JP6918799B2 - トロンビンマイクロカプセル - Google Patents

Description

本発明は、医薬品の分野に関し、より具体的には、マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末、その調製方法、及びその使用に関する。

トロンビンは、血液凝固において複数の機能を有するタンパク分解酵素である。トロンビンは、血漿中に循環チモーゲン前駆体タンパク質であるプロトロンビン（凝固因子ＩＩ）から形成される。これは、タンパク質分解的に分解されて、凝固カスケード中にトロンビンを形成する。トロンビンは、次には、可溶性フィブリノゲンをフィブリンの不溶性ストランドに変換するセリンプロテアーゼ、並びにその他多数の凝固関連の反応の触媒として機能する。

トロンビンは、フィブリノゲンのフィブリンへの変換によって創傷の出血を止めるための凝固因子として臨床適用で広く使用されている。これは、縫合剤の共通成分であり、フィブリン糊、接着剤、及び封止剤などの２成分性止血系においてフィブリノゲン及び他の凝固タンパク質と組み合わせて使用されてきた。

製薬組成物の調製に使用するためのトロンビン粉末は、一般的に溶液の凍結乾燥により調製される。

「凍結乾燥」という用語は典型的には、溶液を凍結してから、水の濃度を、例えば昇華によって、生物反応又は化学反応を支持しないレベルまで低下させるプロセスを指す。

凍結乾燥は、凍結乾燥機の容量によって制限され、通常数日間続くバッチプロセスである。これは、プロセスが完了するまでのかなりの時間の間、乾燥バッチ全体をリスクにさらすことになる。更に、結果として生じる凍結乾燥された「ケーク」を粉末に処理することは、追加の工程（例えば、破壊、ふるい分け、及び／又は粉砕）を実行して粒径を更に縮小することを必要とする。これらの工程は、乾燥製品の力価及び質量収率を低下させ得る。好都合なことに凍結乾燥の代わりにスプレードライプロセスを使用することで、コスト効率が良く、連続的で、高能力のプロセスが提供され、この乾燥生成物は、「ケーク」としてではなく、即座に乾燥粉末の形態で得られる。

本明細書において使用するとき、用語「ケーク」又は「固体ケーク」は、凍結乾燥から生じる多孔質及びスポンジ構造様組成物を指す。

スプレードライは、液体（例えば溶液、懸濁液又は乳濁液）を、例えば、噴霧ガスに接触させながら、スプレーノズルを通してスプレーすることによりスプレー粒子を形成することによる噴霧化を含むか、液体流とガス流の組み合わせによりスプレーが形成され、このガス流により噴霧化エネルギーが供給される二流体ノズル噴霧化による噴霧化を含むか、スプレーがディスクの回転によって生じたエネルギーによって形成されるように、溶液が回転ディスク内に供給される遠心噴霧法による噴霧化を含む。あるいは、液体流は、液体流が小さな孔を通して押し出される圧力ノズルを使用してスプレーされてもよく、圧力の変化が、液体流を小さな液滴のスプレーに転換する。

スプレー粒子の形成の後、乾燥ガス導管により供給される高温ガス（例えば空気又は窒素）の流れの中でこのスプレーを乾燥させる。スプレー粒子は急速に粉末へと乾燥され、粉末は、その後サイクロン装置中で高温空気流から分離され、例えばバイアルなどの容器内に収集することができる。噴霧乾燥プロセスは、乾燥空気流量及び温度、噴霧空気流量、溶液流量などを含むいくつかのキーとなるプロセスパラメータによって制御される。

一般に、トロンビンなどの酵素は、通常、酵素の力価の変性及び後続の損失をもたらす、従来技術の噴霧乾燥プロセスで用いられる高温及び真の応力条件（sheer stress conditions）に敏感である。例えば、溶液中のトロンビンは、約４５℃以上の温度に敏感である。

従来技術は、噴霧乾燥に用いられる溶液において比較的低いトロンビン濃度を使用することによって、又は溶液中のトレハロースなどの炭水化物の濃度を増加させることによって、この問題を解決する。これらの条件は、結果として低濃度のトロンビン（概して最大約１ＩＵ／ｍｇ）を含む噴霧乾燥粉末を得る。

トロンビン粉末の生産及びその使用のための背景技術の噴霧乾燥プロセスの例としては、以下が挙げられる。米国特許第６，１１３，９４８号；米国特許出願公開第２０１２／０３１５３０５号；国際公開第９２／１８１６４号；米国特許第６，４１６，７３９号；欧州特許第０７１３３８８（Ｂ１）号；米国特許第８，８４６，１０５号；米国特許第６，７０３，０４７号；米国特許出願公開第２０１２０１２１５３２号；米国特許出願公開第２０１００２４９０４４号；国際公開第１４／１３５６８９号；Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．２０１３；３０（７）：６２４〜３１．Ｄｏｉ：１０．３１０９／０２６５２０４８．２０１３．７７００９７．Ｅｐｕｂ Ｍａｒ １４ ２０１３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９５ Ｏｃｔ；２２（Ｐｔ ２）：２０３〜１４；及びＥｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｉｏｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｇｙａｎａ Ｒａｎｊａｎ Ｓａｔｐａｔｈｙ教授の指導の下、Ｐｒｉｙａｄａｒｓｉｎｉ Ｐａｔｔｎａｙａｋによって行われた技術、生物工学及び医用工学修士号の論文研究（Ｎａｔｉｏｎａｌ ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｕｒｋｅｌａ，Ｉｎｄｉａ）、２０１０年９月））。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末、その調製方法、及びその使用に関する。

噴霧乾燥トロンビン粉末は、次のパラメータのうちの１つ以上を制御することによって生成され得る：噴霧乾燥プロセスに用いられるトロンビン溶液の組成物、スプレーパラメータ（例えば、溶液流量、噴霧ガス流量）、乾燥ガスパラメータ（例えば、乾燥ガス流量、乾燥ガス温度）、及び粉末捕集パラメータ（例えば、冷却ガス流量）。

意外にも、乾燥ガス流量の増加は、乾燥プロセスに用いられる温度を上昇させずに噴霧乾燥粉末の含水量の減少をもたらすことが見出された。

乾燥塔の下流の冷却ガス導入が、乾燥した粒子の温度をガラス転移温度より下に下げることが更に見出された。粒子は、性質において粘着性がより低く、かつ弾性がより高くなり、したがって、噴霧乾燥機の内壁への付着が少ない傾向があり、質量収率の向上につながる。

いくつかの実施形態では、方法は、いくつかの実施形態で当該技術分野において周知のそのようなキャリア及びタンパク質の濃度と比べて比較的低濃度の安定化タンパク質キャリア、及び炭水化物（例えば糖）を含む、特定の水性トロンビン組成物の使用を含む。例えば、米国特許第６，４１６，７３９号は、本明細書に開示された０．０６〜約６．０％（ｗ／ｖ）の範囲のキャリアタンパク質と比較して１０〜２０（％ｗ／ｖ）のキャリアタンパク質の使用を開示するが、一方米国特許第８，８４６，１０５号は、本明細書に開示された０．２〜５％（ｗ／ｖ）の範囲と比較して２０〜３０％（ｗ／ｖ）の糖を開示する。

意外にも、本明細書に記載の噴霧乾燥方法及び水性組成物の使用は、高いトロンビン活性（いくつかの実施形態では、９０％超）を保持しながら、高水準のトロンビン活性を有する、即ち、高濃度である（いくつかの実施形態では、トロンビン含有量が約２４ＩＵ／ｍｇなど約２０〜約３０ＩＵ／ｍｇである）、乾燥している（いくつかの実施形態では、含水量５％ｗ／ｗ未満である）、及び高密度を有する（いくつかの実施形態では、約０．４６ｇ／ｍＬなど約０．１〜約１．０ｇ／ｍＬのトロンビン密度を有する）、トロンビン粉末の生成をもたらすことが見出された。

いくつかの実施形態では、関連する密度は、調整された嵩密度である。いくつかの実施形態では、関連する密度は、タップ密度である。

本発明の態様及び実施形態は、本明細書中の以下に、及び添付の請求項において、記述される。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態の態様によると、マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末が提供され、この粉末は、トロンビン、キャリアタンパク質、及び炭水化物を含み、トロンビン（ＩＵ）対キャリアタンパク質（ｍｇ）の比は、約０．８５：１〜６６，８７５：１であり、トロンビン（ＩＵ）対炭水化物（ｍｇ）の比は、０．７５：１〜２６，７５０：１である。

いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、トロンビン、キャリアタンパク質、及び炭水化物を含み、トロンビン（ＩＵ）対キャリアタンパク質（ｍｇ）の比は、約０．８５：１〜６６，８７５：１であり、トロンビン（ＩＵ）対炭水化物（ｍｇ）の比は、０．７５：１〜２６，７５０：１である。

いくつかの実施形態では、トロンビン（ＩＵ）対キャリアタンパク質（ｍｇ）の比は、約１１０：１〜約２８５：１、任意追加的に約１２９：１〜約２１９：１である。

いくつかの実施形態では、トロンビン（ＩＵ）対炭水化物（ｍｇ）の比は、約４０：１〜約６４：１、任意追加的に約３５：１〜約７５：１である。

いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、アルブミン、カゼイン、ケラチン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、アルブミン、任意追加的にヒト血清アルブミンを含む。

いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、アルブミン、任意追加的にヒト血清アルブミンである。

いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、カゼインを含む。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、カゼインである。

いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、ケラチンを含む。いくつかの実施形態では、キャリアタンパク質は、ケラチンである。

いくつかの実施形態では、炭水化物は、糖アルコールであり、任意追加的にグリセロール、ソルビトール、キシリトール、及びマンニトールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、糖アルコールはマンニトールを含む。いくつかの実施形態では、糖アルコールはマンニトールである。

いくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖類、二糖類（任意追加的にスクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される）、オリゴ糖類、多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される糖類などの糖類である。

いくつかの実施形態では、粉末は、トロンビン、アルブミン、及びマンニトールを含み、トロンビン（ＩＵ）対アルブミン（ｍｇ）の比は、約０．８５：１〜６６，８７５：１であり、トロンビン（ＩＵ）対マンニトール（ｍｇ）の比は、約０．７５：１〜約２６，７５０：１であり、任意追加的に、約３５：１〜約６５：１である（例えば約５０：１など）。

いくつかの実施形態では、トロンビン（ＩＵ）対アルブミン（ｍｇ）の比は、約１００：１〜約３００：１、約１１０：１〜約２８５：１、約１２０：１〜約２４０：１である（例えば約１２９：１〜約２１９：１など）。いくつかの実施形態では、トロンビン（ＩＵ）対アルブミン（ｍｇ）の比は、約１６０：１である。

