1。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约0.6至约535IU/mg固体的凝血酶。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约0.02至约0.8mg/mg固体的碳水化合物(诸如甘露糖醇)。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约0.008至约0.7mg/mg固体的载体蛋白质。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约0.008至约0.7mg/mg固体的白蛋白。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约20至约40IU/mg固体的凝血酶，浓度为约0.1至约0.2mg/mg固体的白蛋白，以及浓度为约0.5至约0.6mg/mg固体的甘露糖醇。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含浓度为约22至约35IU/mg固体的凝血酶，浓度为约0.16至约0.17mg/mg固体的白蛋白，以及浓度为约0.55至约0.56mg/mg固体的甘露糖醇。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含凝血酶、酪蛋白和甘露糖醇，其中凝血酶(IU)与酪蛋白(mg)的比率为约0.85:1至66,875:1，并且其中凝血酶(IU)与甘露糖醇(mg)的比率为0.75:1至26,750:1。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末还包含钙，浓度为约0.006至约0.115mg/mg固体，任选地为约0.034至约0.057mg/mg固体，任选地为约0.044至约0.048mg/mg固体。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末的总盐浓度为约0.1至约0.4mg/mg固体，任选地为约0.25至约0.30mg/mg固体。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末还包含氯化钠，浓度为约0.1至约0.3mg/mg固体，任选地为约0.19至约0.2mg/mg固体。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末还包含浓度为约0.012至约0.086mg/mg固体的乙酸盐。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含约0.001％至约5％(w/w)的凝血酶。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末包含小于约5％的水(w/w)，诸如小于约4％或小于约3％的水(w/w)。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末具有约5至约13μm的D50以及约15至约25μm的D90的粒度分布。

在一些实施方案中，喷雾干燥的凝血酶粉末的粉末密度为约0.1至约1.0g/ml，任选地为约0.4至约0.6g/ml。

在一些实施方案中，通过Freeman Technology FT4粉末流变仪(即通过使用Freeman Technology FT4粉末流变仪以向上提升位移模式移动叶片)测量的喷雾干燥的凝血酶粉末的粉末流动性为约5至约15mJ/g，任选地为约9至约10mJ/g。

所得的喷雾干燥的凝血酶粉末/微胶囊可保存相对长的一段时间。在保存后，粉末/微胶囊可以按原样使用或可以通过加入各种体积的水性溶液(诸如注射用水)而重构。在重构过程中加入的体积可以类似于喷雾干燥前的溶液体积，更低或更高。

根据本文所述的一些实施方案的另一个方面，提供了适用于制备凝血酶微胶囊的水性组合物，该水性组合物包含：凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶(IU)与载体蛋白质(mg)的比率为约1.6:1至5,000:1，并且其中凝血酶(IU)与碳水化合物(mg)的比率为2:1至1,500:1。

根据本文所述的一些实施方案的另一个方面，提供了用于制备凝血酶微胶囊的方法，该方法包括以下步骤：

提供水性组合物，包含：凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶(IU)与载体蛋白质(mg)的比率为约1.6:1至5000:1，并且其中凝血酶(IU)与碳水化合物(mg)的比率为2:1至1500:1；以及

喷雾干燥该水性组合物。

在一些实施方案中，喷雾干燥包括：

将水性组合物引入到喷雾干燥装置中；

由引入到装置中的水性组合物产生液滴；以及

通过干燥气体流从液滴蒸发水，

从而制备凝血酶微胶囊。

在一些实施方案中，由水性组合物产生液滴包括使用雾化气体流。

在一些实施方案中，将水性组合物引入到喷雾干燥装置中的速率:雾化气体流的速率的比率为至少1:1000。

在一些实施方案中，从液滴蒸发水包括在约100至约170℃的温度下将液滴引导到干燥柱的干燥气体流中。

在一些实施方案中，将水性组合物引入到喷雾干燥装置中的速率与雾化气体流的速率与干燥气体流的速率的比率为1:(至少1000):(至少43,000)。

在一些实施方案中，水性组合物流、雾化气体流和干燥气体流在相同方向上是同轴的。

在一些实施方案中，该方法还包括通过暴露于冷却气体流来冷却凝血酶微胶囊。

在一些实施方案中，将水性组合物引入到喷雾干燥装置中的速率为约100至约1000ml/小时，任选地为约200至约800ml/小时，任选地为约300至约500ml/小时。

在一些实施方案中，雾化气体流的速率为约3至约20l/分钟，任选地为约5至约15l/分钟，任选地为约7至约9l/分钟。

在一些实施方案中，干燥气体流的速率为约0.1至约1.0m³/分钟，任选地为约0.3至约0.6m³/分钟。

在一些实施方案中，水性组合物包含约100至约3000IU/ml的凝血酶。

在一些实施方案中，水性组合物包含约0.06至约6.0％(w/v)的载体蛋白质。

在一些实施方案中，水性组合物包含约0.2至约5％(w/v)的碳水化合物。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，碳水化合物为糖醇，诸如甘露糖醇。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，碳水化合物是糖类，诸如选自由以下项组成的组的糖类：单糖、二糖(任选地选自由以下项组成的组：蔗糖、海藻糖和它们的组合)、寡糖、多糖以及它们的组合。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质选自由以下项组成的组：白蛋白、酪蛋白和角蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质包含白蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质为白蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质包含酪蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质为酪蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质包含角蛋白。

在本文所公开的方法的一些实施方案中，载体蛋白质为角蛋白。

在一些实施方案中，水性组合物包含钙，浓度为约5mM至约100mM，任选地为约30至约50mM，任选地为约38至约42mM。

在一些实施方案中，水性组合物包含乙酸盐，浓度为约7至约50mM，任选地为约15至约25mM，约18至约20mM。

在一些实施方案中，水性组合物包含氯化钠，浓度为约100至约200mM，任选地为约114至约120mM。

在一些实施方案中，水性组合物还包含：

约800至约1200IU/ml的凝血酶；

约0.5至约0.65％(w/v)的载体蛋白质；

约1.85至约2.05％(w/v)的碳水化合物；

约38至约42mM的钙；

约18.0至约20.0mM的乙酸盐；以及

约60-240mM的氯化钠，

水性组合物具有约1.01至约1.03g/ml的密度。

在一些实施方案中，组合物具有约1.01至约1.03g/ml的密度。

在一些实施方案中，水性组合物包含约1000IU/ml的凝血酶。

在水性组合物的一些实施方案中，载体蛋白质包含约0.06至约6.0％(w/v)的白蛋白，例如0.6％(w/v)的白蛋白。

在水性组合物的一些实施方案中，碳水化合物包含约0.2至约5％(w/v)的甘露糖醇，例如约2.0％(w/v)的甘露糖醇。在一个实施方案中，水性组合物的pH范围为约5至约8，诸如约6.9至约7.1。

在一些实施方案中，水性组合物的密度范围为约1.001-1.1克/ml。

在一些实施方案中，提供了包含根据本文所公开的方法的任何实施方案制备的微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末。

在一些实施方案中，提供了包含根据本文所公开的任何实施方案的喷雾干燥的凝血酶粉末的基质。在一些此类实施方案中，与冻干和研磨的凝血酶粉末相比，本文所公开的喷雾干燥的凝血酶粉末的高密度(例如约0.1至约1.0g/cm³，任选地约0.4至约0.6cm³)促使每cm²基质使用更小体积的粉末，使得基质上的粉末高度较低并且因此更容易粘附至基质表面。

在一些实施方案中，喷雾干燥的粉末的调整堆积密度为约0.46g/cm³，并且喷雾干燥的粉末的振实密度为约0.58g/cm³。

在一些实施方案中，基质为贴片，任选地为生物可降解贴片。

在一些实施方案中，贴片包括织造物。

在一个实施方案中，贴片包括非织造物。

在一些实施方案中，贴片包含单个层。

在一些实施方案中，贴片为多层的，任选地包含两层、三层或更多层。

在一些实施方案中，贴片包含氧化再生纤维素，任选地包含氧化再生纤维素基质和非织造PG910纤维。

在一些实施方案中，贴片包含明胶。

在一些实施方案中，贴片可施加至出血组织(例如伤口)上，并且在使用猪脾模型时能够实现小于3分钟的止血时间(即完全停止出血的时间)。

在一些实施方案中，贴片包括PCT专利公开WO 2007/117237中所公开的任何实施方案。

在一些实施方案中，基质还包含纤维蛋白原粉末。

在一些实施方案中，通过冷冻干燥/冻干来制备纤维蛋白原粉末。在一些此类实施方案中，可研磨所得的冻干块。

在一些实施方案中，提供了包含容器的试剂盒，该容器包含根据本文所公开的任何实施方案的喷雾干燥的凝血酶粉末作为第一组分。

在一些实施方案中，试剂盒还包含选自由以下项组成的组的第二组分：纤维蛋白原、明胶、胶原、氧化再生纤维素以及它们的组合。

在一些实施方案中，第二组分是呈选自由以下项组成的组的形式的：粉末、珠、颗粒剂、附聚物。

在一些实施方案中，第二组分是呈选自由以下项组成的组的形式的：溶液、糊剂、凝胶和浆液。

在一些实施方案中，纤维蛋白原制剂是呈粉末形式的。

在一些实施方案中，纤维蛋白原制剂为溶液，例如液体或冷冻形式的溶液。

在一些实施方案中，第一组分和第二组分在同一容器内一起提供。

在一些实施方案中，第二组分与第一组分在单独的容器中提供。

在一些实施方案中，第二组分是呈选自由以下项组成的组的形式的：海绵、垫、绷带和纱布。

本文所公开的喷雾干燥的凝血酶粉末、基质或试剂盒可用于任何治疗目的。术语“任何治疗目的”是指在受试者中的任何治愈性或预防性治疗。示例性治疗目的包括但不限于：密封在组织或器官(例如骨)中形成的孔洞；血管的吻合；接合组织部分(例如软组织部分)；治疗或预防硬脑膜缺损，例如硬膜注射后的撕裂或泄漏、裂痕或断裂；治疗或预防出血；治疗或预防诸如肺部切除后的空气泄漏；治疗或预防肠穿孔后的缺陷；治疗或预防在任何组织中进行吻合手术后的缺陷，这些组织例如子宫、食管、胃、胰腺、胰管、胆囊、胆管、肠(包括小肠和大肠)和直肠；治疗或预防任何组织中的手术后泄露，这些组织例如子宫、食管、胃、胰腺、胰管、胆囊、胆管、肠(包括小肠和大肠)和直肠；预防或减弱钉或缝合线处的手术后泄露的发生，例如通过将根据本发明的试剂盒组分、贴片或粉末施加至缺陷(诸如钉/缝合线)的至少一部分上；用于例如在疝手术过程中强力固定假体；用于钉/缝合线增强；预防或减弱肺泡空气泄漏；治疗或预防肾缺陷；治疗或预防瘘管；治疗或预防心脏缺陷，例如心脏贯通伤；增强血管移植假体；以及治疗或预防脑脊液泄漏。

在一些实施方案中，根据本文所公开的任何实施方案的喷雾干燥的凝血酶粉末、试剂盒或基质用于提供止血、密封泄漏和/或结合结构。

在一些实施方案中，提供了在对其有需要的受试者中提供止血、密封泄漏和/或结合结构的方法，该方法包括使用根据本文所公开的任何实施方案的喷雾干燥的凝血酶粉末或基质。

根据本文所述的一些实施方案的另一个方面，提供了适用于制备凝血酶微胶囊的水性组合物，该水性组合物包含：凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约1.6IU:1mg至5,000IU:1mg，并且其中凝血酶:碳水化合物的比率为2IU:1mg至1500IU:1mg。

根据本文所述的一些实施方案的另一个方面，提供了用于制备凝血酶微胶囊的方法，该方法包括以下步骤：将凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物混合在水性溶液中，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约1.6IU:1mg至5000IU:1mg，并且其中凝血酶:碳水化合物的比率为2IU:1mg至1500IU:1mg；以及喷雾干燥该水性溶液。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。另外，说明、材料、方法和实施例仅为示例性的而非旨在用于限制。类似于或等同于本文所述的方法和材料可用于实践本发明。

如本文所用，术语“微胶囊”是指具有外部壳体和内部空间的颗粒，其中颗粒的形状是基本上球形或圆柱形的，并且其中外部壳体的尺寸在1和1000之间的范围内，这些颗粒包含至少凝血酶和/或至少一种赋形剂。在其中颗粒是基本上球形的实施方案中，该尺寸为直径。在其中颗粒是基本上圆柱形的实施方案中，该尺寸为长度。

外部壳体可以是完整的、破裂的或塌缩的。

本文所公开的微胶囊是通过干燥包含溶质的液体(例如含水的凝血酶组合物)液滴来制备的。

虽然固体微粒可通过微粉化(通常通过物理冲击方法，诸如破碎、筛分、研磨和/或碾磨)由较大的固体颗粒来产生，但此种微粉化方法不适用于制备微胶囊。因此，根据一些实施方案，微胶囊不是通过较大颗粒的微粉化来制备的。

如本文所用，术语“包含微胶囊的粉末”是除了微胶囊之外还包含具有微米范围和非微米范围的直径/长度的其它颗粒的粉末，这些其它颗粒例如无定形微胶囊碎片(即，源自被破裂或撕裂成独立壳体片段的微胶囊的独立壳体片段)。在一些实施方案中，根据本文的教导内容的“包含微胶囊的粉末”为至少50重量％的微胶囊，并且在一些实施方案中，为至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、至少80重量％、至少85重量％、至少90重量％、至少95重量％或甚至100重量％的微胶囊，包括所公开的百分比之间的任何范围。在一些实施方案中，微胶囊的外部壳体是完整的。

在一些实施方案中，“包含微胶囊的粉末”包含约50重量％至约100重量％的微胶囊，诸如50-55重量％、50-60重量％、50-65重量％、50-70重量％、50-75重量％、50-80重量％、50-85重量％、50-90重量％、50-95重量％、50-99重量％、55-60重量％、55-65重量％、55-70重量％、55-75重量％、55-80重量％、55-85重量％、55-90重量％、55-95重量％、55-99重量％、60-65重量％、60-70重量％、60-75重量％、60-80重量％、60-85重量％、60-90重量％、60-95重量％、60-99重量％、65-70重量％、65-75重量％、65-80重量％、65-85重量％、65-90重量％、65-95重量％、65-99重量％、70-75重量％、70-80重量％、70-85重量％、70-90重量％、70-95重量％、70-99重量％、75-80重量％、75-85重量％、75-90重量％、75-95重量％、75-99重量％、80-85重量％、80-90重量％、80-95重量％、80-99重量％、85-90重量％、85-95重量％、85-99重量％、90-95重量％、90-99重量％、95-99重量％、90-100重量％、95-100重量％的微胶囊。