いくつかの実施形態では、トロンビン（ＩＵ）対マンニトール（ｍｇ）の比は、約３５：１〜約７５：１である（例えば約４０：１〜約６４：１など）。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、トロンビンを約０．６〜約５３５ＩＵ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、炭水化物（マンニトールなど）を約０．０２〜約０．８ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、キャリアタンパク質を約０．００８〜約０．７ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、アルブミンを約０．００８〜約０．７ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、トロンビンを約２０〜約４０ＩＵ／ｍｇ固形物の濃度で、アルブミンを約０．１〜約０．２ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で、及びマンニトールを約０．５〜約０．６ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、トロンビンを約２２〜約３５ＩＵ／ｍｇ固形物の濃度で、アルブミンを約０．１６〜約０．１７ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で、及びマンニトールを約０．５５〜約０．５６ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、トロンビン、カゼイン、及びマンニトールを含み、トロンビン（ＩＵ）対カゼイン（ｍｇ）の比は、約０．８５：１〜６６，８７５：１であり、トロンビン（ＩＵ）対マンニトール（ｍｇ）の比は、０．７５：１〜２６，７５０：１である。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、カルシウムを約０．００６〜約０．１１５ｍｇ／ｍｇ固形物、任意追加的に約０．０３４〜約０．０５７ｍｇ／ｍｇ固形物、任意追加的に約０．０４４〜約０．０４８ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で更に含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末の総塩濃度は、約０．１〜約０．４ｍｇ／ｍｇ固形物、任意追加的に約０．２５〜約０．３０ｍｇ／ｍｇ固形物である。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、塩化ナトリウムを約０．１〜約０．３ｍｇ／ｍｇ固形物、任意追加的に約０．１９〜約０．２ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で更に含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、アセテートを約０．０１２〜約０．０８６ｍｇ／ｍｇ固形物の濃度で更に含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、トロンビンを約０．００１％〜約５％（ｗ／ｗ）含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、水分を約５％（ｗ／ｗ）未満（約４％未満など）、又は水分を約３％（ｗ／ｗ）未満含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末は、約５〜約１３μｍのＤ５０及び約１５〜約２５μｍのＤ９０の粒径分布を有する。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥トロンビン粉末の粉末密度は、約０．１〜約１．０ｇ／ｍＬ、任意追加的に約０．４〜約０．６ｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＦＴ４ Ｐｏｗｄｅｒ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒによって（即ち、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＦＴ４ Ｐｏｗｄｅｒ Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒを使用して、上方移動モードでブレードを移動させることによって）測定される噴霧乾燥トロンビン粉末の粉体流動性は、約５〜約１５ｍＪ／ｇ、任意追加的に約９〜約１０ｍＪ／ｇである。

結果として生じる噴霧乾燥トロンビン粉末／マイクロカプセルは、比較的長い期間貯蔵され得る。貯蔵後に、粉末／マイクロカプセルをそのまま使用することができる、又は様々な体積の注射用蒸留水などの水溶液の添加によって再構成することができる。再構成中に添加された体積は、噴霧乾燥前の溶液の体積に類似している、より低い、又はより高い場合がある。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態の更なる態様によると、トロンビンマイクロカプセルの調製で使用するのに好適な水性組成物が提供され、この水性組成物は、トロンビン、キャリアタンパク質、及び炭水化物を含み、トロンビン（ＩＵ）対キャリアタンパク質（ｍｇ）の比は、約１．６：１〜５，０００：１であり、トロンビン（ＩＵ）対炭水化物（ｍｇ）の比は、２：１〜１，５００：１である。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態の更なる態様によると、トロンビンマイクロカプセルを調製するための方法が提供され、この方法は、
トロンビンと、キャリアタンパク質と、炭水化物とを含む水性組成物を提供する工程であって、トロンビン（ＩＵ）対キャリアタンパク質（ｍｇ）の比が、約１．６：１〜５０００：１であり、トロンビン（ＩＵ）対炭水化物（ｍｇ）の比が、２：１〜１５００：１である工程と、
水性組成物を噴霧乾燥する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥は、
水性組成物を噴霧乾燥装置の中に導入することと、
装置に導入された水性組成物から液滴を生成することと、
乾燥ガス流によって液滴から水分を蒸発させることと、
それによってトロンビンマイクロカプセルを調製することと、を含む。

いくつかの実施形態では、水性組成物からの液滴の生成は、噴霧ガス流の使用を含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥装置への水性組成物の導入の速度：噴霧ガス流の速度の比は、少なくとも１：１０００である。

いくつかの実施形態では、液滴から水分を蒸発させることは、約１００〜約１７０℃の温度で乾燥塔内の乾燥ガス流へと液滴を向かわせることを含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥装置の中へ水性組成物を導入する速度対噴霧ガス流の速度対乾燥ガス流の速度の比は、１：（少なくとも１０００）：（少なくとも４３，０００）である。

いくつかの実施形態では、水性組成物流、噴霧ガス流、及び乾燥ガス流の流れは、同じ方向に同軸である。

いくつかの実施形態では、方法は、冷却ガス流への暴露によってトロンビンマイクロカプセルを冷却することを更に含む。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥装置の中へ水性組成物を導入する速度は、約１００〜約１０００ｍＬ／時間、任意追加的に約２００〜約８００ｍＬ／時間、任意追加的に約３００〜約５００ｍＬ／時間である。

いくつかの実施形態では、噴霧ガス流の速度は、約３〜約２０Ｌ／分、任意追加的に約５〜約１５Ｌ／分、任意追加的に約７〜約９Ｌ／分である。

いくつかの実施形態では、乾燥ガス流の速度は、約０．１〜約１．０ｍ^３／分、任意追加的に約０．３〜約０．６ｍ^３／分である。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、トロンビンを約１００〜約３０００ＩＵ／ｍＬ含む。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、キャリアタンパク質を約０．０６〜約６．０％（ｗ／ｖ）含む。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、炭水化物を約０．２〜約５％（ｗ／ｖ）含む。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、炭水化物は、マンニトールなどの糖アルコールである。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、炭水化物は、単糖類、二糖類（任意追加的にスクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される）、オリゴ糖類、多糖類、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される糖類などの糖類である。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミン、カゼイン、及びケラチンからなる群から選択される。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミンを含む。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、アルブミンである。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、カゼインを含む。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、カゼインである。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、ケラチンを含む。

本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、ケラチンである。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、カルシウムを約５ｍＭ〜約１００ｍＭ、任意追加的に約３０〜約５０ｍＭ、任意追加的に約３８〜約４２ｍＭの濃度で含む。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、アセテートを約７〜約５０ｍＭ、任意追加的に約１５〜約２５ｍＭ、約１８〜約２０ｍＭの濃度で含む。

いくつかの実施形態では、水性組成物は、塩化ナトリウムを約１００〜約２００ｍＭ、任意追加的に約１１４〜約１２０ｍＭの濃度で含む。

いくつかの実施形態において、水性組成物は、
約８００〜約１２００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、
約０．５〜約０．６５％（ｗ／ｖ）のキャリアタンパク質と、
約１．８５〜約２．０５％（ｗ／ｖ）の炭水化物と、
約３８〜約４２ｍＭのカルシウムと、
約１８．０〜約２０．０ｍＭの酢酸塩と
約６０〜２４０ｍＭの塩化ナトリウムと、を含み、
水性組成物は、約１．０１〜約１．０３ｇ／ｍＬの密度を有する。

いくつかの実施形態において、組成物は約１．０１〜約１．０３ｇ／ｍＬの密度を有する。

いくつかの実施形態において、水性組成物は約１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビンを含む。

水性組成物のいくつかの実施形態において、キャリアタンパク質は、約０．０６〜約６．０％（ｗ／ｖ）のアルブミン（例えば、０．６％（ｗ／ｖ））を含む。

水性組成物のいくつかの実施形態において、炭水化物は、約０．２〜約５％（ｗ／ｖ）のマンニトール、例えば、約２．０％（ｗ／ｖ）のマンニトールを含む。いくつかの実施形態では、水性組成物のｐＨ範囲は、例えば６．９〜７．１など、約５〜約８である。

いくつかの実施形態では、水性組成物の密度範囲は、約１．００１〜１．１ｇｒ／ｍＬである。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された方法の実施形態のいずれかによって調製されたマイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末が提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示された実施形態のいずれかによる噴霧乾燥トロンビン粉末を含むマトリックスが提供される。いくつかのそのような実施形態では、高密度（例えば、約０．１〜約１．０ｇ／ｃｍ^３、任意追加的に約０．４〜約０．６ｃｍ^３）の本明細書に開示された噴霧乾燥トロンビン粉末は、凍結乾燥され、粉砕されたトロンビン粉末と比較してより小さい体積の粉末をマトリックスのｃｍ^２毎に使用できるようにし、その結果マトリックス上の粉末の高さは低くなり、したがってより容易にマトリックス表面に付着する。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥粉末の調整された嵩密度は、約０．４６ｇ／ｃｍ^３であり、噴霧乾燥粉末のタップ密度は、約０．５８ｇ／ｃｍｍ^３である。

いくつかの実施形態では、マトリックスは、パッチ、任意追加的に生分解性パッチである。

いくつかの実施形態では、パッチは、織布を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、不織布を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、単一層を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、多層であり、任意追加的に２つ、３つ又はそれ以上の層を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、酸化再生セルロース、任意追加的に酸化再生セルロースマトリックス、及び不織布ＰＧ９１０繊維を含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、ゼラチンを含む。

いくつかの実施形態では、パッチは、例えば、傷などの出血している組織に貼付けられてもよく、ブタ脾臓モデルを使用すると３分未満の止血時間を得ることができる（即ち、出血の完全な停止までの時間）。

いくつかの実施形態では、パッチは、国際公開第２００７／１１７２３７号に開示された実施形態のいずれかを含む。

いくつかの実施形態では、マトリックスは、フィブリノゲン粉末を更に含む。

いくつかの実施形態では、フィブリノゲン粉末は、フリーズドライ／凍結乾燥によって調製される。そのようないくつかの実施形態では、結果として生じる凍結乾燥されたケークは、粉砕され得る。

いくつかの実施形態では、第１の成分として本明細書に開示された実施形態のいずれかによる噴霧乾燥トロンビン粉末を含む容器を含むキットが提供される。

いくつかの実施形態では、キットは、フィブリノゲン、ゼラチン、コラーゲン、酸化再生セルロース、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される第２の成分を更に含む。