在一些实施方案中，“包含微胶囊的粉末”包含约90重量％至约100重量％的微胶囊。

如本文所用，术语“载体蛋白质”是指与凝血酶在水性溶液中可逆地相互作用，即不影响凝血酶活性或结构，的蛋白质。

如本文所用，术语“水性凝血酶组合物”或“水性组合物”是指包含凝血酶和至少一种另外的赋形剂的液体，其中该液体包含至少50重量％的水。在优选的实施方案中，溶液包含至少95重量％的水以及不超过5重量％的溶解于其中的凝血酶和其它固体，并且在甚至更优选的实施方案中，包含至少98重量％的水和不超过2重量％的溶解于其中的凝血酶和其它固体。

如本文所用，对于凝血酶活性而言，术语“收率”是与喷雾干燥之前液体水性凝血酶组合物中的凝血酶活性相比，粉末重构时的凝血酶的生物学活性的百分比。术语“凝血酶收率”和“凝血酶活性恢复”是可互换使用的。

“凝血酶活性”或“凝血酶生物学活性”旨在包括凝血酶介导的异源底物的转化，包括蛋白质的转化(例如纤维蛋白原转化成纤维蛋白)以及因子VIII转化成因子VIIIa、XI转化成XIa、XIII转化成XIIIa和因子V转化成Va。“异源底物”是除凝血酶以外的底物，优选为蛋白质底物。在一些实施方案中，凝血酶活性是指将纤维蛋白原转化成纤维蛋白。

如上所述，用于实施本文教导内容的微胶囊是通过喷雾干燥水性凝血酶溶液来制造的。

在一些实施方案中，喷雾干燥液滴通过以下来形成：将水性凝血酶溶液通过雾化喷雾嘴喷雾到称为“双流体喷嘴雾化”的干燥室中，然后通过热干燥气体流从水滴中蒸发水以形成所需的微胶囊。任何适用的液滴大小都可用于实施本文的教导内容。

在一些实施方案中，液滴通过压力喷嘴雾化来形成，其中喷雾通过迫使溶液通过开口来形成。

在一些实施方案中，液滴通过离心雾化来形成，其中喷雾通过在旋转盘中传送溶液而来形成。在一些实施方案中，所形成的液滴具有等于或低于1000微米的直径，诸如1和1000微米之间的直径。

如本领域已知的，用于喷雾干燥的液滴可通过使用雾化气体来形成，这些雾化气体可在约15℃至约30℃的温度下提供，例如在室温(18-25℃)下提供，例如与水性凝血酶组合物同轴并在相同的方向上流动通过雾化喷嘴。可将任何合适的惰性气体用作雾化气体，包括空气、氮气和氩气。优选地，雾化气体是干燥的，含有尽可能少的水，在一些实施方案中，雾化气体具有至多约30％的相对湿度。

如本领域已知的，所形成用于喷雾干燥的液滴可喷雾到干燥室中的干燥气体中，并且被带走。任何合适的气体可在约100至约190℃的范围内的温度下用作干燥气体，包括空气、氮气和氩气。优选地，干燥气体是干燥的，含有尽可能少的水，诸如具有至多约30％的相对湿度。通常，如下文所详细讨论的，将干燥气体加热至高温。

在喷雾干燥的一些实现方式中，喷雾干燥的颗粒从干燥室的底部回收并通过冷却室转移，其中这些颗粒通过与维持在约4至约24℃的温度的冷却气体接触进行冷却。可将任何合适的气体用作冷却气体，包括空气、氮气和氩气。优选地，冷却气体是干燥的，包含尽可能少的水，诸如至多约30％的相对湿度。在一些实施方案中，气体的水含量为约0.0001％。

图1中示出了可商购获得的喷雾干燥设备10的示例，该设备包括具有喷雾嘴14和干燥气体导管16的干燥柱12。

喷雾嘴14具有近侧端部18和远侧端部20，在远侧端部20处具有喷雾嘴尖端22。

提供液体导管24用于将待喷雾干燥的液体载送至喷雾嘴尖端22，液体流经喷雾嘴尖端22。

在本文所述的设备或方法的一些实施方案中，在喷雾嘴尖端22的远侧端部20处提供雾化部件25，并且在喷雾嘴尖端22处提供具有远侧端部的液体导管24，用于将待喷雾干燥的液体载送至喷雾嘴尖端22。

在一些实施方案中，雾化部件25包括雾化气体导管26，用于引导雾化气体流通过雾化气体出口离开以接触离开喷雾嘴尖端的液体。

在一些实施方案中，以高压迫使液体通过位于雾化部件25的远侧端部的小孔，导致压降，从而将液体转变为液滴的喷雾(例如微小液滴)。因此，在一些实施方案中，雾化部件[25]包括位于所述液体导管[24]的远侧端部的孔，其中所述液体被迫通过所述孔以形成喷雾

在一些实施方案中，雾化部件25包括旋转盘，其中液体的喷雾通过由盘旋转产生的离心力来形成。

干燥气体导管16包括干燥气体出口28，用于提供干燥气体以在液体离开喷嘴尖端22时干燥由该液体形成的喷雾，由此形成粉末。

产生的粉末通过旋风除尘器单元30与干燥气体分离，然后收集在旋风除尘器单元30的底部，例如收集在收集容器32中。分离的干燥气体的路径和粉末的路径分别表示为35和36。

在一些实施方案中，通过冷却气体导管29将具有较低温度(例如，室温或更低)的冷却气体然后是干燥气体引入干燥柱12的下游。

在一些实施方案中，防止凝血酶热损伤的方法是通过防止凝血酶在液体导管24和喷嘴尖端22中一度过热，如图2所示。图2示出了现有技术的包括热交换机构的喷雾嘴14，包括两根用于循环冷却水的管，即用于冷却水流入的围绕液体导管24同心布置的第一管34a，以及用于冷却水流出的第二管34b，并且使用循环泵(未示出)将冷却水循环进入第一管34a中并从第二管34b流出至水浴。

如本文所用，术语“雾化气体”是指以与液体溶液流平行的方向流动的气体(平行流)，从而形成低压，该低压形成液体流中的微小液滴。在一些实施方案中，雾化气体提供在喷雾器气体导管26中，如图1所示。

如本文所用，术语“微小液滴”可指在特定喷雾干燥条件下在接触干燥气体流之后可能干燥成粉末的液滴，而大液滴在相同的特定条件下可能不干燥成粉末，而是粘附至在用于干燥大液滴的喷雾干燥设备的内壁，从而导致过程产物损失，即降低质量收率。根据一些实施方案，“微小液滴”是直径等于或小于1mm的液滴。根据一些实施方案，“大液滴”是指具有的大小大于1mm的液滴。

如本文所用，术语“干燥柱”或“干燥室”是指其中发生液滴干燥的柱，液滴干燥通过高温(诸如约100至约170℃)的干燥气体流来实现。在一些实施方案中，干燥柱或干燥室如图1中12所示。

如本文所用，术语“水性凝血酶组合物”是指包含凝血酶和溶质的溶液。

如本文所用，术语“干燥气体”是指与液滴接触时将液滴干燥成粉末/微胶囊的气体。在一些实施方案中，干燥气体提供在导管16中，并且包括干燥气体出口28，如图1所示。

如本文所用，术语“冷却气体”是指进入喷雾干燥器并且与接触粉末流的干燥气体流合并以降低干燥气体流和粉末的温度的气体。在一些实施方案中，冷却气体提供在导管29中，如图1所示。

如本文所用，术语“密度”是指每单位体积固体的重量。密度可在液体、固体(例如粉末)形式中测量，并且以g/ml或g/cm³来测量。对于粉末，密度可以是“调整堆积密度”或“振实密度”。