いくつかの実施形態では、第２の成分は、粉末、ビーズ、顆粒、粒塊からなる群から選択される形態である。

いくつかの実施形態では、第２の成分は、溶液、ペースト、ジェル、及びスラリーからなる群から選択される形態である。

いくつかの実施形態では、フィブリノゲンは、粉末状である。

いくつかの実施形態では、フィブリノゲンは、例えば、液体又は凍結状態の溶液である。

いくつかの実施形態では、第１の成分及び第２の成分は、同じ容器内に一緒に提供される。

いくつかの実施形態では、第２の成分は、第１の成分と別の容器内に提供される。

いくつかの実施形態では、第２の成分は、スポンジ、パッド、パッチ、包帯、及びガーゼからなる群から選択される形態である。

本明細書で開示される噴霧乾燥トロンビン粉末、マトリックス、又はキットは、任意の治療目的で使用することができる。「任意の治療目的」なる用語は、被験者における任意の根治又は予防処置のことを指す。例示的な治療目的としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。組織又は器官（例えば、骨）に形成された穿孔の封止、血管における吻合、組織部（例えば、軟組織部）の接合、硬膜の異常（例えば、硬膜注入後の断裂及び漏れ、亀裂又は裂け目）の処置又は予防、出血の処置又は予防、肺切除後などの空気漏出の処置又は予防、腸穿孔後の異常の処置又は予防、任意の組織（例えば、子宮、食道、胃、膵臓、膵管、胆嚢、胆管、腸（小腸及び大腸を含む）、及び直腸）で実施される吻合処置後の異常の処置又は予防、任意の組織（例えば、子宮、食道、胃、膵臓、膵管、胆嚢、胆管、腸（小腸及び大腸を含む）、及び直腸）における手術後の漏出の処置又は予防、ステープル／縫合線における手術後の漏出の発生の予防又は減少（例えば、ステープル／縫合線などの不具合の少なくとも一部に本発明によるキットの成分、パッチ又は粉末の適用によって）、プロテーゼの強固な取り付けのため（例えば、ヘルニア手術中に）、ステープル／縫合線強化のため、肺胞気漏出を予防又は減少させるため、腎臓の欠陥の処置又は予防、フィスチュラの処置又は予防、心臓の欠陥（例えば、穿通性心臓外傷）の処置又は予防、人工血管プロテーゼの強化、並びに脳脊髄液漏出の処置又は予防。

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される（discloses）実施形態のいずれかによる噴霧乾燥トロンビン粉末、キット又はマトリックスは、止血の提供、漏出の封止、及び／又は構造の接合のために使用される。

いくつかの実施形態では、止血の提供、漏出の封止、及び／又は構造の接合の方法がそれを必要とする被験体で提供され、その方法は、本明細書に開示された実施形態のいずれかによる噴霧乾燥トロンビン粉末又はマトリックスの使用を含む。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態の更なる態様によると、トロンビンマイクロカプセルの調製で使用するのに好適な水性組成物が提供され、この水性組成物は、トロンビン、キャリアタンパク質、及び炭水化物を含み、トロンビン：キャリアタンパク質の比は、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５，０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：炭水化物の比は、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態の更なる態様によると、トロンビンマイクロカプセルを調製するための方法が提供され、この方法は、トロンビン：キャリアタンパク質の比が、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：炭水化物の比が、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである水溶液中でトロンビン、キャリアタンパク質及び炭水化物を混合する工程と、その水溶液を噴霧乾燥する工程とを含む。

別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味と同一の意味を有する。加えて、記載、材料、方法、及び実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。本発明を実施する上で、本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を使用することができる。

本明細書で使用するとき、「マイクロカプセル」という用語は、外側シェル及び内部体積を有する粒子であって、粒子の形状が実質的に球形又は円筒形であり、外側シェルの寸法が１〜１０００マイクロメートルの範囲にあり、少なくともトロンビン及び／又は少なくとも１つの賦形剤を含む粒子を指す。粒子が実質的に球形である実施形態では、その寸法は、直径である。粒子が実質的に円筒形である実施形態では、その寸法は、長さである。

外側シェルは、無傷の、破裂した、又は崩壊したものであり得る。

本明細書に開示されるマイクロカプセルは、溶質を含む液体（例えば、水性トロンビン組成物）の液滴を乾燥することによって調製される。

固体の微粒子は、微粒子化（典型的には、破壊、ふるい分け、粉砕、及び／又は研削などの物理的衝撃方法によって）によってより大きな固体粒子から生成され得るが、そのような微粒子化方法は、マイクロカプセルを生成するのに好適ではない。このように、いくつかの実施形態によると、マイクロカプセルは、より大きな粒子の微粒子化によって調製されない。

本明細書で使用するとき、「マイクロカプセルを含む粉末」という用語は、マイクロカプセルに加えて、マイクロメートルの範囲の、及び非マイクロメートルの範囲の直径／長さを有する他の粒子も含む粉末である（例えば、非晶質マイクロカプセルのくず（即ち、別個のシェルフラグメントに破裂した又は断裂したマイクロカプセル由来の別個のシェルフラグメント））。いくつかの実施形態では、本明細書の教示による「マイクロカプセルを含む粉末」は、少なくとも５０重量％のマイクロカプセル、またいくつかの実施形態では、開示されたパーセンテージ間の任意の範囲を含む、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、又は更には１００重量％のマイクロカプセルである。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルの外側シェルは、無傷である。

いくつかの実施形態では、「マイクロカプセルを含む粉末」は、例えば、５０〜５５重量％、５０〜６０重量％、５０〜６５重量％、５０〜７０重量％、５０〜７５重量％、５０〜８０重量％、５０〜８５重量％、５０〜９０重量％、５０〜９５重量％、５０〜９９重量％、５５〜６０重量％、５５〜６５重量％、５５〜７０重量％、５５〜７５重量％、５５〜８０重量％、５５〜８５重量％、５５〜９０重量％、５５〜９５重量％、５５〜９９重量％、６０〜６５重量％、６０〜７０重量％、６０〜７５重量％、６０〜８０重量％、６０〜８５重量％、６０〜９０重量％、６０〜９５重量％、６０〜９９重量％、６５〜７０重量％、６５〜７５重量％、６５〜８０重量％、６５〜８５重量％、６５〜９０重量％、６５〜９５重量％、６５〜９９重量％、７０〜７５重量％、７０〜８０重量％、７０〜８５重量％、７０〜９０重量％、７０〜９５重量％、７０〜９９重量％、７５〜８０重量％、７５〜８５重量％、７５〜９０重量％、７５〜９５重量％、７５〜９９重量％、８０〜８５重量％、８０〜９０重量％、８０〜９５重量％、８０〜９９重量％、８５〜９０重量％、８５〜９５重量％、８５〜９９重量％、９０〜９５重量％、９０〜９９重量％、９５〜９９重量％、９０〜１００重量％、９５〜１００重量％のマイクロカプセルなどの約５０重量％〜約１００重量％のマイクロカプセルを含む。

いくつかの実施形態では、「マイクロカプセルを含む粉末」は、約９０重量％〜約１００重量％のマイクロカプセルを含む。

本明細書で使用するとき、「キャリアタンパク質」という用語は、水溶液中のトロンビンと可逆的に、即ちトロンビン活性又は構造に影響を与えずに相互作用するタンパク質を指す。

本明細書で使用するとき、「水性トロンビン組成物」又は「水性組成物」という用語は、トロンビン及び少なくとも１つの追加の賦形剤を含む液体であって、少なくとも５０重量％の水分を含む液体を指す。好ましい実施形態では、溶液は、少なくとも９５重量％の水分及び５重量％以下のトロンビン及びそこに溶解された他の固体を含み、更により好ましい実施形態では、少なくとも９８重量％の水分及び２重量％以下のトロンビン及びそこに溶解された他の固体を含む。

本明細書でトロンビン活性に関して用いられる用語「収率」は、噴霧乾燥前の水性トロンビン組成物の活性に比べた、粉末の再構成時のトロンビンの生物活性のパーセンテージである。「トロンビン収率」及び「トロンビン活性回復」という用語は、互換的に使用される。

「トロンビン活性」及び「トロンビン生物活性」は、トロンビンが媒介する、タンパク質を含む異種基質の変換、例えば、フィブリノゲンのフィブリンへの変換に加えて、第ＶＩＩＩ因子の第ＶＩＩＩａ因子への変換、第ＸＩ因子の第ＸＩａ因子への変換、第ＸＩＩＩ因子の第ＸＩＩＩａ因子への変換、及び第Ｖ因子の第Ｖａ因子への変換を含むことを意味する。「異種基質」は、トロンビン以外の基質、好ましくはタンパク質基質である。いくつかの実施形態では、トロンビン活性は、フィブリノゲンのフィブリンへの変換を指す。

上述したように、本明細書の教示を実装する際に用いられるマイクロカプセルは、水性トロンビン溶液を噴霧乾燥することによって作製される。

いくつかの実施形態では、噴霧乾燥液滴は、「二流体ノズル噴霧」と呼ばれる、乾燥室の中に噴霧スプレーノズルを通じて水性トロンビン溶液をスプレーすること、そして次に所望のマイクロカプセルを形成するために熱い乾燥ガス流によって水分を液滴から蒸発させることによって形成される。本明細書の教示を実施するために、任意の好適な液滴サイズを使用することができる。

いくつかの実施形態では、液滴は、圧力ノズル噴霧によって形成され、スプレーは、開口部を通して溶液を押し流すことによって作製される。

いくつかの実施形態では、液滴は、遠心噴霧法によって形成され、スプレーは、回転ディスク内の溶液を送達することによって作製される。いくつかの実施形態では、形成された液滴は、１〜１０００マイクロメートルなどの１０００マイクロメートル以下の直径を有する。

当該技術分野において周知のように、液滴は、噴霧乾燥用に噴霧ガスの使用によって形成されてもよく、噴霧ガスは、例えば、約１５℃〜約３０℃の温度（例えば、室温（１８〜２５℃））で提供されてもよく、例えば、同軸状にかつ水性トロンビン組成物と同じ方向に噴霧ノズルを通して流れる。空気、窒素及びアルゴンを含む、任意の好適な不活性ガスを、噴霧ガスとして使用することができる。好ましくは、噴霧ガスは、乾燥しており、できるだけ少ない水分を含有し、いくつかの実施形態では、噴霧ガスは、最大約３０％の相対湿度を有する。

当該技術分野において周知のように、噴霧乾燥用に形成された液滴は、乾燥室内で乾燥ガスの中にスプレーされ得、そして搬出される。空気、窒素及びアルゴンを含む、任意の好適なガスを、約１００〜約１９０℃の範囲の温度で乾燥ガスとして使用することができる。好ましくは、乾燥ガスは、乾燥しており、最大約３０％の相対湿度を有するなどできるだけ少ない水分を含有する。詳細に後述されるように、典型的には、乾燥ガスは高温に加熱される。

噴霧乾燥のいくつかの実装では、噴霧乾燥粒子は、乾燥室の底部から回収され、粒子が約４〜約２４℃の温度で維持された冷却ガスと接触することによって冷却される冷却室を通じて移動される。空気、窒素及びアルゴンを含む、任意の好適なガスを、冷却ガスとして使用することができる。好ましくは、冷却ガスは、乾燥しており、最大約３０％の相対湿度などできるだけ少ない水分を含有する。いくつかの実施形態では、ガスの含水量は、約０．０００１％である。

市販のスプレードライ装置１０の一例が図１に示されており、装置は、スプレーノズル１４及び乾燥ガス導管１６を有する乾燥筒１２を備える。

スプレーノズル１４は近位端１８及び遠位端２０を有し、遠位端２０にスプレーノズル先端２２を備える。

液体導管２４は、噴霧乾燥される液体をスプレーノズル先端２２へと送達するために設けられており、この中を液体が通過する。

本明細書に記述される装置又は方法のいくつかの実施形態において、噴霧構成要素２５が、スプレーノズル先端２２の遠位端２０に設けられ、スプレーノズル先端２２には、遠位端を有する液体導管２４が、噴霧乾燥される液体をスプレーノズル先端２２へと送達するために設けられている。

いくつかの実施形態では、噴霧構成要素２５は噴霧ガス導管２６を備え、これは、噴霧ガスの流れを噴霧ガス出口から外へ導き、スプレーノズル先端から出る液体に接触させるためのものである。

いくつかの実施形態では、この液体は、噴霧構成要素２５の遠位端に位置する小さな開口部を通って高圧で押し出され、これにより圧力低下が生じ、これにより液体が液滴のスプレー（例えば微細液滴）へと変化する。よって、いくつかの実施形態において、噴霧構成要素［２５］は液体導管［２４］の遠位端に位置する開口部を備え、液体がこの開口部から外へ押し出されてスプレーを形成する。

いくつかの実施形態において、噴霧構成要素２５は回転ディスクを備え、このディスクの回転によって生じる遠心力によって、液体のスプレーが形成される。

乾燥ガス導管１６は、乾燥ガスを供給するための乾燥ガス出口２８を備え、乾燥ガスにより、ノズル先端２２から出る際に液体から形成されるスプレーを乾燥させ、これによって粉末を形成する。

生成された粉末は、サイクロン装置３０により乾燥ガスから分離され、サイクロン装置３０の底部で、例えば収集容器３２内に収集される。分離された乾燥ガスと粉末の経路が、それぞれ、３５及び３６として示されている。

いくつかの実施形態では、乾燥ガスより（then）低い温度を有する（例えば、室温以下）冷却ガスは、乾燥塔１２の下流に冷却ガス導管２９によって導入される。

いくつかの実施形態では、トロンビンへの熱損傷を予防する方法は、図２に示される液体導管２４及びノズル先端２２において、トロンビンが一旦過熱するのを防ぐことによる方法である。図２は、熱交換機構を含む従来技術のスプレーノズル１４を図示しており、冷水を循環させるための２本のチューブ、即ち、液体導管２４の周りに同心状に配置されている、冷水を導入するための第１のチューブ３４ａと、冷水を排出するための第２のチューブ３４ｂとを備え、冷水は、循環ポンプ（図示なし）を使用して第１のチューブ３４ａ内へ入り、第２のチューブ３４ｂから水槽へと出て、循環する。

本明細書で使用するとき、「噴霧ガス」という用語は、液体流から微細液滴を形成する低圧を形成する、液体溶液の流れと同方向に流れる（並流）ガスを指す。いくつかの実施形態では、噴霧ガスは、図１に示されるアトマイザーガス導管２６内に供給される。

本明細書で使用される用語「微細液滴」は、特定のスプレードライ条件下で乾燥ガスに接触すると乾燥されて粉末になり得る液滴を指すことができ、一方、大きな液滴は、同じ条件で乾燥しても粉末にはならなくて、代わりにスプレードライ装置の内壁に付着し、これが乾くとプロセス製品の喪失をもたらし、すなわち、質量収率の低減がもたらされることがある。いくつかの実施形態によると、「微細液滴」は、１ｍｍ以下の直径を有するものである。いくつかの実施形態によると、「大きな液滴」は、１ｍｍ超のサイズを有する液滴を指す。

本明細書で使用するとき、「乾燥塔」又は「乾燥室」という用語は、高温（約１００〜約１７０℃など）での乾燥ガスの流れによって実装される、液滴の乾燥が行われる塔を指す。いくつかの実施形態では、乾燥塔又は乾燥室は、図１で１２として示されるとおりである。

本明細書で使用するとき、「水性トロンビン組成物」という用語は、トロンビン及び溶質を含む溶液を指す。

本明細書で使用するとき、「乾燥ガス」という用語は、液滴に接触すると、その液滴を粉末／マイクロカプセルへと乾燥させるガスを指す。いくつかの実施形態では、乾燥ガスは、導管１６内に供給され、図１に示される乾燥ガス出口２８を備える。

本明細書で使用するとき、「冷却ガス」という用語は、噴霧乾燥機に入り、乾燥ガス流及び粉末の温度を下げるために粉体流と接触して乾燥ガス流と合流するガスを指す。いくつかの実施形態では、冷却ガスは、図１に示される導管２９内に供給される。

本明細書で使用するとき、「密度」という用語は、単位体積あたりの固体の重量である。密度は、液体、固体（例えば、粉末）の形状で測定することができ、ｇ／ｍＬ又はｇ／ｃｍ^３として測定することができる。粉末について、密度は、「調整された嵩密度」又は「タップ密度」であり得る。

粉末の嵩密度とは、タップされていない粉体試料の質量と、粒子間の空隙容量の寄与を含めたその粉体試料の体積との比である。

本明細書で使用するとき、「調整された嵩密度」という用語は、粉末をほぐして予備圧縮及び／又は過剰空気を除去するために粉末を移動させる（例えば、回転ブレードを使用して）調整工程を受けた大量の粉体試料の密度を指す。

本明細書で使用するとき、「タップ密度」という用語は、粉体試料が入っている器（例えば、容器）を機械的にタップした後に得られる増加した嵩密度を指す。

噴霧乾燥によって形成されたトロンビンマイクロカプセルは、血液凝固剤として使用されることがある。いくつかの実施形態では、トロンビンマイクロカプセルは、マトリックス、つまり、織布又は不織布のパッチなどの固形物体に物理的に関連している（即ち、組み込まれる又は結合される）。

本明細書において使用するとき、用語「含む（comprising）」、「含む（including）」、「有する」、及びその文法的変形は、記載される特徴、完成体、工程、又は構成要素を特定するものとして理解されるが、１つ以上の追加的特徴、完全体、工程、構成要素、又はこれらの群の追加を排除するものではない。これらの用語は、用語「〜からなる」、及び「〜から本質的になる」を包含する。

本明細書において使用するとき、不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、文脈が明確にそうでない旨を表さない限り、「少なくとも１つの」又は「１つ又は２つ以上の」を意味する。

本明細書で使用するとき、「約」という用語は、±１０％を指す。

フィブリノゲン及びトロンビンは場合により、初期血液組成物から調製され得る。血液組成物は、全血液、又は血液の一部、すなわち、血漿のような全血液の画分であり得る。フィブリノゲン及びトロンビンの起源は、自家であることが可能であるため、患者自身の血液から、プールされた血液又は血液分画から製造される。また、トロンビン及びフィブリノゲンを遺伝子組み換え法によって調製することも可能である。

本発明の一実施形態において、フィブリノゲンは、血漿由来のタンパク質溶液である生物学的有効成分（ＢＡＣ）を含み、場合により、トラネキサム酸等の抗線維素溶解薬剤及び／若しくはアルギニン、リシン、これらの製薬的に許容できる塩類等の安定剤、又はこれらの混合物を更に含む。ＢＡＣは、場合により、クリオプレシピテート、特に濃縮クリオプレシピテート由来である。

「クリオプレシピテート」という用語は、全血から調製される凍結血漿、回収された血漿、又は血漿瀉血により回収された元血漿から得られる、血液成分を指す。クリオプレシピテートは場合により、凍結した血漿を低温、通常は０〜４℃の温度で徐々に解凍すると得られ、結果としてフィブリノゲン及び第ＸＩＩＩ因子を含む沈殿物が形成される。沈殿物は、例えば、遠心分離によって収集し、１２０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１２０ｍＭのグリシン、９５ｍＭのアルギニン塩酸塩、１ｍＭの塩化カルシウムを含む緩衝液等の好適な緩衝液に溶解することができる。ＢＡＣの溶液は、場合により、例えば、米国特許第６，１２１，２３２号及び国際公開第９８３３５３３号に記載されるように、例えば、第ＶＩＩＩ因子、フィブロネクチン、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、ビトロネクチン等の追加の因子を含む。ＢＡＣの組成は、場合により、トラネキサム酸及びアルギニン塩酸塩等の安定剤を含む。ＢＡＣの溶液内のトラネキサム酸の量は、場合により、約８０〜約１１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。アルギニン塩酸塩の量は、場合により、約１５〜約２５ｍｇ／ｍＬの範囲である。

場合により、フィブリノゲン溶液は生理学的適合性を有するｐＨ値に緩衝される。緩衝液は、グリシン、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、及び溶媒としての注射用蒸留水を含む。グリシンは場合により、約６〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で組成物中に存在し、クエン酸ナトリウムは場合により、約１〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度で組成物中に存在し、塩化ナトリウムは、任意追加的に約５〜約９ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在し、塩化カルシウムは、任意追加的に約０．１〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度で存在する。

本発明の一実施形態において、フィブリノゲンは、例えば、ＢＡＣ組成物などの血液由来である。本発明の別の実施形態において、血液由来成分中のプラスミン及び／又はプラスミノゲンの濃度は、低減される。血液由来成分からのプラスミン及びプラスミノゲンの除去は、米国特許第７，１２５，５６９号及び国際公開第０２０９５０１９号に記載のように実行することができる。

本発明のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して、本明細書において記載される。図面と共に説明を読むことにより、本発明のいくつかの実施形態がどのように実施され得るかということが、当業者にとって明らかとなる。図面は、例示的な記載の目的のためであり、実施形態における構造の詳細を、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に示そうとするものではない。明確性のため、図面に示されるいくつかの物体は、縮尺通りではない。