粉末的堆积密度是未振实的粉末样品的质量与它的体积(包括粒间空隙体积的贡献)的比率。

如本文所用，术语“调理堆积密度”是指已经历调整步骤的堆积粉末样品的密度，其中粉末被转移(例如，使用旋转叶片)以使该粉末松散来移除任何预压实和/或过量空气。

如本文所用，术语“振实密度”是指在机械振实含有粉末样品的器皿(例如容器)之后获得的增加的堆积密度。

通过喷雾干燥形成的凝血酶微胶囊可以用作血液凝聚剂。在一些实施方案中，凝血酶微胶囊与基质物理缔合(即掺入或附接到基质)，该基质即固体物体，诸如织造或非织造织物的贴片。

如本文所用，术语“包括”、“包含”、“具有”及其语法变体应视为指定所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一种或多种另外特征、整数、步骤、组分或其组的添加。这些术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。

如本文所用，不定冠词“一个”和“一种”意指“至少一个/种”或“一个或多个/一种或多种”，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，术语“约”是指±10％。

纤维蛋白原和凝血酶可任选地由初始血液组合物制备。血液组合物可以是全血或血液成分，即全血的成分，诸如血浆。纤维蛋白原和凝血酶的起源可以是自体同源的，由此它们可由患者自己的血液、由储集的血液或血液成分制造。凝血酶和蛋白酶原也可能通过重组方法制备。

在本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原包括作为从血浆衍生的蛋白质溶液的生物活性组分(BAC)，纤维蛋白原任选地还包括抗纤维蛋白溶解剂(诸如凝血酸)和/或稳定剂(诸如精氨酸、赖氨酸、它们的药学上可接受的盐、或者它们的混合物)。BAC任选地衍生自冷凝蛋白质，特别是浓缩的冷凝蛋白质。

术语“冷凝蛋白质”是指从由全血制备而成的冷冻血浆、复原的血浆或通过血浆取出法采集的原血浆获得的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4℃的温度下)缓慢解冻导致形成含有纤维蛋白原和因子XIII的沉淀物时，任选地获得冷凝蛋白质。沉淀物可例如通过离心分离来采集并溶解于合适的缓冲液，诸如包含120mM的氯化钠、10mM的柠檬酸钠、120mM的甘氨酸、95mM的盐酸精氨酸、1mM的氯化钙的缓冲液。BAC的溶液任选地包含另外的因子，诸如例如因子VIII、纤粘蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等，例如如在US 6,121,232和WO9833533中所描述的。BAC的组合物任选地包含稳定剂(诸如凝血酸和盐酸精氨酸)。BAC的溶液中的凝血酸的量任选地在约80至约110mg/ml的范围内。盐酸精氨酸的量任选地在约15至约25mg/ml的范围内。

任选地，将纤维蛋白原溶液缓冲到生理相容的pH值。缓冲液包括用于作为注入载体的甘氨酸、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙和水。甘氨酸任选地以在约6至约10mg/ml范围内的浓度存在于组合物中；柠檬酸钠任选地以在约1至约5mg/ml范围内的浓度存在；氯化钠任选地以在约5至约9mg/ml范围内的浓度存在；且氯化钙任选地以在约0.1至约0.2mg/ml范围内的浓度存在。

在本发明的一个实施方案中，纤维蛋白原衍生自血液，例如BAC组合物。在本发明的在另一个实施方案中，血液衍生组分中纤溶酶原和/或纤溶酶的浓度被降低。从血液衍生组分中移除纤溶酶和纤溶酶原可以如US7,125,569和WO02095019中所述的进行。

附图说明

本发明的一些实施方案在本文中参考附图进行描述。说明书连同附图使本领域的普通技术人员显而易见地知道如何实践本发明的一些实施方案。附图用于例示性讨论的目的，而非试图显示比基本理解本发明所需的更详细的实施方案结构细节。为清楚起见，附图中描绘的一些物体未按比例绘制。

在附图中：

图1(现有技术)为喷雾干燥设备的示意图；

图2(现有技术)为喷雾嘴的示意图；

图3为示出凝血酶溶液组合物对喷雾干燥的凝血酶粉末的凝血酶活性恢复(％)的影响的图；

图4为示出入口气体温度对喷雾干燥的凝血酶粉末的凝血酶活性恢复(％)和水含量(％)的影响的图；以及

图5为示出入口气体流速对喷雾干燥的凝血酶粉末的凝血酶活性恢复(％)和水含量(％)的影响的图。

具体实施方式

本文教导的原理、用途和具体实施可参考所附说明书得到更好理解。在精读说明书后，本领域技术人员能够实施本发明而无需过度努力或实验。

在详细说明至少一个实施方案之前，应当理解本发明不一定在其应用中限制于下述说明书中所示的组分和/或方法的构建和排列的细节。本发明能够具有其它实施方案，或能够以各种方式实践或实施。本文采用的措辞和术语用于描述性目的且不应视为限制性的。

如下结果部分所示(参见实施例1、2和图3)，本文所公开的包括盐和载体蛋白质二者的重构凝血酶组合物的实施方案具有相对高的凝血酶活性恢复(～80％，组合物6)。对于还包括碳水化合物(尤其是糖醇，诸如甘露糖醇)的重构凝血酶组合物，喷雾干燥后凝血酶活性恢复较高(～85％，组合物7)，并且当重构凝血酶组合物还包括相对大量的氯化钙时，喷雾干燥后凝血酶活性恢复甚至更高(～95％，组合物8)。所有情况均相同，用具有相对高的载体蛋白质/凝血酶比的组合物实现了更高的凝血酶活性恢复(参见表2B和3)。

如下结果部分所示，本文所公开的包括载体蛋白质(例如白蛋白)和碳水化合物(例如糖醇，诸如甘露糖醇)二者的重构凝血酶组合物的实施方案具有异常高的凝血酶活性恢复(参见实施例2和4)，甚至在高凝血酶浓度下也是令人惊讶的(参见实施例6和6)。不希望受任何一种理论支配，当前认为载体蛋白质和碳水化合物的组合有助于保持凝血酶结构和效能力，特别是通过提供热保护。

由本文教导内容的实施方案提供的凝血酶活性恢复优于现有技术提供的凝血酶活性恢复。例如，美国专利申请公布2012/0315305公开了具有25至1000IU/g的浓度的喷雾干燥的凝血酶。比较实施例6示出根据本文教导内容的包括载体蛋白质的凝血酶组合物提供基本上更高的凝血酶活性恢复。

认为根据本文教导内容的一些实施方案的一些优点是所用的喷雾干燥条件的结果导致以高质量和效能收率以及高浓度产生活性凝血酶粉末。在一些实施方案中，高水平的凝血酶活性恢复通过以下中的至少一者来实现：

在不高于190℃的温度下干燥气体(例如，干燥空气或氮气)；至少1:1000的凝血酶溶液流速:雾化气体流速的比率，即当每分钟喷雾干燥1ml凝血酶溶液时，雾化气体流速优选为至少1l/分钟。

至少1:43,000的凝血酶溶液流速:干燥气体流速的比率，即当每分钟干燥1ml凝血酶时，干燥气体流速优选为至少43l/分钟。

具体地，在实施例8a中，190℃的干燥气体温度产生具有低至1.5％的水含量的喷雾干燥的凝血酶粉末。在实施例9中观察到，为了获得具有高凝血酶活性恢复和低水含量的喷雾干燥的凝血酶粉末，优选将入口气体温度设定至不超过约170℃。在一些实施方案中，为了减少水含量同时保持凝血酶活性恢复，增加干燥气体流速而不是干燥气体温度。