図面の説明
（先行技術）噴霧乾燥装置の模式図である。 （先行技術）スプレーノズルの模式図である。 噴霧乾燥トロンビン粉末のトロンビン活性回復（％）に与えるトロンビン溶液組成物の影響を示すプロットである。 噴霧乾燥トロンビン粉末のトロンビン活性回復（％）及び含水量（％）に与える入口ガス温度の影響を示す線グラフである。 噴霧乾燥トロンビン粉末のトロンビン活性回復（％）及び含水量（％）に与える入口ガス流量の影響を示す線グラフである。

本発明は、そのいくつかの実施形態において、マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末、その調製方法、及びその使用に関する。

本明細書における教示の原理、使用法、及び実施は、添付の記載を参照してよりよく理解され得る。この記載を精査することにより、当業者は、過度な努力又は実験を行うことなく、本発明を実施することができる。

少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、理解されたいこととして、本発明は、その用途において、以下の説明に記載した各構成要素及び／又は方法の構造又は構成の詳細に必ずしも限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法によって実行又は実施することが可能である。本明細書において使用される表現及び用語は、記述的目的のためであり、限定としてみなされるべきではない。

下記結果セクションに実証されるように（実施例１、２及び図３を参照）、本明細書に開示される塩及びキャリアタンパク質の両方を含む再構成されたトロンビン組成物の実施形態は、比較的高いトロンビン活性回復（〜８０％、組成物６）を有する。噴霧乾燥後のトロンビン活性回復は、炭水化物、特にマンニトールなどの糖アルコールを更に含む（〜８５％、組成物７）再構成されたトロンビン組成物でより高く、及び再構成されたトロンビン組成物が比較的大量の塩化カルシウムを更に含む（〜９５％、組成物８）とき、更に高い。全ての条件が同じだとすると、より高いトロンビン活性回復が、比較的高いキャリアタンパク質／トロンビン比を有する組成物によって得られる（表２Ｂ及び３を参照）。

下記結果セクションに実証されるように、本明細書に開示されるキャリアタンパク質（例えば、アルブミン）及び炭水化物（例えば、マンニトールなどの糖アルコール）の両方を含む再構成されたトロンビン組成物の実施形態は、例外的に高いトロンビン活性回復（実施例２及び４を参照）を、意外にも更に高いトロンビン濃度（実施例６及び６）を有する。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、キャリアタンパク質及び炭水化物の混合が、トロンビンの構造及び力価を、とりわけ熱防御を提供することによって、維持するのに役立つことが現在考えられている。

本明細書に教示の実施形態によって提供されるトロンビン活性回復は、従来技術によって提供されるものよりも優れている。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３１５３０５号は、２５〜１０００ＩＵ／ｇの濃度を有する噴霧乾燥トロンビンを開示する。同等な実施例６は、本明細書の教示によるキャリアタンパク質を含むトロンビン組成物が、実質的により高いトロンビン活性回復を提供することを示す。

本明細書の教示による実施形態のうちいくつかの利点のうちいくつかは、高い質量及び力価収率かつ高濃度での活性トロンビン粉末の生成につながる、使用する噴霧乾燥条件の結果であると考えられている。いくつかの実施形態では、高レベルのトロンビン活性回復は、以下のうち少なくとも１つによって達成される：
１９０℃以下の温度の乾燥ガス（例えば、乾燥空気又は窒素）；少なくとも１：１０００のトロンビン溶液流量：噴霧ガス流量の比。即ち、１分あたり１ｍＬのトロンビン溶液を噴霧乾燥するとき、噴霧ガス流量は、好ましくは少なくとも１Ｌ／分である。
少なくとも１：４３，０００のトロンビン溶液流量：乾燥ガス流量の比。即ち、１分あたり１ｍＬのトロンビンを乾燥するとき、乾燥ガス流量は、好ましくは少なくとも４３Ｌ／分である。

具体的に、実施例８では１９０℃の乾燥ガス温度は、１．５％と低い含水量の噴霧乾燥トロンビン粉末を得た。実施例９では、高いトロンビン活性回復及び低い含水量の噴霧乾燥トロンビン粉末を得るには、入口ガス温度を約１７０℃以下に設定することが好ましいことが見られる。いくつかの実施形態では、トロンビン活性回復を維持しながら含水量を低減するために、乾燥ガス温度よりむしろ乾燥ガス流量が増加する。

意外にも、いくつかの実施形態では乾燥ガス流量の増加は、乾燥塔内のトロンビンの保持時間の減少にもかかわらず、結果として生じる乾燥トロンビン組成物の含水量の減少につながることがわかった。

増加した乾燥ガス流量は、乾燥粒子にかかる圧力を減少させ、その結果、蒸発の増加につながると考えられる。いずれか１つの理論に拘束されるものではないが、粉末が乾燥塔の底部に到達すると、温まり、粒子は、乾燥塔の内側部分及び乾燥塔からサイクロンへ粉体流を送達するチューブに付着する傾向になり、質量収率の低減につながることが着目される。この付着は、粉末がそのガラス転移温度を超える温度であるとき生じると予想され、ガラス転移温度は、粒子の表面を「弾性のある」又は性質において可塑性にさせる。乾燥塔の底部に冷却ガスを導入することは、したがって粒子が流れる温度を低下させ、そのため、質量収率が結果的に増加するように、粒子がガラス状又は弾性状態で存在し、粒子がシステムの内側部分に付着するのを防ぐように、そのガラス転移温度より下に粒子の表面温度を低下させると予想される。

実施例７に見られるように、乾燥した噴霧乾燥トロンビン粉末を提供した、特に低い乾燥ガス温度（１４０℃）で高い乾燥ガス流量（トロンビン溶液：乾燥ガス流量が１：９０００００）の実施形態は、粒径分布が狭く、トロンビン活性回復が高かった。

本明細書の教示によるトロンビン濃度が比較的高い噴霧乾燥トロンビン組成物の実施形態は、多数の利点を提供する。例えば、そのような組成物を含むフィブリンパッチを使用すると、形成されるフィブリン凝塊中のトロンビン濃度はより高く形成され、結果として凝塊内により多くのフィブリン繊維をもたらし、より大きな凝塊強度及び組織に対する付着力（実施例１０を参照）、並びにより迅速な凝塊形成（止血時間（ＴＴＨ）＜３分、実施例１１を参照）につながる。

本明細書の教示による噴霧乾燥トロンビン組成物の実施形態は、低温（即ち、２〜８℃）で貯蔵する必要なく又は凍結（即ち、−１８℃未満）しないで長時間室温で貯蔵され得る。

本明細書の教示による噴霧乾燥トロンビン組成物の流動性は、実施例１２に示されている。本明細書で使用するとき、「粉体流動性」という用語は、パウダーレオメーター（ＦＴ４ ｐｏｗｄｅｒ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｆｒｅｅｍａｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））で、上昇移動モードでブレードを移動させることによって測定される、粉体の指定した条件のセットの下での流れやすさを指す。そのような条件の例としては、粉末上の圧力、粒子表面の粗さ、粉末周囲の空気の湿度、及び粉末がそれを通して又はそこから流れる装置が挙げられる。流動性は、移動した粉末重量で除算した、粉末組成物を移動するのに必要なエネルギーと表現される。実証された組成物の低い比エネルギーは、組成物の移動に必要なエネルギーが少ないことを示す。実際に、製造プロセス中に、低い比エネルギーの組成物は、組成物を移動させるのに使用される機械装置（例えばオーガードーザ（auger dozer））の動きを妨げ得るインターロック及び摩擦を生じにくい。

加えて、噴霧乾燥トロンビンマイクロカプセル組成物を調製するための、本明細書の教示による噴霧乾燥プロセスの実施形態を使用する本明細書の教示による水性トロンビン組成物フィードの実施形態の乾燥は、結果として高密の粒子を有する高濃度トロンビン組成物の生成につながる。表１７（実施例１２）に示されるように、同等な凍結乾燥された組成物の０．３７ｇ／ｍＬの調整された嵩密度及び０．４８ｇｒ／ｍＬのタップ密度と比較して、本明細書の教示の実施形態による噴霧乾燥トロンビン組成物の調整された嵩密度（即ち、例えばタッピングによって、粒子間のエアギャップが除去されていない粉末密度）は、０．４６ｇ／ｍＬであり、タップ密度（例えば、タッピングによる、粒子間のエアギャップの除去後の粉末密度）は、０．５８ｇ／ｍＬであった。

材料及び方法
材料
トロンビン（ＮＤＣ Ｎｏ．６３７１３−４６０、Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．，（Ｉｓｒａｅｌ）製）。下記の実験では、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌａｎｔ（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．（Ｉｓｒａｅｌ）製）におけるようなトロンビン構成成分を用いた。

ヒト血清アルブミン（Ｐｌａｓｂｕｍｉｎ ２５、水性希釈剤中のアルブミンの２５％滅菌溶液、ＮＤＣ ｎｏ．１３５３３−６９２−２０）は、Ｇｒｉｆｏｌｓ ＵＳＡ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ（Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）より入手した。

Ｄ−マンニトール（カタログ番号４４３９０７）、酢酸ナトリウム三水和物（カタログ番号１３７０１２１０００）、塩化カルシウム二水和物（１３７１０１５０００）は、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ））より入手した。

使用するまで、トロンビンは、約−１８℃の温度を維持するために標準的な実験室用の冷凍庫セットに貯蔵し、ヒト血清アルブミン及び全ての固体材料は、３０℃を超えない室温（約２４℃）で貯蔵した。

装置
噴霧乾燥機。４Ｍ８−ＴｒｉＸ噴霧乾燥機を使用した（ＰｒｏＣｅｐＴ ｎｖ（Ｚｅｌｚａｔｅ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）製）。

方法
トロンビン溶液の調製：
各試験について、所望される量の凍結トロンビン溶液（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｉｓｒａｅｌ））を、密封したボトル内で室温まで温めた。温めたトロンビンを３回蒸留した水に所望の濃度（下表を参照）で溶解することによって、トロンビン溶液を作製した。

噴霧乾燥：
調製されたトロンビン溶液をシリンジに引き込み、噴霧乾燥機のシリンジポンプ内部に定置した。フィードバルブを閉じて所望される流量にシリンジポンプをセットした。

シリンジポンプのフィードバルブを閉じている間に、噴霧乾燥機を作動させ、所望される噴霧ガス流量、乾燥ガス流量、乾燥ガス温度、冷却ガス流量及びサイクロンガス流量をセットした。

冷却ガス流量及び温度は、乾燥塔の層流を乱さないが、粉末がガラス部分に粘着するのを防ぐためにガス流の温度を組成物のガラス転移温度より下に下げるように選択した。

噴霧乾燥機を、実際に測定されたパラメータの値がセットしたレベルに達し、一定を維持した定常状態に達するまで実行させた。次にフィードバルブを開放し、トロンビン溶液を、フィード入口を通してスプレーノズルに流すことを可能にして、次に乾燥塔内で乾燥される小さな液滴に噴霧ガス流によって噴霧する。噴霧乾燥トロンビン粉末を形成し、噴霧乾燥機のサイクロンの粉末出口内で収集した。

サイクロンから回収された噴霧乾燥トロンビン粉末を、３０％未満の相対湿度で除湿器内で計量し、１００〜２００ｍｇの試料に分割した。各試料を個々にプラグで試験管に密閉し、評価までＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（Ｂｅｍｉｓ，Ｏｓｈｋｏｓｈ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ））で密閉した。

噴霧乾燥トロンビン粉末の特性評価
トロンビン活性回復（噴霧乾燥前のトロンビン活性と比較して）、含水量、粒径分布、総及び凝固性タンパク質、密度（調整された嵩及びタップ）、流動性並びに質量収率を含むトロンビン活性を測定することによって、噴霧乾燥トロンビン粉末を特性化した。

トロンビン活性測定
改善されたＥｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ａｓｓａｙ（０９０３／１９９７）法に従って、溶液中のトロンビン凝固活性を測定することによる凝固時間アッセイを使用して、水性トロンビン溶液のトロンビン活性を測定した。簡潔に、トロンビン標準品（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｔａｇｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ，（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）製のＦｉｂｒｉ−Ｐｒｅｓｔ（登録商標）２）と０．１％フィブリノゲン溶液（Ｏｍｒｉｘ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．，（Ｉｓｒａｅｌ））を様々な異なるトロンビン濃度（４、６、８、及び１０ＩＵ／ｍＬ）で混合し、凝固測定装置（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｓｔａｇｏ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．Ｌｔｄ．，（Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）製のＳＴａｒｔ（登録商標））を使用して各試料が凝固するのにかかる時間を測定することによって、トロンビン濃度対凝固時間の検量線を作成した。

各分析について、約３５ｍｇ噴霧乾燥トロンビンの試料を２回蒸留した水１ｍＬに溶解した（〜１０００ＩＵ／ｍＬのトロンビン活性を有するトロンビン溶液を得るため）。この溶液を、１：２００に希釈して、〜５ＩＵ／ｍＬの力価を有する溶液を生成した）。凝固測定装置内で４０μＬの希釈したトロンビン溶液を１６０μＬの０．１％フィブリノゲン溶液と混合した。試料の凝固時間を測定し、検量線を参照してトロンビン活性を外挿した。

含水量測定
水含有率の測定は、カールフィッシャー容量滴定法（ＫＦＴ）を用いて行い、この方法は、米国薬局方のアッセイ（ＵＳＰ ２７，＜９２１＞，Ｐ．２３９８〜２３９９）に基づいている。滴定の前に、乾燥メタノール約１０ｍＬを約１００〜約２００ｍｇの噴霧乾燥トロンビン粉末に添加することによって、噴霧乾燥トロンビン粉末から水分を抽出した。

粒径分布測定
光散乱の原理を使用して、液体中に懸濁した粒子のサイズ分布を測定する。測定を粒径分析器ＬＳ １３ ３２０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．，（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ））を使用して実行した。ＬＳ １３ ３２０によって測定されたパターンは、試料中の各構成粒子によって散乱したパターンの総和である。ＬＳ １３ ３２０は、光学ベンチ並びに化学的耐性のある液体セル及び懸濁した粒子の均一混合を保持するための撹拌子を含むマイクロリキッドモジュール（ＭＬＭ）からなる。システムは、少量の懸濁流体（１２ｍＬ）で機能するように設計されている。１００〜２００ｍｇの噴霧乾燥トロンビンの粉体試料を、１０ｍＬのハイドロフルオロエーテル（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｔｗｏ Ｈａｒｂｏｒｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）製のＨＦＥ−７０００）に懸濁させた。試料をマイクロリキッドモジュール（ＭＬＭ）内に定置し、粒径分布を測定した。

総タンパク質及び凝固性タンパク質
総タンパク質試験を使用して、フィブリンシーラントパッチ試料中のタンパク質の総量を測定した。粉末をフィブリンシーラントパッチから抽出し、試料中のタンパク質を溶解することができる可溶化溶液中に溶解する。検量線とのローリー法によってタンパク質濃度を測定する。

破砕性
フィブリノゲン及びトロンビン粉末を含むパッチの破砕性は、パッチの試料に力が加えられた後でフィブリンシーラントパッチからの粉末の剥離又は崩壊の程度を測定することを意図した。破砕性を測定するために、パッチを特定のサイズに切断し、試料の重量を測定した。試料は、バイアル内部に試料を定置し、一定の高さのチューブを通してゴムストッパの上にバイアルを落下させることによる、定められた衝撃力を受けた。パッチ試料を計量することによって粉末損失の量を決定し、試料の重量減少のパーセンテージを計算した。

組織剥離
５０００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｔｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ，Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を使用してフィブリンシーラントパッチの子ウシ真皮組織基質に対する接着強度を測定した）。接着強度を測定するために、フィブリンパッチを真皮の表面に貼り付け、生理食塩水で湿らせた。力対距離曲線の下の積分を計算することによって、子ウシ真皮組織からのフィブリンパッチの９０度剥離試験を続けて実施するのに必要な平均力を測定した。

引張り強度
横の幅２５ｍｍ、中央の幅１５ｍｍ及び長さ１０２ｍｍを有するドッグボーン形状のフィブリンパッチ試料の引張り強度を測定した。試料をインストロン把持部間に定置した（５０００ Ｓｅｒｉｅｓ Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｔｅｎｓｉｏｍｅｔｅｒ，Ｉｎｓｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．（Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ））。クロスヘッドを予め定められた３０５ｍｍ／分という一定の伸展速度で移動した。この試験は、３０％のピーク荷重の降下が得られ断裂発生を示した時点で終了した。

密度（調整された嵩、タップ）
パウダーレオメーター（ＦＴ４ ｐｏｗｄｅｒ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｆｒｅｅｍａｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））を使用して、調整された嵩密度、タップ密度、及び比エネルギーを測定した。２３．５ｍｍブレードを有する２５ｍｍの器内で２５０タップにて試験を実行した。

「密度」という用語は、単位体積あたりの固体の重量を指す。密度は、液体、固体（例えば、粉末）又はガスの形態で測定することができる。粉末について、密度は、「調整された嵩密度」又は「タップ密度」であり得る。粉末の嵩密度とは、タップされていない粉体試料の質量と、粒子間の空隙容量の寄与を含めたその粉体試料の体積との比である。

本明細書で使用するとき、「嵩密度」という用語は、既知の体積サイズにおける既知の重量の大量の粉体試料の密度を指す。

本明細書で使用するとき、「調整された嵩密度」という用語は、粉末をほぐして予備圧縮又は過剰空気を除去するために回転ブレードを使用して粉末を静かに移動させる調整工程を受けた大量の粉体試料の密度を指す。

本明細書で使用するとき、「タップ密度」という用語は、粉体試料が一定回数タップされ、その後密度が測定される調整された嵩密度を指す。

流動性（比エネルギー）
ＦＴ４パウダーレオメーター（ＦＴ４ ｐｏｗｄｅｒ ｒｈｅｏｍｅｔｅｒ，Ｆｒｅｅｍａｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））を使用して、トルク（半径方向抵抗）及び荷重（垂直抵抗）と表現される、粉体がレオメーターブレードに及ぼす抵抗（流れに対する粉体の抵抗）を測定した。

比エネルギー（流動性）＝［距離×（トルク＋荷重）］／分裂質量
式中、距離は、上昇移動モードでブレードによって移動した距離を指す。

本明細書で使用するとき、「分裂質量」という用語は、測定中に移動された粉末の質量を指す。

後述の実施例では、試験条件を次のとおりとした：−５度のヘリックス及び１００ｍｍ／秒のブレード先端速度。２５ｍＬの試料体積を使用した。

実施例１：噴霧乾燥中にトロンビン溶液組成物がトロンビン活性の維持に与える影響
噴霧乾燥中に溶液中の賦形剤（複数可）がトロンビン活性の維持に与える影響を試験するために、様々なトロンビン溶液を調製した（異なる塩及び／又は炭水化物及び／又はタンパク質を含む）。

そのような８種の異なるトロンビン溶液を表１に示すように調製した：

組成物１〜８を、以下のパラメータを使用して上述のように噴霧乾燥した：
１．トロンビン試料流量：４００ｍＬ／時間；
２．噴霧ガス流量：７Ｌ／分；
３．乾燥ガス（乾燥空気）流量：６００Ｌ／分；
４．乾燥ガス（乾燥空気）温度：１４０℃；
５．冷却ガス（乾燥空気）流量：１００Ｌ／分；
６．サイクロンガス（乾燥空気）流量：１５０Ｌ／分。

サイクロンから回収後、各噴霧乾燥トロンビン組成物（賦形剤を有する乾燥したトロンビン）を親溶液と同じ濃度まで水中に再構成した。それぞれの再構成された溶液のトロンビン活性を、対応する親溶液のものと比較した。相対活性を図３のグラフに示す。

図３に示されるように、塩のみを含む再構成された組成物（組成物１〜３）は、噴霧乾燥後のトロンビン活性回復が比較的低かった（最大２５％）。塩及び糖アルコール（例えば、マンニトール）で再構成された組成物は、適度の噴霧乾燥後のトロンビン活性回復を有した（〜５０％、組成物４、５）。塩及びタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）で再構成された組成物は、噴霧乾燥後のトロンビン活性回復が比較的高かった（〜８０％、組成物６）。塩、糖アルコール（例えば、マンニトール）、及びタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ＨＳＡ）で再構成された組成物は、噴霧乾燥後のトロンビン活性回復が非常に高く（〜８５％、組成物７）、トロンビン組成物が塩、糖アルコール及びタンパク質を相対的に大量の塩化カルシウムと共に含んだときに更に高くなった（トロンビン活性回復〜９５％、組成物８）。

実施例２：トロンビン溶液の噴霧乾燥中にトロンビン及びヒト血清アルブミン（キャリアタンパク質）濃度がトロンビン活性の維持に与える影響
異なる濃度のトロンビン及びキャリアタンパク質として機能するアルブミンを有する１５種のトロンビン溶液を表２に示すように調製した。