已令人惊讶地发现，在一些实施方案中，增加干燥气体流速导致所得的干燥凝血酶组合物的水含量降低，尽管凝血酶在干燥盘中的停留时间减少。

认为，增加的干燥气体流速将降低干燥颗粒上的压力，从而导致蒸发的增加。不希望受任何一种理论支配，注意到当粉末到达干燥柱的底部时，它是热的并且颗粒将倾向于粘附到干燥柱的内部部分以及将粉末流从干燥柱传送至旋风除尘器的管，从而导致质量收率降低。当粉末处于大于它的玻璃化转变温度的温度时，这种粘合将会发生，这使得颗粒的表面在性质上为“橡胶似的”或塑料的。因此，将冷却气体引入干燥柱的底部将会降低颗粒流所处的温度，从而将颗粒的表面温度降低至低于它们的玻璃化转变温度，使得颗粒将以玻璃或弹性状态存在并防止它们粘附到系统的内部部分，使得质量收率因此增加。

如实施例7所示，具有特别低的干燥气体温度(140℃)和高的干燥气体流速(凝血酶溶液:干燥气体流速1：900000)的实施方案提供干燥的、具有窄的粒度分布并且具有高凝血酶活性恢复的喷雾干燥的凝血酶粉末。

根据本文的教导内容，具有相对高的凝血酶浓度的喷雾干燥的凝血酶组合物的实施方案提供了多个优点。例如，当使用包含此类组合物的纤维蛋白贴剂时，形成的纤维蛋白凝块中存在较高的凝血酶浓度，导致凝块中更多的纤维蛋白纤维，引起更大的凝聚强度和对组织的粘合力(参见实施例10)以及更快的凝块形成(止血时间(TTH)<3分钟，参见实施例11)。

根据本文的教导内容，喷雾干燥的凝血酶组合物的实施方案可在室温下保存延长的时间段，而无需在冷却(即，2-8℃)或冷冻(即，小于-18℃)下保存。

根据本文的教导内容，喷雾干燥的凝血酶组合物的流动性在实施例12中示出。如本文所用，术语“粉末流动性”是指粉末在一组指定的条件下流动的容易性，如用粉末流变仪(FT4粉末流变仪，Freeman technology,Gloucestershire,UK)通过向上提升位移模式移动叶片所测量的。此类条件的示例包括粉末上的压力、颗粒表面的粗糙度、粉末周围空气的湿度以及粉末流经或从中流出的器械。流动性被表示为转移粉末组合物所需的能量，除以所转移的粉末重量。该组合物所展示的低比能量意味着转移该组合物需要较少的能量。实际上，在制造过程中，低比能量组合物较不可能引起可堵塞用于转移组合物的机械(例如，螺旋推机)的联锁和摩擦。

另外，根据本文的教导内容，使用根据本文的教导内容用于制备喷雾干燥的凝血酶微胶囊组合物的喷雾干燥方法的实施方案干燥水性凝血酶组合物供给的实施方案导致产生具有密实颗粒的高度浓缩的凝血酶组合物。如表17所示(实施例12)，与比较冻干组合物的0.37g/ml的调整堆积密度和0.48g/ml的振实密度相比，根据本文教导内容的实施方案的喷雾干燥的凝血酶组合物的调整堆积密度(即，其中颗粒之间的气隙未被消除(例如通过振实)的粉末密度)为0.46g/ml，并且振实密度(在(例如通过振实)消除颗粒之间的气隙后的粉末密度)为0.58g/ml。

实施例：

材料和方法

材料

凝血酶(NDC号63713-460，由以色列的Omrix Biopharmaceuticals有限公司制造)。在以下实验中，使用商品名为纤维蛋白密封剂(由以色列的OmrixBiopharmaceuticals有限公司制造)的凝血酶组分。

人血清白蛋白(Plasbumin 25，白蛋白在水性稀释剂中的25％无菌溶液，NDC号13533-692-20)获取自Grifols USA,Research Triangle Park,North Carolina,USA。

D-甘露醇(目录号443907)、醋酸钠三水合物(目录号1370121000)、氯化钙二水合物(1371015000)可购自Merck Milipore(Billerica,Massachusetts,USA)。

在使用之前，将凝血酶保存在标准实验室冷冻机中，以保持约-18℃的温度，将人血清白蛋白和所有固体材料保存在室温(约24℃)不超过30℃的温度下。

设备

喷雾干燥器。使用4M8-TriX喷雾干燥机(来自ProCepT nv,Zelzate,Belgium)。

方法

凝血酶溶液的制备：

对于每个实验，使所需量的冷冻凝血酶溶液(Omrix Biopharmaceuticals,Israel)在密封瓶中温热至室温。通过将温热的凝血酶以所需的浓度溶解于三蒸水中来制造凝血酶溶液(参见下文的表)。

喷雾干燥：

将制备的凝血酶溶液吸入注射器内并置于喷雾干燥器的注射器泵内。将注射器泵设定至所需的流速，并且关闭进料阀。

当注射器泵进料阀关闭时，启动喷雾干燥器，并且设定所需的雾化气体流速、干燥气体流速、干燥气体温度、冷却气体流速和旋风除尘气体流速。

选择冷却气体流速和温度，使得不破坏干燥柱中的层流，而是将气体流温度降低至组合物的玻璃化转变温度以下，以便防止粉末粘到玻璃零件。

使喷雾干燥器运行，直至达到稳态，其中参数的实际测量值达到设定水平并且保持稳定。然后打开进料阀，从而允许凝血酶溶液流经进料入口至喷雾嘴，以使凝血酶溶液通过雾化气体流雾化成小液滴，然后小液滴在干燥柱中干燥。形成喷雾干燥的凝血酶粉末，在喷雾干燥器的旋风除尘器的粉末出口中收集。

将从旋风除尘器中回收的喷雾干燥的凝血酶粉末在湿度低于30％的相对湿度下在除湿器中称重，并分成在100-200mg之间的样品。每个样品单独密封在具有塞的试管中，并且用(Bemis,Oshkosh,Wisconsin,USA)密封，直至评估。

喷雾干燥的凝血酶粉末的表征

喷雾干燥的凝血酶粉末的特征在于测定凝血酶活性，包括凝血酶活性恢复(与喷雾干燥之前的凝血酶活性相比)、水含量、粒度分布、总蛋白质和可凝聚蛋白质、密度(调理堆积密度和振实密度)、流动性和质量收率。

凝血酶活性测定

根据修改的欧洲药典测定(0903/1997)过程使用凝聚时间测定法通过测定溶液中的凝血酶凝聚活性来测定水性凝血酶溶液的凝血酶活性。简而言之，通过以下来制作凝血酶浓度与凝聚时间的校准曲线：将凝血酶标准物(2，来自Beijing StagoDiagnosis Trading Co.Ltd,Beijing,China)以不同的凝血酶浓度(4、6、8和10IU/ml)与0.1％纤维蛋白原溶液(Omrix Biopharmaceuticals Ltd.,Israel)混合，并使用凝聚测量装置(来自Beijing Stago Diagnosis Trading Co.Ltd.,Beijing,China)测量每个样品凝聚所花费的时间。

对于每个分析，将大约35mg喷雾干燥的凝血酶的样品溶解于1ml双蒸水中(以提供具有～1000IU/ml的凝血酶活性的凝血酶溶液)。将此溶液稀释至1:200以产生具有～5IU/ml的效能的溶液。将40μl稀释的凝血酶溶液与160μl的0.1％纤维蛋白原溶液在凝聚测量装置中混合。测定样品的凝聚时间，并且参考校准曲线外推凝血酶活性。

水含量测定

水含量测定使用基于美国药典测定(USP 27，<921>，第2398-2399页)的测量体积的卡耳费瑟库仑滴定法(Karl Fischer Titration method(KFT))来进行。在滴定之前，通过将约10ml干燥的甲醇加入约100至约200mg的喷雾干燥的凝血酶粉末中将水从喷雾干燥的凝血酶粉末中提取出来。

粒度分布测定

悬浮在液体中的颗粒的粒度分布通过使用光散射的原理来测量。使用粒度分析仪LS 13 320(Beckman Coulter Inc.,Pasadena,California,USA)进行测量。由LS 13 320测量的图案是样品中每种组分颗粒散射的图案的总和。LS 13 320由光学试验台和微型液体模块(MLM)组成，微型液体模块包括化学抗性的液体池和搅拌棒，以使悬浮颗粒均匀混合。该系统被设计来使用少量的悬浮流体(12ml)进行工作。将在100与200mg之间的喷雾干燥的凝血酶的粉末样品悬浮于10ml氢氟醚(HFE 7000，由3M公司,Two Harbors,Minnesota,USA制造)。将样品置于微型液体模块(MLM)中，并且测定粒度分布。

总蛋白质和可凝聚蛋白质

使用总蛋白质测试来测定纤维蛋白密封剂贴片样品中的蛋白质的总量。将粉末从纤维蛋白密封剂贴片中提取出来并溶解于能够溶解样品中的蛋白质的增溶溶液中。通过Lowry法对照校准曲线来测定蛋白质浓度。

脆碎度

包含纤维蛋白原和凝血酶粉末的贴片的脆碎度旨在测定粉末在施加至贴剂样品之后从纤维蛋白密封剂贴片片状剥落或碎裂的程度。为了测量脆碎度，将贴片切割成指定大小，并且测定样品的重量。通过将样品放置在小瓶内并使小瓶下落通过固定高度的管到橡胶塞上，使样品经受限定的冲击力。通过称重贴片样品来测定粉末损失的量，并且计算样品的重量减少百分比。

组织剥离

通过使用5000系列Instron张力计(Instron Corp.Norwood,Massachusetts,USA)来测定纤维蛋白密封剂贴片至小牛真皮组织基底的粘合强度。为了测量粘合强度，将纤维蛋白贴片施加到真皮表面并用盐水润湿。随后通过测量力与距离曲线下的积分来确定执行纤维蛋白贴片与小牛真皮组织的90度剥离测试所需的平均力。

抗拉强度

测定具有25mm的侧边宽度、15mm的中间宽度和102mm的长度的狗骨形纤维蛋白贴片样品的抗拉强度。将样品置于Instron夹持件(5000系列Instron张力计，InstronCorp.Norwood,Massachusetts,USA)之间。夹头以305mm/分钟的预定拉伸速率移动。当达到30％的峰值荷降时，表明破裂发生，结束测试。

密度(调整堆积密度、振实密度)

使用粉末流变仪(FT4粉末流变仪，Freeman technology,Gloucestershire,UK)测量调整堆积密度、振实密度和比能量。测试在带有23.5mm叶片250个抽头的25mm的器皿中进行。

术语“密度”是指每单位体积固体的重量。密度可在液体、固体(例如粉末)或气体形式中进行测量。对于粉末，密度可以是“调整堆积密度”或“振实密度”。粉末的堆积密度是未振实的粉末样品的质量与它的体积(包括粒间空隙体积的贡献)的比率。

如本文所用，术语“堆积密度”是指具有已知体积大小的已知重量的堆积粉末样品的密度。

如本文所用，术语“调理堆积密度”是指已经历调整步骤的堆积粉末样品的密度，其中粉末使用旋转叶片被轻轻转移以使该粉末松散来移除任何预压实和/或过量空气。

如本文所用，术语“振实密度”是指在将调整堆积密度粉末样品振实恒定的次数后，测量密度。

流动性(比能量)

使用FT4粉末流变仪(FT4粉末流变仪，Freeman technology,Gloucestershire,UK)来测量粉末在流变仪叶片上施加的阻力(粉末对流动的阻力)，表示为扭矩(径向阻力)和力(垂直阻力)。

比能量(流动性)＝[距离×(扭矩+力)]/分离质量

其中距离是指叶片在向上提升位移模式下行进的距离。

如本文所用，术语“分离质量”是指在测量过程中转移的粉末的质量。

在下文所述的实施例中，测试条件如下：-5°螺旋和100mm/秒的叶片尖端速度。使用25ml的样品体积。

实施例1：凝血酶溶液组合物在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

制备各种凝血酶溶液(包括不同的盐和/或碳水化合物和/或蛋白质)，以便测试溶液中的赋形剂在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响。

如表1中所示，制备八种不同的此类凝血酶溶液：

表1

如上所述用以下参数将组合物1-8喷雾干燥：

1.凝血酶样品流速：400ml/小时；

2.雾化气体流速：7l/分钟；

3.干燥气体(干燥空气)流速：600l/分钟；

4.干燥气体(干燥空气)温度：140℃；

5.冷却气体(干燥空气)流速：100l/分钟；

6.旋风除尘气体(干燥空气)流速：150l/分钟。

在从旋风除尘器回收后，将每种喷雾干燥的凝血酶组合物(用赋形剂干燥的凝血酶)以与母溶相同的浓度在水中重构。将每种重构溶液的凝血酶活性与相应母液的凝血酶活性进行比较。相对活性示于图3的图中。

如图3所示，仅包括盐的重构组合物(组合物1-3)具有相对低的喷雾干燥后凝血酶活性恢复(至多25％)。具有盐和糖醇(例如甘露糖醇)的重构组合物具有适度的喷雾干燥后凝血酶活性恢复(～50％，组合物4、5)。具有盐和蛋白质(例如人血清白蛋白，HSA)的重构组合物具有相对高的喷雾干燥后凝血酶活性恢复(～80％，组合物6)。具有盐、糖醇(例如甘露糖醇)和蛋白质(例如人血清白蛋白，HSA)的重构组合物具有非常高的喷雾干燥后凝血酶活性恢复(～85％，组合物7)，当凝血酶组合物包含盐、糖醇和蛋白质以及相对大量的氯化钙，喷雾干燥后凝血酶活性恢复甚至更高(～95％的凝血酶活性恢复，组合物8)。

实施例2：凝血酶和人血清白蛋白(载体蛋白质)浓度在凝血酶溶液的喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

如表2所示，制备具有不同浓度的凝血酶和白蛋白(充当载体蛋白质)的十五种凝血酶溶液：

表2

如上所述，将组合物9-23喷雾干燥。如上所述，在喷雾干燥之后，将每种喷雾干燥的凝血酶组合物的三个35mg样品以与母液相同的浓度在水中重构。将每种重构溶液的凝血酶活性测量两次，并与相应的母液的凝血酶活性进行比较，得到每种溶液的共计6次测量结果。平均凝血酶活性恢复示于表2中。

计算示出母液中白蛋白重量与凝血酶活性的比率以及该比值对喷雾干燥后凝血酶活性恢复的影响的另外的参数，如表2b中可见(根据白蛋白/凝血酶(g/IU)比从低至高进行分类)。所示的凝血酶活性恢复表示为平均值±标准偏差。