組成物９〜２３を上述のように噴霧乾燥した。上述のように、噴霧乾燥後、各噴霧乾燥トロンビン組成物の３５ｍｇ試料３個を、親溶液と同じ濃度まで水中に再構成した。それぞれの再構成された溶液のトロンビン活性を２回測定し、対応する親溶液のものと比較し、各溶液について合計６個の測定値を得た。平均のトロンビン活性回復を表２に示す。

表２ｂ（アルブミン／トロンビン（ｇ／ＩＵ）比に従って低から高まで分類した）に見ることができるように、親溶液におけるアルブミン重量対トロンビン活性の比、及び噴霧乾燥後のトロンビン活性回復に与える影響を示す追加のパラメータを計算した。示されたトロンビン活性回復は、平均±標準偏差を表す。

この結果は、組成物２１のみを異常値として最も高いトロンビン活性回復は、アルブミン対トロンビンのレベルが比較的高い組成物（表２ｂ）で得られることを示す。しかしながら、組成物１１及び１２に対して得られる大きなトロンビン活性回復の変動、並びに組成物２２及び２３の比較的低いトロンビン活性回復によって見ることができるように、アルブミン対トロンビンの比率が高いことは、噴霧乾燥後の高いトロンビン活性回復を保証するものではない。

実施例３：噴霧乾燥中にカゼイン（キャリアタンパク質）濃度がトロンビン活性の維持に与える影響
表３に示すように、異なるカゼイン（キャリアタンパク質）濃度を有する４種のトロンビン溶液の組成物を調製した。

溶液２４〜２７を上述のように噴霧乾燥した。上述のように、噴霧乾燥後、各噴霧乾燥トロンビン組成物の３５ｍｇ試料３個を、親溶液と同じ濃度まで水中に再構成した。それぞれの再構成された溶液のトロンビン活性を２回測定し、対応する親溶液のものと比較し、各溶液について合計６個の測定値を得た。得られたトロンビン活性回復を表３に示す。カゼインで得られた結果は、アルブミンで得られた結果と類似しており、高いトロンビン活性回復は、キャリアタンパク質対トロンビンの比が高いときに得られるが、組成物２７においてトロンビン活性回復の高い分散に見ることができるように、このことは、高いトロンビン活性回復を保証するものではないことを意味している。

実施例４：噴霧乾燥中に炭水化物タイプ及び濃度がトロンビン活性の維持に与える影響
表４〜８に示されるように、異なるトロンビン濃度、炭水化物タイプ、及び炭水化物濃度を有し、キャリアタンパク質を含め、又は含めずに２５種のトロンビン溶液を調製した。

組成物２８〜５２を噴霧乾燥した。試料を回収し、上述のように水中に再構成し、それぞれ再構成された溶液のトロンビン活性を、対応する親溶液のものと比較した。相対活性を対応の表４〜８に示す。

結果は以下を示している。
表４：糖アルコール（マンニトール）のみのトロンビン溶液への添加は、噴霧乾燥中にトロンビン活性を維持するのに十分ではなかった。

表５及び表６：二糖類（表５ではトレハロース、表６ではスクロース）のみのトロンビン溶液への添加は、噴霧乾燥中にトロンビン活性を維持するのに十分ではなかった。しかしながら、二糖類をキャリアタンパク質（アルブミン）と共に添加すると、トロンビン活性回復でかなりの増加があった。

表７及び表８：多糖類（表７ではデンプン、表８ではマルトデキストリン）のみのトロンビン溶液への添加は、噴霧乾燥中にトロンビン活性を維持するのに十分ではなかった。

実施例５：噴霧乾燥中に一定のトロンビン対ヒト血清アルブミン（キャリアタンパク質）のモル比を有するトロンビン濃度がトロンビン活性の維持に与える影響
表９に示されるように、異なるトロンビン及びアルブミン濃度を有する３種のトロンビン組成物を調製し、３種の溶液全てにおいてトロンビン対アルブミンのモル比は、１：６．４であった。

組成物５３〜５５の試料を噴霧乾燥した。試料を回収し、上述のように水中に再構成し、それぞれ再構成された溶液のトロンビン活性を、対応する親溶液のものと比較した。トロンビン活性回復を表９に示す。３種の再構成された溶液のトロンビン活性は、ほぼ同じで、トロンビン活性回復が低い（組成物５３及び５５）又はトロンビン活性回復の分散が高い（組成物５４）のいずれかであったことがわかる。

実施例６：噴霧乾燥中にトレハロース（二糖類）がトロンビン活性の維持に与える影響
米国特許出願公開第２０１２／０３１５３０５号は、トレハロースを含むトロンビン組成物の噴霧乾燥を開示しており、９７％のトロンビン活性回復を報告している。

（トロンビンの供給源が異なっていたこと及び噴霧乾燥機が異なるタイプのものであったことを除き）米国特許出願公開第２０１２／０３１５３０５号に記載されたものと類似した溶液５６及び５７を、表１０に示されるように調製した。更に、トレハロース及びタンパク質（ヒト血清アルブミン）を含む新しいトロンビン溶液５８を調製した。

組成物５６〜５８を、この公開に従って類似の噴霧乾燥条件で噴霧乾燥した。試料を回収し、水中に再構成し、それぞれ再構成された溶液のトロンビン活性を、対応する親溶液のものと比較した。トロンビン活性回復を表１０に示す。

結果は、米国特許出願公開第２０１２／０３１５３０５号に報告されたものに反して、溶液５６及び５７が６５％未満のトロンビン活性回復を示したことを示す。しかしながら、本明細書の教示のいくつかの実施形態による組成物５８におけるキャリアタンパク質（ヒト血清アルブミン）の添加は、トロンビン活性回復でかなりの増加につながった。

実施例７：好ましいトロンビン組成物の噴霧乾燥プロセス及び生産物特性評価
表１１に示されるように、実施例１の組成物８に基づいて、水中にトロンビン、アルブミン、マンニトール、アセテート、カルシウム、及び塩化ナトリウムからなる３リットルの組成物５９を調製した。

噴霧乾燥機のパラメータを以下に設定した。
トロンビン試料流量：４００ｍＬ／時間；噴霧ガス流量：７Ｌ／分；乾燥ガス流量：６００Ｌ／分；乾燥ガス温度：１４０℃；冷却ガス流量：１００Ｌ／分；サイクロンガス流量：１３０Ｌ／分；二流体ノズル（次の先端直径を有する）：０．４ｍｍ。

３リットルの組成物５９を上述のように噴霧乾燥した。噴霧乾燥中に、様々な噴霧乾燥パラメータの実数の値を１分毎に記録した。６３．２５ｇの噴霧乾燥組成物を、ボトル＃１に指定された２００ｍＬのガラスボトルに収集し、ボトル＃１が満杯になると、４８．４１ｇの噴霧乾燥組成物をボトル＃２に指定された２００ｍＬのガラスボトルに収集した。乾燥組成物で満たした後、ボトルを迅速にキャップし、分析を実施するまでＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）で密封した。

測定された噴霧乾燥パラメータ並びに噴霧乾燥トロンビン組成物の属性の平均は、表１２に示されるとおりであった。

得られた噴霧乾燥トロンビン粉末は、狭い粒径分布で乾燥しており、最も重要なことに、親溶液のトロンビン活性を維持した。

実施例８：乾燥ガス温度が噴霧乾燥トロンビンの属性に与える影響
好ましいトロンビン組成物（組成物８）を、処理間で乾燥ガス温度だけを変更すると、いくつかの噴霧乾燥処理で噴霧乾燥した。
トロンビン組成物流量：７ｍＬ／分
噴霧ガス流量：７Ｌ／分
乾燥ガス流量：３００Ｌ／分
乾燥ガス温度：１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、及び１９０℃
冷却ガス流量：１５０Ｌ／分
サイクロンガス流量：３００Ｌ／分

異なる乾燥ガス温度による噴霧乾燥トロンビン組成物の乾燥した試料をサイクロンから収集し、対応の再構成された溶液のトロンビン活性回復を上述のように測定した。トロンビン活性の結果を、試料の含水量と共に図４に示す。

図４に示されるように、１７０℃以上の乾燥ガス温度で、より低いトロンビン活性を測定した。より低い乾燥ガス温度（例えば、１７０℃以下）で、高いトロンビン活性が観察された。噴霧乾燥トロンビン組成物の含水量は、乾燥ガス温度の増加とともに減少した。１００℃の温度で、約４．５％の含水量が観察された。最大１９０℃までの温度の増加は、１．５％と低い含水量の噴霧乾燥トロンビン粉末を得た。

実施例９：乾燥ガス流量が噴霧乾燥トロンビンの属性に与える影響
好ましいトロンビン組成物（組成物８）を、処理間で乾燥ガス流量だけを変更すると、いくつかの噴霧乾燥処理で噴霧乾燥した。
トロンビン組成物流量：７ｍＬ／分
噴霧ガス流量：７Ｌ／分
乾燥ガス流量：３００、３５０、４００、４５０、５００、及び５５０Ｌ／分
乾燥ガス温度：１５５℃
サイクロンガス流量：６００Ｌ／分の噴霧乾燥機の総流量へと補完する流量（即ち、３００、２５０、２００、１５０、１００、及び５０Ｌ／分）。

乾燥噴霧乾燥トロンビンの試料を、サイクロンから収集し、対応の再構成された溶液のトロンビン活性回復を上述のように測定した。トロンビン活性の結果を図５に示す。

図５に見られるように、試験された乾燥ガス流量の全てで、高いトロンビン活性が観察された。噴霧乾燥トロンビンの含水量は、乾燥ガス流量の増加とともに減少した。３００Ｌ／分のガス流量で、約３．５％の含水量が観察された。最大５５０Ｌ／分までの乾燥ガス流量の増加は、２％と低い含水量を有する噴霧乾燥トロンビン粉末を得た。総合すれば、この結果は、高いトロンビン活性回復及び低い含水量を有する噴霧乾燥トロンビン粉末を得るためには、一定の制限、例えば、最大約１７０℃までにのみ入口ガス温度を上昇させることが望ましいことを示している。意外にも、噴霧乾燥トロンビン活性回復を損なわずに噴霧乾燥粉末の含水量を減少させるために、乾燥ガス温度を上昇させる前に乾燥ガス流量を最初に増加させることが推奨される。

実施例１０：凍結乾燥粉砕されたＢＡＣ２及び噴霧乾燥トロンビンを用いたフィブリンパッチの生産物
実施例１に記載したトロンビン組成物８を、実施例１に記載した条件下で噴霧乾燥した。サイクロンから回収される、結果として生じる噴霧乾燥トロンビン粉末を、凍結乾燥され粉砕されたＢＡＣ２と共に使用して、国際公開第２００７１１７２３７号に記載されたフィブリンパッチを生成した。