表2b

结果表明，在具有相对高的白蛋白比凝血酶水平的组合物中实现了最高的凝血酶活性恢复(表2b)，其中仅组合物21是异常值。然而，具有凝血酶与白蛋白高比值不能保证高的喷雾干燥后凝血酶活性恢复，如通过组合物11和12获得的大的凝血酶活性恢复差异以及组合物22和23的相对低的凝血酶活性恢复可以看出的。

实施例3：酪蛋白(载体蛋白质)浓度在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

如表3所示，制备具有不同酪蛋白(载体蛋白质)浓度的凝血酶溶液的四种组合物：

表3

如上所述，将溶液24-27喷雾干燥。如上所述，在喷雾干燥之后，将每种喷雾干燥的凝血酶组合物的三个35mg样品以与母液相同的浓度在水中重构。将每种重构溶液的凝血酶活性测量两次，并与相应的母液的凝血酶活性进行比较，得到每种溶液的共计6次测量结果。获得的凝血酶活性恢复示于表3中。用酪蛋白实现的结果类似于用白蛋白实现的结果，这意味着当载体蛋白质与凝血酶的比率高时，获得高的凝血酶活性恢复，然而这不能保证高的凝血酶活性恢复，如从组合物27中凝血酶活性恢复的高差异中可以看出的。

实施例4：碳水化合物类型和浓度在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

如表4至8所示，制备具有不同凝血酶浓度、碳水化合物类型和碳水化合物浓度并且具有或不具有载体蛋白质的二十五种凝血酶溶液：

组合物#	凝血酶(IU/ml)	甘露糖醇[mg/ml]	凝血酶活性恢复(％)
				28	800	2.0	43
29	1200	2.0	54
				30	2000	2.0	49
31	3300	2.0	42

表4

组合物#	凝血酶(IU/ml)	海藻糖[mg/ml]	白蛋白[mg/ml]	凝血酶活性恢复(％)
					32	200	20	-	34-48
33	400	20	-	40-44
					34	454	20	-	54-64
35	600	20	-	43-47
					36	800	20	-	38-44
37	1000	20	-	57-63
					38	454	20	0.6	76-86

表5

组合物#	凝血酶(IU/ml)	蔗糖[mg/ml]	白蛋白[mg/ml]	凝血酶活性恢复(％)
					39	1000	0.2	-	45
40	1000	2.0	-	71-75
					41	1000	20	-	66-80
42	1000	0.2	0.6	54-64
					43	1000	2.0	0.6	93
44	1000	20	0.6	81-93

表6

组合物#	凝血酶(IU/ml)	淀粉[mg/ml]	凝血酶活性恢复(％)
				45	1000	0.06	44-48
46	1000	0.6	36-46
				47	1000	1.8	51-85
48	1000	6.0	57-81

表7

表8

将组合物28-52喷雾干燥。如上所述，在水中回收并重构样品，并且将每种重构溶液的凝血酶活性与相应母液的凝血酶活性进行比较。相对活性示于相应的表4-8中。

结果显示：

表4：仅向凝血酶溶液中加入糖醇(甘露糖醇)不足以在喷雾干燥过程中维持凝血酶活性。

表5和表6：仅向凝血酶溶液中加入二糖(表5中的海藻糖、表6中的蔗糖)不足以在喷雾干燥过程中维持凝血酶活性。然而，当一起加入二糖与载体蛋白质(白蛋白)时，凝血酶活性恢复显著增加。

表7和表8：仅向凝血酶溶液中加入多糖(表7中的淀粉、表8中的麦芽糖糊精)不足以在喷雾干燥过程中维持凝血酶活性。

实施例5：凝血酶浓度以及凝血酶与人血清白蛋白(载体蛋白质)的固定摩尔比在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

如表9所示，制备具有不同凝血酶和白蛋白浓度的三种凝血酶组合物，其中凝血酶与白蛋白的摩尔比在全部三种溶液中为1:6.4：

组合物#	凝血酶(IU/ml)	白蛋白(重量％)	凝血酶活性恢复(％)
				53	100	0.06	55-77
54	1000	0.6	62-98
				55	3000	1.8	58-62

表9

将组合物53-55的样品喷雾干燥。如上所述，在水中回收并重构样品，并且将每种重构溶液的凝血酶活性与相应母液的凝血酶活性进行比较。凝血酶活性恢复示于表9中。可以看出，三种重构溶液的凝血酶活性大致相同，或者凝血酶活性恢复低(组合物53和55)或者凝血酶活性恢复差异高(组合物54)。

实施例6：海藻糖(二糖)在喷雾干燥过程中对维持凝血酶活性的影响

美国专利申请公布2012/0315305公开了包含海藻糖的凝血酶组合物的喷雾干燥，并报道了97％的凝血酶活性恢复。

如表10中所示，制备类似于US 2012/0315305中所述的那些溶液的溶液56和57(除了凝血酶的来源不同并且喷雾干燥器具有不同类型)。另外，制备包括海藻糖和蛋白质(人血清白蛋白)的新型凝血酶溶液58。

表10

根据公布，在类似的喷雾干燥条件下将组合物56-58喷雾干燥。在水中回收并重构样品，并且将每种重构溶液的凝血酶活性与相应母液的凝血酶活性进行比较。凝血酶活性恢复示于表10中。

结果表明，与US 2012/0315305中所报道的结果相反，溶液56和57示出了小于65％的凝血酶活性恢复。然而，根据本文教导内容的一些实施方案，向组合物58中加入载体蛋白质(人血清白蛋白)引起凝血酶活性恢复显著增加。

实施例7：优选的凝血酶组合物的喷雾干燥方法和产品表征

如表11所示，基于实施例1的组合物8制备三升组合物59，由凝血酶、白蛋白、甘露糖醇、乙酸盐、钙和氯化钠组成。

表11

将喷雾干燥器的参数设定如下：

凝血酶样品流速：400ml/小时；雾化气体流速：7l/分钟；干燥气体流速：600l/分钟；干燥气体温度：140℃；冷却气体流速：100l/分钟；旋风除尘气体流速：130l分钟；双流体喷嘴的尖端直径：0.4mm。

如上所述，将3升组合物59喷雾干燥。在喷雾干燥过程中，每1个分钟记录各种喷雾干燥参数的真实值。将63.25g喷雾干燥的组合物收集在200ml玻璃瓶中，命名为瓶#1，并且当瓶#1已满时，将48.41g喷雾干燥的组合物收集在200ml玻璃瓶中，命名为瓶#2。在填充干燥的组合物后，立即将瓶子封盖并用密封，直至进行分析。

平均测量的喷雾干燥参数以及喷雾干燥的凝血酶组合物属性示于表12中：

表12

所获得的喷雾干燥的凝血酶粉末以窄粒度分布进行干燥，并且重要的是，维持了母液的凝血酶活性。

实施例8：干燥气体温度对喷雾干燥的凝血酶属性的影响

在若干喷雾干燥运行中将优选的凝血酶组合物(组合物8)喷雾干燥，仅干燥气体温度在各运行间变化：

凝血酶组合物流速：7ml/分钟

雾化气体流速：7l/分钟

干燥气体流速：300l/分钟

干燥气体温度：100、110、120、130、140、150、160、170、180和190℃

冷却气体流速：150l/分钟

旋风除尘气体流速：300l分钟

从旋风除尘器收集具有不同干燥气体温度的喷雾干燥的凝血酶组合物的干燥样品，并且如上所述测量相应重构溶液的凝血酶活性恢复。凝血酶活性的结果连同样品的水含量示于图4中。

如图4所示，在170℃和更高的干燥气体温度下测量到较低的凝血酶活性。在较低的干燥气体温度(例如170℃和更低)下，观察到高的凝血酶活性。喷雾干燥的凝血酶组合物的水含量随着干燥气体温度的增加而降低。在100℃的温度下，获得约4.5％的水含量。将温度提高至190℃，产生具有低至1.5％的水含量的喷雾干燥的凝血酶粉末。

实施例9：干燥气体流速对喷雾干燥的凝血酶属性的影响

在若干喷雾干燥运行中将优选的凝血酶组合物(组合物8)喷雾干燥，仅干燥气体流速在各运行间变化：

凝血酶组合物流速：7ml/分钟

雾化气体流速：7l/分钟

干燥气体流速：300、350、400、450、500和550l/分钟

干燥气体温度：155℃

旋风除尘气体流速：将喷雾干燥器的总流速增补至600l/分钟的流速(即300、250、200、150、100和50l/分钟)。

从旋风除尘器收集喷雾干燥的凝血酶的干燥样品，并且如上所述测量相应重构溶液的凝血酶活性恢复。凝血酶活性的结果示于图5中。

如图5所示，在所有测试的干燥气体流速下，观察到高的凝血酶活性。喷雾干燥的凝血酶的水含量随着干燥气体流速的增加而降低。在300l/分钟的流速下，获得约3.5％的水含量。将干燥气体流速提高至550l/分钟，产生具有低至2％的水含量的喷雾干燥的凝血酶粉末。合在一起，结果表明，为了获得具有高凝血酶活性恢复和低水含量的喷雾干燥的凝血酶粉末，优选仅将入口气体温度提高至一定限度，例如至多约170℃。令人惊讶的是，为了减少喷雾干燥的粉末水含量而不损害喷雾干燥的凝血酶活性恢复，建议首先提高干燥气体流速，然后提高干燥气体温度。

实施例10：具有冻干研磨的BAC2和喷雾干燥的凝血酶生产纤维蛋白贴片

在实施例1所述的条件下将实施例1中所述的凝血酶组合物8喷雾干燥。将从旋风分离器收集所得的喷雾干燥的凝血酶粉末与冻干研磨的BAC2一起使用，以制备WO2007117237所述的纤维蛋白贴片。

分析纤维蛋白贴片的特征，如表13所示：

参数	喷雾干燥的凝血酶
		水含量(％)	2.4
粒度分布(μm)	D50＝8；D90＝16
		凝血酶活性[IU/mg固体]	24.1

表13

分析纤维蛋白密封剂贴片的特征，如表14所示：

表14

可以看出，用喷雾干燥的凝血酶粉末制造的纤维蛋白密封剂贴片具有低的水含量(2.1％)和高的凝血酶活性(36±2.7IU/cm²)。

在组织剥离测试中，通过确定将贴片从组织剥离所需的力来确定润湿的纤维蛋白密封剂补片对真皮组织基底的粘合强度。用喷雾干燥的凝血酶组合物制造的贴片表现出高粘合力。

实施例11：纤维蛋白密封剂贴片的体内功效

测试实施例10中所述的纤维蛋白密封剂贴片的止血时间(TTH)。

将两只相似大小和重量的猪在整个外科手术中麻醉，并且脾脏外科暴露。在两个脾脏中的每一个中使用适当的刀片制成五个3mm深15mm长的伤口，并且施加纤维蛋白贴剂以覆盖这些伤口中的每一个。3分钟之后的结果示于表15中，并且10分钟之后的结果示于表16中，其中“通过”指示完全止血。

表15

表16

如表15和16中可以看出的，贴片在3分钟内实现了100％止血，并且在10分钟之后未观察到再出血。

实施例12：喷雾干燥的凝血酶组合物的表征

在实施例1所述的条件或冻干下将实施例1的凝血酶组合物8喷雾干燥。如表17所示，分析两种所得的干燥凝血酶粉末的堆积密度、振实密度和比能量(ParticleTechnology Labs,US)。

表17

表17中所示的结果表明，喷雾干燥的凝血酶粉末比冻干的凝血酶粉末更密实。表17中的结果还表明喷雾干燥的凝血酶粉末具有比冻干的凝血酶粉末更低的比能量，这意味着喷雾干燥的凝血酶更容易流动。实际上，喷雾干燥的凝血酶粉末不太可能导致机械中的机械联锁和摩擦，例如从而降低传送装置、进料机构和管材的堵塞的风险。

Claims

1.包含微胶囊的喷雾干燥的凝血酶粉末，所述粉末包含：

凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约0.85IU:1mg至66,875IU:1mg，并且其中凝血酶:碳水化合物的比率为0.75IU:1mg至26,750IU:1mg。

2.根据权利要求1所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约110IU:1mg至约285IU:1mg，任选地为约129IU:1mg至约219IU:1mg。

3.根据权利要求1或2所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中所述载体蛋白质包括白蛋白。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中所述碳水化合物为糖醇或糖类。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中所述载体蛋白质为白蛋白并且所述碳水化合物为甘露糖醇，其中凝血酶:白蛋白的比率为约0.85IU:1mg至66,875IU:1mg，并且其中凝血酶:甘露糖醇的比率为0.75IU:1mg至26,750IU:1mg。

6.根据权利要求5所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中凝血酶:白蛋白的比率为约110IU:1mg至约285IU:1mg，任选地为约129IU:1mg至约219IU:1mg。

7.根据权利要求5或6所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，其中凝血酶:甘露糖醇的比率为约40IU:1mg至约64IU:1mg。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，包含约0.001％至约5％w/w的凝血酶。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，包含小于约3％w/w的水。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末，具有约5至约13μm的D50和约15至约25μm的D90的粒度分布。

11.一种适用于制备凝血酶微胶囊的水性组合物，所述水性组合物包含：

凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约1.6IU:1mg至5,000IU:1mg，并且其中凝血酶:碳水化合物的比率为2IU:1mg至1500IU:1mg。

12.一种用于制备凝血酶微胶囊的方法，所述方法包括以下步骤：将凝血酶、载体蛋白质和碳水化合物混合在水性溶液中，其中凝血酶:载体蛋白质的比率为约1.6IU:1mg至5000IU:1mg，并且其中凝血酶:碳水化合物的比率为2IU:1mg至1500IU:1mg；以及

喷雾干燥所述水性溶液。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述喷雾干燥包括：

将所述水性溶液引入喷雾干燥装置中；

通过使用雾化气体流从引入所述装置中的所述水性溶液产生液滴；并且

通过干燥气体流从所述液滴蒸发水，

从而制备凝血酶微胶囊。

14.根据权利要求12或13所述的方法，所述水性溶液包含：

约800至约1200IU/ml的凝血酶；

约0.5至约0.65％w/v的载体蛋白质；

约1.85至约2.05％w/v的碳水化合物；

约38至约42mM的钙；

约18.0至约20.0mM的乙酸盐；以及

约60-240mM的氯化钠，

所述溶液具有约1.01至约1.03g/ml的密度。

15.根据权利要求12至14中任一项所述的方法制备的喷雾干燥的凝血酶微胶囊。

16.一种基质，所述基质包含根据权利要求1至10中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末和/或根据权利要求15所述的喷雾干燥的凝血酶微胶囊。

17.根据权利要求16所述的基质，所述基质还包含纤维蛋白原粉末。

18.根据权利要求17所述的基质，其中所述纤维蛋白原粉末是通过冷冻干燥制备的。

19.一种试剂盒，所述试剂盒包括容器，所述容器包含根据权利要求1至10中任一项所述的喷雾干燥的凝血酶粉末和/或根据权利要求15所述的喷雾干燥的凝血酶微胶囊。