フィブリンパッチの特性を表１３に示すように分析した。

フィブリンシーラントパッチの特性を表１４に示すように分析した。

噴霧乾燥トロンビン粉末で作製されたフィブリンシーラントパッチが、低い含水量（２．１％）及び高いトロンビン活性（３６±２．７ＩＵ／ｃｍ^２）を有することがわかった。

組織剥離試験では、組織からパッチを剥離するのに必要な力を測定することによって真皮組織基質に対する濡れたフィブリンシーラントパッチの接着強度を測定した。噴霧乾燥トロンビン組成物で作製されたパッチは、高い接着性を呈した。

実施例１１：フィブリンシーラントパッチの生体内有効性
実施例１０に記載したフィブリンシーラントパッチの止血時間（ＴＴＨ）を測定した。

類似のサイズ及び重量の２頭のブタに外科的手順全体の間麻酔をかけ、脾臓を外科的に露出させた。３ｍｍ深さで１５ｍｍ長さの５つの傷を、適切な刃を使用して２つの脾臓の１つずつに作製し、各傷を覆うようにフィブリンパッチを貼り付けた。３分後の結果が表１５に見られ、１０分後が表１６に見られ、ここで「チェック」は、完全な止血を示す。

表１５及び表１６に見ることができるように、パッチは、３分以内に１００％の止血を達成し、再出血は、１０分後に観察されなかった。

実施例１２：噴霧乾燥トロンビン組成物の特性評価
実施例１のトロンビン組成物８を、実施例１に記載した条件下で噴霧乾燥、又は凍結乾燥のどちらかを行った。表１７に示されるように、結果として生じた２種の乾燥トロンビン粉末を、嵩密度、タップ密度、及び比エネルギーについて分析した（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ（ＵＳ））。

表１７に示された結果は、噴霧乾燥トロンビン粉末が、凍結乾燥されたトロンビン粉末より密度が高いことを示す。表１７の結果はまた、噴霧乾燥トロンビン粉末が、流動性について凍結乾燥されたトロンビン粉末より低い比エネルギーを有し、噴霧乾燥トロンビンがより容易に流れることを意味することも示す。実際に、噴霧乾燥トロンビン粉末は、例えば、移動装置、送り機構及び管の目詰まりのリスクを低減するなど、機械的なインターロック及び機械の摩擦を生じにくい。

〔実施の態様〕
（１） マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末であって、
トロンビンと、キャリアタンパク質と、炭水化物と、を含み、トロンビン：キャリアタンパク質の比が、約０．８５ＩＵ：１ｍｇ〜６６，８７５ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：炭水化物の比が、０．７５ＩＵ：１ｍｇ〜２６，７５０ＩＵ：１ｍｇである、噴霧乾燥トロンビン粉末。
（２） トロンビン：キャリアタンパク質の比が、約１１０ＩＵ：１ｍｇ〜約２８５ＩＵ：１ｍｇ、任意追加的に約１２９ＩＵ：１ｍｇ〜約２１９ＩＵ：１ｍｇである、実施態様１に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（３） 前記キャリアタンパク質が、アルブミンを含む、実施態様１又は２に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（４） 前記炭水化物が、糖アルコール又は糖類である、実施態様１〜３のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（５） 前記キャリアタンパク質がアルブミンであり、前記炭水化物がマンニトールであり、トロンビン：アルブミンの比が、約０．８５ＩＵ：１ｍｇ〜６６，８７５ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：マンニトールの比が、０．７５ＩＵ：１ｍｇ〜２６，７５０ＩＵ：１ｍｇである、実施態様１〜４のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。

（６） トロンビン：アルブミンの比が、約１１０ＩＵ：１ｍｇ〜約２８５ＩＵ：１ｍｇ、任意追加的に約１２９ＩＵ：１ｍｇ〜約２１９ＩＵ：１ｍｇである、実施態様５に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（７） トロンビン：マンニトールの比が約４０ＩＵ：１ｍｇ〜約６４ＩＵ：１ｍｇである、実施態様５又は６に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（８） 約０．００１％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗのトロンビンを含む、実施態様１〜７のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（９） 約３％ｗ／ｗ未満の水分を含む、実施態様１〜８のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
（１０） 約５〜約１３μｍのＤ５０、及び約１５〜約２５μｍのＤ９０の粒径分布を有する、実施態様１〜９のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。

（１１） トロンビンマイクロカプセルの調製で使用するのに好適な水性組成物であって、前記水性組成物が、
トロンビンと、キャリアタンパク質と、炭水化物と、を含み、トロンビン：キャリアタンパク質の比が、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５，０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：炭水化物の比が、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである、水性組成物。
（１２） トロンビンマイクロカプセルを調製するための方法であって、前記方法が、水溶液中でトロンビン、キャリアタンパク質、及び炭水化物を混合する工程であって、トロンビン：キャリアタンパク質の比が、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：炭水化物の比が、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである、工程と、
前記水溶液を噴霧乾燥する工程と、を含む、方法。
（１３） 前記噴霧乾燥する工程が、
噴霧乾燥装置の中に前記水溶液を導入することと、
噴霧ガス流を使用することによって前記装置に導入された前記水溶液から液滴を生成することと、
乾燥ガス流によって前記液滴から水分を蒸発させることと、
それによってトロンビンマイクロカプセルを調製することと、を含む、実施態様１２に記載の方法。
（１４） 前記水溶液が、
約８００〜約１２００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、
約０．５〜約０．６５％ｗ／ｖのキャリアタンパク質と、
約１．８５〜約２．０５％ｗ／ｖの炭水化物と、
約３８〜約４２ｍＭのカルシウムと、
約１８．０〜約２０．０ｍＭの酢酸塩と、
約６０〜２４０ｍＭの塩化ナトリウムと、を含み、
前記溶液が、約１．０１〜約１．０３ｇ／ｍＬの密度を有する、実施態様１２又は１３に記載の方法。
（１５） 実施態様１２〜１４のいずれかに記載の方法によって調製された噴霧乾燥トロンビンマイクロカプセル。

（１６） 実施態様１〜１０のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末及び／又は実施態様１５に記載の噴霧乾燥トロンビンマイクロカプセルを含む、マトリックス。
（１７） フィブリノゲン粉末を更に含む、実施態様１６に記載のマトリックス。
（１８） 前記フィブリノゲン粉末がフリーズドライによって調製されている、実施態様１７に記載のマトリックス。
（１９） 実施態様１〜１０のいずれかに記載の噴霧乾燥トロンビン粉末及び／又は実施態様１５に記載の噴霧乾燥トロンビンマイクロカプセルを含む、容器を含むキット。

Claims (19)

1. マイクロカプセルを含む噴霧乾燥トロンビン粉末であって、
   トロンビンと、キャリアタンパク質と、糖アルコールと、を含み、トロンビン：前記キャリアタンパク質の比が、約０．８５ＩＵ：１ｍｇ〜６６，８７５ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：前記糖アルコールの比が、０．７５ＩＵ：１ｍｇ〜２６，７５０ＩＵ：１ｍｇである、噴霧乾燥トロンビン粉末。
2. トロンビン：前記キャリアタンパク質の比が、約１１０ＩＵ：１ｍｇ〜約２８５ＩＵ：１ｍｇ、任意追加的に約１２９ＩＵ：１ｍｇ〜約２１９ＩＵ：１ｍｇである、請求項１に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
3. 前記キャリアタンパク質が、アルブミンを含む、請求項１又は２に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
4. 前記糖アルコールがマンニトールを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
5. 前記キャリアタンパク質がアルブミンであり、前記糖アルコールがマンニトールであり、トロンビン：アルブミンの比が、約０．８５ＩＵ：１ｍｇ〜６６，８７５ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：マンニトールの比が、０．７５ＩＵ：１ｍｇ〜２６，７５０ＩＵ：１ｍｇである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
6. トロンビン：アルブミンの比が、約１１０ＩＵ：１ｍｇ〜約２８５ＩＵ：１ｍｇ、任意追加的に約１２９ＩＵ：１ｍｇ〜約２１９ＩＵ：１ｍｇである、請求項５に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
7. トロンビン：マンニトールの比が約４０ＩＵ：１ｍｇ〜約６４ＩＵ：１ｍｇである、請求項６に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
8. 約０．００１％ｗ／ｗ〜約５％ｗ／ｗのトロンビンを含む、請求項７に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
9. 約３％ｗ／ｗ未満の水分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
10. 約５〜約１３μｍのＤ５０、及び約１５〜約２５μｍのＤ９０の粒径分布を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
11. フィブリノゲンを含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末。
12. トロンビンマイクロカプセルの調製で使用するのに好適な水性組成物であって、前記水性組成物が、
    トロンビンと、キャリアタンパク質と、糖アルコールと、を含み、トロンビン：前記キャリアタンパク質の比が、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５，０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：前記糖アルコールの比が、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである、水性組成物。
13. トロンビンマイクロカプセルを調製するための方法であって、前記方法が、水溶液中でトロンビン、キャリアタンパク質、及び糖アルコールを混合する工程であって、トロンビン：前記キャリアタンパク質の比が、約１．６ＩＵ：１ｍｇ〜５０００ＩＵ：１ｍｇであり、トロンビン：前記糖アルコールの比が、２ＩＵ：１ｍｇ〜１５００ＩＵ：１ｍｇである、工程と、
    前記水溶液を噴霧乾燥する工程と、を含む、方法。
14. 前記噴霧乾燥する工程が、
    噴霧乾燥装置の中に前記水溶液を導入することと、
    噴霧ガス流を使用することによって前記噴霧乾燥装置に導入された前記水溶液から液滴を生成することと、
    乾燥ガス流によって前記液滴から水分を蒸発させることと、
    それによってトロンビンマイクロカプセルを調製することと、を含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記水溶液が、
    約８００〜約１２００ＩＵ／ｍＬのトロンビンと、
    約０．５〜約０．６５％ｗ／ｖの前記キャリアタンパク質と、
    約１．８５〜約２．０５％ｗ／ｖの前記糖アルコールと、
    約３８〜約４２ｍＭのカルシウムと、
    約１８．０〜約２０．０ｍＭの酢酸塩と、
    約６０〜２４０ｍＭの塩化ナトリウムと、を含み、
    前記水溶液が、約１．０１〜約１．０３ｇ／ｍＬの密度を有する、請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末を含む、マトリックス。
17. フィブリノゲン粉末を更に含む、請求項１６に記載のマトリックス。
18. 前記フィブリノゲン粉末がフリーズドライ粉末である、請求項１７に記載のマトリックス。
19. 請求項１〜１１のいずれか一項に記載の噴霧乾燥トロンビン粉末を含む、容器を含むキット。

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